JP3554331B2 - 体液中のlbpを定量する方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本願発明は、血液試料を含む体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質(LBP)の存在を決定する方法に関する。
リポ多糖(LPS)は、グラム陰性細菌の外膜に存在する成分であり、グラム陰性細菌感染および内毒素血症に関連した多くの治療効果に関与している。細菌感染と敗血症との関連性から、疾患に伴う内毒素の血清/血漿レベルの相関付けが試みられてきた。内毒素が、物理的、比濁分析あるいは分光測光的に計測できる凝固カスケードを形成する、Limulus遊走細胞溶解物(LAL)分析を用いて内毒素レベルが計測されてきた。しかしながら、これら試みがされているにもかかわらず、内毒素レベルと敗血症の程度あるいは診断との間の信頼できる相関は未だ確立されいない。このことは、(i)敗血症患者の内毒素レベルが非常に低いこと(>10pg/L)、(ii)いくつかの血清タンパク質がタンパク質分解性LALカスケードに干渉すること、(iii)血液に一旦接触した内毒素が、高密度リポタンパク質(HDL)および低密度リポタンパク質(LDL)を含む様々な血液成分との相互作用によって「解毒」されること、および(iv)異なるグラム陰性生物からの内毒素のLALカスケードを誘発する能力が相異すること、によるものと思われる。よって、患者の血清中の内毒素の絶対レベルは、in vivoに存在する活性内毒素の実際の濃度とは相関しないものと思われる。
LPSと高い親和性でもって結合する二つの関連したタンパク質が、ヒトおよび他の動物にて同定された。これら二つのタンパク質、リポ多糖結合性タンパク質(LBP)と殺菌性/浸透性が向上したタンパク質(BPI)はほとんど同じ分子量を有しており、また、45%のアミノ酸で相同性が認められるものの、明確に異なる生理学的特性を示す。LBPは肝臓で合成される60kDの糖タンパク質であるのに対し、BPIは好中球のアズール性顆粒として認められる。LBPは、5〜10μg/mlのレベルで健常者の血清で認められるが、敗血症患者では5〜100μg/mlのレベルに達する。Schumann et al.,Science,249:1429(1990)は、ヒトおよびウナギのLBP双方のcDNAをコードするアミノ酸配列と塩基配列を開示している。BPI同様、LBPはリピドAに対する結合部位を有しており、ラフ(R−)およびスムース(S−)形態の細菌に由来するLPSに結合する。BPIとは違って、LBPは顕著な殺菌活性を有していない。BPIは、単球およびマクロファージに関するLPSとCD14のLBPに対する相互作用によるTNFの生成を、中和および阻害することが認められている。Marra et al.,J.Immunol.148:532(1992),Weiss et al.,J.Clin.Invest.90:1122(1992)。これとは対照的に、LBPはLPS−誘導したTNFの生成を向上せしめることが認められている。Wright et al.,Science,249:1131(1990)。よって、BPIとは対照的に、LBPは免疫刺激性分子として認識されてきた。例えば、LBP−βとして称するLBPの変異体を開示したSeilhamerのPCT国際出願WO 93/06228を参照のこと。また、数ある薬剤の中から、抗敗血症治療剤としての抗−LBP抗体を開示したUlevitchのPCT国際出願WO 91/01639、およびLBPに関して、LBPに対する相同性を有するポリペプチドと免疫反応を呈する抗体を開示した米国特許第5,245,013号も、本願発明の背景に関連性があると思われる。
LBPは、感染および非感染組織の破壊プロセスの進行に応じて濃度が増大する(C反応性タンパク質、フィブリノーゲン、および血清アミロイドAなどの)多くの血漿タンパク質の一つである「急性期タンパク質」に分類される。よって、リウマチ性関節炎および紅斑性狼瘡のような多くの自己免疫疾患に罹患した患者から採取した試料ではLBPレベルが高まっていることが予想される。
本願発明との関連で興味深いものに、患者体内でのBPI活性の分析に関する開示がある。von der Mohien et al.,要約、13th International Symposium on Insentive Care and Emerghency Medicine,ブリュッセル(1993年3月)は、グラム陰性敗血症患者及び健常者の血清レベルでのBPIの分析結果を開示している。この要約によれば、健常者の血清の分析ではBPIは検出されなかったが、すべての敗血症患者では循環しているBPIが検出されことが報告されている。本明細書に参考までに取り込んだ、1993年9月22日に出願された米国特許出願No.08/125,677の一部継続出願である、共同所有に係る、係属中の1993年12月29日に出願された米国特許出願No.08/175,276にも本願発明との関連で興味深い事項が開示されている。これらの特許出願は、血漿試料中のBPIのレベルが、敗血症の有無と相関しているのに対し、血清試料中のBPIのレベルには相関が認められないことが開示されている。これら特許出願は、血清中のBPIレベルが循環血液中のBPIの内因性細胞外レベルとは対応しておらず、血漿試料中のBPIのレベルが対応することを教示している。
ヒトLBPに対するモノクローナル抗体の調整を報告したLeturcq,et al.,Keystone Tahoe Endotoxin Conference,1992年3月1−7日(要約)も、本願発明との関連で興味深い事項を開示している。LBPの存在に関する正常ヒト血清試料のスクリーニングも報告されている。正常血清試料のLBPレベルは、1μg/ml〜24μg/ml、平均7μg/mlであると報告されている。敗血症患者及び健常者の血清でのLBPおよび可溶性CD14レベルに関するデータを提供した、ジョージア州、アトランタにて1993年5月16−21日に開催された、American Society for Microbiology General MeeetingでのRichard Ulevitchによる報告も本願発明との関連で興味深い事項を開示している。成人健常者の血清での可溶性CD14レベルとLBP濃度の平均値は、それぞれ1μg/mlと7μg/mlであった。敗血症患者の血清での可溶性CD14レベルとLBP濃度の平均値は、それぞれ2μg/mlと55μg/mlであった。
Geller et al.,Arch.Surg.,128:22−28(1993)は、急性期反応として知られる3つのモデル;(1)LPSの注射、(2)Corynebacterium parvumの注射、および(3)テレペンティンの注射、にてLBP mRNAの誘発を試験する実験について報告している。つまり、LBP mRNAは、肝臓が炎症を起こしている間に誘発されることが報告されており、LBPが内毒素に対するin vivo応答を調節する重要な急性期タンパク質であることを示唆している。
Gallay at al.,Infect.Immun.,61:378−383(1993)には、硝酸銀を注射したマウスでの急性期反応がLBP合成を誘発し、急性期反応後にはLBPのレベルが正常レベルよりも約10倍増大したことを開示している。
患者が内毒素に曝されているか否かを決定する方法、および他の急性期生理学的反応と内毒素への暴露による反応とを差別化する方法が、当該技術分野では待望されているのである。また、グラム陰性敗血症の有無あるいは程度を診断する方法、および敗血症に罹患した患者の予後を見極める方法も待望されている。
発明の要約
本発明は、LBPに関する分析を行うことで患者が内毒素に曝されているか否かを決定する方法を提供する。さらに本発明は、LBPに関する分析を行うことでヒトの急性期応答におけるグラム陰性細菌内毒素への暴露に関するスクリーニングのための方法を提供する。特に、その方法は、患者の体液試料中のLBPの濃度を決定し、内毒素への暴露の程度を示す指示薬とこのLBP濃度とを相関せしめる工程を含む。外科処置を行う以前の未処置状態での患者のLBPレベルによって決定された患者の標準状態を加味して標準レベルとすることができる。外科処置の結果による内毒素への暴露の有無を、その患者の外科処置前の標準LBPレベルと外科処置後のLBPレベルとを比較することで決定することができる。処置前の標準LBPレベルが分からない場合、集団あるいはサブ集団の平均値に基づいた客観標準を比較のために用いることができる。標準値以上のLBPレベルを示した患者は、内毒素に曝されているものとして診断され、標準値以下のLBPレベルを示した患者はそうでないとみなして診断される。分析方法の所望の感度ならびに選択性、および対象となる患者が該当するサブ集団に基づいて、標準LBPレベルを定めることもできる。例えば、この標準値は、様々なサブ集団の多様な年齢、性別、民族性および健康状態について個々に定められる。さらに、分析される体液によって、標準レベルは変化するものであることを理解すべきである。
さらに、本発明は、患者の体液試料中のLBPの濃度を決定し、敗血症の有無あるいは程度を示す指示薬とこのLBP濃度とを相関せしめる工程を含む、敗血症の有無あるいは程度を診断する方法も提供する。さらに、本発明は、患者の体液試料中のLBPの濃度を決定し、敗血症患者の予後の程度を示す指示薬とこのLBP濃度とを相関せしめる工程を含む、敗血症患者の予後の程度を見極める方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
図1は、LBPサンドウィッチ分析での、rLBP、rLBP25、rBPIおよびrBPI23に関する用量−応答曲線を示している。
図2は、健常者および様々な疾患の患者の血漿中のLBPレベル(平均±標準誤差)を示している。
図3は、LPSで処置した健常者でのLBPレベル(平均±標準誤差)を示している。
図4は、高レベルあるいは低レベルの血漿LBPによって分類したグラム陰性敗血症が疑われた患者の生存率を比較しており、そして
図5a−5cは、健常者、リウマチ性関節炎および敗血症患者におけるLBP、C反応性タンパク質(CRP)およびフィブリノーゲンレベル(平均±標準誤差)を示している。
発明の詳細な説明
本発明は、血液を含む体液中のLBPの存在を定量する方法に関する。この分析方法は、治療のために投与されたLBPの存在と量を決定するために用いることができ、内毒素への暴露を示す循環血液中での内因性LBPの存在を定量する場合に特に有用である。さらに、LBPの存在を定量することで、グラム陰性敗血症患者の診断および予後処置での使用も意図するものである。
本願発明は、高い分析感度、高い特異性および優れた再現性を示すヒトLBPのためのサンドウィッチELISA法を提供する。本明細書で使用する、分析方法に従って定量した「LBP」とは、天然のLBP、組換えLBP、LBP断片および類似体、ならびに他のLBPタンパク質およびタンパク質生成物を含む。
配列番号:1および2に記載の組換えLBPのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、1993年6月17日に出願された共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.08/029,510に記載されている。組換えLBPのアミノ末端断片は、配列番号:3および4に記載のLBPのアミノ末端の最初の197個のアミノ酸のアミノ酸配列を特徴とするものであり、その生成物は、本明細書に参考までに取り入れた、1993年6月12日に出願された共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.08/079,510に記載されている。かようなLBPタンパク質生成物は、1ng/mlに満たない範囲で、免疫学的分析および生物学的分析を含む分析によって容易に定量することができる。LBPを定量するための免疫学的分析は、好ましくは、酵素結合したイムノソルベント(ELISA)サンドウィッチ分析法によって行うが、他の標識物質を用いた拮抗分析および免疫学的方法も使用することができる。本発明の好ましい分析法では、モノクローナル抗体およびアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗体を含む抗−LBP抗体を使用する。ウサギポリクローナル抗体−LBP抗体は、免疫原としてLBPを用いた従来の方法に従って調製することができる。LBPの分析のために非免疫学的方法も使用できる。一例として、Ulevitch et al.,の米国特許第5,245,013号は、LPSにLBPを結合し、遠心密度勾配法によって複合体を分離する工程を含む分析法を開示している。他の例として、Geller et al.,Arch.Syrg.128:22−28(1993)は、IL−6とTNF調節を測定するLBP生物活性分析を開示している。
LBPの有無が分析される体液は、好ましくは血清と血漿を有する全血を含む。LBPは血清タンパクであるから体外に排泄されるため、尿中のLBPレベルを解析することで、診断あるいは予後の状態を見る上で有用である。本発明のLBPの免疫分析は、これに限定されるわけではないが、肺の洗浄液、硝子体液、歯肉溝液、大脳脊髄液、唾液および滑液を含む他の体液でのLBPの濃度を決定するために使用できる。
LBPは「急性期タンパク質」に分類されるので、自己免疫疾患に罹患した患者のLBPレベルを高めるものと考えられる。本発明の一態様として、急性リンパ球芽白血病(ALL)、急性体宿主性移植片病(aGvHD)、慢性リンパ球芽白血病(CLL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、I型糖尿病、再生不能性貧血(AA)、クローン病、乾癬、リウマチ性関節炎(RA)、硬皮症、および全身性紅斑性狼瘡(SLE)に罹患した患者のLBPレベルを、一般に正常値以上に高めないことが認められた。
グラム陰性敗血症に罹患したと思われていたが、最終的にグラム陽性敗血症に罹患していたと決定された患者のLBPレベルも向上していた。消化管からの細菌および/または内毒素の血流への移行は、どんな感染症においても起こり得ることを注意すべきである。グラム陽性細菌あるいは真菌による感染は、血液中の内毒素あるいはグラム陰性細菌の出現を招き、結果としれ、LBPのレベルを向上せしめることになる。
本願発明は、生物学的に活性なLPSが患者に曝されることと、血清および血漿でのLBPのレベルとが直接的に相関するとの知見に一部基づいている。さらに、LBPレベルは、グラム陰性敗血症が疑われた患者の生存率とも相関していると思われる。例えば、27.3μg/mlを下回る循環LBPレベルの患者(グラム陰性敗血症に罹患した患者の平均値は58)では、平均値を上回るLBPレベルの患者よりも14日間長く生存する傾向にあった。さらに、例えば、血漿LBPレベル域値が46μg/mlに設定されていた場合、46μg/mlに満たない処理前のLBP血漿レベルを有する患者は、46μg/mlを超える処理前のLBP血漿レベルを有する患者よりも、27日間の試験期間にわたって有無の生存率(p=0.004)を示した。
本発明では、LBPレベルの増大は多量の内毒素に曝されたことによる結果であることから、重大な感染症および/または内毒素血症の程度を診断することも意図している。増大したLBPレベルは、グラム陰性細菌に対する抗生物質、あるいはモノクローナル抗体E5を含む抗内毒素抗体あるいはBPIのような直接的に内毒素を標的とする他の治療薬の使用の適否を知るために用いることができる。
本発明の他の態様および利点は、以下の実施例の開示を考慮するれば理解できるであろう。実施例1は、アフィニティー精製したウサギ抗−BPI抗体の調製に関し;実施例2は、かような抗体のビオチン標識化に関し;そして、実施例3は、かような抗体を用いたELISA法に関する。実施例4は、rLBP、rLBP25、rBPIおよびrBPI23の免疫反応性の比較に関する。実施例5は、ヒトの血漿中に加えたrLBPの測定に関し;そして、実施例6は、ヒトの血漿および血清におけるLBPレベルの比較に関する。実施例7は、敗血症および他の疾患での、ヒトの血漿中の内因性LBP免疫反応性の臨床的相関に関し;および、実施例8は、健常者の内因性LBPレベルに関するLPS投与の効果に関する。実施例9は、グラム陰性敗血症が疑われた患者の血漿LBPレベルと生存率との臨床的相関に関し;および、実施例10は、健常者、リウマチ性関節炎および敗血症患者での急性期タンパク質の臨床的相関に関する。
実施例1
アフィニティー精製したウサギ抗−rLBP抗体の調製
本実施例にて、アフィニティー精製したウサギ抗−rLBP抗体を調製した。具体的には、本明細書に参考までに取り入れた、1993年6月17日に出願された、共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.08/079,510に従って調製したrLBP(20mg)を、0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.2M重炭酸塩、pH8.6、中にて10mlの臭化シアンで活性化したセファロース4B(Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州)に適用した。約94%のrLBPが樹脂に吸着された。1993年6月17日に出願された米国特許出願No.08/079,510の方法に従って調製したrLBP25で、次いで、rLBPで免疫処置した二匹のウサギから得た抗血清(125ml)を、同量のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、pH7.2で希釈した。希釈した抗血清の一部(50ml)を、10mlのrLBP−セファロースカラムに通し、そのカラムをPBSで洗浄し、そして、結合した抗体を、0.1Mグリシン、pH2.5で溶出した。Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,p.312(1988)の方法に従って、280nmでの吸光度でピーク画分を同定した。一連のカラム処理を数回行った後に、アフィニティー精製したウサギ抗−LBP抗体を、PBS−アジ化物、pH7.2に対して透析した。
実施例2
ビオチン標識したウサギ抗−rLBP抗体の調製
本実施例では、実施例1に記載の方法に従って調製したアフィニティー精製したウサギ抗−rLBP抗体の12mgを、11mlの0.1M重炭酸ナトリウム、pH8.3にて、2mgのビオチナミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシニミドエステル(Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州)と共にインキュベートした。接合していないビオチンを除去し、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSで平衡化したPD−10カラム(Pharmacia Biotech社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)での反応混合物を留出してアルカリ性緩衝液と交換した。
実施例3
ELISA法
アフィニティー精製したウサギ抗−rLBP抗体(PBSにて2μg/ml)の50μlを、イムロン2マイクロ滴定用プレート(Dynatech Laboratories社、チャンティリー、バージニア州)のウェルにて、2〜8℃で一晩(あるいは、37℃で一時間)インキュベートした。抗体溶液を除去し、PBS(ブッロク剤)で溶解した1%脱脂ミルクの200μlを全ウェルに添加した。室温で1時間、プレートをブロッキングした後に、300μlの洗浄用緩衝液(PBS/0.05%Tween−20)で3回洗浄を行った。
標準試料、被験試料および対照試料を、1%ウシ血清アルブミン、0.05%Tween 20(PBS−BSA/Tween)、および10単位/mlのヘパリンナトリウム(Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州)を含むPBSで、個々の96ウェルプレートを3度洗浄した。rLBPあるいはrLBP25標準溶液を、100から0.012ng/mlに至る連続2倍希釈溶液として調製した。標準試料、被験試料および対照試料の各レプリカおよび希釈液(50μl)を、ブロック処理したマイクロ滴定用プレートに移し、37℃で1時間インキュベートした。最初のインキュベーションの後、洗浄用緩衝液でウェルを3度洗浄した。ビオチン標識したウサギ抗−LPB抗体を、PBS−BSA/Tweenにて1/2000に希釈し、その50μlを全ウェルに添加した。そして、これらプレートを、37℃で一時間インキュベートした。続いて、すべてのウェルを洗浄用緩衝液で3度洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ(Zymed Laboratories社、サンフランシスコ、カリフォルニア州)を標識したストレプトアビジンを、PBS−BSA/Tweenにて1/2000に希釈し、その50μlを全ウェルに添加した。37℃で15分間インキュベートした後、すべてのウェルを洗浄用緩衝液で3度、そして脱イオン水で3度洗浄し、発色物質p−ニトロフェニルホスフェート(10%ジエタノールアミン緩衝液にて1mg/ml)の50μlを全ウェルに添加した。室温で1時間発色反応を進行せしめ、そして、反応を停止するために1N塩化ナトリウムの50μlを添加した。Vmaxプレートリーダー(Molecular Devices社、メンローパーク、カリフォルニア州)を用いて、全ウェルについて、405nmでの吸光度を測定した。
すべての被験試料および標準試料(3試料)に関する405nmでの吸光度(A405)の平均値は、最初のインキュベーション工程にて希釈緩衝液(LBPを含まない)のみを入れたウェルに関するA405の値を差し引くことで補正した。そして、A405の値とrLBPあるいはrLBP25の濃度(ng/ml)に関する標準曲線を作成した。直線領域を選択し、直線回帰解析を実施し、そして、標準曲線の補間によって被験試料と対照試料の濃度を決定した。
実施例4
rLBP、rLBP25、rBPIおよびrBPI23の免疫反応性の比較
本実施例にて、免疫学的交差反応を決定するために、BPIサンドウィッチELISAにて、rLBP、rLBP25、rBPIおよびrBPI23の免疫反応性を比較した。LBPとBPIとの間に相当の配列相同性がある(例えば、Schumann et al.,Science,249:1429(1990)を参照のこと)にもかかわらず、図1に記載の結果は、質量当たりで、rBPI23が、rLBP25とrLBPのシグナルよりも約3桁小さい大きさのシグナルしか生成せず、また、rBPIが、rLBPとrLBP25のシグナルよりも約5桁小さい大きさのシグナルしか生成していないことを示している。例えば、100,000ng/ml(100μg/ml)のrBPIあるいは400ng/mlのrBPI23は、0.8ng/mlのrLBPあるいは0.8ng/mlのrLBP25によって生成したのと同等のシグナルを生成した。これら結果は、抗体とBPIとの最小交差反応性を実証し、LBP分析で得られた特異性を確認するものである。
実施例5
ヒト血漿中のrLBPの測定
本実施例にて、異なる濃度のrLBPが含まれるヒトの血漿を検定し、そして、サンドウィッチELISAに先駆けて凍結および解凍することで、ヒトの血液中のrLBPの再生効果を評価した。rLBPの再生効果を、ヒト血漿試料中にて測定されたLPBの量からLBPを加えていない対照試料でのLBPの量を差し引き、そして、これを試料中に実際に含まれるLBPの量で割り算をして得た値で表現した。この値に100を乗じて、得られた数値を再生濃度のパーセントとして表示した。ヒト血漿試料に含まれる異なる濃度のrLBPの平均再生率は68%であり、42μg/mlでの59%から168μg/mlでの78%に至っている。表1に、LBPを添加した血漿試料での再生データをまとめた。
実施例6
血漿および血清中のLBPレベルの比較
本実施例では、健常者の血清および血漿中のLBP濃度を分析し、そして、実施例3のサンドウィッチELISAを用いて比較を行った。抗凝固剤の添加による希釈のために血漿量を(0.85の係数で割ることで)補正した場合、LBPの血漿濃度はLBPの血清濃度と実質的に同じであった。健常者の血漿濃度は3.1μg/ml(標準偏差0.9μg/ml)であり、3.7μg/ml(標準偏差1.1μg/ml)に補正したものを、血清用の3.7μg/ml(標準偏差0.9μg/ml)と比較した。
実施例7
ヒト血漿における内因性LBP免疫反応性の臨床的相関
本実施例にて、グラム陰性敗血症の患者ならびに他の様々な臨床状態の患者から採取したヒト血漿あるいは血清での内因性LBP免疫反応性を測定した。特に、健常者(30名)とグラム陰性敗血症と診断された患者(363名)の血漿試料を、LBPレベルについて分析した。急性リンパ球芽白血病(ALL)(6例)、急性体宿主性移植片病(aGvHD)(8例)、慢性リンパ球芽白血病(CLL)(9例)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)(12例)、I型糖尿病(13例)、再生不能性貧血(AA)(16例)、クローン病(8例)、乾癬(13例)、リウマチ性関節炎(RA)(86例)、硬皮症(4例)、および全身性紅斑性狼瘡(SLE)(10例)に罹患した患者の血清試料を、LBPレベルについて分析した。この結果を、図2に示した。
グラム陰性敗血症に罹患した患者のLBPレベルは増大したが、急性リンパ球芽白血病、急性体宿主性移植片病、慢性リンパ球芽白血病、皮膚T細胞リンパ腫、I型糖尿病、再生不能性貧血、クローン病、乾癬、リウマチ性関節炎、硬皮症および全身性紅斑性狼瘡(SLE)に罹患した患者のLBPレベルは正常値以上にはならなかった。よって、本発明のLBP分析は、(リウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘡のような)他の急性期状態での内毒素に関連する疾患状態を識別する上で有用である。
実施例8
LPS投与による健常者の内因性LPBレベルに関する効果
本実施例では、健常者の内因性LBPの免疫反応性に関する、LPS投与による効果を決定した。具体的には、4ng/kgのLPSを静脈投与して後の様々な時間における投与群(16例)のLPB血漿レベルとLPSを投与しない対照群(2例)のLBP血漿レベルの変化をLBPサンドウィッチ分析を用いてモニターした。図3に示した結果は、時間の経過に伴う平均血漿LBP濃度の変化を示している。LPS処理した症例においては、LPSを投与してから約6時間後にLBPレベルが上昇し始めた。LPSを投与してから10〜12時間後に、ほとんどの症例においてピークLBP血漿レベルが認められた。ベースラインとピークLBPレベルの間の平均値は、約3倍に増大した。この試験期間において、対照例の平均LBPレベル(約5μg/ml)は、標準領域内にとどまっていた。
他の分析でも体液中のLBPレベルと内毒素に曝された場合の症状との間に相関が認められ、LBPレベルが内毒素に曝された場合の疾患症状の診断および予後処置において有用であると期待される。
他の分析でも体液中のLBPレベルと、細菌感染、内毒素血症、敗血症、およびDICならびにARDSを含む敗血症に関連する症状との間に相関が期待される。
実施例9
グラム陰性敗血症が疑われた患者の血漿LBPレベルと生存率との臨床的相関
グラム陰性敗血症が疑われた患者の血漿LBPレベルと生存率との臨床的相関を、実施例7に記載の敗血症患者から得たデータを用いて比較した。この場合、標準LBP濃度を46μg/mlとし、グラム陰性敗血症が疑われた患者は、前処理した試料にて測定したLBP血漿レベルの(46μg/mlを境にした)高低によって分類した。図4のデータにあるように、低LBPレベルの患者は、高LBPレベルの患者と比較して、27日間の試験期間において顕著な生存率(p=0.004)を示した。これら結果は、LBPレベルの分析を行い、敗血症患者の予後を見極めるために、標準LBP値と分析値を比較することの有用性を示唆している。
実施例10
健常者、リウマチ性関節炎患者および敗血症患者での急性期タンパク質の臨床的相関
健常者、リウマチ性関節炎患者および敗血症患者の小グループに対して、LBP、C反応性タンパク質(CRP)およびフィブリノーゲンに関する血漿レベルでの測定を行い、その結果を、図5a(LBPレベル)、5b(CRPレベル)および5c(フィブリノーゲンレベル)に示した。これら結果は、リウマチ性関節炎患者および敗血症患者での平均フィブリノーゲンレベルは、健常者の2.5倍に達していることを示している。リウマチ性関節炎患者での平均CRPレベルは健常者の40倍に、そして、敗血症患者での平均CRPレベルは健常者の200倍に達していることが認められた。これに対して、実施例7の結果とも符合して、リウマチ性関節炎患者での平均LBPレベルはわずかに増大した(2倍に満たない)のに対し、敗血症患者での平均LBPレベルは6倍以上に増大した。
本発明の好適な実施態様に関するこれまでの記載を考慮することで、当業者であれば、本発明の実施に当たって様々な変更と修正を想到するものと思われる。従って、請求の範囲に記載の限定のみが本願発明の範疇に付加されるものである。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:ゾーマ コーポレーション
(ii)発明の名称:体液中のLBPを定量する方法
(iii)配列の数:4
(iv)連絡先住所:
(A)あて名:マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー アンド ボーラン
(B)番地:6300 シアーズ タワー、233 サウス ワッカー ドライブ
(C)都市名:シカゴ
(D)州名:イリノイ
(E)国名:米国
(F)郵便番号:60606−6402
(v)コンピューター読取形式:
(A)媒体:フロッピー ディスク
(B)コンピューター:IBM PC互換機
(C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテント イン リリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(viii)弁護士/弁理士情報:
(A)氏名:シャープ、ジェフリー、エス.
(B)登録番号:31,879
(C)参照/事件番号:27129/31843
(ix)通信情報:
(A)電話:312/474−6300
(B)ファックス:312/474−0448
(C)テレックス:25−3856
(2)配列番号:1の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ:1443塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..1443
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:misc_feature
(D)他の情報:「rLBP」
(xi)配列:配列番号:1
(2)配列番号:2の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ:481アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:misc_feature
(D)他の情報:「rLBP」
(xi)配列:配列番号:2
(2)配列番号:3の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ:591塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:CDS
(B)存在位置:1..591
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:misc_feature
(D)他の情報:「rLBP25」
(xi)配列:配列番号:3
(2)配列番号:4の情報
(i)配列特徴:
(A)配列の長さ:197アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)配列の特徴:
(A)配列を表す記号:misc_feature
(D)他の情報:「rLBP」
(xi)配列:配列番号:4
Claims (37)
- 患者の内毒素への曝露の特異的な決定のための検査方法であって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を決定する工程、および、内毒素への曝露の標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめる工程を含む、方法。
- 前記標準指標が、前処置期間内にて分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第1項に記載の方法。
- 前記内毒素への曝露が感染または内毒素疾患状態の指標となる請求の範囲第1項に記載の方法。
- リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、重大な感染症および/または内毒素血症の程度の指標となる請求の範囲第3項に記載の方法。
- リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、グラム陰性細菌に対する抗生物質あるいは直接的に内毒素を標的とする他の治療薬の使用の適否を知るために用いられ得る請求の範囲第4項に記載の方法。
- 前記標準指標が、内毒素に曝露される前の期間内にて分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第3項に記載の方法。
- 患者の敗血症または敗血症に関連した症状の存在あるいは程度の特異的な診断のための検査方法であって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を決定する工程、および、敗血症または敗血症に関連した症状を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめる工程を含む、方法。
- 前記標準指標が、敗血症または敗血症に関連した症状に罹患する前の期間中に分析された患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第7項に記載の方法。
- 内毒素への曝露から生じる疾患状態に罹患した患者の予後の特異的な見極めのための検査方法であって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を決定する工程、および、内毒素への曝露から生じる疾患状態を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめる工程を含む、方法。
- 敗血症患者の予後の特異的な見極めのための検査方法であって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を決定する工程、および、敗血症または敗血症に関連する症状を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめる工程を含む、方法。
- リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、有害な予後の指標となる請求の範囲第9項または第10項に記載の方法。
- 前記標準指標が、内毒素に曝露される前の期間内にて分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第9項に記載の方法。
- 前記標準指標が、敗血症または敗血症に関連した症状に罹患する前の期間中に分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第10項に記載の方法。
- 前記試料が、血液試料である請求の範囲第1項から第13項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、血漿あるいは血清試料である請求の範囲第1項から第13項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リポ多糖結合性タンパク質の濃度が、免疫学的分析法で決定される請求の範囲第1項から第13項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫学的分析法が、サンドウィッチ免疫分析法である請求の範囲第16項に記載の方法。
- ヒトの急性期応答におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露を特異的にスクリーニングする方法であって、以下の工程;
(a)ヒト患者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルを測定する工程、および
(b)工程(a)で決定したリポ多糖結合性タンパク質のレベルと、健常者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルとを比較し、リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、グラム陰性細菌内毒素が関与する急性期応答の指標となる、工程を含む、
方法。 - 前記急性期応答が、敗血症に関連している請求の範囲第18項に記載の方法。
- ヒトの急性期応答におけるグラム陰性細菌内毒素関与について特異的にスクリーニングする方法であって、以下の工程;
(a)急性期応答を示す患者からの血液試料を、リポ多糖結合性タンパク質の特異的結合パートナーと接触させる工程、
(b)血液試料中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルを決定する工程、および
(c)工程(b)において決定したリポ多糖結合性タンパク質のレベルと、健常者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルとを比較し、リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、グラム陰性細菌内毒素が関与する急性期応答の指標となる、工程を含む、
方法。 - 前記急性期応答が、敗血症に関連している請求の範囲第20項に記載の方法。
- 患者の内毒素への曝露を特異的に決定するためのキットであって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段、および、内毒素への曝露の標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめるための指示書を含む、キット。
- 内毒素への曝露から生じる疾患状態に罹患した患者の特異的な診断のための検査キットであって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段、および、内毒素への曝露から生じる疾患状態の標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめるための指示書を含む、キット。
- 患者の敗血症または敗血症に関連した症状の存在あるいは程度の特異的な診断のための検査キットであって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段、および、敗血症または敗血症に関連した症状を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめるための指示書を含む、キット。
- 内毒素への曝露から生じる疾患状態に罹患した患者の予後の特異的な見極めのための検査キットであって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段、および、内毒素への曝露から生じる疾患状態を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめるための指示書を含む、キット。
- 敗血症患者の予後の特異的な見極めのための検査キットであって、患者から採取した体液試料中のリポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段、および、敗血症または敗血症に関連する症状を示す標準指標とリポ多糖結合性タンパク質の濃度とを対応せしめるための指示書を含む、キット。
- ヒトの急性期応答におけるグラム陰性細菌内毒素への曝露を特異的にスクリーニングするためのキットであって、ヒト患者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルを測定するための手段、および決定したリポ多糖結合性タンパク質のレベルと、健常者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルとを比較し、リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、グラム陰性細菌内毒素が関与する急性期応答の指標となる指示書を含む、キット。
- ヒトの急性期応答におけるグラム陰性細菌内毒素関与について特異的にスクリーニングするためのキットであって、リポ多糖結合性タンパク質の特異的結合パートナー、および急性期応答を示す患者からの血液試料中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルと、健常者の循環血液中のリポ多糖結合性タンパク質のレベルとを比較し、リポ多糖結合性タンパク質の増大したレベルが、グラム陰性細菌内毒素が関与する急性期応答の指標となる指示書を含む、キット。
- 前記試料が、血液試料である請求の範囲第22項から第28項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記試料が、血漿あるいは血清試料である請求の範囲第22項から第28項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記リポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段が、免疫学的分析法である請求の範囲第22項から第28項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記免疫学的分析法が、サンドウィッチ免疫分析法である請求の範囲第31項に記載のキット。
- 前記リポ多糖結合性タンパク質の濃度を測定するための手段として、抗リポ多糖結合性タンパク質抗体を含む請求の範囲第22項から第27項のいずれか一項に記載のキット。
- 前記標準指標が、前処置期間内にて分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第22項に記載のキット。
- 前記標準指標が、内毒素に曝露される前の期間内にて分析された前記患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第23項または第25項に記載のキット。
- 前記標準指標が、敗血症または敗血症に関連した症状に罹患する前の期間中に分析された患者のリポ多糖結合性タンパク質濃度よりも大きな濃度である請求の範囲第24項または第26項に記載のキット。
- 前記急性期応答が、敗血症に関連している請求の範囲第27項または第28項に記載のキット。
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