JP2592121B2 - ＩｇＡ腎臓病の診断のための方法及びキツト - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原−抗体相互作用を用いるIgA（免疫グロ
ブリンＡ）腎臓病（nephropathy）の診断のための方法
に関し、且つ本発明はこうした診断に使用する診断用キ
ットをも含むものである。

ベルジェ（Berger）病としても知られている原発性
（primary）IgA腎臓病を持った患者は、糸球体基底膜
（glomerular basement membrane）（GBM）から製造さ
れたコラーゲンIVに結合する、循環するIgA抗体を有す
ることが知られている（１）。IgA抗体はコラーゲン
Ｉ、II及びIVに同様に良く結合すること、及び変性した
コラーゲンが最も効果的に抗体に結合することも示され
ている（１）。各種のコラーゲンが広く分布しているこ
とから見ると、腎臓外（extrarenal）器官からの症状の
IgA腎臓病との共存に留意することは興味あることであ
る（２）。従って、皮膚、目及び関節からの症状は、こ
れらの構造体が主成分としてコラーゲンを含むので、特
に興味あることである。実際に或研究はIgA腎臓病を持
った患者からの皮膚中に、脈管性IgA沈着物の存在を報
告している（３）。

上部気道の臨床的疾病又は胃腸感染症の悪化と糸球体
膜中のIgAの沈着の所見との関連は周知である。IgA保持
末梢リンパ細胞レベルの増大（４）並びにIgA−特異性
サプレッサーＴ細胞活性の増加（５）及びIgA−特異性
ヘルパーＴ−アルファ細胞の増加（６）は免疫学的機構
を示唆するものである。多くの症状の過程で変化する、
寒冷不溶性グロブリン（CIg）としても知られている、
フィブロネクチンは血漿蛋白質として及び細胞表面蛋白
質（CSP）としても存在している。二つの形態は組成が
僅かに異なるが、ゼラチン（コラーゲン）、ヘパリン、
フィブリン、及び細胞表面レセプター（receptor）への
結合のような重要な機能を果している（７）。フィブロ
ネクチンはゼラチンに結合する主な血漿成分であり
（８）、この性質並びにそのヘパリン結合的性質がその
単離に利用された（９）。興味あることには、フィブロ
ネクチンは又基底膜中にも存在している。それは免疫蛍
光検査法により、糸球体基底膜中だけでなく、健康な個
体の糸球体間質（mesangium）中においても観察するこ
とができる（10）。更に糸球体間質フィブロネクチンと
糸球体間質マトリックスの共在的増加が、IgA腎臓病及
びヘーノホ−シェーンライン（Henoch−Schnleins）
紫斑病を持った患者に認められた（10）。

本発明はIgA−抗体が原発性IgA腎臓病を持った患者中
で循環する免疫複合体中に、フィブロネクチンと共に見
出されるという驚く可き発見に基づいており、この予期
しない発見は勿論、IgA−含有複合体はコラーゲンに結
合する能力を有するという事実を説明するものである。
循環する免疫複合体がIgA以外に、フィブロネクチンを
も含むというこの新発見は,IgA腎臓病の診断の方法と、
こうした診断で使用する診断用キットの提供を可能とす
るものである。

従って、本発明の一つの目的は抗原−抗体相互作用を
使用してIgA腎臓病の診断の方法を提供することであ
り、及び本発明の他の目的はIgA腎臓病のこうした診断
に使用する診断用キットを提供することである。

本発明の方法は下記の段階を特徴とする： ａ）フィブロネクチン又はIgAを結合できる基質を製造
すること ｂ）段階ａ）から得られた基質を診断の被検患者から取
り出された体液試料と接触させて、該試料中に存在する
フィブロネクチン−IgA−複合体を基質へ結合させるこ
と、及び ｃ）こうした結合した複合体の露出した部分とそれらに
対応する抗体との間の反応を用いて、基質に結合した複
合体の存在を測定すること。

フィブロネクチンを結合することができるような基質
の構造において、好適な結合剤はコラーゲン、ヘパリ
ン、フィブリン又は抗−フィブロネクチンである。本発
明のこの態様によれば、基質はそのフィブロネクチン成
分を経由してフィブロネクチン−IgA−複合体と結合す
るような方法で製造される。これは即ち、複合体のIgA
成分は基質に結合した複合体の存在を測定するのに利用
できることを意味する。

他方基質へのフィブロネクチン−IgA−成分の結合
を、複合体のIgA部分に向けることができる。こうした
場合は結合剤として、両者共IgAを結合することができ
る、抗−IgA又はレクチンのいずれかを使用することが
可能である。この場合には複合体のフィブロネクチン部
分は基質に結合した複合体の存在を定量するために利用
されよう。

本発明の方法の段階ｃ）の測定は定量的な性質のもの
であることができ、及び普通の検出系に基づくものであ
ることができる。こうした検出系のうち、酵素活性に基
づいた系、又は放射性同位元素により放射される放射線
の基づく系又は蛍光に基づく系を挙げることができよ
う。

診断に付される試料中に存在するフィブロネクチン−
IgA−複合体を結合するのに使用される基質は、マイク
ロタイター盤、実験室用試験管、ニトロセルロース紙、
プラスチック球のような異なる物体又は目的に適当した
任意の他の物体によって構成されることができる。

本発明の診断の方法により検査される患者から取り出
した体液試料は、例えばヒトの血液、血清、血漿又は唾
液により構成されていてもよい。

本発明は又IgA腎臓病の診断に使用するための診断用
キットを提供し、該キットは ａ）フィブロネクチン又はIgAを結合することができる
物体、及び ｂ）IgA又はフィブロネクチンを結合することができる
成分及び該物体に結合したフィブロネクチン−IgA複合
体の測定を可能とする検出成分から成る試薬、 から構成される。

IgA部分が複合体の露出部分を構成する具体化におい
ては、物体はその表面にヘパリン、フィブリン又は抗−
フィブロネクチンを付着させて保持している。こうした
場合、試薬はIgAを対象とするレクチン又は抗体から成
ることが好ましい。

フィブロネクチンが複合体の露出部分である、反対の
場合には、物体はその表面に抗−IgA又はレクチンを付
着させて保持し、試薬はヘパリン、コラーゲン、フィブ
リン又は抗−フィブロネクチンから成っている。

本発明による該診断キットにおいて、検出成分の機能
は酵素活性、放射性同位元素により放射される放射線、
又は蛍光に基づいたものであることができる。

本発明を下記の実施例において更に説明するが、該実
施例は本発明を制限するものではない。この説明は添付
図面に関して関連しており、該図面において、 第１図はIgA、フィブロネクチン（FN）及び複合体の
ヘパリン−セファロース カラムへの結合を示す。

第２図は塩勾配法を用いる通常のイオン交換体から蛋
白質の溶離に関する図形である。

第３図はIgA、フィブロネクチン及び複合体のジャカ
リン−セファロース カラムへの結合を示し、及び 第４図はSDS−PAGE法及び免疫ブロッティング法を用
いる蛋白質の分離を示す。

実施例 １ 抗血清 患者の血清は原発性IgA腎臓病を持った（糸球体腎炎
で腎臓の生検試料の免疫蛍光顕微鏡試験により圧倒的な
糸球体間質IgA沈着が検出された）患者からであった。
患者の誰もが全身性エリテマトーデス（SLE）、ヘーノ
ホ−シェーンライン紫斑病又は肝硬変病の兆候を有して
いなかった。健康な血液供与者からの血清を対照として
使用した。

実施例 ２ 免疫複合体の単離 抗血清（1ml）を10mlのヘパリン−セファロースCL−6
Bカラム（ファルマシア［Pharmacia」、ウプサラ、スウ
ェーデン）にかける前に、pH7の0.05Mトリス、0.05％ナ
トリウムアジドに対し透析した。同じ緩衝液中の0.5M N
aClでカラムから溶離された物質を、1mlのモノ［Mono］
Ｑカラム（ファルマシア）を用いてクロマトグラフにか
ける前に、pH7の0.1Mの燐酸ナトリウム、0.05％のナト
リウムアジドに対して透析した。クロマトグラフはLKB
（ブロマ［Bromma］、スウェーデン）HPLC系を使用し、
低圧混合で行われた。吸光度はLKB2151波長可変検出器
を用い、280nmで測定された。コラーゲンＩに結合し、
抗−ヒトIgA（ダコパッチ［Dakopatts］、ヘゲルステン
［Ｈgersten］、スウェーデン）と反応する画分を貯
留し、ジャカリン・アガロース（jacaline agarose）
（ピアス・ケミカルス［Pierce chemicals］、ロックフ
ォード、イリノイ）にかけた。IgA含有複合体が、pH7.5
の、0.05Mトリス、0.15M NaCl、0.05％のナトリウムア
ミドを含む緩衝液中の0.2Mメリビオースで溶離された。

実施例 ３ コラーゲンＩの製造 コラーゲンＩはヴォーゲル（Vogel）等（12）により
記載されたように牛の屈筋の腱からペプシン抽出により
製造された。

実施例 ４ 電気泳動 レムリ（Laemmli）（13）に記載されたように３−16
％線状勾配ゲルを用いてSDS−PAGEを行った。ゲルはモ
リシー（morrisey）の方法（14）に従い、グルタルアル
デヒドを除外して銀で染色した。還元は電気泳動及び２
分間の煮沸の前に、試料に２−メルカプトエタノールを
0.2％v/v添加することにより行われた。

実施例 ５ ELISA 抗原をポリスチレン製の96穴（well）マイクロタイタ
ー盤（NUNCインムノプレート［immunoplate］Ｉ、NUN
C、ロスキルデ［Roskilde］、デンマーク）に被覆し
た。0.05％ナトリウムアジドを含むpH9.6の0.05M炭酸ナ
トリウム緩衝液を用いて、カラムからの画分を非変性条
件下で一夜被覆した。これに続いて非特異的結合を防止
するために２％の血清アルブミンを含む同じ緩衝液（免
疫阻止緩衝液）で１時間インキュベートした。pH7.4の6
Mグアニジン−HCl、0.05Mトリス−HClを用いて、変性条
件下で一夜コラーゲンＩを被覆した。この場合免疫阻止
緩衝液を用いるインキュベートは不必要である。血清を
0.01M燐酸塩pH7.5、0.15M HCl、0.05％トゥイーン（Twe
en）20及び0.25mグアニジン−HCl中で希釈し、被覆され
たマイクロタイター盤中で１時間インキュベートした。
IgA抗体はアフィニティ（affinity）精製された抗ヒトI
gAアルカリ性フォスファターゼ・コンジュゲート（conj
ugate）（ダコ［Dako］）を用いて１時間インキュベー
トすることにより検出された。フィブロネクチンは兎の
抗−ヒトフィブロネクチン抗血清（ダコ）に続いて抗−
兎IgGアルカリ性フォスファターゼ・コンジュゲート
（ダコ）を用いて検出された。マイクロタイター盤は各
段階の間、0.05％トゥイーン20を含む0.15M NaClで洗浄
された。総ての試料は三試料づつ分析された。吸光度は
ティテルテク・ムルティスカン（Titertek Multiskan）
光度計を用いて405nmで検査された。

実施例 ６ 免疫ブロッティング（immunoboltting） 蛋白質をSDS−PAGEを用いて分離し、0.5Aで４時間か
けて電気泳動的にニトロセルロース紙（シュライヘル
［Schleicher］及びシュル［Schll］−ダッセル［Das
sel］、西ドイツ）に移動させた。免疫阻止緩衝液を用
いて１時間インキュベートすることにより非特異的結合
を防止した。ペルオキシダーゼ結合抗ヒト抗血清（ダ
コ）を用いてIgA抗体を検出し、及び兎抗ヒトフィブロ
ネクチンを使用し、次いでペルオキサダーゼ結合抗兎抗
血清を用いてフィブロネクチンを検出した。酵素活性は
塩化コバルト及び硫酸ニッケルアンモニウムを含むpH7.
5の燐酸ナトリウム緩衝液中でH₂O₂/ジアミノベンジジン
（0.5mg/ml）（フルカ［Fluka］）で測定された（1
5）。

実施例 ７ CNBr−フラグメントの単離 本発明は先にIgA腎臓病を持った患者からの抗体はコ
ラーゲンＩ、II及びIVと結合することを見出して以来、
結合に対応する牛のコラーゲンＩの特異的エピトープを
単離する試みを行った。ペプシン抽出コラーゲンＩはCN
Brを用いてフラグメント化され、各フラグメントはモノ
Ｓカラム上で陽イオン交換クロマトグラフィーにかけら
れ、続いてTSK63000SWカラム上でのゲルクロマトグラフ
ィーで分離された。抗体のコラーゲンＩへの結合はアル
ファ_１鎖のCB7フラグメント及びアルファ_２鎖のCB3、５
フラグメントとして識別されたフラグメントにより完全
に阻害することができる。

これらのフラグメントはフィブロネクチン結合領域を
含むことが知られている（16）。即ち、フィブロネクチ
ンはコラーゲンに対するIgAの結合にかかわっているよ
うに見える。実際、患者のIgA抗体について見出された
ように、エングヴァル（Engval）等（８）は前に、フィ
ブロネクチンはコラーゲンＩ及びIIの両者に結合するこ
と、及び結合は変性したコラーゲンを使用する時に補強
されることを示している。更にこれを支持する事実とし
て、マイクロタイター盤に被覆された抗フィブロネクチ
ン抗体は、原発性IgA腎臓病を持った患者からの血清と
共にインキュベートする時には、IgA抗体並びにフィブ
ロネクチンの結合を起こすことをELISAにより示すこと
が可能であった。

対照として健康な血液供与者からの血清を使用する時
には、IgA抗体は抗フィブロネクチン抗体被覆に結合し
なかった。従ってフィブロネクチン及びIgAについて夫
々逐次的に、原則としてアフィニティ カラムを用いて
複合体を精製することに決定された。

実施例 ８ ヘパリン−セファロースのフィブロネクチンの吸着 ヒト血清からのフィブロネクチン−IgA複合体の精製
の初期段階として、ヘパリン−セファロース（９）が使
用された。ELISA（第１図）に示されたように、被覆物
として画分を用いると、予期した通り大部分のIgA抗体
はヘパリン カラムに保持されなかった。フィブロネク
チンはヘパリンカラムに結合し、0.5M NaClを使用する
と溶離された（第１図）。

フィブロネクチンは分子のＮ−末端部分に位置するコ
ラーゲン結合領域によってコラーゲンに結合することが
知られている（７、17）。フィブロネクチンのコラーゲ
ン結合性はヘパリン カラムカラの溶離液中にフィブロ
ネクチン−IgA免疫複合体の存在を示すためにELISA中で
利用された。変性コラーゲンＩ（17）が被覆として使用
された。ヘパリン−セファロース カラムからの画分
は、コラーゲン被覆マイクロタイター穴中でインキュベ
ートされた。結合したIgA抗体は特異的抗体コンジュゲ
ートを用いて検出された（第１図）。NaClを用いてヘパ
リン カラムから溶離された画分のみが、検査の結果抗
体反応性を含んでおり、IgA抗体がフィブロネクチンに
結合しており、フィブロネクチンがそのコラーゲン結合
領域によりコラーゲンへの結合を仲介している、フィブ
ロネクチン−IgA免疫複合体を明らかに表している。IgA
抗体の大部分はヘパリン セファロースに結合せず、こ
の結合しない画分中にはコラーゲン結合IgA抗体は見い
だされなかった。

健康な血液供与者から得られた血清試料の場合は対称
的な結果が得られた。ヘパリン−セファロースに結合し
た画分にも、結合しない画分にも免疫複合体は検出され
なかった。

実施例 ９ 陰イオン交換カラムへの免疫複合体の結合 ヘパリンはフィブロネクチンだけでなく、他の血漿蛋
白質にも同様に結合する（９）から、次ぎの精製段階に
はイオン交換カラムが選択された。ヘパリンカラムから
溶離された物質をモノＱ、陰イオン交換HPLCカラムにか
けた。コラーゲンＩ被覆でELISAにより検出された免疫
複合体を0.22ないし0.24M NaClで溶離した（第２図）。
遊離のIgA抗体の存在（免疫抗体から分離された）は少
部分のIgAがヘパリン カラムに結合するか及び／又はI
gAが精製工程の際に免疫複合体の解離によって遊離する
ことを示す。

実施例 10 免疫複合体中のIgA成分のジャカリン−セファロースへ
の吸着 免疫複合体を含む画分（第２図）を貯留し、ジャカリ
ン−セファロース カラム上でクロマトグラフにかけ
た。ジャカリンはIgA抗体の結合に使用できるレクチン
である（18）。この構造はフィブロネクチン分子上に存
在しないから、これは遊離のフィブロネクチンから複合
体を分離する可能性を提供する。予期されたようにフィ
ブロネクチンはジャカリンカラムに結合しない物質中
に、及びメリビオースで溶離された結合した画分の両者
中で見出されたが、IgA抗体は結合した物質中にのみ存
在する（第３図）。免疫複合体のフィブロネクチン成分
はELISA中でコラーゲンＩに結合し、フィブロネクチン
及びIgA抗体が同定された（第３図）。ジャカリン カ
ラムに結合した物質中のフィブロネクチン及びIgAに対
応する移動度を持った成分の存在は、更に還元をした場
合又はしない場合の両者についてSDS−PAGEで示された
（第４図）。成分の同一性のもう一つの証明は抗−IgA
及び抗−フィブロネクチン夫々を用いる免疫ブロッティ
ングにより得られた。SDS−PAGEにより可視化された主
要成分は、夫々IgA及びフィブロネクチンを表すことが
こうして示された。

上記の実施例はIgA腎臓病を持った患者はフィブロネ
クチン及びIgA抗体を含む循環する免疫複合体を有する
ことを示している。これは原発性IgA腎臓病の免疫複合
体に仲介された性質の提案（11）とも一致する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘイネガルド，デイツク スウエーデン国エス‐222 47ルンド・ マンタルスクロケン３

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ａ）フィブロネクチン又はIgAを結合でき
   る基質を調製し、 ｂ）段階ａ）から得られる基質を被験者に由来する体液
   試料と接触させて、該試料中に存在するフィブロネクチ
   ン−IgA−複合体を基質へ結合させる、そして ｃ）こうして結合した複合体の露出した部分とそれらに
   対応する抗体との間の反応を用いて、基質に結合した複
   合体の存在を測定する、 ことを特徴とする、抗原−抗体相互作用を利用するフイ
   ブロネクチン−IgA−複合体の免疫学的アツセイ方法。
2. 【請求項２】コラーゲン、フィブリン又はヘパリンを介
   して複合体のフィブロネクチン部分に結合できる基質を
   調製する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】抗−フィブロネクチンを介して複合体のフ
   ィブロネクチン部分に結合できる基質を調製する請求項
   １に記載の方法。
4. 【請求項４】抗−IgA又はIgA結合レクチンを介して複合
   体のIgA部分に結合できる基質を調製する請求項１に記
   載の方法。
5. 【請求項５】体液がヒトの血液、血清、血漿又は唾液に
   より構成される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】段階ｃ）において、結合した複合体の存在
   が酵素活性、放射性同位元素の放射された放射線又は蛍
   光に基づいた検出系を用いて定量的に測定される請求項
   １〜５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】段階ｃ）において、複合体のIgA部分と抗
   −IgA−又はレクチン−酵素複合体の間の反応を使用す
   る請求項２又は３に記載の方法。
8. 【請求項８】段階ｃ）において、複合体のフィブロネク
   チン部分と抗−フィブロネクチン−、ヘパリン−、フィ
   ブリン−又はコラーゲン−酵素複合体の間の反応を使用
   する請求項４に記載の方法。
9. 【請求項９】基質がマイクロタイター盤により構成され
   る請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】ａ）フィブロネクチン又はIgAを結合す
    ることができる物体、及び ｂ）IgA又はフィブロネクチンを結合することができる
    成分及び前記ａ）の物体に結合したフィブロネクチン−
    IgA複合体の測定を可能とする検出成分から成る試薬 を含んでなるIgA腎臓病の診断に使用するための診断用
    キット。
11. 【請求項１１】物体がその表面にヘパリン、フィブリン
    又は抗−フィブロネクチンを付着させて保持し、試薬が
    レクチン又はIgAに対する抗体を含んでなる請求項10に
    記載の診断用キット。
12. 【請求項１２】物体がその表面に抗−IgA又はレクチン
    を付着させて保持し、試薬がヘパリン、フィブリン又は
    抗−フィブロネクチンを含んでなる請求項10に記載の診
    断用キット。
13. 【請求項１３】検出成分の機能が酵素活性、放射性同位
    元素により放射された放射線又は蛍光に基づいたもので
    ある請求項10に記載の診断用キット。