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Diese Erfindung betrifft den Nachweis von
Präeklampsie. Insbesondere betrifft sie die frühe Diagnose von
Präeklampsie durch den Nachweis von erhöhten Spiegeln des
Hormons Inhibin A.
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Präeklampsie, anders bekannt als
Schwangerschaftseiweißausscheidung betreffender Bluthochdruck (GPH), ist eine
Multisystemerkrankung der Schwangerschaft von unbekannter
Ursache. Das mütterliche Syndrom ist durch verschiedene
Abnormalitäten charakterisiert: Erhöhung des Blutdrucks, Ödem,
Eiweißausscheidung und abnormale Gerinnselbildung, Leber- und
Nierenfunktion. Als Ursache von Präeklampsie wird
angenommen, dass sie in der Plazenta liegt und es gibt Hinweise für
einen zirkulierenden, endothelialen "toxischen" Zellfaktor,
der sehr wahrscheinlich von dem Syncytiotrophoblasten stammt.
Der Syncytiotrophoblast liefert die Kontaktoberfläche
zwischen der Plazenta und dem mütterlichen Blut und ist ein
mehrkerniges Syncytium mit einer extensiven mikrovillösen
Bürstengrenze.
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Präeklampsie ist ein relativ bekannter Zustand, der
ungefähr bei einer von zehn schwangeren Frauen vorkommt. Rund
10% der Fälle werden schwerer verlaufen. In schwereren Fällen
kann frühere Entbindung notwendig sein und es besteht deshalb
die Gefahr, dass das Kind behindert ist. Präeklampsie bleibt
auch eine Gefahr für das Leben von sowohl Neugeborenen als
auch Müttern.
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Die vorstehend beschriebenen Präeklampsiesymptome
sind im Allgemeinen von rund 28 Wochen bis zur
Vollständigkeit nachweisbar und treten normalerweise nicht vor 24 Wochen
auf. Herkömmliche Tests erfolgen hinsichtlich Nierenversagen
durch Messen von Harnstoff im Blut oder Protein im Urin und
auf erhöhten mütterlichen Blutdruck. Es gibt einige andere
Hinweise für Präeklampsie, einschließlich hormonelle. Keiner
von diesen Tests kann den Beginn von Präeklampsie jedoch für
mehr als einige Tage, bevor sekundäre Symptome deutlicher
auftreten, vorhersagen.
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Wenn Präeklampsie früher nachgewiesen werden könnte,
bevor klinische Symptome entstehen, wäre es bei betroffenen
Schwangeren möglich, beispielsweise durch Behandeln mit
antihypertensiven Arzneimitteln, wachsender Beobachtung und
Fötenüberwachung einzugreifen und dabei den fötalen und
mütterlichen Folgezustand zu verbessern.
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Somit gibt es einen Bedarf für einen neuen Test für
Präeklampsie und insbesondere einen Test, der den Beginn der
sekundären Symptome von Präeklampsie früher als bei
vorliegenden Tests voraussagen kann. Andere Tests werden
routinemäßig während der Schwangerschaft ausgeführt, beispielsweise
wird der Wirbelspalt bei der 16. Woche getestet. Wenn
Präeklampsie für einige Wochen im Fortschreiten von
möglicherweise dem Beginn von Symptomen getestet werden könnte, würde
mehr Zeit zum Behandeln verfügbar sein, um die Möglichkeit
von entstehenden schweren Problemen zu vermeiden.
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Es wurde nun gefunden, dass das Hormon Inhibin A in
Fällen von Präeklampsie verglichen mit normalen
Schwangerschaften wesentlich erhöht ist. Bevor sekundäre Symptome von
Präeklampsie nachweisbar sind, zeigte eine Gruppe von
Patientinnen, die im Begriff war, Präeklampsie zu entwickeln, einen
höheren mittleren Inhibin A-Spiegel als eine zweite Gruppe,
die keine Präeklampsie entwickelte.
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Inhibin A ist ein Mitglied der Familie von Inhibinen,
die heterodimere Proteine darstellen, bestehend aus αβA
(Inhibin A) und αβB (Inhibin B)-Untereinheiten. Der Begriff
"Inhibin A" wie hierin verwendet, bezieht sich auf das dimere
Protein, welches die biologisch aktive Form von Inhibin A
ist. Die zwei Proteinuntereinheiten sind durch Disulfidbindungen
miteinander verbunden. Inhibin A wird hauptsächlich
durch die Ovarien erzeugt und spielt eine endokrine Rolle
beim Inhibieren von hypophysen Follikel stimulierender Hormon
(FSH) Produktion. Bei der Schwangerschaft werden
zirkulierende Spiegel von Inhibin A erhöht, wobei die Plazenta die
Hauptquelle darstellt (Muttukrishna et al. 1995). Im
Gegensatz dazu sind Inhibin B-Spiegel weder bei Kontroll- noch bei
Präeklampsie-Schwangeren erhöht.
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EP 185 034 offenbart eine dimere Form von Inhibin,
welche sie bezüglich der
Molekulargewichtsuntereinheitstruktur und anderer Eigenschaften identifiziert. Die angegebenen
Größen sind 14 kD ± 2 kD und 44 kD. Spätere Untersuchungen
lassen vermuten, dass die primäre aktive Form von Inhibin A
in biologischen Flüssigkeiten ein 32 kD-Molekül, gebildet
durch ein 12 kD βA und 20 kD-Untereinheit, ist. Das 32 kD-
Inhibin ist die Mutterform, erzeugt durch posttranslationales
Verarbeiten von Vorstufenformen des Molekulargewichts 65 kD
und 56 kD. Immunoreaktives α-Monomer zirkuliert auch im
Körper. Die verschiedenen zirkulierenden Inhibinproteine werden
häufig zusammen als "Inhibinformen" bezeichnet.
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Es wurde auch gefunden, dass mütterliche periphere
Serumkonzentrationen der verwandten Hormone Pro-Alpha C und
Aktivin A, wenn als Gesamtaktivin A gemessen, bei
Präeklampsie deutlich erhöht sind, verglichen mit normalem
mütterlichem Serum. Aktivine sind Homodimere, bestehend aus βAβA
(Aktivin A), βAβB (Aktivin AB) und βBβB (Aktivin B)-
Untereinheiten, gebunden durch Disulfidbrücken. Aktivin A
kommt natürlich in freier Form und in gebundener Form,
gebunden an ein Protein, genannt Follistatin, vor. "Gesamt"-
Aktivin A weist auf beide Aktivin A, ob frei oder gebunden,
ein. Pro-Alpha C ist ein Teil der α-Untereinheit von Inhibin
A, welches nicht in dem biologisch aktiven Dimer vorliegt.
Serum-Konzentrationen an human chorionische Gonadotrophin
(hCG) sind bei Präeklampsie auch wesentlich höher, verglichen
mit normalem Schwangerenserum.
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Khalil et al. 1995 und Petraglia et al. 1995
offenbaren Hormonspiegel während normalen und abnormalen
Schwangerschaften, beschreiben jedoch keine Möglichkeit für einen Test
auf Präeklampsie oder regen diese an.
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Die vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt ein
Verfahren zur Diagnose von Präeklampsie bereit, wobei das
Verfahren das Messen von Inhibin A in einer biologischen
Probe umfasst.
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Die erfindungsgemäße Diagnose schließt voraussagende
Diagnose von Präeklampsie ein, das heißt eine Voraussage,
dass die sekundären Symptome von Präeklampsie, wie
Bluthochdruck, auftreten werden.
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Vorzugsweise ist die Probe eine mütterliche
Körperflüssigkeit. Die Probe kann eine Serum- oder Plasmaprobe aus
dem mütterlichen Blut sein. Alternativ kann sie
beispielsweise eine amniotische Flüssigkeitsprobe sein.
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In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die
Verwendung von Inhibin A-Spiegeln als einen Indikator von
Präeklampsie bereit.
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Die Erfindung kann weiterhin das Messen des Spiegels
von anderen Proteinen umfassen, die Hormone sein können und
die Verwendung von anderen solchen Proteinen zusammen mit
Inhibin A als Indikatoren von Präeklampsie. Die zusätzlichen
gemessenen Proteine können ein oder mehrere der Hormone
Aktivin A, Pro-Alpha C und hCG sein. Wenn Aktivin A gemessen
wird, ist dies vorzugsweise Gesamtaktivin A.
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Der Weg, auf dem die Messung von Inhibin A ausgeführt
wird, ist für die Erfindung nicht wesentlich. Kürzlich
entwickelte spezifische und empfindliche Assays für Inhibin A,
werden von Groome et al. 1994 und Muttukrishna et al. 1994
beschrieben. Die gegenwärtig bevorzugte Art zum Messen von
Inhibin A in einer biologischen Probe wendet eine Antikörper
spezifische für die α-Untereinheit von Inhibin A und eine
zweite Antikörper spezifische für die β-Untereinheit von
Inhibin A an.
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In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung
außerdem die Verwendung eines Antikörpersystems, das bei einem
Test für Präeklampsie für Inhibin A spezifisch ist.
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Gemäß der Erfindung werden die Spiegel von allen
Molekülformen von dimerem Inhibin A vorzugsweise gemessen
ungeachtet der Molekülgröße. Jedoch kann die Messung von speziell
der mütterlichen 32 kD-Form des Proteins für den
erfindungsgemäßen Zweck ausreichend sein.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, dass
Inhibin A-Spiegel in präeklamptischen Schwangerschaften
gegenüber normalen Schwangerschaften wesentlich erhöht werden.
Nicht nur das, es wurde auch gefunden, dass es keine
Überlappung von Inhibin A-Spiegeln zwischen präeklamptischen und
normalen Schwangerschaften gibt. Weiterhin wurde gezeigt,
dass bei einer frühen Stufe der Schwangerschaft, bevor die
sekundären Symptome von Präeklampsie normalerweise
nachweisbar sind, ein signifikant höherer Inhibin A-Spiegel bei einer
Gruppe von Patientinnen nachweisbar ist, welche Präeklampsie
entwickeln werden, verglichen mit einer Kontrollgruppe von
Individuen, die eine präeklamptische Schwangerschaft nicht
aufweisen.
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Bislang gab es noch keinen klinisch verwendbaren
Screeningtest für Frauen mit Risiko für Präeklampsie. Der
Nachweis von Patientinnen mit hohem Risiko von Präeklampsie,
bevor sich die Erkrankung entwickelt, wird eine erhöhte
Überwachung, Beobachtung des Wachstums und Wohlbefindens des
Fötus und der plazentalen Funktion erlauben. Es kann auch zu
neuen Verfahren des Eingriffs führen, um den Blutdruck zu
stabilisieren und die Nierenfunktion und möglicherweise die
Schwere der Erkrankung zu vermindern. Jeglicher Eingriff, der
die Schwangerschaftssicherheit verlängern kann, wird die Last
der Frühgeburt vermindern, welche die Hauptursachen für
fötale Sterblichkeit und neonatale und kindliche Behinderung
darstellen.
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In den beigefügten Figuren:
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Fig. 1 zeigt Assayvalidierungskurven, erstellt aus
Spiegeln von Inhibin A, Aktivin A und Pro-Alpha C in
mütterlichen Proben von präeklamptischen und
Kontrollschwangerschaften;
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Fig. 2 zeigt einzelne Konzentrationen von Inhibin A,
Aktivin A, Pro-Alpha C und hCG von einzelnen mütterlichen
Serumproben in präeklamptischen und Kontrollschwangerschaften;
und
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Fig. 3 zeigt ein Inhibin A und Aktivin
A-Immunoreaktivitätsprofil nach FPLC-Gelpermeationschromatographie
für Kontroll- und präeklamptisches mütterliches Serum.
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Fig. 4 zeigt mütterliche Serum Inhibin
A-Konzentrationen in normalen und präeklamptischen Schwangerschaften bei
verschiedenen Stufen der Schwangerschaft. Die Zahlenwerte
werden in Tabelle 1 angegeben.
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Fig. 5 zeigt mütterliche Serum Inhibin
A-Konzentrationen bei Individuen von 16. Schwangerschaftswoche für eine
Gruppe von Patientinnen, die Präeklampsie entwickeln werden
und für eine zweite Gruppe, die keine Präeklampsie entwickeln
werden.
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Die Erfindung wird nun weiterhin in den nachstehenden
Beispielen beschrieben.
Beispiele
Materialien und Methoden
Probennahme
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Blutproben, erhalten von 20 präeklamptischen
Patientinnen und 20 normalen Schwangeren, im Alter
zusammenpassender schwangerer Kontrollfrauen wurden für die Messung der
Hormone verwendet. Die Proben wurden in der
Präeklampsieklinik beziehungsweise der antenatalen Klinik erhalten und
wurden als Teil von anderen Untersuchungen, für die Patientinnen
ihre Zustimmung gegeben haben, gesammelt. Das Serum wurde
durch Zentrifugierung getrennt und bei -20ºC gelagert.
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Für 16 Wochen Schwangerschaft für Schwangerschafts-
Screening gesammelte Serumproben wurden analysiert. Serum von
15 schwangeren Frauen, die später in der Schwangerschaft
Präeklampsie entwickelten und 54 schwangere Kontrollfrauen, die
über die gesamte Schwangerschaft normal waren, wurden
analysiert.
Fraktionierung von Proben durch Chromatographie
(FPLC)
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Serumproben, zusammengeführt aus präeklamptischen
Patienten (n = 20) und schwangeren Kontrollfrauen (n = 20), wurden
durch Gelpermeationschromatographie fraktioniert. 100 ul
Serumproben wurden auf eine
Schnelle-Protein-Flüssig-Chromatographie-(FPLC)-Säule (Superose 12, Pharmacia Ltd., Milton
Keynes, Bucks, GB) aufgetragen, welche äquilibriert wurden
und mit Phosphat gepufferter Salzlösung (pH 7,4) enthaltend
0,1% (Gewicht/Volumen) Polypep (Sigma) und 0,05%
(Gewicht/Volumen) Natriumazid, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5
ml/Minute eluiert wurden. Die Fraktionen wurden für die
Messung von Inhibin A, Pro-Alpha C und Aktivin A gesammelt. Für
Eichzwecke wurden die Retentionszeiten der nachstehenden
Proteine bestimmt: α&sub2;-Makroglobulin (750 kDa);
Alkoholdehydrogenase (150 kDa); Rinderserumalbumin (66 kDa); rekombinantes
Inhibin A (32 kDa), rekombinantes Aktivin A (24 kDa) und
Cytochrom C (12,5 kDa).
Hormon Assays
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Inhibin A Serum und FPLC Fraktionskonzentrationen von
dimerem Inhibin A wurden in zweifacher Ausführung, 5 ul
beziehungsweise 25 ul aliquote Mengen, wie nachstehend und
andernorts beschrieben (Muttukrishna et al., 1994), gemessen.
Die mittleren Intra- und Inter-Assayvariationen waren 4,3%
beziehungsweise 5,1%. Die minimale Nachweisgrenze des Assays
für humanes rekombinantes Inhibin A (bereitgestellt von Dr.
M. Rose, NIBS, GB) war 2 pg/ml.
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Inhibin B-Serum-Konzentrationen von dimerem Inhibin B
wurden in zweifacher Ausführung unter Verwendung von 50 ul
eines Enzymimmunoassays, wie andernorts genauer (Groome et
al, 1996) mit einigen Modifizierungen beschrieben, gemessen.
Die minimale Nachweisgrenze des Assays für humanes
rekombinantes Inhibin B waren 30 pg/ml. Die mittleren Intra- und
Inter-Assayvariationen waren 6,2% beziehungsweise 7,2%.
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Pro-Alpha C-Serum- und FPLC-Fraktionskonzentrationen
von Pro-Alpha C wurden in zweifacher Ausführung unter
Verwendung von 25 ul beziehungsweise 50 ul aliquoten Mengen wie
vorstehend (Groome et al. 1995) mit einigen Modifizierungen
beschrieben, gemessen. Die minimale Nachweisgrenze des Assays
Pro-Alpha C Standard (Prof. N P Groome) war 5 pg/ml. Die
mittleren Intra- und Inter-Assayvariationen sind 6,8%
beziehungsweise 8,6%.
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Aktivin A-Serum- und FPLC-Fraktionskonzentrationen
von dimerem Aktivin A wurden unter Verwendung eines für
"Gesamt" Aktivin A spezifischen EIA wie nachstehend und
andernorts (Knight et al., 1996) beschrieben, gemessen. Die
mittleren Intra- und Inter-Assayvariationen waren 6,5%
beziehungsweise 7,7%. Die minimale Nachweisgrenze des Assays für
humanes rekombinantes Aktivin A (Genentech, USA) war 50 pg/ml.
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Die hCG Serumkonzentrationen von hCG wurden unter
Verwendung von Immulite-Chemilumineszenz-Assay-Kits
(Diagnostic Products Ltd.) gemessen. Alle Proben wurden dem
gleichen Assay unterzogen und die mittlere
Intra-Assayvariation war kleiner 10%.
Zweiseiten-Enzym-Immunoassay für dimere Inhibin-A
Beschichtung von Platten mit E4 gewonnenem Antikörper.
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Monoklonale Antikörper gegen die βA Untereinheit von
Humaninhibin wurden kovalent an 96-Vertiefungshydrazidplatten
(UniSyn Technologies Inc., Tustin, CA, USA) durch deren Kohlenhydrateinheiten
gebunden. Sofort vor der Verwendung wurden
die Platten mit Enzymimmunoassaypuffer (0,05% Tween 20
(Sigma, GB) in 0,05 M Tris Puffer pH 7,5) an einem
Mikroplattenwäscher gewaschen (10 Zyklen) und durch Umdrehen auf ein
Papierhandtuch getrocknet.
Herstellung und Oxidation von Standards und Proben
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Rekombinantes Humaninhibin A oder gereinigtes 32 kDa-
Rinderinhibin, verwendet als Bezugspräparate, wurden in
Enzymimmunoassay-Verdünnungsmittel allein [10% (Gewicht/Volumen)
Rinderserumalbumin (BSA), 5% (Volumen/Volumen) Mausserum
(Sigma), 5% (Volumen/Volumen) Triton X-100, 0,15 M
Natriumchlorid in 0,1 M Tris-HCl Puffer pH 7,5] oder in
Enzymimmunoassayverdünnungsmittel, vermischt mit einem äquivalenten
Volumen an zusammengegebenem postmenopausalem Human-Serum
(PMS), seriell verdünnt. Die Serumproben wurden wie geeignet
in Enzymimmunoassayverdünnungsmittel (normalerweise eine 1 : 1
Verdünnung eines normalen Zyklusserums: 1 : 10 Verdünnung von
hyperstimuliertem Serum, 1 : 2 000 Verdünnung von Human
follikularer Flüssigkeit) verdünnt. Die Verdünnungen von Standards
und Proben erfolgten in 2,5 ml Einweg-Kunststoffröhrchen. Die
Präassayoxidation von Standards und Proben wurde dann durch
Zugeben von frisch hergestellter Wasserstoffperoxidlösung
(10% Volumen/Volumen Sigma) unter Erzeugung einer
Endkonzentration von 2% (Volumen/Volumen) ausgeführt. Die Röhrchen
wurden sorgfältig vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur
vor dem Überführen von 100 ul aliquoten Mengen auf E4-
beschichtete Platten inkubiert.
Enzymimmunoassayverfahren
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Die Platten wurden in einer Feuchtigkeitskammer
angeordnet und bei 4º auf einer Schüttelplattform inkubiert. Nach
Inkubation über Nacht wurden die Platten gewaschen (10
Zyklen) vor dem Zugeben zu jeder Vertiefung von 50 ul
alkalischem Phosphat konjugierter α-Untereinheit von monoklonalem
Antikörper [R&sub1; F(ab); 1 : 32 000 Verdünnung]. Nach Verdünnen
für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem
Mikroplattenschüttler, wurden die Platten ausgiebig gewaschen (18
Zyklen), wobei die drei Endwaschzyklen unter Verwendung von
Waschpuffer ohne Tween 20 ausgeführt wurden. Quantifizierung
von gebundener alkalischer Phosphatase wurde unter Verwendung
eines kommerziell erhältlichen Enzymimmunoassay-Verstärkungs-
Kits (Immuno Select ELISA Amplification System, Gibco BRL,
Uxbridge, GB) welches gemäß den Anweisungen des Herstellers
angewendet wurde, ausgeführt. Um das Risiko von Temperatur
abhängiger Variation der Signalerzeugung zu minimieren,
wurden beide Inkubationsschritte bei Umgebungstemperatur
durchgeführt. Nach Inkubation mit "Kit-Substratlösung" (50
ul/Vertiefung) für eine Stunde an einem Mikroplattenschüttler
wurden 50 ul von "Kit-Verstärkerlösung" zu jeder Vertiefung
gegeben. Die Verstärkungsreaktion wurde gestoppt, bevor die
Vertiefungen mit den Blindproben begannen, durch Zugeben von
50 ul 0,3 M Schwefelsäure (normalerweise gestoppt nach rund
einer Stunde) eine wesentliche Farbentwicklung zu zeigen. Die
Absorption von 492 nm wurde an einem
Enzymimmunoassayplattenleser gelesen und die Daten durch
Immunoassaykurvenanpassungssoftware (Riacalc. Pharmacia-LKB, Milton Keynes, GB)
verarbeitet.
Aktivin A-Enzymimmunoassay
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Aktivin A-Konzentrationen wurden unter Verwendung
eines Zweiseiten EIA gemessen. Die Standards (rekombinantes
Human Aktivin A) und Proben wurden, falls geeignet, in PBS
enthaltend 10% (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin (BSA) und
0,1% (Gewicht/Volumen) Natriumazid verdünnt. 125 ul Volumina
von verdünnten Proben und Standards wurden in 1,5 ml
Mikrofugenröhrchen überführt und mit einem gleichen Volumen (125 ul)
an destilliertem Wasser, enthaltend 20% (Gewicht/Volumen)
Natriumdodecylsulfat (SDS) verdünnt. Nach einer Inkubation
bei 90 bis 95ºC für 10 Minuten wurden die Röhrchen vor dem
Zugeben von 20 ul Wasserstoffperoxidlösung (30%
Volumen/Volumen, Sigma) gekühlt. Nach einer weiteren Inkubation bei
Raumtemperatur für 10 Minuten wurden aliquote Mengen von
denaturierten und oxidierten Proben/Standards in doppelter
Ausführung zu E4 Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten,
enthaltend 25 ul EIA Plattenpuffer/Vertiefung (0,1 M Tris-HCl,
0,15 M NaCl, 10% (Gewicht/Volumen) BSA, 5% (Volumen/Volumen)
Triton X-100 und 0,1% (Gewicht/Volumen) Natriumazid, pH 7,5)
überführt. Nach Zugeben zu jeder Vertiefung von 25 ul EIA
Plattenpuffer, enthaltend rund 35 ng biotinylierten E4
monoklonalen Antikörper, wurden die Platten über Nacht in einer
Feuchtigkeitsbox bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach
Waschen (15 Zyklen) mit EIA Waschpuffer (0,05 M Tris-HCl, 0,15
M NaCl, 0,05% Volumen/Volumen Tween-20, 0,05% Volumen/Volumen
Natriumazid, pH 7,5) wurden 50 ul alkalische Phosphatase
konjugiertes Extravidin (1 : 10 000 Volumen/Volumen, Sigma)
zugegeben und die Platten zwei Stunden bei Raumtemperatur in
einer Feuchtigkeitsbox inkubiert. Die Platten wurden sorgfältig
gewaschen (18 Zyklen) und gebundene alkalische Phosphatase
unter Verwendung eines erhältlichen ELISA Verstärkungs-Kits
(Immunoselect ELISA Amplification system, Gibco-BRL,
Uxbridge, GB) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert.
Die Nachweisgrenze war 10 pg/Vertiefung und Intra- und Inter-
Assay Variationskoeffizienten (CV) waren 5,0 bzw. 0,1%. Die
Kreuzreaktion von rh Inhibin A, Inhibin B und Aktivin B wäre
< 0,5%. Die Kreuzreaktion von rh Follistatin-288 (Gabe von
NIDDK) und Rinder Pro-αC wäre < 0,1%. Weder Follistatin (500
ng/ml) noch Human α2 Makroglobulin (α2M, 100 ug/ml,
Calbiochem) traten mit dem Assay in Wechselwirkung und die
Gewinnung von Aktivin A-Standard, zugegeben zu Humanserumproben,
war 96 ± 5% (n = 12 Proben).
Statistische Analyse
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Nicht paarweise Student-t-Tests wurden ausgeführt, um
die Konzentrationen an Hormonen von Kontroll- und präeklamptischen
Patienten zu vergleichen. Die Spearman-
Korrelationsanalysen wurden ausgeführt, um die Beziehung
zwischen Hormonen, Trombozytenzählungen und Blutdruck bei
Präeklampsie zu untersuchen. Die gesamte statistische Analyse
wurde unter Verwendung von Graph Pad Prism statistical
package unter Anwendung von 95%iger Vertrauensintervallgrenze
ausgeführt.
Ergebnisse
A) Für Serumproben, genommen zwischen 20 und 38
Wochen Schwangerschaft (Mittelwert 29 Wochen)
Verhalten von normalen und präeklamptischen
Schwangerschaftsseren in den EIA.
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Serielle Verdünnungen von Kontroll- und
präeklamptischem Serum ergaben Reaktionskurven bei dem Inhibin A (Fig.
1a), Pro Alpha C (Fig. 1c) und Aktivin A (Fig. 1b)
Enzymimmunoassays, die zu jenem für den human rekombinanten
Inhibin A-Standard, human Pro Alpha C-Standard beziehungsweise
human Inhibin B-Standard parallel waren. Die Gewinnung von
exogenem humanem rekombinantem Inhibin A (3,8 pg/Vertiefung),
humanem rekombinantem Aktivin A (100 pg/Vertiefung) und Pro
Alpha C (5 pg/Vertiefung) zugegeben vor dem Assay zu
aliquoten Mengen von Schwangerschafts-Kontrollserum (105 ± 6%,
113 ± 13% beziehungsweise 98 ± 3,2%) und Präeklampsieserum
(94,9 ± 6,7%, 122,4 ± 19,2% beziehungsweise 105 ± 10,5%), waren
fast quantitativ.
Serumkonzentrationen von Inhibin A, Pro Alpha C und
Aktivin A (Fig. 2)
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Mütterliche Serumkonzentrationen von Inhibin A (Fig.
2a) waren, verglichen mit Kontrollschwangeren bei
Präeklampsie, 8-fach (P < 0,001) erhöht. Periphere Konzentrationen
von Pro Alpha C (Fig. 2c) waren fast 3-fach (P < 0,001)
erhöht
und Spiegel von Aktivin (Fig. 2b) waren signifikant (~
9-fach, P < 0,001) bei Präeklampsie erhöht.
Serumkonzentrationen von hCG
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Periphere Serumkonzentration von hCG war 4-fach höher
(P < 0,001) bei Präeklampsie (59,05 ± 9,27 IU/ml) verglichen mit
mütterlichem Schwangerschafts-Kontrollserum (16,3 ± 1,84 IU/ml)
(Fig. 2d).
Gelpermeationschromatographie (Fig. 3)
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Die Messung von Inhibin A und Aktivin A in dem
chromatographischen Profilen von zusammengegebenen
präeklamptischen und Schwangerschafts-Kontrollseren wies nur einen
Hauptpeak von Inhibin (32 kDa) und Aktivin A (> 100 kDa) in
den Enzymimmunoassays nach. Spiegel von Pro Alpha C waren
gerade oberhalb der Nachweisgrenze in den präeklamptischen
Serumfraktionen und nicht nachweisbar bei den
chromatographischen Kontrollserum-Fraktionen. Inhibin A eluierte gemeinsam
mit dem human rekombinanten Inhibin A (32 kDa) und gibt die
vollständig verarbeitete reife Form von Inhibin A wieder.
Jedoch eluierte Aktivin A-Immunoreaktivität mit einem
scheinbaren Molekulargewicht > 100 kDa, was vermuten lässt, dass fast
alles Aktivin A in Zirkulation an Aktivinbindungsproteine
ohne nachweisbares "freies" Aktivin A gebunden ist, was der
Elutionsposition von human rekombinantem Aktivin A (~25 kDa)
entspricht.
B) Für Serumproben bei 16. Schwangerschaftswoche
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Die Messung von Serum Inhibin A in Proben, genommen
in der 16. Schwangerschaftswoche, weist eine signifikant
höhere mittlere Inhibin A-Konzentration für eine Gruppe von
Individuen aus, die unter Präeklampsie leiden (327 ± 27,15 pg/ml)
verglichen mit einer Kontrollgruppe, die keine Präeklampsie
entwickelte (197,67 ± 23,77 pg/ml) (P = 0,0097). Die Ergebnisse
werden in Fig. 5 gezeigt.
Literaturstellen
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Groome, N. P., Illingworth P. J., O'Brien, M., Cook,
I., Ganesan, T. S., Baird, D. T. und McNeilly, A. S. (1994)
Clinical Endocrinology, 40, 717-723.
-
Groome, N. P., Illingworth P. J., O'Brien, M.,
Priddle, J., Weaver, K. und McNeilly, A. S. (1995) Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism, 80, 2926-2932.
-
Groome, N. P., Illingworth P. J., O'Brien, M., Pai,
R., Rodger, F. E., Mather, J. und McNeilly, A. S. (1996)
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism (im Druck).
-
Khalil, A., Kaufmann, R. C., Wortsmann, J., Winters,
S. J. und Huffmann, D. G. (1995) Am. J. Obstet. Gynaecol. 172,
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-
Knight, P.G, Muttukrishna S. und Groome, N. P. (1996)
Journal of Endocrinology 148, 267-279.
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Muttukrishna, S., Fowler, P. A., Groome, N. P.,
Mitchell, G. G., Robertson, W. R. und Knight, P. G. (1994) Human
Reproduction 9, 1634-1642.
-
Muttukrishna, S., George, L. Fowler, P. A., Groome,
N. P. und Knight, P. G. (1995) Endocrinology 42, 391-397.
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Petraglia, F., Aguzzoli, L., Gallinell, A., Florio,
P., Zonca, M., Benedetto, C. und Woodruff, K. (1995) Placenta
16, 447-454.
Legenden der Figuren
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Fig. 1 Parallele Reaktionskurven für serielle
Verdünnungen von Proteinstandard, gepooltem Schwangerschafts-
Kontrollserum und gepooltem Präeklampsieserum in den (a)
Inhibin A, (b) Aktivin A und (c) Pro Alpha C Enzymimmunoassays.
Die Werte sind Mittelwerte von zweifachen Bestimmungen der
Absorbtion.
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Fig. 2 Streukurven von einzelnen Konzentrationen von
a) Inhibin A, b) Aktivin A, c) Pro Alpha C und d) hCG in
mütterlichem Serum von Präeklampsie (n = 20) und
Kontrollschwangerschaft (n = 20).
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Fig. 3 Profil von (a) Inhibin A und (b) Aktivin A
Immunoreaktivität, gemessen durch EIA- nach FPLC-
Gelpermeationschromatographie von 100 ul Proben von
mütterlichem Kontroll- oder Präeklampsie-Serum. Die Werte sind
Mittelwerte ± SEM (n = 3 getrennte Fraktionierungen). Die
Elutionspositionen der nachstehenden Proteine werden angegeben:
α&sub2;-Makroglobulin (Vo, 725 kDa), Alkoholdehydrogenase (AD, 150
kDa) Rinderserumalbumin (BSA, 66 kDa), rekombinantes Human
Inhibin A (32 kDa), Human rekombinantes Aktivin A (24 kDa)
und Cytochrom C (12,5 kDa).
Hormonkonzentrationen in mütterlichem Serum
Tabelle 1 Präeklampsie
Tabelle 1 (Fortsetzung) Kontrolle