DE69510772T2 - Verfahren zur quantifizierung von lbp in körperflüssigkeiten - Google Patents
Verfahren zur quantifizierung von lbp in körperflüssigkeitenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Lipopolysaccharid-bindendem Protein (LBP) in Körperflüssigkeitsproben, einschließlich Blutproben.
- Lipopolysaccharid (LPS) ist ein gewöhnlicher Bestandteil der äußeren Membran von gram- negativen Bakterien und ist für viele der pathologischen Effekte, die mit gram-negativer bakterieller Infektion und Endotoxinämie assoziiert sind, verantwortlich. Wegen des Zusammenhangs zwischen bakterieller Infektion und Sepsis sind Versuche unternommen worden, um Serum/Plasma-Spiegel von Endotoxin mit Krankheit zu korrelieren. Typischerweise sind Endotoxin-Spiegel unter Verwendung des Limulus-Amoebocyt-Lysat (LAL)-Tests gemessen worden, bei dem Endotoxin eine Koagulierungskaskade auslöst, die physisch, turbidimetrisch oder spektrophotometrisch gemessen werden kann. Jedoch sind trotz dieser Versuche keine zuverlässigen Korrelationen zwischen Endotoxin-Spiegeln und Sepsis-Heftigkeit oder -Ergebnis identifiziert worden. Am wahrscheinlichsten ist dies auf der Tatsache begründet, daß (i) Endotoxin-Spiegel bei septischen Patienten sehr niedrig sind (> 10 pg/l), (ii) mehrere Serum-Proteine die proteolytische LAL-Kaskade stören, (iii) Endotoxin, wenn es erst einmal mit Blut in Kontakt ist, durch Wechselwirkung mit einer Vielzahl von Blutbestandteilen "detoxifiziert" werden kann, einschließlich Lipoprotein hoher Dichte (HDL) und Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) und (iv) Endotoxin aus verschiedenen gram-negativen Organismen in seiner Fähigkeit, die LAL-Kaskade auszulösen, variiert. So kann es sein, daß die absoluten Endotoxin-Spiegel in einer Patientenprobe nicht den tatsächlichen Konzentrationen von in vivo vorliegendem bioaktiven Endotoxin entsprechen.
- Zwei verwandte Proteine sind bei Menschen und anderen Tieren identifiziert worden, die LPS mit hoher Affinität binden. Diese zwei Proteine, Lipopolysaccharid-bindendes Protein (LBP) und bakterizides/Permeabilität-erhöhendes-Protein (BPI) haben ungefähr dasselbe Molekulargewicht und teilen 45% Aminosäurehomologie, weisen jedoch ausgeprägte physiologische Unterschiede auf. LBP ist ein 60 kD-Glycoprotein, das in der Leber synthetisiert wird, während BPI in den azurophilen Granula der Neutrophilen gefunden wird. LBP wird im Serum normaler Menschen in Konzentrationen von 5-10 ug/ml gefunden, kann aber Konzentrationen von 50-100 ug/ml bei septischen Patienten erreichen. Schumann et al., Science, 249 : 1429 (1990) offenbart die Aminosäurensequenzen und codierende cDNA von sowohl menschli chem als auch Kaninchen-LBP. LBP hat, wie BPI, eine Bindungsstelle für Lipid A und bindet an das LPS von rauh(R-)- und glatt(S-)-Form-Bakterien. LBP hat, nicht so wie BPI, keine signifikante bakterizide Aktivität. Es ist beobachtet worden, daß BPI die Produktion von TNF, welche aus der Wechselwirkung von LBP mit LPS und CD14 an Monocyten und Makrophagen resultiert, neutralisiert und inhibiert. Marra et al., J. Immunol. 148 : 532 (1992), Weiss et al., J. Clin. Invest. 90 : 1122 (1992). Im Gegensatz ist beobachtet worden, daß LBP LPS-induzierte TNF-Produktion verstärkt. Wright et al., Science, 249 : 1131 (1990). So ist erkannt worden, daß LBP, im Gegensatz zu BPI ein immunstimulatorisches Molekül ist. Siehe z. B. Seilhamer, Internationale PCT-Anmeldung WO 93/06228, welche eine variante Form von LBP offenbart, die sie LBP-β nennt. Ebenso von Interesse für die vorliegende Erfindung sind Ulevitch, Internationale PCT-Anmeldung WO 91/01639, die, unter anderen Dingen, anti- LBP-Antikörper als ein therapeutisches Anti-Sepsis-Mittel offenbart, und US-Patent Nr. 5,245,013, welches LBP betrifft und Antikörper offenbart, die mit einem Polypeptid immunreagieren, das Homologie mit LBP hat.
- LBP ist auf dem Gebiet als ein "Akute-Phase-Protein" charakterisiert worden, d. h. eines vieler Plasmaproteine (wie etwa C-reaktives Protein, Fibrinogen und Serum-Amyloid A), die als Antwort auf infektiöse und nicht-infektiöse gewebedestruktive Vorgänge in Konzentration anwachsen. Daher würde es vorhergesagt, daß LBP-Spiegel in Proben aus Patienten, die an einer Zahl von Autoimmunkrankheiten leiden, wie etwa rheumatoider Arthritis und Lupus erythematodes, erhöht sein würden.
- Von Interesse für die vorliegende Erfindung sind Offenbarungen, die sich auf das Testen von BPI-Aktivität in Versuchspersonen beziehen. Von der Mohien et al., Abstract, 13th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, Brüssel (März 1993) offenbart die Resultate von Assays auf Serum-Spiegel von BPI bei Patienten mit gram-negativer Sepsis und gesunden Versuchspersonen. Die Zusammenfassung offenbart, daß kein BPI unter den Bedingungen des Assays im Serum von gesunden Versuchspersonen nachweisbar war, während zirkulierendes BPI bei allen septischen Patienten nachgewiesen wurde. Ebenso von Interesse ist die Offenbarung von mit-anhängiger US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/175,276, mit Mitinhaber, eingereicht am 29. Dezember 1993, die eine continuation-in-part von Anmeldung 08/125,677, eingereicht am 22. September 1993, veröffentlicht als WO 95/08773 (Europäische Patentanmeldung Nr. 94928653.8), ist. Diese Patentanmeldungen offenbaren, daß Konzentrationen von BPI in Blutplasmaproben mit der Anwesenheit oder Abwesenheit von Sepsis korrelieren, während Konzentrationen von BPI in Blutserum-Proben dies nicht tun. Die Pa tentanmeldungen lehren, daß Konzentrationen von BPI, das im Serum vorliegt, für endogene extrazelluläre Konzentrationen von BPI in zirkulierendem Blut nicht repräsentativ sind, während Konzentrationen von BPI im Plasma dies sind.
- Ebenso von Interesse für die vorliegende Erfindung sind die Offenbarungen von Leturcq et al., Keystone Tahoe Endotoxin Conference, 1.-7. März, 1992 (Abstract), in denen die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegenüber menschlichem LBP berichtet wird. Ebenso berichtet wird das Screening von normalen menschlichen Serum-Proben auf die Anwesenheit von LBP. Es wurde berichtet, daß LBP-Konzentrationen für normale Serum-Proben im Bereich von 1 ug/ml bis 24 ug/ml liegen, mit einem Durchschnitt von 7 ug/ml. Weiter von Interesse ist die Offenbarung von Richard Ulevitch am American Society for Microbiology General Meeting in Atlanta, Georgia, 16. - 21. Mai (1993), bei dem Daten über Spiegel von LBP und löslichem CD14 im Serum von septischen und gesunden Individuen präsentiert wurden. Die durchschnittlichen Konzentrationen von löslichem CD14 und LBP im Serum von gesunden Erwachsenen waren 1 ug/ml bzw. 7 ug/ml. Es wurde berichtet, daß die durchschnittlichen Konzentrationen von löslichem CD14 und LBP im Serum von septischen Patienten 2 ug/ml bzw. 55 ug/ml sind.
- Geller et al., Arch. Surg., 128 : 22-28 (1993) offenbaren Experimente, in denen die Induktion von LBP-mRNA in drei Modellen studiert wurde, von denen bekannt ist, daß sie Akute- Phase-Antworten auslösen: (1) LPS-Injektion; (2) Injektion von Corynebacterium parvum; und (3) Injektion von Terpentin. Die Veröffentlichung berichtet, daß LBP-mRNA während Leberentzündung induziert wird und legt nahe, daß LBP ein Akute-Phase-Protein ist, das bei der Regulierung der in vivo-Antwort auf Endotoxin wichtig ist.
- Gallay et al., Infect. Immun., 61 : 378-383 (1993) offenbaren, daß eine Akute-Phase-Antwort bei Mäusen, denen Silbernitrat injiziert wurde, LBP-Synthese induzierte, und daß LBP- Konzentrationen annähernd zehnfach über normale Konzentrationen nach einer Akute-Phase- Antwort anwachsen.
- Auf dem Gebiet gibt es einen Wunsch nach Verfahren zum Bestimmen des Ausgesetztseins von Versuchspersonen gegenüber Endotoxin und zum Unterscheiden der Wirkungen des Ausgesetztseins gegenüber Endotoxin von anderen physiologischen Akute-Phase-Antworten. Ebenso erwünscht sind Verfahren zum Diagnostizieren der Anwesenheit oder der Heftigkeit von gram-negativer Sepsis in einer Versuchsperson und zum Vorhersagen der Prognose einer Versuchsperson, die an Sepsis leidet.
- Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit zum Bestimmen des Ausgesetztseins einer Versuchsperson gegenüber Endotoxin, indem auf LBP getestet wird. Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Screenen auf Ausgesetztsein gegenüber gram-negativem bakteriellem Endotoxin in einer Akute-Phase-Antwort bei Menschen bereit, indem auf LBP getestet wird. Insbesondere umfaßt das Verfahren die Schritte: Bestimmen der Konzentration von LBP in einer Probe von Körperflüssigkeit von der Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration von LBP mit einem Standard, welcher einen Hinweis auf das Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin gibt. Solche Standards können einen subjektiven Standard für eine gegebene Versuchsperson einschließen, der durch LBP-Spiegel dieser Versuchsperson in einem Vorbehandlungszustand, wie etwa vor einer Operation, bestimmt wird. Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin als eine Konsequenz einer solchen Operation kann bestimmt werden, indem postoperative LBP-Spiegel mit dem Standard verglichen werden, der vor der Operation für diese Versuchsperson festgesetzt wurde. Wo der Zugang zu einer Vorbehandlungs-Standard- Konzentration von LBP für ein gegebenes Individuum nicht erhältlich ist, können objektive Standards, die auf Populations- oder Subpopulations-Durchschnittswerten beruhen, zum Vergleich angewandt werden. Ein solcher Standard kann eine Konzentration sein, die größer als näherungsweise 15 ug/ml in menschlichem Plasma oder Serum ist, wie hierin für LBP-Werte bei Versuchspersonen bestimmt wurde, die an zahlreichen Krankheitszuständen leiden. Versuchspersonen, die LBP-Konzentrationen oberhalb dieses Standards aufweisen, könnten mutmaßlich als an Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin leidend diagnostiziert werden, während diejenigen mit Spiegeln unterhalb dieses Standards dies nicht würden. Es ist klar, daß alternative Standards festgesetzt werden könnten in Abhängigkeit von der erwünschten Empfindlichkeit und Selektivität eines Assay-Verfahrens und von der Subpopulation, in die eine gegebene Versuchsperson fällt. Z. B. könnten Standards bei verschiedenen Konzentrationen festgesetzt werden für verschiedene Alter, Geschlechter, ethnische Herkünfte und zugrundeliegende Gesundheitsbedingungen verschiedener Subpopulationen. Darüberhinaus sollte verstanden werden, daß sich Standard-Konzentrationen entsprechend der Identität der individuellen Körperflüssigkeit, die getestet wird, unterscheiden werden.
- Weiterhin stellt die Erfindung Verfahren zum Diagnostizieren einer Versuchsperson bereit, die die Schritte umfassen: Bestimmen der Konzentration von LBP in einer Probe von Körperflüssigkeit von der Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration von LBP mit einem Standard, der auf die Anwesenheit oder Heftigkeit von Sepsis hinweist. Weiterhin stellt die Erfindung Verfahren zur Vorhersage der Prognose einer Versuchsperson bereit, welche die Schritte umfassen: Bestimmen der Konzentration von LBP in einer Probe von Körperflüssigkeit von der Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration von LBP mit einem Standard, der auf die Prognose einer Versuchsperson hinweist, die an Sepsis leidet.
- Fig. 1 zeigt die Dosis-Anwort-Kurven für rLBP, rLBP&sub2;&sub5;, rBPI und rBPI&sub2;&sub3; bei LBP-Sandwich- Assays;
- Fig. 2 stellt die LBP-Spiegel (Mittelwert ± Standardfehler) im Plasma gesunder menschlicher Versuchspersonen und menschlicher Versuchspersonen, die an verschiedenen Krankheitszuständen leiden, dar;
- Fig. 3 stellt die LBP-Spiegel (Mittelwert ± Standardfehler) bei gesunden Versuchspersonen dar, die mit LPS behandelt wurden;
- Fig. 4 stellt vergleichendes Überleben bei Patienten dar, bei denen eine gram-negative Sepsis vermutet wird, und die klassifiziert worden sind, entweder hohe oder niedrige Spiegel von Plasma-LBP zu haben; und
- Fig. 5a-5c stellen LBP-, C-reaktives Protein(CRP)- und Fibrinogen-Spiegel (Mittelwert ± Standardfehler) bei gesunden, rheumatoid-arthritischen und septischen Versuchspersonen dar.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Quantifizieren des Vorhandenseins von LBP in Körperflüssigkeiten, einschließlich Blut. Während der Assay verwendet werden kann, um die Anwesenheit und Quantität von LBP zu bestimmen, das therapeutisch verabreicht worden ist, ist er insbesondere nützlich zum Quantifizieren der Anwesenheit von endogenem LBP in zirkulierendem Blut als ein Hinweis auf das Ausgesetztsein einer Versuchsperson gegenüber Endotoxin. Darüberhinaus wird in Erwägung gezogen, daß Quantifizieren des Vorhandenseins von LBP bei diagnostischen und prognostischen Verfahren zum Bewerten von Patienten mit gram-negativer Sepsis nützlich ist.
- Die vorliegende Erfindung stellt einen Sandwich-ELISA-Assay für menschliches LBP bereit, der hohe Assay-Empfindlichkeit, hohe Spezifität und exzellente Reproduzierbarkeit aufweist. Wie hierin verwendet, schließt "LBP", das gemäß Assay-Verfahren quantifiziert worden ist, natives LBP, rekombinantes LBP, LBP-Fragmente und -Analoge sowie andere LBP-Proteine und -Proteinprodukte ein.
- Die Aminosäuren- und Nukleotid-Sequenz von rekombinantem LBP sind in mit-anhängiger US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/079,510, mit Mitinhaber, eingereicht am 17. Juni 1993, veröffentlicht als WO 95/00641 (PCT/U594/06931), wie in SEQ ID NO: 1 und 2 hierin gezeigt, dargelegt. Ein rekombinantes aminoterminales LBP-Fragment wird durch die Aminosäuresequenz der ersten 197 Aminosäuren des Aminoterminus von LBP charakterisiert, wie in SEQ ID NO: 3 und 4 dargelegt, deren Herstellung in mit-anhängiger US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/079,510, mit Mitinhaber, eingereicht am 17. Juni 1993, veröffentlicht als WO 95/00641 (PCT/US94/06931), beschrieben ist. Solche LBP-Proteinprodukte können leicht quantifiziert werden, wobei Assays, einschließlich immunologischer Assays und Bioassays im Sub- Nanogramm-pro-ml-Bereich verwendet werden. Immunologische Assays, die in der Lage sind, LBP zu quantifizieren, werden bevorzugt mit Enzym-gebundenen immunosorbierenden (ELISA) Sandwich-Assays durchgeführt, aber Kompetitions-Assays und immunologische Assays, die andere Markierungsformate benutzen, können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Assays der Erfindung benützen anti-LBP-Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper und affinitätsgereiniger polyklonaler Kaninchen-Antikörper. Polyklonale Kaninchen- anti-LBP-Antikörper können gemäß konventioneller Methoden unter Verwendung von LBP als ein Immunogen hergestellt werden. Nicht-immunologische Verfahren können ebenso verwendet werden, um auf LBP zu testen. Als ein Beispiel offenbaren Ulevitch et al., US-Patent Nr. 5,245,013 Assay-Verfahren, die Bindung von LBP an LPS und Trennung des Komplexes durch eine Zentrifugations-Dichtegradienten-Methode umfassen. Als ein anderes Beispiel offenbaren Geller et al., Arch. Surg. 128 : 22-28 (1993) LBP-Bioaktivitäts-Assays, bei denen die Hochregulierung von IL-6 und TNF gemessen werden.
- Körperflüssigkeiten, die auf die Anwesenheit von LBP getestet werden können, schließen Vollblut ein, wobei Blutserum und Blutplasma bevorzugt sind. Da LBP ein Serumprotein ist, wird erwogen, daß es ausgeschieden werden könnte, und daß Analyse der LBP-Spiegel im Urin diagnostische und prognostische Nützlichkeit bereitstellen könnte. Die LBP- Immunassays der Erfindung können ebenso verwendet werden, um die Konzentration von LBP in anderen Körperflüssigkeiten zu bestimmen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lungen-Spülungen, Glaskörperflüssigkeit, Crevicular-Flüssigkeit, Cerebrospinal-Flüssigkeit, Speichel und Synovialflüssigkeit.
- Da LBP als ein "Akute-Phase-Protein" charakterisiert worden ist, würde man erwarten, daß LBP-Spiegel bei Personen, die an Autoimmunkrankheiten leiden, erhöht wären. Als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, daß LBP-Konzentrationen im allgemeinen nicht über normal erhöht sind bei Versuchspersonen, die an akuter Lymphoblastenleukämie (ALL), akuter Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (aGvHD), chronischer Lymphozytenleukämie (CLL), cutanem T-Zell-Lymphom (CTCL), Typ-1-Diabetes, aplastischer Anämie (AA), Crohnscher Krankheit, Psoriasis, rheumatoider Arthritis (RA), Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes (SLE) leiden.
- Gewisse Versuchspersonen, die versuchsweise als an gram-negativer Sepsis leidend identifiziert wurden, letztendlich aber als an gram-positiver Sepsis leidend identifiziert wurden, hatten ebenso erhöhte LBP-Spiegel. Es wird festgestellt, daß Translokation von Bakterien und/oder Endotoxin aus dem Darm in den Blutstrom bei jeder Infektion stattfinden kann. So können Infektionen aufgrund von gram-positiven Bakterien oder Fungi ebenso zur Anwesenheit von Endotoxin oder gram-negativen Bakterien im Blut und deshalb zu erhöhten Konzentrationen an LBP führen.
- Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Beobachtung, daß Serum- und Plasma- Spiegel von LBP direkt mit dem Ausgesetztsein einer Versuchsperson gegenüber biologisch aktivem LPS korrelieren. Darüberhinaus scheinen LBP-Spiegel mit dem Überleben bei Patienten mit vermuteter gram-negativer Sepsis zu korrelieren. Z. B. tendierten Versuchspersonen mit Konzentrationen von zirkulierendem LBP unter 27,3 ug/ml (dem Mittelwert für 58 Versuchspersonen, die an gram-negativer Sepsis litten) dazu, einen größeren Überlebenswert über 14 Tage zu haben als diejenigen Versuchspersonen mit Konzentrationen von LBP oberhalb dieses Mittelwerts. Weiterhin hatten, wenn z. B. eine Plasma-LBP-Schwellenkonzentration auf 46 ug/ml gesetzt worden war, diejenigen Versuchspersonen mit einer Vorbehandlungs-LBP- Plasmakonzentration von weniger als 46 ug/ml eine signifikant größere Überlebensrate (p = 0,004) über eine 27-Tage-Periode als diejenigen Versuchspersonen mit einer Vorbehandlungs-Plasma-LBP-Konzentration größer als 46 ug/ml.
- Weiterhin wird von der Erfindung in Erwägung gezogen, daß erhöhte Konzentrationen von LBP aus dem Ausgesetztsein gegenüber größeren Mengen an Endotoxin resultieren können und deshalb diagnostisch für eine größere Infektion und/oder Endotoxinämie-Heftigkeit sein können. Erhöhte Konzentrationen an LBP können ebenso verwendet werden, um die Eignung der Verwendung von gegen gram-negative Bakterien gerichteten Antibiotika oder anderer therapeutischer, direkt gegen Endotoxin, wie etwa BPI, gerichteter Mittel, oder von anti- Endotoxin-Antikörpern, einschließlich des monoklonalen Antikörpers E5, anzuzeigen.
- Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden erläuternden Beispiele verstanden werden. Beispiel 1 betrifft die Herstellung von affinitäts-aufgereinigten Kaninchen-anti-BPI-Antikörpern; Beispiel 2 betrifft die Biotin- Markierung von solchen Antikörpern; und Beispiel 3 betrifft die ELISA-Prozeduren, die solche Antikörper verwenden. Beispiel 4 betrifft die vergleichende Immunreaktivität von rLBP, rLBP&sub2;&sub5;, rBPI und rBPI&sub2;&sub3;. Beispiel 5 betrifft die Messung von rLBP, das vereintem menschlichen Plasma zugegeben wurde; und Beispiel 6 betrifft den Vergleich von LBP-Spiegeln in menschlichem Plasma und Serum. Beispiel 7 betrifft die klinischen Korrelationen von endogener LBP-Immunreaktivität mit Sepsis und anderen Krankheitszuständen im menschlichen Plasma; und Beispiel 8 betrifft die Wirkung von LPS-Verabreichung auf endogene LBP- Spiegel in gesunden Versuchspersonen. Beispiel 9 betrifft klinische Korrelationen zwischen Plasma-LBP-Spiegeln und dem Überleben in Patienten mit vermuteter gram-negativer Sepsis; und Beispiel 10 betrifft klinische Korrelationen von Akute-Phase-Proteinen bei gesunden, rheumatoid-arthritischen und septischen Patienten.
- Gemäß diesem Beispiel wurde affinitäts-aufgereinigter Kaninchen-anti-rLBP-Antikörper hergestellt. Insbesondere wurde rLBP (20 mg), hergestellt gemäß mit-anhängiger US- Patentanmeldung Ser. Nr. 08/079,510, mit Mitinhaber, eingereicht am 17. Juni 1993, veröffentlicht als WO 95/00641 (PCT/US94/06931), an 10 ml Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,2 M Bicarbonat, pH 8,6, das 0,5 NaCl enthielt, gekoppelt. Annähernd 94% des rLBP war an das Harz gekoppelt. Vereinte Antiseren (125 ml) aus zwei Kaninchen, die anfänglich mit rLBP&sub2;&sub5;, das gemäß den Methoden von US- Patentanmeldung Ser. Nr. 08/079,510, eingereicht am 17. Juni 1993, veröffentlicht als WO 95/00641 (PCT/U594/06931) hergestellt war, und danach mit rLBP immunisiert waren, wurden mit einem gleichen Volumen Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2 (PBS), verdünnt. Eine Portion (50 ml) der verdünnten Antiseren wurde über die 10 ml rLBP-Sepharose-Säule geführt; die Säule wurde dann mit PBS gewaschen, und gebundene Antikörper wurden mit 0,1 M Glycin, pH 2,5, eluiert. Gesammelte Fraktionen wurden sofort mit 1 M Phosphat- Puffer, pH 8,0 neutralisiert. Peak-Frakionen wurden durch Messen der Extinktion bei 280 nm gemäß dem Verfahren von Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboatory Press, New York, S. 312 (1988) identifiziert. Nach mehreren sequentiellen Säulen-Zyklen wurde der affinitäts-aufgereinigte Kaninchen-anti-LBP-Antikörper gegen PBS-Azid, pH 7,2, dialysiert.
- In diesem Beispiel wurden 20 mg affinitäts-aufgereinigter Kaninchen-anti-rLBP-Antikörper, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1, mit 1 mg Biotinamidocaproat-N- Hydroxysuccinimidester (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 11 ml 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,3 für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht-konjugiertes Biotin wurde entfernt, und der alkalische Puffer durch Fraktionierung des Reaktionsgemisches auf einer PD-10 Säule (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NT), die mit PBS äquilibriert worden war, das 0,1% Natriumazid enthielt, ausgetauscht.
- 50 Mikroliter von affinitäts-aufgereinigtem Kaninchen-anti-rLBP-Antikörper (2 ug/ml in PBS) wurden über Nacht bei 2-8ºC inkubiert (oder alternativ eine Stunde bei 37ºC) in den Näpfen von Immulon-2- (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)- Mikrotiterplatten. Die Antikörper-Lösung wurde entfernt, und 200 ul 1% fettfreier Milch in PBS (Blockierungsmittel) wurde allen Näpfen zugegeben. Nach Blockieren der Platten für eine Stunde bei Zimmertemperatur wurden die Näpfe dreimal mit 300 ul Waschpuffer (PBS/0,05% Tween-20) gewaschen.
- Standards, Proben und Kontrollen wurden in dreifacher Ausfertigung mit PBS, das 1% bovines Serumalbumin, 0,05% Tween-20 (PBS-BSA/Tween) und 10 Einheiten/ml Heparin- Natrium (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, in separaten Platten mit 96 Näpfen verdünnt. rLBP oder rLBP&sub2;&sub5;-Standard-Lösungen wurden als serielle Zweifach-Verdünnungen von 100 auf 0,012 mg/ml hergestellt. Jedes Replikat und Verdünnung der Standards, Proben und Kontrollen (50 ul) wurde auf die blockierten Mikrotiter-Platten übertragen und für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach der Primär-Inkubation wurden die Näpfe dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Biotin-markierter Kaninchen-anti-LBP-Antikörper wurde 1/2000 in PBS-BSA/Tween verdünnt, und 50 ul wurde allen Näpfen zugegeben. Die Platten wurden dann für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Darauffolgend wurden alle Näpfe dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) wurde 1/2000 in PBS-BSA/Tween verdünnt, und 50 ul wurde allen Näpfen zugefügt. Nach Inkubation für 15 Minuten bei 37ºC wurden alle Näpfe dreimal mit Waschpuffer gewaschen und dreimal mit entionisiertem Wasser, und das chromogene Substrat p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml) in 10% Diethanolamin-Puffer) wurde in einem Volumen von 50 ul allen Näpfen zugegeben. Farbentwicklung ließ man für eine Stunde bei Zimmertemperatur fortschreiten, wonach 50 uL 1 M NaOH zugegeben wurde, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion bei 405 nm wurde für alle Näpfe bestimmt, unter Verwendung eines Vmax Plate Reader (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA).
- Die mittlere Extinktion bei 405 nm (A&sub4;&sub0;&sub5;) für alle Proben und Standards (in dreifacher Ausfertigung) wurden auf Hintergrund korrigiert, indem die mittlere A&sub4;&sub0;&sub5; der Näpfe abgezogen wurde, die nur Proben-Verdünnungspuffer (kein LBP) im Primär-Inkubationsschritt empfingen. Eine Standardkurve wurde dann als A&sub4;&sub0;&sub5; gegen ng/ml von rLBP oder rLBP&sub2;&sub5; aufgezeichnet. Der lineare Bereich wurde ausgewählt, eine lineare Regressionsanalyse wurde durchgeführt, und Konzentrationen wurden bestimmt für Proben und Kontrollen durch Interpolierung aus der Standardkurve.
- In diesem Beispiel wurde die Immunreaktivität von rLBP, rLBP&sub2;&sub5;, rBPI und rBPI&sub2;&sub3; in dem BPI-Sandwich-ELISA verglichen, um mögliche immunologische Kreuzreaktivität zu bestimmen. Trotz beträchtlicher Sequenz-Homologie zwischen LBP und PBI (siehe z. B. Schumann et al., Science, 249 : 1429 (1990)), zeigen die in Fig. 1 veranschaulichten Beispiele, daß, auf einer Massen-Basis, rBPI&sub2;&sub3; ein Signal produzierte, das annähernd drei Größenordnungen geringer als das von rLBP&sub2;&sub5; und rLBP war, während rBPI ein Signal produzierte, das annähernd fünf Größenordnungen geringer als das von rLBP und rLPB&sub2;&sub5; war. Z. B. erzeugte eine Konzentration von 100.000 ng/ml (100 ug/ml) rBPI oder 400 ng/ml rBPI&sub2;&sub3; ein Signal, das gleich dem war, welches durch 0,8 ng/ml rLBP oder 0,4 ng/ml rLBP&sub2;&sub5; erzeugt wurde. Diese Resultate demonstrieren minimale Kreuzreaktivität des Antikörpers mit BPI und bestätigen die Spezifität des Assays für LBP.
- In diesem Beispiel wurde die Wiedergewinnung von rLBP in menschlichen Blutflüssigkeiten bewertet, indem vereintes menschliches Plasma, das mit verschiedenen Konzentrationen an rLBP versehen und dann gefroren und vor Messung in dem Sandwich-ELISA aufgetaut wurde, untersucht wurde. Wiedergewinnung des zugesetzten LBP wurde definiert als die Menge von LBP, die in den damit versehenen menschlichen Plasmaproben gemessen wurde, minus der Konzentration in der nicht damit versehenen Kontrolle, geteilt durch die tatsächliche Menge, die der Probe zugesetzt worden war. Der wiedergewonnene Bruchteil wurde mit 100 multipliziert, und die Resultate wurden als Prozent der eingegebenen Konzentration ausgedrückt. Wiedergewinnung verschiedener Konzentrationen von rLBP, das vereinten menschlichen Plasmaproben zugesetzt worden war, war im Durchschnitt 68% und reichte von 59% bei 42 ug/ml zu 78% bei 168 ug/ml. Tabelle I faßt die Wiedergewinnungsdaten für jede Plasmaprobe, der LBP zugesetzt worden war, zusammen. TABELLE I Wiedergewinnung von rLBP, das vereintem, mit Citrat versehenen menschlichen Plasma zugesetzt worden war
- Gemäß diesem Beispiel wurden Konzentrationen von LBP im Serum und Plasma von gesunden Versuchspersonen getestet und verglichen, wobei der Sandwich-ELISA-Assay nach Beispiel 3 benutzt wurde. Es wurde gefunden, daß Plasma-Konzentrationen von LBP im wesentlichen die selben wie die Serum-Konzentrationen für LBP waren, wenn das Plasmavolumen auf Verdünnung korrigiert wurde (Division durch einen Faktor von 0,85), die aus der Zugabe eines Anti-Koagulans resultierte. Es wurde gefunden, daß Plasma-Konzentrationen bei normalen menschlichen Versuchspersonen 3,1 ug/ml (S. D. 0,9 ug/ml) waren oder 3,7 ug/ml (S. D. 1,1 ug/ml) korngiert, verglichen mit 3,7 ug/ml (S. D. 0,9 ug/ml) für Serum.
- In diesem Beispiel wurde endogene LBP-Immunreaktivität in menschlichen Plasma- oder Serumproben gemessen, die aus einer Vielzahl von Versuchspersonen gesammelt worden waren, die an gram-negativer Sepsis und einer Vielzahl von anderen klinischen Zuständen litten. Insbesondere wurden Plasma-Proben gesunder Individuen (30 Versuchspersonen) und Individuen, die mit gram-negativer Sepsis diagnostiziert worden waren (363 Versuchspersonen) auf LBP-Konzentrationen getestet. Serumproben von Individuen mit akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) (6 Versuchspersonen); akuter Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (aGvHD) (8 Versuchspersonen); chronischer Lymphocytenleukämie (CHL) (9 Versuchspersonen); cutanem T-Zell-Lymphom (CTCL) (12 Versuchspersonen); Typ-1-Diabetes (13 Versuchspersonen); aplastischer Anämie (AA (16 Versuchspersonen); Crohnscher Krankheit (8 Versuchspersonen); Psoriasis (13 Versuchspersonen); rheumatoider Arthritis (RA) (86 Versuchspersonen); Sklerodermie (4 Versuchspersonen) und systemischem Lupus erythematodes (SLE) (10 Versuchspersonen) wurden auf LBP-Konzentrationen getestet. Die Resultate sind in Fig. 2 gezeigt.
- Während LBP-Spiegel bei Versuchspersonen, die als an gram-negativer Sepsis leidend diagnostiziert worden waren, erhöht waren, wurde gefunden, daß LBP-Spiegel nicht über normal erhöht waren bei Versuchspersonen, die an akuter Lymphoblastenleukämie, akuter Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, chronischer Lymphozytenleukämie, cutanem T-Zell- Lymphom, Typ-1-Diabetes, aplastischer Anämie, Crohnscher Krankheit, Psoriasis, rheuma toider Arthritis, Sklerodermie und systemischem Lupus erythematodes (SLE) litten. Entsprechend ist der LBP-Assay der Erfindung wertvoll zum Unterscheiden von Zuständen, die mit Endotoxin assoziiert sind, von anderen Akute-Phase-Zuständen (wie etwa RA, SLE und ähnlichen).
- In diesem Beispiel wurde die Wirkung von LPS-Verabreichung auf endogene LBP- Immunreaktivität bei gesunden menschlichen Versuchspersonen bestimmt. Insbesondere wurden gesunde Versuchspersonen unter Verwendung des LBP-Sandwich-Assays auf Veränderungen der LBP-Plasma-Konzentrationen überwacht zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Verabreichung von 4 ng/kg LPS (16 Versuchspersonen) oder bei Kontroll- Versuchspersonen (2), welche nicht LPS empfingen. Die in Fig. 3 illustrierten Resultate zeigen die Veränderung der mittleren Plasma-LBP-Konzentration mit der Zeit. Für die Versuchspersonen, die mit LPS behandelt worden waren, begannen die LBP-Spiegel ungefähr 6 Stunden nach LPS-Verabreichung anzusteigen. Spitzen-LBP-Plasma-Konzentrationen wurden bei den meisten Versuchspersonen zwischen 10 bis 12 Stunden nach der LPS-Verabreichung beobachtet. Der durchschnittliche Anstieg von Grundlinien- zu Spitzen-LBP-Konzentration war näherungsweise dreifach. Über diese Zeitperiode verblieben die mittleren LBP- Konzentrationen bei den Kontroll-Versuchspersonen innerhalb eines normalen Bereichs (annähernd 5 ug/ml).
- Es wird erwogen, daß zusätzliche Analyse die Korrelation zwischen LBP-Spiegeln in Körperflüssigkeiten mit den Symptomen des Ausgesetztseins gegenüber Endotoxin illustrieren wird, und daß LBP-Spiegel diagnostisch und prognostisch für Krankheitszustände sein werden, die aus dem Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin resultieren.
- Es wird erwogen, daß zusätzliche Analyse die Korrelation von LBP-Spiegeln mit Symptomen von bakteriellen Infektionen, Endotoxinämie und Sepsis, einschließlich Sepsis-assoziierter Zustände, einschließlich disseminierter intravaskulärer Koagulierung (DIC) und akuten Atemnotsyndroms (ARDS) illustrieren wird.
- Korrelationen zwischen Plasma-LBP-Spiegeln und Überleben bei Patienten mit vermuteter gram-negativer Sepsis wurden verglichen unter Verwendung von Daten, die bei den septischen Versuchspersonen, welche in Beispiel 7 beschrieben worden sind, erhalten worden waren. In diesem Fall wurde eine Standard-LBP-Konzentration auf 46 ug/ml festgesetzt, und Patienten mit vermuteter gram-negativer Sepsis wurden klassifiziert als mit entweder hohen (> 46 ug/ml) oder niedrigen (< 46 ug/ml) LBP-Plasma-Spiegeln, wie gemessen in den Vorbehandlungsproben. Wie in den in Fig. 4 präsentierten Daten gezeigt wird, hatten die Versuchspersonen mit niedrigen Vorbehandlungs-Plasma-Spiegeln von LBP eine signifikant größere Überlebensrate (p = 0,004) über eine 27-Tage-Periode als die Versuchspersonen mit einem hohen Vorbehandlungs-Plasma-LBP-Spiegel. Diese Daten zeigen die Nützlichkeit, LBP- Spiegel zu testen und sie mit einem Standard-LBP-Wert zu vergleichen, um die Prognose von Patienten, die an Sepsis leiden, vorherzusagen.
- Plasma-Spiegel von LBP, C-reaktivem Protein (CRP) und Fibrinogen wurden in kleinen Gruppen von gesunden, rheumatoid-arthritischen und septischen Patienten gemessen, mit den Resultaten, die in Fig. 5a (LBP-Spiegel), 5b (CRP-Spiegel) und 5c (Fibrinogen-Spiegel) gezeigt sind. Die Resultate zeigen, daß, bezüglich gesunder Versuchspersonen, mittlere Fibrinogen-Spiegel annähernd 2,5-fach erhöht waren für sowohl rheumatoid-arthritische als auch septische Versuchspersonen. Bezüglich gesunder Versuchspersonen wurde gefunden, daß mittlere CRP-Konzentrationen annähernd 40-fach erhöht waren für rheumatoid-arthritische Versuchspersonen und 200-fach für septische Versuchspersonen. Im Gegensatz hierzu und konsistent mit den Resultaten in Beispiel 7 waren die mittleren LBP-Konzentrationen nur geringfügig erhöht (weniger als 2-fach) für rheumatoid-arthritische Versuchspersonen, während die mittleren LBP-Konzentrationen mehr als 6-fach für septische Versuchspersonen erhöht waren.
- Die Begriffe Sepharose, Immulon und Tween, die hierin verwendet werden, sind alle registrierte Handelsmarken.
- Es wird erwartet, daß zahlreiche Modifikationen und Variationen bei der Ausübung der Erfindung Fachleuten bei Betrachtung der vorhergehenden Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen einfallen werden. Demzufolge sind die einzigen Beschränkungen, die dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auferlegt werden sollten, die, welche in den angehängten Ansprüchen erscheinen.
Claims (21)
1. Ein Verfahren zum Diagnostizieren von Ausgesetztsein einer Versuchsperson gegenüber
Endotoxin, welches die Schritte umfaßt: Bestimmen der Konzentration von
Lipopolysaccharid-bindendem Protein (LBP) in einer Probe von Körperflüssigkeit von der
Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration von LBP mit einem Standard, welcher
einen Hinweis auf das Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin gibt, wobei eine LBP-
Konzentration oberhalb des Standards mutmaßlich diagnostisch dafür ist, daß die
Versuchsperson ein Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin erleidet, während eine
Konzentration unterhalb des Standards dies nicht ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Standard eine Konzentration ist, die größer als die
LBP-Konzentration für besagte Versuchsperson ist, die während einer
Vorbehandlungsperiode untersucht wurde.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin auf eine
Infektion oder einen Endotoxin-Krankheitszustand hinweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin auf Sepsis,
einschließlich Sepsis-assoziierter Zustände, hinweist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein erhöhter Spiegel von Lipopolysaccharid-
bindendem Protein auf stärkere Infektion und/oder Heftigkeit der Endotoxinämie
hinweist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei ein erhöhter Spiegel von Lipopolysaccharid-
bindendem Protein verwendet werden kann, um die Eignung der Verwendung von gegen
gram-negative Bakterien gerichteten Antibiotika oder anderer, direkt auf Endotoxin
zielender therapeutischer Mittel anzuzeigen.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Standard eine Konzentration ist, die größer als die
LBP-Konzentration für besagte Versuchsperson ist, die während einer Periode vor
Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin untersucht wurde.
8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Standard eine Konzentration ist, die größer als die
LBP-Konzentration für besagte Versuchsperson ist, die während einer Periode vor
Erleiden von Sepsis oder einem anderen Sepsis-assoziierten Zustand untersucht wurde.
9. Ein Verfahren zum Bestimmen der Prognose einer Versuchsperson, welches die Schritte
umfaßt: Bestimmen der Konzentration von Lipopolysaccharid-bindendem Protein in einer
Probe von Körperflüssigkeit von der Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration
von Lipopolysaccharid-bindendem Protein mit einem Standard, der auf einen
Krankheitszustand hinweist, welcher aus dem Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin
resultiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin auf Sepsis
hinweist, zum Bestimmen der Prognose einer Versuchsperson, welches die Schritte
umfaßt: Bestimmen der Konzentration von Lipopolysaccharid-bindendem Protein in einer
Probe von Körperflüssigkeit von der Versuchsperson und Korrelieren der Konzentration
von Lipopolysaccharid-bindendem Protein mit einem Standard, der auf Sepsis,
einschließlich Sepsis-assoziierter Zustände, hinweist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei ein erhöhter Spiegel von Lipopolysaccharid-
bindendem Protein auf ungünstige Prognose hinweist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Standard eine Konzentration ist, die größer als die
LBP-Konzentration für besagte Versuchsperson ist, die während einer Periode vor
Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin untersucht wurde.
13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Standard eine Konzentration ist, die größer als
die LBP-Konzentration für besagte Versuchsperson ist, die während einer Periode vor
Erleiden von Sepsis oder einem anderen Sepsis-assoziierten Zustand untersucht wurde.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Probe eine Blutprobe
ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei besagte Probe eine Plasma- oder
Serumprobe ist.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration von
Lipopolysaccharid-bindendem Protein mittels eines Immunassays bestimmt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Immunassay ein Sandwich-Immunassay ist.
18. Ein Verfahren zum Screenen auf Ausgesetztsein gegenüber gram-negativem bakteriellem
Endotoxin in einer Akute-Phase-Antwort bei Menschen, welches umfaßt:
(a) Messen des Spiegels von Lipopolysaccharid-bindendem Protein im Blutkreislauf einer
menschlichen Versuchsperson, und
(b) Vergleichen des Spiegels von Lipopolysaccharid-bindendem Protein, der in Schritt (a)
bestimmt worden ist, mit Spiegeln von Lipopolysaccharid-bindendem Protein im
Blutkreislauf bei normalen Versuchspersonen, wobei erhöhte Spiegel von
Lipopolysaccharid-bindendem Protein auf eine Akute-Phase-Antwort hinweisen,
welche gram-negatives bakterielles Endotoxin einbezieht.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Akute-Phase-Antwort mit Sepsis assoziiert ist.
20. Ein Verfahren zum Screenen auf Beteiligung von gram-negativem bakteriellem Endotoxin
an einer Akute-Phase-Antwort bei Menschen, welches umfaßt:
(a) In-Kontakt-Bringen einer Blutprobe von einer Versuchsperson, die eine Akute-Phase-
Antwort aufweist, mit einem spezifischen Bindungspartner für Lipopolysaccharid-
bindendes Protein,
(b) Bestimmen des Spiegels von Lipopolysaccharid-bindendem Protein in besagter
Blutprobe, und
(c) Vergleichen des Spiegels von Lipopolysaccharid-bindendem Protein, der in Schritt (b)
bestimmt worden ist, mit Spiegeln von Lipopolysaccharid-bindendem Protein im
Kreislauf bei normalen Versuchspersonen, wobei erhöhte Spiegel von
Lipopolysaccharid-bindendem Protein auf eine Akute-Phase-Antwort hinweisen,
welche gram-negatives bakterielles Endotoxin einbezieht.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Akute-Phase-Antwort mit Sepsis assoziiert ist.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: XOMA CORPORATION
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Quantifizierung von LBP in
Körperflüssigkeiten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun
(B) STRASSE: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive
(C) ORT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60606-6402
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy-Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: Sharp, Jeffrey S.
(B) REGISTRIERNUMMER: 31,879
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27129/31843
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 312/474-6300
(B) TELEFAX: 312/474-0448
(C) TELEX: 25-3856
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1443 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1443
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_pepfide
(B) LAGE: 76..1443
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 481 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 591 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..591
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP25"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 197 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP25"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
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US08/186,811 US5484705A (en) | 1994-01-24 | 1994-01-24 | Method for quantifying lipopolysaccharide binding protein |
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