JP3618871B2 - 慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 - Google Patents
慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3618871B2 JP3618871B2 JP02773796A JP2773796A JP3618871B2 JP 3618871 B2 JP3618871 B2 JP 3618871B2 JP 02773796 A JP02773796 A JP 02773796A JP 2773796 A JP2773796 A JP 2773796A JP 3618871 B2 JP3618871 B2 JP 3618871B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- myeloperoxidase
- rheumatoid arthritis
- antigen
- blood
- measuring
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬に関する。更に詳しくは、診断対象者の白血球が産生するミエロペルオキシダーゼ（以下の説明において、ミエロペルオキシダーゼのことをＭＰＯと略記することがある）量を測定することにより、慢性関節リウマチの活動性の診断に有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本における慢性関節リウマチ患者は、人口１０００人あたり約３人の割合といわれており、特に女性に多いことが知られている。
▲１▼定義：リウマチの定義は、「骨、関節、筋肉、腱などの運動器官に痛みとこわばりを訴える疾患」であり、特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、多発性関節炎を主症状とするが、内臓にも広範に病変を惹起するため、全身性疾患であるとされている。
▲２▼病因：リウマチの病因はリウマトイド因子（ＲＦ）の存在など、自己免疫疾患的な色彩の濃いことが認められているが、これですべてを説明することは困難で未だ解明されていないのが現状である。この他には従来から感染説、内分泌異常説、遺伝説などがある。
▲３▼診断および治療：リウマチの診断には、アメリカリウマチ学会（ＡＲＡ）により、１９５８年に作成された１１項目の診断基準が使用されていたが（Ｂｕｌｌｅｔｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ 、第９巻、１７５ページ、１９５８年）、１９８７年に改訂され、診断基準が次の７項目に削減された（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、別冊、４５ページ、１９８７年）。
【０００３】
▲１▼少なくとも１時間以上持続する朝のこわばり（６週間以上）
▲２▼３個以上の関節の腫脹（６週間以上）
▲３▼手（ＷＲＩＳＴ）、中手指関節（ＭＣＰ）、近位指関節（ＰＩＰ）の腫脹（６週間以上）
▲４▼対称性関節腫脹
▲５▼手、指のＸ線像の変化
▲６▼皮下結節（リウマチ結節）
▲７▼ＲＦの存在
そして、これら７項目のうち少なくとも４項目の病変が認められれば、リウマチであると診断される。
【０００４】
特に、これらの基準のうち、リウマチの客観的診断にはＲＦの測定を行うことが一般的に行われている。すなわち、ＲＦの検出は、ＲＡの診断に際して不可欠となっており、さらにＲＡ以外に多くの関節症状（関節痛、関節炎）を有する他疾患との鑑別上にも利用されている。
しかし、実際には健常人でもＲＦ陽性の人が数〜１０％程度存在し、一方リウマチと診断された人でもＲＦの陽性率は４０〜９０％である（検査と技術、第１６巻、１４４２ページ、１９８８年）。また、血清中にＲＦが認められる疾患としては、ＲＡ以外に、リウマチ近縁疾患やＲＡ以外の膠原病諸疾患（シェーグレン症候群、アジュバント病、膠原病など）で２０〜４０％の陽性率を示し、その他肝疾患（特に肝硬変症、慢性肝炎）や心疾患（特に心筋梗塞発作後、亜急性細菌性心内膜炎）ではともに３０〜５０％の高い陽性率を示す。
【０００５】
また、慢性関節リウマチの治療においては、通常各種の非ステロイド性抗炎症剤が最もよく使用されているが、ＲＦ値は本薬剤との関係では、ほとんど不変であることが多い。副腎皮質ステロイド剤、金製剤、ペニシラミン剤などの投与ではＲＦの抗体価減少や陰性化がみられたとの報告もなされている。しかしながら、実際にはＲＡの活動性病期あるいは治療効果の判定にはＲＦは用いられず、ＣＲＰ値や赤沈値をもって指標とされているのが現状である（メディカル テクノロジー、第１８巻、第７号、６０９ページ、１９９０年）。
【０００６】
近年の研究により、リウマチの炎症性とサイトカインとの関係が徐々に明らかになりつつある。特にインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）との関係については、その報告も多い（アースリティス・アンド・リウマティズム、第３０巻、５６２ページ、１９８７年）。これらの報告によれば、特にリウマチを炎症性の疾患の一つとしてとらえ、局所炎症とサイトカインとの関係が論じられている。また、インターロイキン６（ＩＬ−６）および顆粒球／単球マクロファージ刺激因子との関連も明らかになりつつある（医学の歩み、第１６１巻、５８０ページ、１９９２年）。この報告も、どちらかといえば、リウマチに限らず炎症性の疾患としての関係が論じられている。
【０００７】
また、特開平６−１９４３６７号公報には、ヒアルロン酸を除去したヒト関節液に含まれる単球マクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を、Ｍ−ＣＳＦに特異的に反応する抗体と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾患の診断方法が提案されているが、この方法には、▲１▼関節液の採取に苦痛を伴う点、▲２▼単に関節液中のＭ−ＣＳＦを測定するのみであるので、被検者の生体内の状態を正確に反映しているとはいえない点、などの問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、慢性関節リウマチは、その患者人口の多さ、社会的意義の大きさ（患者のＱＯＬ；Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）などから、適切な治療のための薬剤投与計画や、疾患活動性の把握を可能にする診断法が望まれている。しかし、そのような診断法は未だに報告されていない。本発明は、以上の現状に鑑みてなされたものであり、その目的は、特に、慢性関節リウマチの疾患活動性を感度よくかつ特異的に診断するのに有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
周知のごとく、生体の免疫担当細胞としては、単球、マクロファージ、顆粒球、リンパ球等の白血球があり、これらの細胞は血液中や各臓器、器官において免疫監視を行うとともに、各種の免疫反応において様々な役割を担って活動している。一般に、各種の疾患や、悪性腫瘍においては、多様な免疫反応によって、上記の細胞の機能が抑制されたり、または増強されたりすることが知られている。そこで、これらの細胞の機能を調べることによって、生体の免疫機能を把握することが可能となり、種々の病態の把握や薬剤の投与タイミングの決定など治療の指針となる情報を提供することができる。
【００１０】
慢性関節リウマチでも、関節局所に集まった好中球などの白血球が、ＲＡの関節炎にどのように関連しているかについて、骨破壊の面からの研究が多い。Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ら（Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．，６２巻、２７１ページ、１９６５年）は、ＩｇＧとＲＦからなる免疫複合体を貪食した関節液中の好中球から、ライソゾーム酵素が放出され、軟骨が破壊されることを述べた。Ｚｖａｉｆｌｅｒら（Ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ９ｔｈ， Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， ４１７ページ、１９７９年）も、滑膜組織に浸潤したリンパ球がＲＦを産生し、ＩｇＧと免疫複合体を形成し、これを好中球が貪食し、ライソゾーム酵素、活性酸素、プロスタグランディンを放出して、骨破壊をもたらすと述べた。このように、関節液中の好中球などの白血球が産生する各種酵素類は、関節の軟骨および骨破壊に主要な役割を演じている。
【００１１】
しかし、リウマチの活動性をＲＦとＩｇＧとの免疫複合体との反応の結果、遊離される白血球由来の酵素で診断する方法に関する報告は少ない。本発明者らは、鋭意研究の結果、後述のような作用機序により、慢性関節リウマチでの炎症の程度および疾患活動性を、患者自身の細胞機能、すなわちミエロペルオキシダーゼ放出能で定量的に診断できること、その診断のための測定方法及び測定試薬を見い出した。
【００１２】
すなわち、請求項１記載の発明（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、リウマトイド因子に対する抗原に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００１３】
すなわち、本発明１は、インビトロの系に於いて、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる。血液としてＲＡ患者由来の血液のように、血液中にＲＦが含まれていれば、この操作により、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体が形成される。すなわち、本発明１は、血液中のＲＦとＲＦに対する抗原とを反応させて免疫複合体を形成させる。この反応系に共存している血液中の白血球は、上記免疫複合体のＦｃ部分により、その表面上のレセプターが活性化され、速やかにミエロペルオキシダーゼ等のライソゾーム酵素を放出する。本発明１ではこのミエロペルオキシダーゼの放出量を測定する。すなわち、本発明１によると、このように、生体組織内でのインビボ免疫応答を、簡便なインビトロアッセイ系に適用することが可能となった。
【００１４】
また、ミエロペルオキシダーゼは、他のペルオキシダーゼと同様、プロトヘムを補欠分子族として含む酵素であり、主に好中球等骨髄系の白血球から産生されるものであり、他のエラスターゼ、コラゲナーゼに比べて好中球に特異性が高いものである。
【００１５】
本発明１は、上記のように、インビトロの系で形成された免疫複合体により、白血球のミエロペルオキシダーゼの放出を誘導し、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することにより、慢性関節リウマチの疾患活動性をより正確に把握することのできる、正確かつ簡便な診断方法に有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法を提供するものである。
【００１６】
以下、本発明１を詳細に説明する。
本発明１でいう、ＲＦに対する抗原とは、ＲＦと抗原抗体反応性を有し、免疫複合体を形成するものであれば、特に限定されない。ＲＦに対する抗原としては、抗原の成分にＲＦとの反応性を獲得せしめたものが挙げられる。上記抗原の成分としては血液中のグロブリン画分が挙げられる。上記グロブリン画分は、動物血清から調製されたものでも、あるいは、細胞融合法によって作成されたモノクローナル抗体でもかまわない。上記グロブリン画分としては、その産生種は特に限定されず、例えば、ヒトやウサギなどが挙げられる。上記グロブリン画分としては、例えば、ガンマグロブリンやＩｇＧが挙げられる。上記グロブリン画分としては、特に、ＲＦ検出用の免疫診断試薬で実績のある、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００１７】
上記抗原の成分にＲＦとの抗原抗体反応性を獲得せしめる方法としては、通常行われているような、抗原の成分を熱処理する方法、酵素処理する方法など、ＲＦとの抗原抗体反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。
【００１８】
本発明１において、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる際の、血液としては、全血又はその希釈液が使用される。全血を希釈する場合には、例えば、リン酸緩衝液、ハンクス緩衝液、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の通常の培地のいずれも使用できる。従って、本発明１においては、血液より単球や好中球を分離する必要がなく、それに伴う操作や処理時間は不要である。またそれらの操作、処理時間などによる細胞の活性低下、または不要な活性化が惹起される問題もない。
【００１９】
また、本発明１では、検査に必要とされる血液量も非常に少なくて済み、被採血者の負担も軽減される。また、上記のように、全血またはその希釈液を用いるため、血液中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が、生体内と同様に働き、より正確に生体内の免疫機能を把握することができる。
【００２０】
また、本発明１では、検査に必要とされる血液の採取は常法に従い、血液凝固を起こさせない任意の方法で実施できる。例えばヘパリン採血、クエン酸採血等が挙げられる。ただし、ミエロペルオキシダーゼの放出は、細胞の生物学的反応であるため、血液や培地中のカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどをキレートしないヘパリン採血などがより好ましい。
【００２１】
本発明１において、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させる際の反応は、プレートや試験管などの容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが、ミエロペルオキシダーゼの放出には望ましく、個々の血液サンプルの慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能を生体に近い状態で把握し易くする。上記反応温度は、通常３７℃付近の温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行い得る。
【００２２】
本発明１において、放出されたミエロペルオキシダーゼの測定には、請求項６記載の測定方法（詳細後述）を用いるのが、正確且つ簡便であるが、各種の酵素測定法、代表的には比色定量法、化学発光法等でも行い得る。
【００２３】
本発明１の好ましい一実施形態を挙げると、グロブリン画分、例えば、ヒトガンマグロブリンを熱変性させてＲＦとの反応性を獲得せしめる。これに、リウマチ患者血清を全血のまま、または希釈して所定量を加える。これにより、熱変性グロブリンとＲＦとが反応して免疫複合体が形成される。次いで、反応溶液中の免疫複合体を貪食しようとした白血球表面に、免疫複合体が強く付着し、白血球からミエロペルオキシダーゼが放出される。このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００２４】
請求項３記載の発明（以下、請求項３記載の発明を本発明３という）は、不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００２５】
以下、本発明３を詳細に説明する。
本発明３で使用される、ＲＦに対する抗原の成分は、本発明１で使用される抗原の成分と同様である。本発明３で使用されるＲＦに対する抗原の成分としては、本発明１と同様の理由で、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。本発明３では、上記抗原の成分が不溶性担体に固定化されていることにより、ＲＦとの抗原抗体反応性が獲得せしめられている。従って、患者由来の血液のように血液中にＲＦが存在すれば、不溶性担体に固定化された抗原の成分と反応して免疫複合体が形成される。そして、血液中の白血球は、上記免疫複合体を貪食しようとするが、免疫複合体が不溶性担体上に固定化されているため、貪食は困難となり、速やかにミエロペルオキシダーゼなどのライソゾーム酵素を放出する。本発明３では、このように、不溶性担体を用いることにより、生体組織内でのインビボ免疫応答を、簡便なインビトロアッセイ系に適用することが可能となった。
【００２６】
本発明３は、上記のように、形成された免疫複合体により、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導し、該ミエロペルオキシダーゼの産生量を測定することにより、慢性関節リウマチの疾患活動性をより正確に把握することのできる、正確かつ簡便な慢性関節リウマチの診断方法として有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法を提供するものである。
【００２７】
本発明３で使用される不溶性担体は、その表面にＲＦに対する抗原の成分を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。例えば、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれる高分子材料が挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。不溶性担体の形状としては、例えば、ラテックス、ビーズ、プレート、チューブなどが挙げられる。不溶性担体としては、特に、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス、またはプラスチックビーズ、プラスチックプレート、プラスチックチューブなどのプラスチック成型品が好適に使用される。
【００２８】
ＲＦに対する抗原の成分を不溶性担体に固定化する方法としては、ＲＦとの反応性を低下させない方法ならば、とくに限定されない。たとえば、疎水性表面を有する不溶性担体には、疎水性相互作用による物理吸着法が、迅速かつ簡便に多量のＲＦに対する抗原の成分を固定化する方法として好適である。また酵素処理したＲＦに対する抗原の成分を安定に、固定化するために、化学結合法なども好適である。
【００２９】
本発明３において、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる際の、血液としては、全血又はその希釈液が使用される。全血を希釈する場合には、例えば、本発明１で述べたものと同様のものが使用できる。従って、本発明３においても血液より単球や好中球を分離する必要がなく、それに伴う操作や処理時間は不要である。またそれらの操作、処理時間などによる細胞の活性低下、または不要な活性化が惹起される問題もない。
【００３０】
また、本発明３でも、本発明１と同様に、検査に必要とされる血液量も非常に少なくて済み、被採血者の負担も軽減される。また、上記のように、全血またはその希釈液を用いるため、血液中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が、生体内と同様に働き、より正確に生体内の免疫機能を把握することができる。
【００３１】
また、検査に必要とされる血液の採取方法も、本発明１で述べた方法と同様である。
【００３２】
本発明３において、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させる際の反応は、本発明１と同様に、プレートや試験管などの容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが、ミエロペルオキシダーゼの放出には望ましく、個々の血液サンプルの慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能を生体に近い状態で把握し易くする。上記反応温度は、通常３７℃付近の温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行いうる。
【００３３】
本発明３において、放出されたミエロペルオキシダーゼの測定方法は、本発明１と同様である。
【００３４】
本発明３の好ましい一実施形態を挙げると、グロブリン画分、例えば、ヒトガンマグロブリン溶液をプラスチックプレートに固定化させる。これに、リウマチ患者血液を全血のまま、または希釈して所定量を加える。これにより、固定化されたヒトグロブリンとＲＦとが反応して免疫複合体が形成される。次いで、プレート上に形成された免疫複合体を貪食しようとした白血球が、不溶性担体に強く付着し、ミエロペルオキシダーゼが放出される。このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００３５】
請求項６記載の発明（以下、請求項６記載の発明を本発明６という）は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で放出されたミエロペルオキシダーゼを、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体と抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００３６】
以下、本発明６を詳細に説明する。
本発明６で使用される抗ミエロペルオキシダーゼ抗体は、少なくとも一種類以上の抗ミエロペルオキシダーゼポリクローナル抗体または抗ミエロペルオキシダーゼモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体の精製方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、もしくはプロテインＡのような群特異的吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、または精製ミエロペルオキシダーゼを担体ゲルに固定化したものを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の方法が挙げられ、これらを単独あるいはいくつかを組み合わせた方法が挙げられる。
【００３７】
上記抗体としては、通常の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体分子だけでなく、上記抗体分子をペプシンやパパイン等のタンパク質分解酵素で処理しＦｃフラグメントを除いた、ＦａｂやＦ（ａｂ’）分子も使用できる。抗体として、ＦａｂやＦ（ａｂ’）分子を用いると、抗体を不溶性粒子に固定化する際、又は担体ゲルを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する際などに、不溶性粒子や担体ゲルに結合した抗体分子に不純物が抗原抗体反応以外の相互作用により結合することが防止される。
【００３８】
本発明６で使用される不溶性粒子は、その表面に抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。上記高分子材料としては、合成高分子でも、天然高分子でもよい。また、有機高分子でも、無機高分子でもよい。合成高分子からなる不溶性粒子の例としては、ポリスチレン粒子、スチレン系共重合体粒子、ナイロン粒子、ポリアクリルアミド粒子等が挙げられる。無機高分子からなる不溶性粒子の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル粒子等が挙げられる。天然高分子からなる不溶性粒子の例としては、架橋デキストラン、架橋アガロース等のゲルが挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。また、これらを組み合わせた粒子も使用可能であり、例えば、アクリルアミドとアガロースを組み合わせた粒子、アクリルアミドとデキストラン誘導体を組み合わせた粒子などが挙げられる。また、高分子材料以外の粒子としては、金属粒子も使用可能である。これらの不溶性粒子の中で、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス粒子が特に好適である。
【００３９】
本発明６の測定方法において、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を不溶性粒子に固定化する方法としては、固定化によって抗ミエロペルオキシダーゼ抗体のミエロペルオキシダーゼに対する反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。例えば、不溶性粒子が疎水性表面を有する場合には、疎水性相互作用による物理吸着法が、迅速かつ簡便に多量の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を固定できるので好適である。また、不溶性粒子上に官能基が存在する場合（不溶性粒子分子そのものが官能基を有する場合、又は不溶性粒子分子に官能基が導入された場合がある）には、該官能基と抗体分子中の官能基とを適当な架橋剤を用いて架橋し、共有結合により固定化させる化学結合法なども好適である。
【００４０】
本発明６の測定方法は、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとを抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定する。換言すると、この方法では、不溶性粒子に抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されているので、各粒子上の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとが抗原抗体反応すると、ミエロペルオキシダーゼを介して不溶性粒子同士が結合し不溶性粒子が大きくなり凝集する。この凝集の度合いは、ミエロペルオキシダーゼの量と正の相関をするので、凝集の度合いを検出することによりミエロペルオキシダーゼ量を検出できる。
【００４１】
上記の抗原抗体反応の温度は、通常３７℃付近の生理的温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行い得る。
【００４２】
生じた凝集の度合いを検出する方法としては、例えば、光学的に測定する方法又は目視観察する方法が挙げられる。
【００４３】
上記の測定系としては、不溶性粒子としてラテックス粒子を使用した系が特に好適である。
【００４４】
また、本発明６の方法で用いられるミエロペルオキシダーゼを含む検体としては、本発明１〜５の測定方法により得られた血液成分であり、具体的には、血液成分から血球成分を除去した血漿、血清又はそれらの希釈液が使用される。
【００４５】
また、本発明６の方法では、測定に必要とされる検体量が少なくて済むので、本発明１〜５の測定方法に用いられる血液の量も少なくて済み、例えば、慢性関節リウマチの診断のための被検者の負担も軽減される。
【００４６】
本発明６は、上記のように、正確かつ簡便な慢性関節リウマチの診断方法として有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法によって、放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定する方法を提供するものである。
【００４７】
本発明６の好ましい一実施形態を挙げると、例えば、ウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体をポリスチレンラテックスに固定化させる。これに、本発明１〜５の方法により、ミエロペルオキシダーゼを放出させたリウマチ患者血液の血清または血漿をそのまま、又は希釈して所定量を加える。ミエロペルオキシダーゼとそれに対する抗体との抗原抗体反応の結果、形成された凝集塊を検出することにより、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を測定する。その結果より、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００４８】
請求項７記載の発明（以下、請求項７記載の発明を本発明７という）は、リウマトイド因子に対する抗原又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分、及び抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子からなることを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬である。
【００４９】
本発明７で用いられるリウマトイド因子に対する抗原は、本発明１の説明において述べたものと同様であり、具体的には、ＲＦと抗原抗体反応性を有し、免疫複合体を形成するものであれば、特に限定されない。ＲＦに対する抗原としては、抗原の成分にＲＦとの反応性を獲得せしめたものが挙げられる。上記抗原の成分としては血液中のグロブリン画分が挙げられる。上記グロブリン画分は、動物血清から調製されたものでも、あるいは、細胞融合法によって作成されたモノクローナル抗体でもかまわない。上記グロブリン画分としては、その産生種は特に限定されず、例えば、ヒトやウサギなどが挙げられる。上記グロブリン画分としては、例えば、ガンマグロブリンやＩｇＧが挙げられる。上記グロブリン画分としては、特に、ＲＦ検出用の免疫診断試薬で実績のある、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００５０】
上記抗原の成分にＲＦとの抗原抗体反応性を獲得せしめる方法としては、通常行われているような、抗原の成分を熱処理する方法、酵素処理する方法など、ＲＦとの抗原抗体反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。
【００５１】
本発明７で用いられるリウマトイド因子に対する抗原の成分としては、本発明３の説明において述べたものと同様であり、具体的には、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００５２】
本発明７で用いられる不溶性担体は、本発明３の説明において述べたものと同様であり、具体的には、その表面にＲＦに対する抗原の成分を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。例えば、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれる高分子材料が挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。不溶性担体の形状としては、例えば、ラテックス、ビーズ、プレート、チューブなどが挙げられる。不溶性担体としては、特に、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス、またはプラスチックビーズ、プラスチックプレート、プラスチックチューブなどのプラスチック成型品が好適に使用される。
【００５３】
本発明７では、不溶性担体に固定化されたＲＦに対する抗原の成分が使用される。上記抗原の成分を不溶性担体に固定化する方法としては、本発明３の説明で述べた方法と同様であり、例えば、物理吸着法や化学結合法が使用できる。
【００５４】
本発明７で用いられる、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子において、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体及び不溶性粒子としては、本発明６の説明で述べたものと同様である。
【００５５】
本発明７で用いられる、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子は、ミエロペルオキシダーゼと抗原抗体反応するが、それにより凝集するものが好ましい。特に、上記凝集の度合いがミエロペルオキシダーゼの量と正の相関をするものが好ましく、その場合は、その凝集の度合いを検出することによりミエロペルオキシダーゼ量を定量できる。請求項８記載の発明（請求項８記載の発明を本発明８という）においては、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子の作用として、ミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による凝集現象を利用してミエロペルオキシダーゼ量を検出するものに限定される。このような作用をする抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子の例としては、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子が挙げられる。
【００５６】
本発明７の測定試薬の使用方法は、リウマトイド因子に対する抗原（例えば、ヒトガンマグロブリンを熱変性させてＲＦとの反応性を獲得せしめたもの）又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分に、リウマチ患者血清を全血のまま、または希釈して所定量を加え、該抗原又は不溶性担体に固定化された抗原の成分とＲＦとを反応させて免疫複合体を形成させ、次いで、血液中の共存する白血球からミエロペルオキシダーゼを放出せしめる。次いで、放出されたミエロペルオキシダーゼを含む血液（血漿）と抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子を接触させて、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとを抗原抗体反応させ、その反応量から放出されたミエロペルオキシダーゼの量を測定する。この場合、本発明８の測定試薬の場合は、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による不溶性粒子の凝集の度合いを検出することにより、放出されたミエロペルオキシダーゼの量を定量する。以上のようにして測定される、放出されたミエロペルオキシダーゼの量は、慢性関節リウマチによる疾患活動性と相関するので、本発明７又は８の試薬は、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定に有用である。
【００５７】
（作用）
上記のように、本発明１及び２によれば、ＲＦに対する抗原と患者血液中のリウマトイド因子が結合し、形成された免疫複合体が好中球などの白血球を活性化させてミエロペルオキシダーゼが放出される。このような方法で放出されたミエロペルオキシダーゼは、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をよく反映するマーカーとなるため、このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、被採血者のリウマチの疾患活動性を正確に定量的に測定することができる。
【００５８】
上記のように、本発明３〜５によれば、不溶性担体に固定化されたＲＦに対する抗原の成分と患者血液中のリウマトイド因子が結合し、形成された免疫複合体が好中球を活性化させてミエロペルオキシダーゼが放出される。このような方法で放出されたミエロペルオキシダーゼは、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をよく反映するマーカーとなるため、このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、被採血者のリウマチの疾患活動性を正確に定量的に測定することができる。
【００５９】
上記のように、本発明６によれば、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で放出されたミエロペルオキシダーゼを、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体と抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定するので、放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定することができる。
【００６０】
上記のように、本発明７によれば、リウマトイド因子に対する抗原又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分と、リウマチ患者血清等と接触させ、血液中の白血球からミエロペルオキシダーゼを放出せしめ、該ミエロペルオキシダーゼ量を、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子との反応量によって求めるので、リウマチ患者等のリウマチの疾患活動性を簡便に且つ正確に測定することができる。
【００６１】
上記のように、本発明８によれば、本発明７と同様にして放出されたミエロペルオキシダーゼ量を、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による不溶性粒子の凝集の度合いを検出することにより定量するので、リウマチ患者等のリウマチの疾患活動性を、より一層、簡便に且つ正確に測定することができる。
【００６２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
（実施例１〜１０、比較例１〜１０）
実施例１〜１０は、熱変性グロブリンとＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００６３】
Ｉ．試薬および材料
実施例１〜１０、比較例１〜１０で使用した試薬および材料は以下の通りである。
グロブリン（抗原の成分）：ウサギＩｇＧ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、Ｃａｐｐｅｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、１９．０ｍｇ／ｍｌ ）を用いた。
ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス血液：多発性関節炎を自然発症したＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスと略す、３０週令、雄性）から採取した血液を用いた。
正常マウス血液：ＩＣＲ マウス（３０週令、雄性）から採取した血液を用いた。
グロブリン希釈用緩衝液：５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ （ｐＨ８．４０）をグロブリン希釈用緩衝液として用いた。
血液希釈用緩衝液：１３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４と２３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ を混合してｐＨを６．５０に調整し、ＮａＣｌ濃度を１４０ｍＭ に調整したもの（以下Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳと略す）にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を ５％（ｗ／ｖ ）になるように添加したものを血液希釈用緩衝液として用いた。
【００６４】
ブロッキング用緩衝液：ＰＢＳにウシ血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ ）になるように添加したものを用いた。
ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液：０．１Ｍ ＭｃＣｉｌｖｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５．７ ）にＤＡ−６７ （和光純薬、試薬特級）を０．１ｍＭ になるように溶解したもの９９ｍｌに、２ ％Ｈ２Ｏ２を１ｍｌ 添加したものを基質溶液とした。なお、ＤＡ−６７ とは、１０−（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）−３，７−ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔのことである。
ＲＦ測定用試薬：血清中のＲＦ測定用ＴＩＡ試薬（オートＴＩＡ ＲＦＩＩ「ニッスイ」、日水製薬社製）を用いた。
プラスチックプレート：Ｎｕｎｃ社製のＥＩＡ （酵素免疫測定法）用プラスチックプレート（９６ウエル、平底、ポリスチレン製）を用いた。
【００６５】
ＩＩ． 方法
（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼抗原の成分であるグロブリンの溶液を３５℃で２時間インキュベートすることにより、グロブリンを熱変性してグロブリンにＲＦとの抗原性を獲得させた。この熱変性グロブリンを、グロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈した。
▲２▼熱変性グロブリンの吸着を回避できる容器としてプラスチックプレートを以下に示す方法で表面処理したものを反応容器として用いた。各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、ウェル中の溶液を吸引除去した。次に、ＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００６６】
▲３▼上記▲１▼で得られた１０倍希釈熱変性グロブリン溶液をウェルに１００μｌ 添加し、次いでマウス血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、１０倍希釈熱変性グロブリン溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加したウェルも用意し、同様に処理した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００６７】
▲６▼ＭＰＯ 測定用基質溶液２ｍｌを石英セル中で３７℃でインキュベートしながら、上記▲５▼で得られた上清５０μｌ を添加した。上清添加５分後の６６６ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６６ ）を測定した。そして、検体の上清を用いて得られたＯＤ６６６ の測定値から、ブランクの上清を用いて得られたＯＤ６６６ の測定値を差し引いた値をその検体の反応量とした。
▲７▼上記▲５▼で得られた検体の上清の代わりに、既知濃度のＭＰＯのＰＢＳ溶液を用いて、上記▲６▼の操作を行って予め検量線を作成しておき、上記▲６▼で得られた検体の反応量（ＯＤ６６６ ）を上記検量線に当てはめて、検体中のＭＰＯ量を算出した。
【００６８】
（２）疾患活動性の判定
マウスの慢性リウマチ関節炎の疾患活動性を判定するために、四肢の指関節の変形度や尻尾関節の変形度などを総合的に判断して、関節炎の重篤度を以下の＋１から＋５までに分類した。
＋１：尻尾の動きが固い。
＋２：尻尾がやや変形している。
＋３：尻尾がかなり変形している。
＋４：手足の爪がはがれ、出血のあとがある。
＋５：毛並みがあれている。
【００６９】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例１〜１０
多発性関節炎を自然発症したＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例（各個体をＭ−１、Ｍ−２、Ｍ−３、Ｍ−４、Ｍ−５とする）および正常マウス５例（各個体をＮ−１、Ｎ−２、Ｎ−３、Ｎ−４、Ｎ−５とする）から血液を採取したものを検体として、上記ＩＩ． の（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、熱変性グロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量を測定した。また、上記ＩＩ． の（２）疾患活動性の判定に従って、上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例の関節炎の重篤度の観察を行った。上記のミエロペルオキシダーゼ量の測定および関節炎の重篤度の観察は、上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの関節炎の発症前後の４週間にわたり、１週間毎に行った（すなわち、採血日及び観察日は、０、７、１４、２１日目）。この測定結果を表１に示した。なお、表１の関節炎の重篤度の欄の−は、関節炎の徴候が何ら見られなかったことを示す。また、表１及び後述の表２、３において、マウス欄にＭＲＬと示したものは、ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのことである。
【００７０】
【表１】
【００７１】
（２）比較例１〜１０
上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例について、実施例１〜１０のミエロペルオキシダーゼ量の測定および関節炎の重篤度の観察と同じ時期に、血液を採取し、その血清中のＲＦ量をＲＦ測定用試薬を用いて測定した。この測定結果を表２に示した。
【００７２】
【表２】
【００７３】
また、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの５例について、表１に示したミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を図１に、関節炎の重篤度の経時的変動を図２に、および表２に示したＲＦ値の経時的変動を図３に示した。
【００７４】
表１および表２、図１〜３から明らかなように、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量および変動状況は、肉眼観察による関節炎の症状の重篤度および変動状況とよく一致し、これに対して血清中のＲＦの測定値は症状の重篤度と必ずしも一致しなかった。
【００７５】
また、実施例の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて１．０ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２２．５〜１８０．３ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
一方、比較例の結果から明らかなように、ＲＦの測定値は、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２２．５〜１２０．６ＩＵ／ｍｌを示したが、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群でも、ＲＦの測定値は１１．５から７５．９ＩＵ／ｍｌ と広範な値を示しており、ＲＦによる診断方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性があることが分かる。
【００７６】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【００７７】
（実施例１１〜２０）
実施例１１〜２０は、プラスチックプレートに固定化されたグロブリンとＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００７８】
Ｉ．試薬および材料
実施例１１〜２０で使用した試薬および材料は、実施例１〜１０で使用したものと同様である。
【００７９】
ＩＩ． 方法
（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼グロブリンのプラスチックプレートへの固定化操作
抗原の成分であるグロブリンの溶液をグロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈し、プラスチックプレートの各ウェルに１００μｌ ずつ添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。
▲２▼各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。次にＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００８０】
▲３▼マウス血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、グロブリンの溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加して上記▲１▼及び▲２▼と同様に操作して得られたプラスチックプレートのウェルにも上記の検体を２００μｌ 添加した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００８１】
▲６▼ＭＰＯ 測定用基質溶液２ｍｌを石英セル中で３７℃でインキュベートしながら、上記▲５▼で得られた上清５０μｌ を添加した。上清添加５分後の６６６ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６６ ）を測定した。そして、グロブリンの溶液を固定化したウエルを用いて得られた検体の上清のＯＤ６６６ の測定値から、ブランクのグロブリン希釈用緩衝液を固定化したウエルを用いて得られた検体の上清のＯＤ６６６ の測定値を差し引いた値をその検体の反応量とした。
▲７▼上記▲５▼で得られた検体の上清の代わりに、既知濃度のＭＰＯのＰＢＳ溶液を用いて、上記▲６▼の操作を行って予め検量線を作成しておき、上記▲６▼で得られた検体の反応量（ＯＤ６６６ ）を上記検量線に当てはめて、検体中のＭＰＯ量を算出した。
【００８２】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例１１〜２０
上記実施例１〜１０の試験に用いた、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例から血液を採取したものと同一の血液を検体として、上記ＩＩ． の（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、不溶性担体に固定化されたグロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量を測定した。この測定結果を表３に示した。
【００８３】
【表３】
【００８４】
また、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの５例について、表３に示したミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を図４に示した。
【００８５】
表１及び３、図２及び４から明らかなように、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量および変動状況は、肉眼観察による関節炎の症状の重篤度および変動状況とよく一致した。
【００８６】
また、表３から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて１．０ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２５．２〜１１０．４ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【００８７】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、慢性関節リウマチの疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【００８８】
（実施例２１〜４０、比較例１１〜３０）
実施例２１〜４０は、熱変性グロブリンと抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００８９】
Ｉ． 試薬および材料
実施例２１〜４０、比較例１１〜３０で使用した試薬および材料は以下の通りである。
ラテックス：粒径０．４００ μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％、積水化学工業社製）を用いた。
ラテックス懸濁用緩衝液：１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ と１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ をｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ 、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ． 社製）を１ ％（Ｗ／Ｖ） になるように添加したものをラテックス懸濁用緩衝液として用いた。
グロブリン希釈用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
【００９０】
抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体：ウサギの抗血清から精製されたウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ａ３９８ ＤＡＫＯ 社製、７．６ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
ブロッキング用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
グロブリン（抗原の成分）：実施例１〜１０と同様。
【００９１】
慢性関節リウマチ患者血液：慢性関節リウマチ患者から採取した血液を用いた。
健常人血液：健常人から採取した血液を用いた。
血液希釈用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
ＲＦ測定用試薬：実施例１〜１０と同様。
プラスチックプレート：実施例１〜１０と同様。
【００９２】
測定用希釈液（Ｒ１液）：ラテックス懸濁用緩衝液に、ポリエチレングリコール ６０００ （平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ） になるように添加したものを測定用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【００９３】
ＩＩ． 方法
（１）ラテックス試薬の調製
抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体を、タンパク濃度が２５０μｇ／ｍｌになるようにグロブリン希釈用緩衝液で希釈し、抗体感作液とした。ラテックス１００μｌ に、２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで撹拌しながら、抗体感作液９００μｌ を素早く添加し、２５℃にて１ 時間撹拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて１ 時間撹拌した。その後、１５℃、１５０００ ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にラテックス懸濁用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にラテックス懸濁用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく撹拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．５％のラテックス試薬とした。このようにして調製したラテックス試薬を４℃にて保存した。
【００９４】
（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼抗原の成分であるグロブリンの溶液を３５℃で２時間インキュベートすることにより、グロブリンを熱変性してグロブリンにＲＦとの抗原性を獲得させた。この熱変性グロブリンを、グロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈した。
▲２▼熱変性グロブリンの吸着を回避できる容器としてプラスチックプレートを以下に示す方法で表面処理したものを反応容器として用いた。各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、ウェル中の溶液を吸引除去した。次に、ＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００９５】
▲３▼上記▲１▼で得られた１０倍希釈熱変性グロブリン溶液をウェルに１００μｌ 添加し、次いでヒト血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、１０倍希釈熱変性グロブリン溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加したウェルも用意し、同様に処理した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００９６】
▲６▼ミエロペルオキシダーゼの測定は、汎用自動分析装置７１５０型（日立製作所社製）を用いて行った。▲１▼で得られた固形分０．５％のラテックス試薬をラテックス懸濁用緩衝液で４倍に希釈し、Ｒ２液（固形分０．１２５％）とした。測定条件は以下の通りである。
検体容量 ２０μｌ
希釈液（Ｒ１液） ３５０μｌ
試薬（Ｒ２液） ５０μｌ
測定波長 ５７０ｎｍ
測定温度 ３７℃
試薬（Ｒ２液）を添加してから８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度の差（△ＯＤ５７０ ）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを測定値とした。検体の上清の代わりに、既知濃度のミエロペルオキシダーゼのＰＢＳ溶液を用いて同様の測定を行い、予め検量線を作成しておき、上清検体の測定値を上記検量線に当てはめて、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を算出した。
【００９７】
（３）疾患活動性の判定
慢性関節リウマチ患者の疾患活動性を判定するために、血液採取と同時期に、慢性関節リウマチ各患者のランスバリー指数をその患者の疾患活動度とした。ランスバリー指数とは、▲１▼朝のこわばり時間、▲２▼握力、▲３▼血沈値、▲４▼腫脹および疼痛関節点数の４項目を測定し、この実測値を指数換算表より％に換算して、その合計で疾患活動度を評価するものである。
【００９８】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例２１〜４０
慢性関節リウマチ患者１０例（各個体をＲ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｒ−７、Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−１０とする）および健常人１０例（各個体をＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−１０とする）から血液を採取したものを検体として、上記ＩＩ． の（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、熱変性グロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量をラテックス測定試薬を用いて測定した。また、上記ＩＩ． の（３）疾患活動性の判定に従って、上記の慢性関節リウマチ患者１０例のランスバリー指数を測定した。この測定結果を表４に示した。なお、表４のランスバリー指数の欄の−は、慢性関節リウマチの徴候が何ら見られなかったことを示す。また、表４及び後述の表５、表６のヒト種類欄のＲＡは、慢性関節リウマチ患者を表す。
【００９９】
【表４】
【０１００】
（２）比較例１１〜３０
上記の慢性関節リウマチ患者１０例および健常人１０例について、実施例２１〜４０のミエロペルオキシダーゼ量の測定およびランスバリー指数の測定と同じ時期に血液を採取し、その血清中のＲＦ量をＲＦ測定用試薬を用いて測定した。この測定結果を表５に示した。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
また、慢性関節リウマチ患者１０例について、表４に示したランスバリー指数とミエロペルオキシダーゼ量との相関を図５に、表４に示したランスバリー指数と表５に示したＲＦ量との相関を図６に示した。
【０１０３】
表４および表５、図５および図６から明らかなように、慢性関節リウマチの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量は、疾患活動度を示すランスバリー指数と正の相関を示し、これに対して血清中のＲＦの測定値はランスバリー指数との相関が悪かった。
【０１０４】
また、実施例の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて５．５ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、慢性関節リウマチを発症している患者のものは、３１３ 〜７９５ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【０１０５】
一方、比較例の結果から明らかなように、ＲＦの測定値は、慢性関節リウマチを発症しているものは、８７．３〜６１３ＩＵ／ｍｌを示したが、慢性関節リウマチを発症していない正常群でも、ＲＦの測定値は１１．０〜１１０ＩＵ／ｍｌと広範な値を示しており、ＲＦによる診断方法であると慢性関節リウマチを発症していない健常者を誤って陽性と判断する危険性があることが分かる。
【０１０６】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【０１０７】
（実施例４１〜６０）
実施例４１〜６０は、プラスチックプレートに固定化されたグロブリンと抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【０１０８】
Ｉ．試薬および材料
実施例４１〜６０で使用した試薬および材料は、実施例２１〜４０で使用したものと同様である。
【０１０９】
ＩＩ． 方法
（１）ラテックス試薬の調製
実施例２１〜４０と全く同様にしてラテックス試薬を調製した。
（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼グロブリンのプラスチックプレートへの固定化操作
抗原の成分であるグロブリンの溶液をグロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈し、プラスチックプレートの各ウェルに１００μｌ ずつ添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。
▲２▼各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。次にＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【０１１０】
▲３▼ヒト血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、グロブリンの溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加して上記▲１▼及び▲２▼と同様に操作して得られたプラスチックプレートのウェルにも上記の検体を２００μｌ 添加した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【０１１１】
▲６▼ミエロペルオキシダーゼの測定は、汎用自動分析装置７１５０型（日立製作所社製）を用いて行った。▲１▼で得られた固形分０．５％のラテックス試薬をラテックス懸濁用緩衝液で４倍に希釈し、Ｒ２液（固形分０．１２５％）とした。測定条件は以下の通りである。
検体容量 ２０μｌ
希釈液（Ｒ１液） ３５０μｌ
試薬（Ｒ２液） ５０μｌ
測定波長 ５７０ｎｍ
測定温度 ３７℃
試薬（Ｒ２液）を添加してから８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度の差（△ＯＤ５７０ ）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを測定値とした。検体の上清の代わりに、既知濃度のミエロペルオキシダーゼのＰＢＳ溶液を用いて同様の測定を行い、予め検量線を作成しておき、上清検体の測定値を上記検量線に当てはめて、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を算出した。
【０１１２】
（３）疾患活動性の判定
慢性関節リウマチ患者の疾患活動性を判定するために、慢性関節リウマチ各患者のランスバリー指数を測定した。
【０１１３】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例４１〜６０
上記実施例２１〜４０の試験に用いた、慢性関節リウマチ患者１０例および健常人１０例から血液を採取したものと同一の血液を検体として、上記ＩＩ． の（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、不溶性担体に固定化されたグロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量をラテックス測定試薬を用いて測定した。この測定結果を表６に示した。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
また、慢性関節リウマチ患者１０例について、表４に示したランスバリー指数と表６に示したミエロペルオキシダーゼ量との相関を図７に示した。
表６および図７から明らかなように、慢性関節リウマチの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量は、疾患活動度を示すランスバリー指数と正の相関を示した。
【０１１６】
また、表６の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて３．５ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、慢性関節リウマチを発症している患者のものは、３１６ 〜６２２ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【０１１７】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明１および２の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１１９】
特に、本発明２の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種であるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２０】
本発明３〜５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１２１】
特に、本発明４の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種であるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２２】
また、本発明５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、不溶性担体が、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２３】
本発明６の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、本発明６を用いると、請求項１〜５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法によって放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定できるので、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をより簡便かつ、より的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに、より有益である。
【０１２４】
本発明７の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬の構成は、上記の通りであり、本発明７の測定試薬を用いると、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１２５】
本発明８の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬の構成は、上記の通りであり、本発明８の測定試薬を用いると、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確かつ簡便に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた実施例１〜５のミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を示す図である。
【図２】実施例１〜５に使用されたＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの関節炎の重篤度の経時的変動を示す図である。
【図３】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた比較例１〜５のＲＦ値の経時的変動を示す図である。
【図４】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた実施例１１〜１５のミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を示す図である。
【図５】実施例２１〜３０により得られた慢性関節リウマチ患者のランスバリー指数とミエロペルオキシダーゼ量との相関を示す図である。
【図６】実施例２１〜３０により得られたランスバリー指数と比較例１１〜２０により得られたＲＦ量との相関を示す図である。
【図７】実施例２１〜３０により得られたランスバリー指数と実施例４１〜５０により得られたミエロペルオキシダーゼ量との相関を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬に関する。更に詳しくは、診断対象者の白血球が産生するミエロペルオキシダーゼ（以下の説明において、ミエロペルオキシダーゼのことをＭＰＯと略記することがある）量を測定することにより、慢性関節リウマチの活動性の診断に有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本における慢性関節リウマチ患者は、人口１０００人あたり約３人の割合といわれており、特に女性に多いことが知られている。
▲１▼定義：リウマチの定義は、「骨、関節、筋肉、腱などの運動器官に痛みとこわばりを訴える疾患」であり、特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、多発性関節炎を主症状とするが、内臓にも広範に病変を惹起するため、全身性疾患であるとされている。
▲２▼病因：リウマチの病因はリウマトイド因子（ＲＦ）の存在など、自己免疫疾患的な色彩の濃いことが認められているが、これですべてを説明することは困難で未だ解明されていないのが現状である。この他には従来から感染説、内分泌異常説、遺伝説などがある。
▲３▼診断および治療：リウマチの診断には、アメリカリウマチ学会（ＡＲＡ）により、１９５８年に作成された１１項目の診断基準が使用されていたが（Ｂｕｌｌｅｔｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ 、第９巻、１７５ページ、１９５８年）、１９８７年に改訂され、診断基準が次の７項目に削減された（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、別冊、４５ページ、１９８７年）。
【０００３】
▲１▼少なくとも１時間以上持続する朝のこわばり（６週間以上）
▲２▼３個以上の関節の腫脹（６週間以上）
▲３▼手（ＷＲＩＳＴ）、中手指関節（ＭＣＰ）、近位指関節（ＰＩＰ）の腫脹（６週間以上）
▲４▼対称性関節腫脹
▲５▼手、指のＸ線像の変化
▲６▼皮下結節（リウマチ結節）
▲７▼ＲＦの存在
そして、これら７項目のうち少なくとも４項目の病変が認められれば、リウマチであると診断される。
【０００４】
特に、これらの基準のうち、リウマチの客観的診断にはＲＦの測定を行うことが一般的に行われている。すなわち、ＲＦの検出は、ＲＡの診断に際して不可欠となっており、さらにＲＡ以外に多くの関節症状（関節痛、関節炎）を有する他疾患との鑑別上にも利用されている。
しかし、実際には健常人でもＲＦ陽性の人が数〜１０％程度存在し、一方リウマチと診断された人でもＲＦの陽性率は４０〜９０％である（検査と技術、第１６巻、１４４２ページ、１９８８年）。また、血清中にＲＦが認められる疾患としては、ＲＡ以外に、リウマチ近縁疾患やＲＡ以外の膠原病諸疾患（シェーグレン症候群、アジュバント病、膠原病など）で２０〜４０％の陽性率を示し、その他肝疾患（特に肝硬変症、慢性肝炎）や心疾患（特に心筋梗塞発作後、亜急性細菌性心内膜炎）ではともに３０〜５０％の高い陽性率を示す。
【０００５】
また、慢性関節リウマチの治療においては、通常各種の非ステロイド性抗炎症剤が最もよく使用されているが、ＲＦ値は本薬剤との関係では、ほとんど不変であることが多い。副腎皮質ステロイド剤、金製剤、ペニシラミン剤などの投与ではＲＦの抗体価減少や陰性化がみられたとの報告もなされている。しかしながら、実際にはＲＡの活動性病期あるいは治療効果の判定にはＲＦは用いられず、ＣＲＰ値や赤沈値をもって指標とされているのが現状である（メディカル テクノロジー、第１８巻、第７号、６０９ページ、１９９０年）。
【０００６】
近年の研究により、リウマチの炎症性とサイトカインとの関係が徐々に明らかになりつつある。特にインターロイキン１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ ）との関係については、その報告も多い（アースリティス・アンド・リウマティズム、第３０巻、５６２ページ、１９８７年）。これらの報告によれば、特にリウマチを炎症性の疾患の一つとしてとらえ、局所炎症とサイトカインとの関係が論じられている。また、インターロイキン６（ＩＬ−６）および顆粒球／単球マクロファージ刺激因子との関連も明らかになりつつある（医学の歩み、第１６１巻、５８０ページ、１９９２年）。この報告も、どちらかといえば、リウマチに限らず炎症性の疾患としての関係が論じられている。
【０００７】
また、特開平６−１９４３６７号公報には、ヒアルロン酸を除去したヒト関節液に含まれる単球マクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を、Ｍ−ＣＳＦに特異的に反応する抗体と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾患の診断方法が提案されているが、この方法には、▲１▼関節液の採取に苦痛を伴う点、▲２▼単に関節液中のＭ−ＣＳＦを測定するのみであるので、被検者の生体内の状態を正確に反映しているとはいえない点、などの問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、慢性関節リウマチは、その患者人口の多さ、社会的意義の大きさ（患者のＱＯＬ；Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）などから、適切な治療のための薬剤投与計画や、疾患活動性の把握を可能にする診断法が望まれている。しかし、そのような診断法は未だに報告されていない。本発明は、以上の現状に鑑みてなされたものであり、その目的は、特に、慢性関節リウマチの疾患活動性を感度よくかつ特異的に診断するのに有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
周知のごとく、生体の免疫担当細胞としては、単球、マクロファージ、顆粒球、リンパ球等の白血球があり、これらの細胞は血液中や各臓器、器官において免疫監視を行うとともに、各種の免疫反応において様々な役割を担って活動している。一般に、各種の疾患や、悪性腫瘍においては、多様な免疫反応によって、上記の細胞の機能が抑制されたり、または増強されたりすることが知られている。そこで、これらの細胞の機能を調べることによって、生体の免疫機能を把握することが可能となり、種々の病態の把握や薬剤の投与タイミングの決定など治療の指針となる情報を提供することができる。
【００１０】
慢性関節リウマチでも、関節局所に集まった好中球などの白血球が、ＲＡの関節炎にどのように関連しているかについて、骨破壊の面からの研究が多い。Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ら（Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．，６２巻、２７１ページ、１９６５年）は、ＩｇＧとＲＦからなる免疫複合体を貪食した関節液中の好中球から、ライソゾーム酵素が放出され、軟骨が破壊されることを述べた。Ｚｖａｉｆｌｅｒら（Ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ９ｔｈ， Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， ４１７ページ、１９７９年）も、滑膜組織に浸潤したリンパ球がＲＦを産生し、ＩｇＧと免疫複合体を形成し、これを好中球が貪食し、ライソゾーム酵素、活性酸素、プロスタグランディンを放出して、骨破壊をもたらすと述べた。このように、関節液中の好中球などの白血球が産生する各種酵素類は、関節の軟骨および骨破壊に主要な役割を演じている。
【００１１】
しかし、リウマチの活動性をＲＦとＩｇＧとの免疫複合体との反応の結果、遊離される白血球由来の酵素で診断する方法に関する報告は少ない。本発明者らは、鋭意研究の結果、後述のような作用機序により、慢性関節リウマチでの炎症の程度および疾患活動性を、患者自身の細胞機能、すなわちミエロペルオキシダーゼ放出能で定量的に診断できること、その診断のための測定方法及び測定試薬を見い出した。
【００１２】
すなわち、請求項１記載の発明（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）は、リウマトイド因子に対する抗原に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００１３】
すなわち、本発明１は、インビトロの系に於いて、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる。血液としてＲＡ患者由来の血液のように、血液中にＲＦが含まれていれば、この操作により、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体が形成される。すなわち、本発明１は、血液中のＲＦとＲＦに対する抗原とを反応させて免疫複合体を形成させる。この反応系に共存している血液中の白血球は、上記免疫複合体のＦｃ部分により、その表面上のレセプターが活性化され、速やかにミエロペルオキシダーゼ等のライソゾーム酵素を放出する。本発明１ではこのミエロペルオキシダーゼの放出量を測定する。すなわち、本発明１によると、このように、生体組織内でのインビボ免疫応答を、簡便なインビトロアッセイ系に適用することが可能となった。
【００１４】
また、ミエロペルオキシダーゼは、他のペルオキシダーゼと同様、プロトヘムを補欠分子族として含む酵素であり、主に好中球等骨髄系の白血球から産生されるものであり、他のエラスターゼ、コラゲナーゼに比べて好中球に特異性が高いものである。
【００１５】
本発明１は、上記のように、インビトロの系で形成された免疫複合体により、白血球のミエロペルオキシダーゼの放出を誘導し、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することにより、慢性関節リウマチの疾患活動性をより正確に把握することのできる、正確かつ簡便な診断方法に有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法を提供するものである。
【００１６】
以下、本発明１を詳細に説明する。
本発明１でいう、ＲＦに対する抗原とは、ＲＦと抗原抗体反応性を有し、免疫複合体を形成するものであれば、特に限定されない。ＲＦに対する抗原としては、抗原の成分にＲＦとの反応性を獲得せしめたものが挙げられる。上記抗原の成分としては血液中のグロブリン画分が挙げられる。上記グロブリン画分は、動物血清から調製されたものでも、あるいは、細胞融合法によって作成されたモノクローナル抗体でもかまわない。上記グロブリン画分としては、その産生種は特に限定されず、例えば、ヒトやウサギなどが挙げられる。上記グロブリン画分としては、例えば、ガンマグロブリンやＩｇＧが挙げられる。上記グロブリン画分としては、特に、ＲＦ検出用の免疫診断試薬で実績のある、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００１７】
上記抗原の成分にＲＦとの抗原抗体反応性を獲得せしめる方法としては、通常行われているような、抗原の成分を熱処理する方法、酵素処理する方法など、ＲＦとの抗原抗体反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。
【００１８】
本発明１において、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる際の、血液としては、全血又はその希釈液が使用される。全血を希釈する場合には、例えば、リン酸緩衝液、ハンクス緩衝液、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の通常の培地のいずれも使用できる。従って、本発明１においては、血液より単球や好中球を分離する必要がなく、それに伴う操作や処理時間は不要である。またそれらの操作、処理時間などによる細胞の活性低下、または不要な活性化が惹起される問題もない。
【００１９】
また、本発明１では、検査に必要とされる血液量も非常に少なくて済み、被採血者の負担も軽減される。また、上記のように、全血またはその希釈液を用いるため、血液中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が、生体内と同様に働き、より正確に生体内の免疫機能を把握することができる。
【００２０】
また、本発明１では、検査に必要とされる血液の採取は常法に従い、血液凝固を起こさせない任意の方法で実施できる。例えばヘパリン採血、クエン酸採血等が挙げられる。ただし、ミエロペルオキシダーゼの放出は、細胞の生物学的反応であるため、血液や培地中のカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどをキレートしないヘパリン採血などがより好ましい。
【００２１】
本発明１において、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させる際の反応は、プレートや試験管などの容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが、ミエロペルオキシダーゼの放出には望ましく、個々の血液サンプルの慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能を生体に近い状態で把握し易くする。上記反応温度は、通常３７℃付近の温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行い得る。
【００２２】
本発明１において、放出されたミエロペルオキシダーゼの測定には、請求項６記載の測定方法（詳細後述）を用いるのが、正確且つ簡便であるが、各種の酵素測定法、代表的には比色定量法、化学発光法等でも行い得る。
【００２３】
本発明１の好ましい一実施形態を挙げると、グロブリン画分、例えば、ヒトガンマグロブリンを熱変性させてＲＦとの反応性を獲得せしめる。これに、リウマチ患者血清を全血のまま、または希釈して所定量を加える。これにより、熱変性グロブリンとＲＦとが反応して免疫複合体が形成される。次いで、反応溶液中の免疫複合体を貪食しようとした白血球表面に、免疫複合体が強く付着し、白血球からミエロペルオキシダーゼが放出される。このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００２４】
請求項３記載の発明（以下、請求項３記載の発明を本発明３という）は、不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００２５】
以下、本発明３を詳細に説明する。
本発明３で使用される、ＲＦに対する抗原の成分は、本発明１で使用される抗原の成分と同様である。本発明３で使用されるＲＦに対する抗原の成分としては、本発明１と同様の理由で、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。本発明３では、上記抗原の成分が不溶性担体に固定化されていることにより、ＲＦとの抗原抗体反応性が獲得せしめられている。従って、患者由来の血液のように血液中にＲＦが存在すれば、不溶性担体に固定化された抗原の成分と反応して免疫複合体が形成される。そして、血液中の白血球は、上記免疫複合体を貪食しようとするが、免疫複合体が不溶性担体上に固定化されているため、貪食は困難となり、速やかにミエロペルオキシダーゼなどのライソゾーム酵素を放出する。本発明３では、このように、不溶性担体を用いることにより、生体組織内でのインビボ免疫応答を、簡便なインビトロアッセイ系に適用することが可能となった。
【００２６】
本発明３は、上記のように、形成された免疫複合体により、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導し、該ミエロペルオキシダーゼの産生量を測定することにより、慢性関節リウマチの疾患活動性をより正確に把握することのできる、正確かつ簡便な慢性関節リウマチの診断方法として有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法を提供するものである。
【００２７】
本発明３で使用される不溶性担体は、その表面にＲＦに対する抗原の成分を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。例えば、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれる高分子材料が挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。不溶性担体の形状としては、例えば、ラテックス、ビーズ、プレート、チューブなどが挙げられる。不溶性担体としては、特に、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス、またはプラスチックビーズ、プラスチックプレート、プラスチックチューブなどのプラスチック成型品が好適に使用される。
【００２８】
ＲＦに対する抗原の成分を不溶性担体に固定化する方法としては、ＲＦとの反応性を低下させない方法ならば、とくに限定されない。たとえば、疎水性表面を有する不溶性担体には、疎水性相互作用による物理吸着法が、迅速かつ簡便に多量のＲＦに対する抗原の成分を固定化する方法として好適である。また酵素処理したＲＦに対する抗原の成分を安定に、固定化するために、化学結合法なども好適である。
【００２９】
本発明３において、ＲＦに対する抗原に血液を接触させる際の、血液としては、全血又はその希釈液が使用される。全血を希釈する場合には、例えば、本発明１で述べたものと同様のものが使用できる。従って、本発明３においても血液より単球や好中球を分離する必要がなく、それに伴う操作や処理時間は不要である。またそれらの操作、処理時間などによる細胞の活性低下、または不要な活性化が惹起される問題もない。
【００３０】
また、本発明３でも、本発明１と同様に、検査に必要とされる血液量も非常に少なくて済み、被採血者の負担も軽減される。また、上記のように、全血またはその希釈液を用いるため、血液中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が、生体内と同様に働き、より正確に生体内の免疫機能を把握することができる。
【００３１】
また、検査に必要とされる血液の採取方法も、本発明１で述べた方法と同様である。
【００３２】
本発明３において、ＲＦとそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させる際の反応は、本発明１と同様に、プレートや試験管などの容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが、ミエロペルオキシダーゼの放出には望ましく、個々の血液サンプルの慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能を生体に近い状態で把握し易くする。上記反応温度は、通常３７℃付近の温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行いうる。
【００３３】
本発明３において、放出されたミエロペルオキシダーゼの測定方法は、本発明１と同様である。
【００３４】
本発明３の好ましい一実施形態を挙げると、グロブリン画分、例えば、ヒトガンマグロブリン溶液をプラスチックプレートに固定化させる。これに、リウマチ患者血液を全血のまま、または希釈して所定量を加える。これにより、固定化されたヒトグロブリンとＲＦとが反応して免疫複合体が形成される。次いで、プレート上に形成された免疫複合体を貪食しようとした白血球が、不溶性担体に強く付着し、ミエロペルオキシダーゼが放出される。このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００３５】
請求項６記載の発明（以下、請求項６記載の発明を本発明６という）は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で放出されたミエロペルオキシダーゼを、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体と抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法である。
【００３６】
以下、本発明６を詳細に説明する。
本発明６で使用される抗ミエロペルオキシダーゼ抗体は、少なくとも一種類以上の抗ミエロペルオキシダーゼポリクローナル抗体または抗ミエロペルオキシダーゼモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体の精製方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、もしくはプロテインＡのような群特異的吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、または精製ミエロペルオキシダーゼを担体ゲルに固定化したものを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の方法が挙げられ、これらを単独あるいはいくつかを組み合わせた方法が挙げられる。
【００３７】
上記抗体としては、通常の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体分子だけでなく、上記抗体分子をペプシンやパパイン等のタンパク質分解酵素で処理しＦｃフラグメントを除いた、ＦａｂやＦ（ａｂ’）分子も使用できる。抗体として、ＦａｂやＦ（ａｂ’）分子を用いると、抗体を不溶性粒子に固定化する際、又は担体ゲルを用いてアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製する際などに、不溶性粒子や担体ゲルに結合した抗体分子に不純物が抗原抗体反応以外の相互作用により結合することが防止される。
【００３８】
本発明６で使用される不溶性粒子は、その表面に抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。上記高分子材料としては、合成高分子でも、天然高分子でもよい。また、有機高分子でも、無機高分子でもよい。合成高分子からなる不溶性粒子の例としては、ポリスチレン粒子、スチレン系共重合体粒子、ナイロン粒子、ポリアクリルアミド粒子等が挙げられる。無機高分子からなる不溶性粒子の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル粒子等が挙げられる。天然高分子からなる不溶性粒子の例としては、架橋デキストラン、架橋アガロース等のゲルが挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。また、これらを組み合わせた粒子も使用可能であり、例えば、アクリルアミドとアガロースを組み合わせた粒子、アクリルアミドとデキストラン誘導体を組み合わせた粒子などが挙げられる。また、高分子材料以外の粒子としては、金属粒子も使用可能である。これらの不溶性粒子の中で、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス粒子が特に好適である。
【００３９】
本発明６の測定方法において、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を不溶性粒子に固定化する方法としては、固定化によって抗ミエロペルオキシダーゼ抗体のミエロペルオキシダーゼに対する反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。例えば、不溶性粒子が疎水性表面を有する場合には、疎水性相互作用による物理吸着法が、迅速かつ簡便に多量の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を固定できるので好適である。また、不溶性粒子上に官能基が存在する場合（不溶性粒子分子そのものが官能基を有する場合、又は不溶性粒子分子に官能基が導入された場合がある）には、該官能基と抗体分子中の官能基とを適当な架橋剤を用いて架橋し、共有結合により固定化させる化学結合法なども好適である。
【００４０】
本発明６の測定方法は、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとを抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定する。換言すると、この方法では、不溶性粒子に抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されているので、各粒子上の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとが抗原抗体反応すると、ミエロペルオキシダーゼを介して不溶性粒子同士が結合し不溶性粒子が大きくなり凝集する。この凝集の度合いは、ミエロペルオキシダーゼの量と正の相関をするので、凝集の度合いを検出することによりミエロペルオキシダーゼ量を検出できる。
【００４１】
上記の抗原抗体反応の温度は、通常３７℃付近の生理的温度条件下で行われるが、１５℃から４２℃の範囲でも行い得る。
【００４２】
生じた凝集の度合いを検出する方法としては、例えば、光学的に測定する方法又は目視観察する方法が挙げられる。
【００４３】
上記の測定系としては、不溶性粒子としてラテックス粒子を使用した系が特に好適である。
【００４４】
また、本発明６の方法で用いられるミエロペルオキシダーゼを含む検体としては、本発明１〜５の測定方法により得られた血液成分であり、具体的には、血液成分から血球成分を除去した血漿、血清又はそれらの希釈液が使用される。
【００４５】
また、本発明６の方法では、測定に必要とされる検体量が少なくて済むので、本発明１〜５の測定方法に用いられる血液の量も少なくて済み、例えば、慢性関節リウマチの診断のための被検者の負担も軽減される。
【００４６】
本発明６は、上記のように、正確かつ簡便な慢性関節リウマチの診断方法として有用な慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法によって、放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定する方法を提供するものである。
【００４７】
本発明６の好ましい一実施形態を挙げると、例えば、ウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体をポリスチレンラテックスに固定化させる。これに、本発明１〜５の方法により、ミエロペルオキシダーゼを放出させたリウマチ患者血液の血清または血漿をそのまま、又は希釈して所定量を加える。ミエロペルオキシダーゼとそれに対する抗体との抗原抗体反応の結果、形成された凝集塊を検出することにより、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を測定する。その結果より、慢性関節リウマチによる炎症の程度を把握することができる。
【００４８】
請求項７記載の発明（以下、請求項７記載の発明を本発明７という）は、リウマトイド因子に対する抗原又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分、及び抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子からなることを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬である。
【００４９】
本発明７で用いられるリウマトイド因子に対する抗原は、本発明１の説明において述べたものと同様であり、具体的には、ＲＦと抗原抗体反応性を有し、免疫複合体を形成するものであれば、特に限定されない。ＲＦに対する抗原としては、抗原の成分にＲＦとの反応性を獲得せしめたものが挙げられる。上記抗原の成分としては血液中のグロブリン画分が挙げられる。上記グロブリン画分は、動物血清から調製されたものでも、あるいは、細胞融合法によって作成されたモノクローナル抗体でもかまわない。上記グロブリン画分としては、その産生種は特に限定されず、例えば、ヒトやウサギなどが挙げられる。上記グロブリン画分としては、例えば、ガンマグロブリンやＩｇＧが挙げられる。上記グロブリン画分としては、特に、ＲＦ検出用の免疫診断試薬で実績のある、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００５０】
上記抗原の成分にＲＦとの抗原抗体反応性を獲得せしめる方法としては、通常行われているような、抗原の成分を熱処理する方法、酵素処理する方法など、ＲＦとの抗原抗体反応性を低下させない方法ならば、特に限定されない。
【００５１】
本発明７で用いられるリウマトイド因子に対する抗原の成分としては、本発明３の説明において述べたものと同様であり、具体的には、ウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００５２】
本発明７で用いられる不溶性担体は、本発明３の説明において述べたものと同様であり、具体的には、その表面にＲＦに対する抗原の成分を固定化し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能基を有するものなどいずれでもよく、特に制限はない。好適な材料は、疎水性材料または表面に官能基を有する高分子材料である。例えば、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれる高分子材料が挙げられる。また、タンニン酸で処理した赤血球なども使用可能である。不溶性担体の形状としては、例えば、ラテックス、ビーズ、プレート、チューブなどが挙げられる。不溶性担体としては、特に、工業的に安定した品質で大量生産しうるラテックス、またはプラスチックビーズ、プラスチックプレート、プラスチックチューブなどのプラスチック成型品が好適に使用される。
【００５３】
本発明７では、不溶性担体に固定化されたＲＦに対する抗原の成分が使用される。上記抗原の成分を不溶性担体に固定化する方法としては、本発明３の説明で述べた方法と同様であり、例えば、物理吸着法や化学結合法が使用できる。
【００５４】
本発明７で用いられる、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子において、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体及び不溶性粒子としては、本発明６の説明で述べたものと同様である。
【００５５】
本発明７で用いられる、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子は、ミエロペルオキシダーゼと抗原抗体反応するが、それにより凝集するものが好ましい。特に、上記凝集の度合いがミエロペルオキシダーゼの量と正の相関をするものが好ましく、その場合は、その凝集の度合いを検出することによりミエロペルオキシダーゼ量を定量できる。請求項８記載の発明（請求項８記載の発明を本発明８という）においては、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子の作用として、ミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による凝集現象を利用してミエロペルオキシダーゼ量を検出するものに限定される。このような作用をする抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子の例としては、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子が挙げられる。
【００５６】
本発明７の測定試薬の使用方法は、リウマトイド因子に対する抗原（例えば、ヒトガンマグロブリンを熱変性させてＲＦとの反応性を獲得せしめたもの）又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分に、リウマチ患者血清を全血のまま、または希釈して所定量を加え、該抗原又は不溶性担体に固定化された抗原の成分とＲＦとを反応させて免疫複合体を形成させ、次いで、血液中の共存する白血球からミエロペルオキシダーゼを放出せしめる。次いで、放出されたミエロペルオキシダーゼを含む血液（血漿）と抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子を接触させて、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとを抗原抗体反応させ、その反応量から放出されたミエロペルオキシダーゼの量を測定する。この場合、本発明８の測定試薬の場合は、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による不溶性粒子の凝集の度合いを検出することにより、放出されたミエロペルオキシダーゼの量を定量する。以上のようにして測定される、放出されたミエロペルオキシダーゼの量は、慢性関節リウマチによる疾患活動性と相関するので、本発明７又は８の試薬は、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定に有用である。
【００５７】
（作用）
上記のように、本発明１及び２によれば、ＲＦに対する抗原と患者血液中のリウマトイド因子が結合し、形成された免疫複合体が好中球などの白血球を活性化させてミエロペルオキシダーゼが放出される。このような方法で放出されたミエロペルオキシダーゼは、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をよく反映するマーカーとなるため、このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、被採血者のリウマチの疾患活動性を正確に定量的に測定することができる。
【００５８】
上記のように、本発明３〜５によれば、不溶性担体に固定化されたＲＦに対する抗原の成分と患者血液中のリウマトイド因子が結合し、形成された免疫複合体が好中球を活性化させてミエロペルオキシダーゼが放出される。このような方法で放出されたミエロペルオキシダーゼは、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をよく反映するマーカーとなるため、このミエロペルオキシダーゼ量を測定することにより、被採血者のリウマチの疾患活動性を正確に定量的に測定することができる。
【００５９】
上記のように、本発明６によれば、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で放出されたミエロペルオキシダーゼを、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体と抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定するので、放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定することができる。
【００６０】
上記のように、本発明７によれば、リウマトイド因子に対する抗原又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分と、リウマチ患者血清等と接触させ、血液中の白血球からミエロペルオキシダーゼを放出せしめ、該ミエロペルオキシダーゼ量を、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子との反応量によって求めるので、リウマチ患者等のリウマチの疾患活動性を簡便に且つ正確に測定することができる。
【００６１】
上記のように、本発明８によれば、本発明７と同様にして放出されたミエロペルオキシダーゼ量を、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体とミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応による不溶性粒子の凝集の度合いを検出することにより定量するので、リウマチ患者等のリウマチの疾患活動性を、より一層、簡便に且つ正確に測定することができる。
【００６２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
（実施例１〜１０、比較例１〜１０）
実施例１〜１０は、熱変性グロブリンとＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００６３】
Ｉ．試薬および材料
実施例１〜１０、比較例１〜１０で使用した試薬および材料は以下の通りである。
グロブリン（抗原の成分）：ウサギＩｇＧ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、Ｃａｐｐｅｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、１９．０ｍｇ／ｍｌ ）を用いた。
ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス血液：多発性関節炎を自然発症したＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（以下ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスと略す、３０週令、雄性）から採取した血液を用いた。
正常マウス血液：ＩＣＲ マウス（３０週令、雄性）から採取した血液を用いた。
グロブリン希釈用緩衝液：５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ （ｐＨ８．４０）をグロブリン希釈用緩衝液として用いた。
血液希釈用緩衝液：１３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４と２３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４ を混合してｐＨを６．５０に調整し、ＮａＣｌ濃度を１４０ｍＭ に調整したもの（以下Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳと略す）にウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を ５％（ｗ／ｖ ）になるように添加したものを血液希釈用緩衝液として用いた。
【００６４】
ブロッキング用緩衝液：ＰＢＳにウシ血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ ）になるように添加したものを用いた。
ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液：０．１Ｍ ＭｃＣｉｌｖｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ５．７ ）にＤＡ−６７ （和光純薬、試薬特級）を０．１ｍＭ になるように溶解したもの９９ｍｌに、２ ％Ｈ２Ｏ２を１ｍｌ 添加したものを基質溶液とした。なお、ＤＡ−６７ とは、１０−（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）−３，７−ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔのことである。
ＲＦ測定用試薬：血清中のＲＦ測定用ＴＩＡ試薬（オートＴＩＡ ＲＦＩＩ「ニッスイ」、日水製薬社製）を用いた。
プラスチックプレート：Ｎｕｎｃ社製のＥＩＡ （酵素免疫測定法）用プラスチックプレート（９６ウエル、平底、ポリスチレン製）を用いた。
【００６５】
ＩＩ． 方法
（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼抗原の成分であるグロブリンの溶液を３５℃で２時間インキュベートすることにより、グロブリンを熱変性してグロブリンにＲＦとの抗原性を獲得させた。この熱変性グロブリンを、グロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈した。
▲２▼熱変性グロブリンの吸着を回避できる容器としてプラスチックプレートを以下に示す方法で表面処理したものを反応容器として用いた。各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、ウェル中の溶液を吸引除去した。次に、ＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００６６】
▲３▼上記▲１▼で得られた１０倍希釈熱変性グロブリン溶液をウェルに１００μｌ 添加し、次いでマウス血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、１０倍希釈熱変性グロブリン溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加したウェルも用意し、同様に処理した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００６７】
▲６▼ＭＰＯ 測定用基質溶液２ｍｌを石英セル中で３７℃でインキュベートしながら、上記▲５▼で得られた上清５０μｌ を添加した。上清添加５分後の６６６ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６６ ）を測定した。そして、検体の上清を用いて得られたＯＤ６６６ の測定値から、ブランクの上清を用いて得られたＯＤ６６６ の測定値を差し引いた値をその検体の反応量とした。
▲７▼上記▲５▼で得られた検体の上清の代わりに、既知濃度のＭＰＯのＰＢＳ溶液を用いて、上記▲６▼の操作を行って予め検量線を作成しておき、上記▲６▼で得られた検体の反応量（ＯＤ６６６ ）を上記検量線に当てはめて、検体中のＭＰＯ量を算出した。
【００６８】
（２）疾患活動性の判定
マウスの慢性リウマチ関節炎の疾患活動性を判定するために、四肢の指関節の変形度や尻尾関節の変形度などを総合的に判断して、関節炎の重篤度を以下の＋１から＋５までに分類した。
＋１：尻尾の動きが固い。
＋２：尻尾がやや変形している。
＋３：尻尾がかなり変形している。
＋４：手足の爪がはがれ、出血のあとがある。
＋５：毛並みがあれている。
【００６９】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例１〜１０
多発性関節炎を自然発症したＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例（各個体をＭ−１、Ｍ−２、Ｍ−３、Ｍ−４、Ｍ−５とする）および正常マウス５例（各個体をＮ−１、Ｎ−２、Ｎ−３、Ｎ−４、Ｎ−５とする）から血液を採取したものを検体として、上記ＩＩ． の（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、熱変性グロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量を測定した。また、上記ＩＩ． の（２）疾患活動性の判定に従って、上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例の関節炎の重篤度の観察を行った。上記のミエロペルオキシダーゼ量の測定および関節炎の重篤度の観察は、上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの関節炎の発症前後の４週間にわたり、１週間毎に行った（すなわち、採血日及び観察日は、０、７、１４、２１日目）。この測定結果を表１に示した。なお、表１の関節炎の重篤度の欄の−は、関節炎の徴候が何ら見られなかったことを示す。また、表１及び後述の表２、３において、マウス欄にＭＲＬと示したものは、ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのことである。
【００７０】
【表１】
（２）比較例１〜１０
上記のＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例について、実施例１〜１０のミエロペルオキシダーゼ量の測定および関節炎の重篤度の観察と同じ時期に、血液を採取し、その血清中のＲＦ量をＲＦ測定用試薬を用いて測定した。この測定結果を表２に示した。
【００７２】
【表２】
また、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの５例について、表１に示したミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を図１に、関節炎の重篤度の経時的変動を図２に、および表２に示したＲＦ値の経時的変動を図３に示した。
【００７４】
表１および表２、図１〜３から明らかなように、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量および変動状況は、肉眼観察による関節炎の症状の重篤度および変動状況とよく一致し、これに対して血清中のＲＦの測定値は症状の重篤度と必ずしも一致しなかった。
【００７５】
また、実施例の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて１．０ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２２．５〜１８０．３ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
一方、比較例の結果から明らかなように、ＲＦの測定値は、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２２．５〜１２０．６ＩＵ／ｍｌを示したが、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群でも、ＲＦの測定値は１１．５から７５．９ＩＵ／ｍｌ と広範な値を示しており、ＲＦによる診断方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性があることが分かる。
【００７６】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【００７７】
（実施例１１〜２０）
実施例１１〜２０は、プラスチックプレートに固定化されたグロブリンとＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）測定用基質溶液とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００７８】
Ｉ．試薬および材料
実施例１１〜２０で使用した試薬および材料は、実施例１〜１０で使用したものと同様である。
【００７９】
ＩＩ． 方法
（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼グロブリンのプラスチックプレートへの固定化操作
抗原の成分であるグロブリンの溶液をグロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈し、プラスチックプレートの各ウェルに１００μｌ ずつ添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。
▲２▼各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。次にＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００８０】
▲３▼マウス血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、グロブリンの溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加して上記▲１▼及び▲２▼と同様に操作して得られたプラスチックプレートのウェルにも上記の検体を２００μｌ 添加した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００８１】
▲６▼ＭＰＯ 測定用基質溶液２ｍｌを石英セル中で３７℃でインキュベートしながら、上記▲５▼で得られた上清５０μｌ を添加した。上清添加５分後の６６６ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６６ ）を測定した。そして、グロブリンの溶液を固定化したウエルを用いて得られた検体の上清のＯＤ６６６ の測定値から、ブランクのグロブリン希釈用緩衝液を固定化したウエルを用いて得られた検体の上清のＯＤ６６６ の測定値を差し引いた値をその検体の反応量とした。
▲７▼上記▲５▼で得られた検体の上清の代わりに、既知濃度のＭＰＯのＰＢＳ溶液を用いて、上記▲６▼の操作を行って予め検量線を作成しておき、上記▲６▼で得られた検体の反応量（ＯＤ６６６ ）を上記検量線に当てはめて、検体中のＭＰＯ量を算出した。
【００８２】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例１１〜２０
上記実施例１〜１０の試験に用いた、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス５例および正常マウス５例から血液を採取したものと同一の血液を検体として、上記ＩＩ． の（１）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、不溶性担体に固定化されたグロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量を測定した。この測定結果を表３に示した。
【００８３】
【表３】
また、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの５例について、表３に示したミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を図４に示した。
【００８５】
表１及び３、図２及び４から明らかなように、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量および変動状況は、肉眼観察による関節炎の症状の重篤度および変動状況とよく一致した。
【００８６】
また、表３から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて１．０ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、ＭＲＬ／ｌｐｒ マウス群で慢性関節リウマチを発症しているものは、２５．２〜１１０．４ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常マウス群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【００８７】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、慢性関節リウマチの疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【００８８】
（実施例２１〜４０、比較例１１〜３０）
実施例２１〜４０は、熱変性グロブリンと抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【００８９】
Ｉ． 試薬および材料
実施例２１〜４０、比較例１１〜３０で使用した試薬および材料は以下の通りである。
ラテックス：粒径０．４００ μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％、積水化学工業社製）を用いた。
ラテックス懸濁用緩衝液：１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ と１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ をｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ 、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ． 社製）を１ ％（Ｗ／Ｖ） になるように添加したものをラテックス懸濁用緩衝液として用いた。
グロブリン希釈用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
【００９０】
抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体：ウサギの抗血清から精製されたウサギ抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体（Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｄｅ Ｎｏ．Ａ３９８ ＤＡＫＯ 社製、７．６ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
ブロッキング用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
グロブリン（抗原の成分）：実施例１〜１０と同様。
【００９１】
慢性関節リウマチ患者血液：慢性関節リウマチ患者から採取した血液を用いた。
健常人血液：健常人から採取した血液を用いた。
血液希釈用緩衝液：実施例１〜１０と同様。
ＲＦ測定用試薬：実施例１〜１０と同様。
プラスチックプレート：実施例１〜１０と同様。
【００９２】
測定用希釈液（Ｒ１液）：ラテックス懸濁用緩衝液に、ポリエチレングリコール ６０００ （平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３％（Ｗ／Ｖ） になるように添加したものを測定用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【００９３】
ＩＩ． 方法
（１）ラテックス試薬の調製
抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体を、タンパク濃度が２５０μｇ／ｍｌになるようにグロブリン希釈用緩衝液で希釈し、抗体感作液とした。ラテックス１００μｌ に、２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで撹拌しながら、抗体感作液９００μｌ を素早く添加し、２５℃にて１ 時間撹拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて１ 時間撹拌した。その後、１５℃、１５０００ ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にラテックス懸濁用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にラテックス懸濁用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく撹拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．５％のラテックス試薬とした。このようにして調製したラテックス試薬を４℃にて保存した。
【００９４】
（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼抗原の成分であるグロブリンの溶液を３５℃で２時間インキュベートすることにより、グロブリンを熱変性してグロブリンにＲＦとの抗原性を獲得させた。この熱変性グロブリンを、グロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈した。
▲２▼熱変性グロブリンの吸着を回避できる容器としてプラスチックプレートを以下に示す方法で表面処理したものを反応容器として用いた。各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、ウェル中の溶液を吸引除去した。次に、ＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【００９５】
▲３▼上記▲１▼で得られた１０倍希釈熱変性グロブリン溶液をウェルに１００μｌ 添加し、次いでヒト血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、１０倍希釈熱変性グロブリン溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加したウェルも用意し、同様に処理した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【００９６】
▲６▼ミエロペルオキシダーゼの測定は、汎用自動分析装置７１５０型（日立製作所社製）を用いて行った。▲１▼で得られた固形分０．５％のラテックス試薬をラテックス懸濁用緩衝液で４倍に希釈し、Ｒ２液（固形分０．１２５％）とした。測定条件は以下の通りである。
検体容量 ２０μｌ
希釈液（Ｒ１液） ３５０μｌ
試薬（Ｒ２液） ５０μｌ
測定波長 ５７０ｎｍ
測定温度 ３７℃
試薬（Ｒ２液）を添加してから８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度の差（△ＯＤ５７０ ）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを測定値とした。検体の上清の代わりに、既知濃度のミエロペルオキシダーゼのＰＢＳ溶液を用いて同様の測定を行い、予め検量線を作成しておき、上清検体の測定値を上記検量線に当てはめて、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を算出した。
【００９７】
（３）疾患活動性の判定
慢性関節リウマチ患者の疾患活動性を判定するために、血液採取と同時期に、慢性関節リウマチ各患者のランスバリー指数をその患者の疾患活動度とした。ランスバリー指数とは、▲１▼朝のこわばり時間、▲２▼握力、▲３▼血沈値、▲４▼腫脹および疼痛関節点数の４項目を測定し、この実測値を指数換算表より％に換算して、その合計で疾患活動度を評価するものである。
【００９８】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例２１〜４０
慢性関節リウマチ患者１０例（各個体をＲ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｒ−４、Ｒ−５、Ｒ−６、Ｒ−７、Ｒ−８、Ｒ−９、Ｒ−１０とする）および健常人１０例（各個体をＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９、Ｈ−１０とする）から血液を採取したものを検体として、上記ＩＩ． の（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、熱変性グロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量をラテックス測定試薬を用いて測定した。また、上記ＩＩ． の（３）疾患活動性の判定に従って、上記の慢性関節リウマチ患者１０例のランスバリー指数を測定した。この測定結果を表４に示した。なお、表４のランスバリー指数の欄の−は、慢性関節リウマチの徴候が何ら見られなかったことを示す。また、表４及び後述の表５、表６のヒト種類欄のＲＡは、慢性関節リウマチ患者を表す。
【００９９】
【表４】
（２）比較例１１〜３０
上記の慢性関節リウマチ患者１０例および健常人１０例について、実施例２１〜４０のミエロペルオキシダーゼ量の測定およびランスバリー指数の測定と同じ時期に血液を採取し、その血清中のＲＦ量をＲＦ測定用試薬を用いて測定した。この測定結果を表５に示した。
【０１０１】
【表５】
また、慢性関節リウマチ患者１０例について、表４に示したランスバリー指数とミエロペルオキシダーゼ量との相関を図５に、表４に示したランスバリー指数と表５に示したＲＦ量との相関を図６に示した。
【０１０３】
表４および表５、図５および図６から明らかなように、慢性関節リウマチの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量は、疾患活動度を示すランスバリー指数と正の相関を示し、これに対して血清中のＲＦの測定値はランスバリー指数との相関が悪かった。
【０１０４】
また、実施例の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて５．５ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、慢性関節リウマチを発症している患者のものは、３１３ 〜７９５ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【０１０５】
一方、比較例の結果から明らかなように、ＲＦの測定値は、慢性関節リウマチを発症しているものは、８７．３〜６１３ＩＵ／ｍｌを示したが、慢性関節リウマチを発症していない正常群でも、ＲＦの測定値は１１．０〜１１０ＩＵ／ｍｌと広範な値を示しており、ＲＦによる診断方法であると慢性関節リウマチを発症していない健常者を誤って陽性と判断する危険性があることが分かる。
【０１０６】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【０１０７】
（実施例４１〜６０）
実施例４１〜６０は、プラスチックプレートに固定化されたグロブリンと抗ヒトミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化されたラテックス粒子とからなる、慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬を用いた実施例である。
【０１０８】
Ｉ．試薬および材料
実施例４１〜６０で使用した試薬および材料は、実施例２１〜４０で使用したものと同様である。
【０１０９】
ＩＩ． 方法
（１）ラテックス試薬の調製
実施例２１〜４０と全く同様にしてラテックス試薬を調製した。
（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定
▲１▼グロブリンのプラスチックプレートへの固定化操作
抗原の成分であるグロブリンの溶液をグロブリン希釈用緩衝液で１０倍希釈し、プラスチックプレートの各ウェルに１００μｌ ずつ添加した。２５℃で１時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。
▲２▼各ウェルにブロッキング用緩衝液を２００μｌ ずつ添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、各ウェル中の溶液を吸引除去した。次にＰＢＳを２００μｌ ずつ各ウェルに添加し、吸引除去した。以下この操作を３回繰り返した。この方法で得られたプラスチックプレートを反応容器として用いた。
【０１１０】
▲３▼ヒト血液（ヘパリン採血したもの）を血液希釈用緩衝液で１０倍希釈し、検体としてウェルに２００μｌ 添加した。ブランクとして、グロブリンの溶液の代わりにグロブリン希釈用緩衝液をウェルに１００μｌ 添加して上記▲１▼及び▲２▼と同様に操作して得られたプラスチックプレートのウェルにも上記の検体を２００μｌ 添加した。
▲４▼プラスチックプレートを３７℃で３時間インキュベートした。
▲５▼各ウェルの上清を採取した。ここで得られた上清を検体として以下の▲６▼の方法に用い、ミエロペルオキシダーゼ量の測定を行った。
【０１１１】
▲６▼ミエロペルオキシダーゼの測定は、汎用自動分析装置７１５０型（日立製作所社製）を用いて行った。▲１▼で得られた固形分０．５％のラテックス試薬をラテックス懸濁用緩衝液で４倍に希釈し、Ｒ２液（固形分０．１２５％）とした。測定条件は以下の通りである。
検体容量 ２０μｌ
希釈液（Ｒ１液） ３５０μｌ
試薬（Ｒ２液） ５０μｌ
測定波長 ５７０ｎｍ
測定温度 ３７℃
試薬（Ｒ２液）を添加してから８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度の差（△ＯＤ５７０ ）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを測定値とした。検体の上清の代わりに、既知濃度のミエロペルオキシダーゼのＰＢＳ溶液を用いて同様の測定を行い、予め検量線を作成しておき、上清検体の測定値を上記検量線に当てはめて、検体中のミエロペルオキシダーゼ量を算出した。
【０１１２】
（３）疾患活動性の判定
慢性関節リウマチ患者の疾患活動性を判定するために、慢性関節リウマチ各患者のランスバリー指数を測定した。
【０１１３】
ＩＩＩ．試験と結果
（１）実施例４１〜６０
上記実施例２１〜４０の試験に用いた、慢性関節リウマチ患者１０例および健常人１０例から血液を採取したものと同一の血液を検体として、上記ＩＩ． の（２）ミエロペルオキシダーゼの放出および測定に従って、不溶性担体に固定化されたグロブリンとの反応の結果、放出された血液中のミエロペルオキシダーゼ量をラテックス測定試薬を用いて測定した。この測定結果を表６に示した。
【０１１４】
【表６】
また、慢性関節リウマチ患者１０例について、表４に示したランスバリー指数と表６に示したミエロペルオキシダーゼ量との相関を図７に示した。
表６および図７から明らかなように、慢性関節リウマチの血液を用いて得られたミエロペルオキシダーゼの量は、疾患活動度を示すランスバリー指数と正の相関を示した。
【０１１６】
また、表６の結果から明らかなように、慢性関節リウマチを発症していない正常群では、ミエロペルオキシダーゼの量は、すべて３．５ｎｇ／ｍｌ以下を示したが、慢性関節リウマチを発症している患者のものは、３１６ 〜６２２ｎｇ／ｍｌを示しており、この測定方法であると慢性関節リウマチを発症していない正常群を誤って陽性と判断する危険性がないことが分かる。
【０１１７】
以上の結果から、本発明の測定方法により測定されるミエロペルオキシダーゼ量は、従来の慢性関節リウマチのマーカーであるＲＦよりも、より疾患活動性を反映する優れたマーカーであることが確認された。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明１および２の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１１９】
特に、本発明２の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種であるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２０】
本発明３〜５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１２１】
特に、本発明４の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種であるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２２】
また、本発明５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法は、不溶性担体が、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれるので、慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確に測定および診断することが可能となる。
【０１２３】
本発明６の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法の構成は、上記の通りであり、本発明６を用いると、請求項１〜５の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法によって放出されたミエロペルオキシダーゼ量を正確かつ簡便に測定できるので、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をより簡便かつ、より的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに、より有益である。
【０１２４】
本発明７の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬の構成は、上記の通りであり、本発明７の測定試薬を用いると、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性を的確に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【０１２５】
本発明８の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬の構成は、上記の通りであり、本発明８の測定試薬を用いると、被採血者の血液を用いてミエロペルオキシダーゼ放出量を測定することによって、被採血者の慢性関節リウマチの疾患活動性をより的確かつ簡便に測定および診断することが可能になり、病態の把握、治療のための薬剤投与量、治療方法の決定などに有益である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた実施例１〜５のミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を示す図である。
【図２】実施例１〜５に使用されたＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの関節炎の重篤度の経時的変動を示す図である。
【図３】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた比較例１〜５のＲＦ値の経時的変動を示す図である。
【図４】ＭＲＬ／ｌｐｒ マウスの血液を用いて得られた実施例１１〜１５のミエロペルオキシダーゼ量の経時的変動を示す図である。
【図５】実施例２１〜３０により得られた慢性関節リウマチ患者のランスバリー指数とミエロペルオキシダーゼ量との相関を示す図である。
【図６】実施例２１〜３０により得られたランスバリー指数と比較例１１〜２０により得られたＲＦ量との相関を示す図である。
【図７】実施例２１〜３０により得られたランスバリー指数と実施例４１〜５０により得られたミエロペルオキシダーゼ量との相関を示す図である。
Claims (8)
- リウマトイド因子に対する抗原に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種である請求項１記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- 不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分に血液を接触させ、リウマトイド因子とそれに対する抗原からなる免疫複合体を形成させて、ミエロペルオキシダーゼの放出を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの放出量を測定することを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- リウマトイド因子に対する抗原の成分がウサギガンマグロブリン、ウサギＩｇＧ、ヒトガンマグロブリンおよびヒトＩｇＧより成る群から選ばれる少なくとも一種である請求項３記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- 不溶性担体が、清浄光学ポリスチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ニトロセルロースおよびシリコンオキサイドより成る群から選ばれる請求項３又は４記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- 放出されたミエロペルオキシダーゼを、不溶性粒子に固定化された抗ミエロペルオキシダーゼ抗体と抗原抗体反応させて該不溶性粒子を凝集させ、その凝集の度合いを検出することにより、該ミエロペルオキシダーゼ量を測定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法。
- リウマトイド因子に対する抗原又は不溶性担体に固定化されたリウマトイド因子に対する抗原の成分、及び抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子からなることを特徴とする慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬。
- 請求項７記載の抗ミエロペルオキシダーゼ抗体が固定化された不溶性粒子と、ミエロペルオキシダーゼとの抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを検出することを特徴とする請求項７記載の慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02773796A JP3618871B2 (ja) | 1995-10-24 | 1996-02-15 | 慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-275665 | 1995-10-24 | ||
| JP27566595 | 1995-10-24 | ||
| JP02773796A JP3618871B2 (ja) | 1995-10-24 | 1996-02-15 | 慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173336A JPH09173336A (ja) | 1997-07-08 |
| JP3618871B2 true JP3618871B2 (ja) | 2005-02-09 |
Family
ID=26365706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02773796A Expired - Lifetime JP3618871B2 (ja) | 1995-10-24 | 1996-02-15 | 慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3618871B2 (ja) |
-
1996
- 1996-02-15 JP JP02773796A patent/JP3618871B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09173336A (ja) | 1997-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barton et al. | Effects of iron on the absorption and retention of lead | |
| US5187065A (en) | Method and materials for detecting lyme disease | |
| Araujo et al. | Antigenemia in recently acquired acute toxoplasmosis | |
| JP2901296B2 (ja) | カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法 | |
| JP3554331B2 (ja) | 体液中のｌｂｐを定量する方法 | |
| Peichl et al. | Human neutrophil activating peptide/interleukin 8 acts as an autoantigen in rheumatoid arthritis. | |
| JP2012181211A (ja) | ヒトの体液中のターゲットを特定することにより疾病を高速に検出する方法 | |
| Torcal et al. | Immune response and in vivo production of cytokines in patients with liver hydatidosis | |
| Virella et al. | Soluble immune complexes in patients with diabetes mellitus: detection and pathological significance | |
| CA2113823A1 (en) | Method and kit for measuring endogenous cytokines | |
| Rajaei et al. | Evaluating the relationship between serum level of interleukin-6 and rheumatoid arthritis severity and disease activity | |
| US20230341392A1 (en) | Detection of antibodies to sars-cov2 | |
| EP2100122A2 (en) | Poly (ethylene glycol) anti-body detection assays and kits for performing thereof | |
| CN1623092A (zh) | 诊断方法 | |
| JPS6089755A (ja) | 診断用試薬及びその製造法並びにそれを用いる診断法 | |
| JP7081861B1 (ja) | ＬＩＰに基づいてＵＭＯＤを修飾した尿中のＮｅｕ５Ｇｃを識別する尿路上皮癌の検査用キット、およびその製造方法 | |
| JP3618871B2 (ja) | 慢性関節リウマチ特異的細胞性免疫能の測定方法及び測定試薬 | |
| KR101142434B1 (ko) | 조기양막파수 산모에서 비침습적인 양수 내 염증 및 감염의 예측 또는 진단 방법 | |
| JP3989837B2 (ja) | 抗ラミニン−１抗体の測定法およびその応用 | |
| Lai et al. | Neutrophil attractant protein-1/interleukin 8 and its autoantibodies in IgA nephropathy | |
| JP3998245B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| RU2323443C1 (ru) | Способ оценки эффективности лечения аутоиммунного тиреоидита | |
| RU2310851C1 (ru) | Способ диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей | |
| RU2137137C1 (ru) | Способ определения m.leprae у больных с регрессом заболевания | |
| JP2003502643A (ja) | アッセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20041020 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20041111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071119 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081119 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081119 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091119 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101119 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111119 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121119 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131119 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |