CN105074461A - 用于检测抗生物制品治疗的中和性自身抗体的测定 - Google Patents

用于检测抗生物制品治疗的中和性自身抗体的测定 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测和测量样品中抗生物制品(如抗TNFα药物治疗剂)的中和性自身抗体和非中和性自身抗体的存在或水平的测定。本发明用于监测个体进行生物制品治疗时，随着时间推移，中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明还用于预测和/或测定个体样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制品治疗的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受生物制剂治疗的那些个体的治疗决定的信息，并改善优化治疗、降低毒性和/或监测生物制品治疗的治疗处理的功效的准确性。

Description

用于检测抗生物制品治疗的中和性自身抗体的测定
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月13日提交的美国申请号13/802,117的优先权，美国申请号13/802,117是2012年7月6日提交的PCT申请号PCT/US2012/045794的部分继续申请，PCT申请号PCT/US2012/045794要求2011年7月6日提交的美国临时申请号61/505,031、2011年8月26日提交的美国临时申请号61/528,072和2011年9月16日提交的美国临时申请号61/535,884的优先权。本申请还要求2012年11月30日提交的美国临时申请号61/732,251的优先权。这些申请中每一篇的公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
背景技术
自身免疫障碍是显著和普遍的医学问题。例如，类风湿性关节炎(RA)是在美国影响超过两百万人的自身免疫病。RA引起关节的慢性炎症，且通常是具有引起关节破坏和失能的潜能的进行性疾病。类风湿性关节炎的病因未知，但已将遗传易感性、感染性物质和环境因素与该疾病的病原学相关联。在活动性RA中，症状可以包括疲劳、食欲不振、低烧、肌肉和关节疼痛和僵硬。另外，在疾病发作期间，由于滑膜的炎症，关节常变红、肿胀、疼痛和脆弱。此外，由于RA是全身性疾病，炎症可以影响关节以外的身体器官和区域，包括眼和口的腺体、肺衬(lunglining)、心包和血管。
用于管理RA和其他自身免疫障碍的传统处理包括快作用“一线药物”和慢作用“二线药物”。一线药物减少疼痛和炎症。这类一线药物的实例包括口服给药或直接注射入组织和关节的阿司匹林、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、依托度酸(etodolac)和其他非类固醇抗炎药(NSAID)，以及糖皮质激素。二线药物促进疾病缓解，防止进行性关节破坏，也称为改变病情抗风湿药或DMARD。二线药物的实例包括金、羟化氯喹、柳氮磺胺吡啶(azulfidine)和免疫抑制剂，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)和环孢霉素。但是，许多这些药物可以具有有害的副作用。因此，人们已在探寻用于类风湿性关节炎和其他自身免疫障碍的附加疗法。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由包括单核细胞和巨噬细胞的许多细胞类型产生的细胞因子，最初根据其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力鉴定出来。随后，与恶病质相关的称为恶液质素的因子显示与TNF-α一致。已将TNF-α与许多其他人类疾病和障碍的病理生理学相关联，这些人类疾病和障碍包括休克、脓毒、感染、自身免疫病、RA、克隆病、移植排斥和移植物抗宿主病。
由于人TNF-α(hTNF-α)在多种人类障碍中的有害作用，已设计治疗策略来抑制或对抗hTNF-α活性。具体而言，已探寻结合并中和hTNF-α的抗体作为抑制hTNF-α活性的手段。这类抗体中最早的一些是由从hTNF-α免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAb)(参见例如Moeller等的美国专利号5,231,024)。虽然这些小鼠抗-hTNF-α抗体通常显示对hTNF-α的高亲和力且能够中和hTNF-α活性，但它们的体内用途受限于与对人类施用小鼠抗体相关的问题，如短血清半衰期，不能触发某些人效应子功能，及在人中引出不想要的抗小鼠抗体的免疫应答(“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)。
最近，生物制品治疗(biologicaltherapies)已应用于诸如类风湿性关节炎的自身免疫障碍的治疗。例如，FDA已批准四种TNFα抑制剂(REMICADETM(英夫利昔单抗(infliximab))(嵌合抗-TNFαmAb)、ENBRELTM(依那西普(etanercept))(TNFR-IgFc融合蛋白)、HUMIRATM(阿达木单抗(adalimumab))(人抗-TNFαmAb)和(赛妥珠单抗(certolizumabpegol))(PEG化Fab片段)用于治疗类风湿性关节炎。还用于治疗中度至重度克隆病。虽然已证明这类生物制品治疗成功治疗类风湿性关节炎和其他自身免疫障碍如CD，但并非所有治疗的个体都响应或良好地响应这种治疗。此外，施用TNFα抑制剂可以诱发对药物的免疫应答，导致自身抗体(如人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA))的产生。这类HACA、HAHA或HAMA免疫应答可以与过敏反应及免疫治疗TNFα抑制剂的药代动力学和生物分布的显著变化相关，这妨碍用该药物进一步治疗。因此，本领域存在对检测抗生物制剂(如抗TNFα药物)的自身抗体在患者样品中的存在来监测生物制品治疗并指导治疗决定的测定的需要。本发明满足此需要，也提供相关优势。
发明概述
本发明提供用于检测和测量样品中抗生物制品(如抗TNFα药物治疗剂)的中和性自身抗体和非中和性自身抗体的存在或水平的测定。本发明用于监测个体进行生物制品治疗(如抗TNFα药物治疗)时，随着时间推移，中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明还用于预测和/或测定个体样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制品治疗(例如备选抗TNFα治疗)的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受生物制剂治疗的那些个体的治疗决定的信息，并改善优化治疗、降低毒性和/或监测生物制品治疗的治疗处理的功效的准确性。
在一方面，本发明提供用于检测样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比较(例如通过在仅含有游离的标记生物制品结合部分的参考样品的SEC后测量游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)，从而检测中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在。
在某些实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相同或基本相同时检测到中和性形式自身抗体。在某些其他实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比减少(例如实质性减少)或缺乏(例如检测不到)时检测到非中和性形式自身抗体。
在另一方面，本发明提供用于测量样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的水平或百分比的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比(例如通过在仅含有游离的标记生物制品结合部分的参考样品的SEC后测量并归一化游离的标记生物制品结合部分峰的AUC来计算游离的标记生物制品结合部分的水平或百分比)相比较，其中对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比对应于中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些实施方案中，对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比和步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平之间的差对应于非中和性形式自身抗体的水平或百分比。
还在另一方面，本发明提供用于测量样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的百分比或水平的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比较(例如通过在参考样品的SEC后测量游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)，从而测量中和性形式自身抗体的百分比或水平。
在另一方面，本发明提供用于确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)生物制品交叉反应的方法，该方法包括：
(a)按照本文所述的测定检测或测量样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式自身抗体阳性还是阴性；如果样品是中和性形式自身抗体阳性，则：
(b)使样品与标记第二生物制品接触，以形成标记第二生物制品和中和性形式自身抗体的标记复合物(即其中标记复合物的成分未相互共价附着)；
(c)对标记复合物进行大小排阻层析，以分开标记复合物(例如从游离的标记第二生物制品)；和
(d)检测标记复合物，从而确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二生物制品交叉反应。
在某些实施方案中，标记复合物的存在是抗第一生物制品的中和性自身抗体与第二生物制品交叉反应的指示，即中和性自身抗体将抑制第一和第二生物药物二者的活性。
在某些其他实施方案中，标记复合物的缺乏是抗第一生物制品的中和性自身抗体不与第二生物制品交叉反应的指示，即中和性自身抗体将不抑制第二生物药物的活性。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体(例如抗TNFα单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子，如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受生物制品治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗生物制品的自身抗体。在其他实施方案中，生物制品自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在某些方面，本发明的测定方法进一步包括酸解离步骤，其包括在使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触之前、期间和/或之后使样品与酸接触。
在某些其它方面，本发明的测定方法包括检测样品中抗生物制品的一种或多种同种型的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在或水平。
在一个具体方面，本发明提供用于检测样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比较(例如通过在仅含有游离的标记TNFα的参考样品的SEC后测量游离的标记TNFα峰的AUC)，从而检测中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在。
在某些实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相同或基本相同时检测到中和性形式自身抗体。在某些其他实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比减少(例如实质性减少)或缺乏(例如检测不到)时检测到非中和性形式自身抗体。
在另一具体方面，本发明提供用于测量样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的水平或百分比的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比相比较(例如通过在仅含有游离的标记TNFα的参考样品的SEC后测量并归一化游离的标记TNFα峰的AUC来计算游离的标记TNFα的水平或百分比)，其中对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比对应于中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些实施方案中，对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比和步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平之间的差对应于非中和性形式自身抗体的水平或百分比。
还在另一具体方面，本发明提供用于测量样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的百分比或水平的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平(例如通过在参考样品的SEC后测量游离的标记TNFα峰的AUC)相比较，从而测量中和性形式自身抗体的百分比或水平。
还在另一具体方面，本发明提供用于确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)抗TNFα药物交叉反应的方法，该方法包括：
(a)按照本文所述的测定检测或测量样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式自身抗体阳性还是阴性；如果样品是中和性形式自身抗体阳性，则：
(b)使样品与标记第二抗TNFα药物接触，以形成标记第二抗TNFα药物和中和性形式自身抗体的标记复合物(即其中标记复合物的成分未相互共价附着)；
(c)对标记复合物进行大小排阻层析，以分开标记复合物(例如从游离的标记第二抗TNFα药物)；和
(d)检测标记复合物，从而确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二抗TNFα药物交叉反应。
在某些实施方案中，标记复合物的存在是抗第一抗TNFα药物的中和性自身抗体与第二抗TNFα药物交叉反应的指示，即中和性自身抗体将抑制第一和第二抗TNFα药物二者的活性。
在某些其他实施方案中，标记复合物的缺乏是抗第一抗TNFα药物的中和性自身抗体不与第二抗TNFα药物交叉反应的指示，即中和性自身抗体将不抑制第二抗TNFα药物的活性。
在一些实施方案中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗(golimumab)；CNTO148)，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受抗TNFα药物治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗抗TNFα药物的自身抗体。在其他实施方案中，抗TNFα药物自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在某些方面，本发明的测定方法进一步包括酸解离步骤，其包括在使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触之前、期间和/或之后使样品与酸接触。
在某些其它方面，本发明的测定方法包括检测样品中抗抗TNFα药物的一种或多种同种型的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在或水平。
在另一方面，本发明提供用于在接受生物制品疗程的个体中监测和/或优化生物制品治疗的方法，该方法包括：
(a)在疗程的多个时间点按照本文所述的测定检测或测量抗生物制品的中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比；
(b)检测中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在一个具体方面，本发明提供用于在接受生物制品疗程的个体中监测和/或优化生物制品治疗的方法，该方法包括：
(a)在时间点t0按本文所述测量来自个体的第一样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(b)在时间点t1按本文所述测量来自个体的第二样品中中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(c)可选地在时间点tn+1用来自个体的n个附加样品重复步骤(b)，其中n是从1至约25的整数(例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任意范围)；
(d)检测中和性形式自身抗体的水平或百分比从时间点t0至t1或从时间点t0至tn+1的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在另一方面，本发明提供用于在接受第一生物制品疗程的个体中优化治疗和/或降低毒性的方法，该方法包括：
(a)通过按照本文所述的测定检测或测量来自个体的样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比来确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)生物制品交叉反应；和
(b)如果中和性形式自身抗体与第二生物制品交叉反应，则确定应对个体施用不同的疗程。
在一个具体方面，本发明提供用于在接受抗TNFα药物疗程的个体中监测和/或优化抗TNFα药物治疗的方法，该方法包括：
(a)在疗程的多个时间点按照本文所述的测定检测或测量抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比；
(b)检测中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在另一具体方面，本发明提供用于在接受抗TNFα药物疗程的个体中监测和/或优化抗TNFα药物治疗的方法，该方法包括：
(a)在时间点t0按本文所述测量来自个体的第一样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(b)在时间点t1按本文所述测量来自个体的第二样品中中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(c)可选地在时间点tn+1用来自个体的n个附加样品重复步骤(b)，其中n是从1至约25的整数(例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任意范围)；
(d)检测中和性形式自身抗体的水平或百分比从时间点t0至t1或从时间点t0至tn+1的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
还在另一具体方面，本发明提供用于在接受第一抗TNFα药物疗程的个体中优化治疗和/或降低毒性的方法，该方法包括：
(a)通过按照本文所述的测定检测或测量来自个体的样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比来确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)抗TNFα药物交叉反应；和
(b)如果中和性形式自身抗体与第二抗TNFα药物交叉反应，则确定应对个体施用不同的疗程。
对本领域技术人员而言，本发明的其他方面、特征和优势将从以下发明详述和附图显而易见。
附图简述
图1显示NAb百分比(y轴)和ATI水平之间存在清楚的关系。
图2显示ATI浓度≥60U/ml是NAb+的预测。
图3显示ATI以0.931的ROCAUC预测NAb。
图4显示通过本发明的液相迁移率变动测定检测ATI。
图5显示本发明的示例性ATI/IFX液相迁移率变动测定。
图6显示本发明的非中和性抗药物抗体(ADA)测定。
图7显示本发明的中和性ADA测定。
图8显示间隔1、2或3个月采集的5份来自UC患者的样品的IFX和ATI水平的时程。
图9显示测定UC患者中游离TNFα的百分比随时间变化的峰分析。
图10显示随时间推移从存在非中和性自身抗体向存在中和性自身抗体变动，如间隔2或3个月采集并掺入IFX的3份来自UC患者的样品中所示例。
图11显示测定掺入IFX的来自UC患者的样品中游离TNFα的百分比随时间变化的峰分析。
图12显示用兔抗人IgG1Fc作为非中和性抗体(Ab)对照。
图13显示用ATI阳性血清作为混合的中和性抗体(NAb)/非中和性抗体(Ab)对照。
图14显示从ATI阳性血清纯化ATI导致亲和力较弱的NAb的丢失。
图15显示来自测定这些多种对照中游离TNFα的百分比的UC患者病例研究的峰分析。
图16显示来自测定在30周的时期内间隔7或8周采集的4份样品的游离TNFα的百分比的时程的CD患者病例研究的峰分析。
图17显示来自测定在50周的时期内采集的3份样品的游离TNFα的百分比的时程的另一CD患者病例研究的峰分析。
图18显示来自在诱导或维持治疗期间或之后的特定周测定样品中游离TNFα的百分比的另外4项CD患者病例研究的峰分析。
图19显示通过迁移率变动测定检测非中和性抗体活性。
图20显示抗IFX和ADL二者的ADA的交叉反应性，其中ADA的结合部位模拟TNFα的结合部位，因此可以结合多个抗TNFα药物。
图21显示两个患者实例(患者1和2)，其中测定了响应一种抗TNF药物而产生的NAb对其他抗TNF药物的交叉反应性。具体而言，针对Humira(ADL)测试了患者接受Remicade(IFX)时产生的NAb。
图22显示本发明检测抗诸如IFX或ADL的药物的非中和性抗体(非NAb)(上)或中和性抗体(NAb)(下)的存在的测定的示例性实施方案。
图23显示NAb标准曲线的产生和使用。
图24提供测定针对IFX产生的NAb对ADL的交叉反应性的患者3(用IFX治疗但对IFX失去应答)的病例研究结果。
图25提供测定针对IFX产生的NAb对ADL的交叉反应性的患者4(用IFX治疗但对IFX失去应答)的病例研究结果。
图26显示患者研究的非限制性实例，其证明ATI亲和力成熟及交叉反应性ATI的出现。
图27显示本发明的竞争性配体结合NAb测定的一个实施方案。游离TNF-532代表最大测定信号。不含ATI的TNF-532/IFX-488阴性对照代表最小测定信号。(A)不影响测定信号的结合ATI。(B)恢复测定信号的中和性ATI患者血清。
图28显示本发明的中和测定的临床用途。
图29显示本发明的中和测定的性能特征。
发明详述
I.前言
本发明部分基于这样的发现，使用大小排阻层析和可选的使得能够平衡免疫复合物的酸解离的均相迁移率变动测定对测量针对诸如抗TNFα药物的生物制品产生的中和性和非中和性形式自身抗体(例如HACA、HAHA等)的存在或水平尤其有利。这类自身抗体也称为抗药物抗体或ADA，其中和性和非中和性形式也分别称为NAb和非NAb。
在具体实施方案中，通过使个体的样品与(例如荧光)标记生物制品(例如抗TNFα药物)和(例如荧光)标记生物制品结合部分(例如TNFα)接触来进行本发明的均相迁移率变动测定。本文所述测定至少由于以下原因而是有利的：它们避免了对去除低亲和力ADA的洗涤步骤的需要；它们使用允许在可见、IR和/或近IR(NIR)光谱上检测的不同标记，如荧光团，这减少了背景和血清干扰问题；它们由于荧光标记检测的高灵敏度而提高了检测低效价个体中的中和性和/或非中和性ADA的能力；它们作为液相反应存在，从而减少了因附着于诸如ELISA平板的固体表面而引起任意表位变化的机会。
在示例性实施方案中，本发明的测定是有利的，因为它们使得能够进行接受抗TNFα药物治疗的IBD个体的时程病例研究来监测不同时间点的多个样品中中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明的测定还因它们使得能够确定个体接受抗TNFα药物治疗时是否存在随时间推移从非中和性至中和性抗药物抗体的变动而是有利的。不受限于任意具体理论，中和性抗药物抗体可具有显著的阴性临床结果，因为它们干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合，从而诱导功效丧失。
在其他示例性实施方案中，本发明的测定用于预测和/或确定个体样品中的中和性抗药物抗体与诸如其他抗TNF药物的备选生物药物的交叉反应性。仅为了说明的目的，如果样品包含抗一种抗TNFα药物的中和性ADA，则这些中和性ADA可能将交叉反应，对其他抗TNFα药物而言是中和性的，使得建议用于个体的治疗调整将是转换至具有不同作用机制的药物(例如非抗TNFα药物)。但是，如果样品包含抗一种抗TNFα药物的非中和性ADA，则建议用于个体治疗调整可以是转换至另一种抗TNFα药物。
因此，本发明部分通过提供用于指导接受抗TNFα药物治疗的那些个体的治疗决定的信息来涉及和克服目前与施用诸如英夫利昔单抗和阿达木单抗的抗TNFα药物相关的限制。本发明的方法尤其用于监测接受抗TNFα药物的那些个体，以检测或测量中和性ADA的形成和/或出现(例如抗TNFα药物治疗过程期间随时间的变化)，以及用于检测或测量个体接受抗TNFα药物治疗时中和性ADA与非中和性ADA相比的量、百分比或比值随时间的变化(例如增加)。
因此，本发明提供用于确定何时和/或如何进行以下的方法：(1)基于中和性ADA的存在、水平或百分比调整或改变(例如增加或减少)抗TNFα药物的后续剂量来优化治疗功效和/或降低毒性；(2)基于中和性ADA的存在、水平或百分比将抗TNFα药物(例如按起始、提高、降低或相同的剂量)与一种或多种免疫抑制剂(如氨甲喋呤(MTX)或硫唑嘌呤(AZA)组合；和/或(3)基于中和性ADA的存在、水平或百分比改变目前的疗程(例如转换至不同的抗TNFα药物或转换至靶向不同机制的药物)。这类方法用于确保接受抗TNFα药物的个体得到正确的剂量，他们不出现针对药物的免疫应答，他们应由于起始药物的失败(例如出现抗起始抗TNFα药物的交叉反应性中和性ADA)而转换至不同的药物。
II.定义
除非另有说明，本文所用的以下术语具有针对它们描述的含义。
本文所用的术语“生物制品”或“生物制剂”或“生物药物”涵盖从生物系统(例如活生物)产生或提取的产品和物质。生物制品的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白质、多肽、肽、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(例如DVDIg)、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
术语“生物制品结合部分”包括(例如特异性)结合生物制品或与生物制品相互作用的任意分子、药剂或物质。在某些情况下，中和性形式自身抗体干扰生物制品结合部分和生物制品之间的结合。在某些其他情况下，非中和性形式自身抗体不干扰生物制品结合部分和生物制品之间的结合。作为一个非限制性实例，在生物制品包含抗TNFα药物时，生物制品结合部分包含TNFα。作为另一非限制性实例，在生物制品包含白介素如IL-2时，生物制品结合部分包含白介素受体(例如白介素受体的可溶性胞外片段)。
本文所用的术语“抗TNFα药物”或“TNFα抑制剂”旨在涵盖包括蛋白质、抗体、抗体片段、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(例如DVDIg)、小分子TNFα拮抗剂及类似的天然存在或非天然存在的分子、和/或其重组和/或改造形式的药物，其直接或间接抑制TNFα活性，如通过抑制TNFα与TNFα的细胞表面受体的相互作用，抑制TNFα蛋白质产生，抑制TNFα基因表达，抑制TNFα从细胞分泌，抑制TNFα受体信号发放，或导致个体中TNFα活性减少的任意其他手段。术语“抗TNFα药物”或“TNFα抑制剂”优选包括干扰TNFα活性的药物。抗TNFα药物的实例包括但不限于英夫利昔单抗(REMICADETM,JohnsonandJohnson)、人抗TNF单克隆抗体阿达木单抗(D2E7/HUMIRATM,AbbottLaboratories)、依那西普(ENBRELTM,Amgen)、赛妥珠单抗(UCB,Inc.)、戈利木单抗(CNTO148)、CDP571(Celltech)、CDP870(Celltech)，以及其他抑制TNFα活性的化合物，使得在对患有其中TNFα活性有害的障碍(例如RA)或处于患上其中TNFα活性有害的障碍(例如RA)的个体施用时可治疗该障碍。
术语“TNFα”旨在包括作为17kDa分泌形式和26kDa膜结合形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kDa分子的三聚体组成。TNFα的结构进一步描述于例如Jones等,Nature,338:225-228(1989)中。术语TNFα旨在包括人TNFα、重组人TNFα(rhTNF-α)、或与人TNFα蛋白质至少约80％同一的TNFα。人TNFα由35氨基酸(aa)胞质结构域、21aa跨膜区段和177aa胞外域(ECD)组成(Pennica,D.等(1984)Nature312:724)。在ECD内，人TNFα与猕猴TNFα具有97％aa序列同一性，与牛、犬、棉鼠、马、猫、小鼠、猪和大鼠TNFα具有71％至92％aa序列同一性。TNFα可以通过标准重组表达方法制备或购买(R&DSystems,目录号210-TA,Minneapolis,Minn.)。
在某些实施方案中，“TNFα”是“抗原”，其包括能够被抗TNF-α药物结合的分子或分子的部分。TNFα可以具有一个或一个以上表位。在某些情况下，TNFα将以高度选择性的方式与抗TNFα抗体反应。优选的结合抗TNFα抗体的抗体、片段和区域的抗原包括人TNFα的至少5个氨基酸。在某些情况下，TNFα是具有能够结合抗TNFα抗体、其片段和区域的TNFα表位的足够长度。
术语“大小排阻层析”或“SEC”包括这样的层析方法，其中溶液中的分子根据其大小和/或流体动力学体积分开。它适用于大分子或大分子复合物，如蛋白质及其缀合物。通常，在用水溶液来转运样品通过柱时，该技术称为凝胶过滤层析。
术语“复合物”、“免疫复合物”、“缀合物”和“免疫缀合物”包括但不限于结合(例如通过非共价方式)于抗TNFα药物的TNFα、结合(例如通过非共价方式)于抗抗TNFα药物的自身抗体(例如中和性或非中和性抗药物抗体)的抗TNFα药物、及结合(例如通过非共价方式)于TNFα和抗抗TNFα药物的自身抗体(例如中和性或非中和性抗药物抗体)二者的抗TNFα药物。
如本文所使用，用术语“标记”修饰的实体包括与另一分子缀合的任意实体、分子、蛋白质、酶、抗体、抗体片段、细胞因子或相关种类，或可在经验上检测到的化学实体。适合作为标记实体的标记的化学种类包括但不限于荧光染料，例如Alexa染料，如Alexa647，量子原子团，光学染料，发光染料，及放射性核素，例如125I。
短语“荧光标记检测”包括用于检测荧光标记的手段。检测手段包括但不限于分光计、荧光计、光度计，及通常并入层析仪器(如但不限于大小排阻高效液相层析)的检测装置，如但不限于Agilent-1200HPLC系统。
短语“优化治疗”包括优化剂量(例如有效量或水平)和/或具体治疗的类型。例如，优化抗TNFα药物的剂量包括增加或减少随后对个体施用的抗TNFα药物的量。在某些情况下，优化抗TNFα药物的类型包括将所施用的抗TNFα药物从一种药物变为不同药物(例如不同的抗TNFα药物或靶向不同机制的药物)。在其他情况下，优化治疗包括与一种或多种免疫抑制药物组合共同施用抗TNFα药物的剂量(例如，按与之前的剂量相比增加、减少或相同的剂量)。
术语“共同施用”包括施用一种以上活性剂，使得一种活性剂的生理学作用的持续时间与第二活性剂的生理学作用重叠。
术语“受试者”、“患者”或“个体”通常包括人类，但也包括其他动物，例如其他灵长类、啮齿类、犬、猫、马、羊、猪等等。
术语“疗程”包括采用来减轻或防止与疾病或障碍相关的一种或多种症状的治疗途径。该术语涵盖施用用于改善患有疾病或障碍的个体的健康的任意化合物、药物、流程和/或方案，且包括本文所述的任意治疗剂。作为非限制性实例，可以根据TNFα、抗TNFα药物和/或抗药物抗体的存在或浓度水平(例如，用本发明的方法测定中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的存在、水平或百分比)改变(例如增加或减少)疗程或当前疗程的剂量。
术语“免疫抑制药物”或“免疫抑制剂”包括能够产生免疫抑制作用，例如防止或减少免疫应答的任意物质，如通过照射或通过施用药物，如抗代谢物、抗淋巴细胞血清、抗体等。免疫抑制药物的实例包括但不限于硫代嘌呤药物，如硫唑嘌呤(AZA)及其代谢物；抗代谢物，如氨甲喋呤(MTX)；西罗莫司(sirolimus)(纳巴霉素)；替西罗莫司(temsirolimus)；依维莫司(everolimus)；他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；FK-778；抗淋巴细胞球蛋白抗体、抗胸腺细胞球蛋白抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体和抗体-毒素缀合物；环孢霉素；麦考酚酸(mycophenolate)；咪唑立宾单磷酸酯(mizoribinemonophosphate)；异茛菪亭(scoparone)；醋酸格拉替雷(glatirameracetate)；其代谢物；其可药用盐；其衍生物；其前体药物；及其组合。
术语“硫代嘌呤药物”包括硫唑嘌呤(AZA)、6-巯基嘌呤(6-MP)、或其任意代谢物，该代谢物具有治疗功效，且包括但不限于6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、6-甲基巯基嘌呤核苷、6-硫代肌苷核苷酸(例如6-硫代肌苷单磷酸、6-硫代肌苷二磷酸、6-硫代肌苷三磷酸)、6-硫代鸟嘌呤核苷酸(例如6-硫代鸟嘌呤单磷酸、6-硫代鸟嘌呤二磷酸、6-硫代鸟嘌呤三磷酸)、6-硫代黄苷核苷酸(例如6-硫代黄苷单磷酸、6-硫代黄苷二磷酸、6-硫代黄苷三磷酸)、其衍生物、其类似物，及其组合。
术语“样品”包括任意获自个体的生物样品。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)、多形核(PMN)细胞)、导管灌洗液、乳头抽出物、淋巴(例如淋巴结的散布肿瘤细胞)、骨髓抽出物、唾液、尿、粪(即粪便)、痰、支气管灌洗液、泪、细针抽出物(例如通过随机乳晕外周细针抽吸收集)、任意其他体液、组织样品如炎症部位的活检组织(例如针头活检组织)、其细胞提取物、及源自一种或多种这些体液或组织的免疫球蛋白富集级分。在一些实施方案中，样品是全血、其分级分离成分如血浆、血清或细胞沉淀、或其免疫球蛋白富集级分。本领域技术人员将理解，诸如血清样品的样品可以在分析之前稀释。在某些实施方案中，通过用本领域已知的任意技术分离PBMC和/或PMN来获得样品。在某些其他实施方案中，样品是例如来自炎症部位的活检组织，如胃肠道或滑膜组织的部分。
本发明的方法的步骤并非必须以呈现它们的具体顺序进行。本领域普通技术人员将理解，本发明的方法的步骤的其他顺序也包含在本发明的范围之内。
方括号“[]”表示通过其浓度来提到方括号内的种类。
III.实施方案描述
本发明提供用于检测和测量样品中抗生物制品(如抗TNFα药物治疗剂)的中和性自身抗体和非中和性自身抗体的存在或水平的测定。本发明用于监测个体进行生物制品治疗(如抗TNFα药物治疗)时，随着时间推移，中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的形成。本发明还用于预测和/或测定个体样品中的中和性抗药物抗体与备选生物制品治疗(例如备选抗TNFα治疗)的交叉反应性。因此，本发明提供用于指导接受生物制剂治疗的那些个体的治疗决定的信息，并改善优化治疗、降低毒性和/或监测生物制品治疗的治疗处理的功效的准确性。
在一方面，本发明提供用于检测样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在仅含有游离的标记生物制品结合部分的参考样品的SEC后测量游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)相比较，从而检测中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在。
在一些实施方案中，中和性形式自身抗体干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。在其他实施方案中，非中和性形式自身抗体不干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。
在一些情况下，游离的标记生物制品结合部分由基本不含结合的生物制品(例如标记和/或未标记的生物制品)的标记生物制品结合部分组成。
在某些实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相同或基本相同时检测到中和性形式自身抗体。在某些其他实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比减少(例如实质性减少)或缺乏(例如检测不到)时检测到非中和性形式自身抗体。
在具体实施方案中，在它是在对照样品中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平的至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％时，认为步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平基本相同。在具体实施方案中，在它比在对照样品中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平低至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％时，认为步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比实质性降低。
在一些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记生物制品结合部分的水平。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体(例如抗TNFα单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子，如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受生物制品治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗生物制品的自身抗体。在其他实施方案中，生物制品自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在另一方面，本发明提供用于测量样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的水平或百分比的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比(例如通过在仅含有游离的标记生物制品结合部分的参考样品的SEC后测量并归一化游离的标记生物制品结合部分峰的AUC来计算游离的标记生物制品结合部分的水平或百分比)相比较，其中对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比对应于中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些实施方案中，对照样品中游离的标记生物制品结合部分的归一化水平或百分比和步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平之间的差对应于非中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些情况下，游离的标记生物制品结合部分由基本不含结合的生物制品(例如标记和/或未标记的生物制品)的标记生物制品结合部分组成。
在具体实施方案中，通过测量标记生物制品和标记生物制品结合部分之间形成的复合物(例如“标记复合物”)的峰面积(例如通过测量AUC)，然后从游离的标记生物制品结合部分的峰面积(例如通过测量游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)减去所测量的标记复合物的峰面积，来归一化对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平或百分比。
在某些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记生物制品结合部分的水平。在其他实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记生物制品结合部分峰的AUC来测量标记生物制品和标记生物制品结合部分之间形成的复合物的水平。
在某些实施方案中，抗生物制品的自身抗体(例如ADA)的亚群是中和性形式自身抗体(例如NAb)。在一些实施方案中，可以通过将按照本发明的方法测量的中和性和非中和性形式自身抗体二者的水平相加来计算样品中抗生物制品的自身抗体的总水平。
在一些实施方案中，将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平进一步与阴性对照、阳性对照或其组合相比较。在其他实施方案中，将步骤(d)中测定的中和性形式自身抗体(例如NAb)的百分比与从健康对照(例如正常人血清)建立的截止值或参考范围相比较。在一些实施方案中，截止值或参考范围表示为为了将样品视为NAb阳性而必须具有的NAb阈值百分比。在这类实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比大于或等于从健康对照建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比小于从健康对照建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阴性。截止值或参考范围的非限制性实例包括例如至少约0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.50％、2.00％、2.50％、2.60％、2.70％、2.80％、2.90％、3.00％、3.01％、3.02％、3.03％、3.04％、3.05％、3.06％、3.07％、3.08％、3.09％、3.10％、3.20％、3.30％、3.40％、3.50％、4.00％、4.50％、5.00％、5.50％、6.00％、6.50％、7.00％、7.50％、8.00％、8.50％、9.00％、9.50％、10.00％NAb、或其中的任意范围。
在一些实施方案中，抗生物制品的所有自身抗体都是中和性抗体，将样品定义为具有100％中和性抗药物抗体(NAb)和/或0％非中和性抗药物抗体(非NAb)。在这些实施方案中，步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平通常与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相同，预测自身抗体完全阻断或干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。
在其他实施方案中，抗生物制品的自身抗体中没有一种是中和性抗体，将样品定义为具有100％非NAb和/或0％NAb。在这些实施方案中，与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比，步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平通常缺乏(例如检测不到)，预测自身抗体不完全阻断或干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。
在其他实施方案中，在样品中存在中和性和非中和性形式自身抗体二者时，每一种类的百分比可以以其自身表示(例如50％NAb或50％非NAb定义为样品中等比例的NAb和非NAb)或表示为比值。在某些情况下，通过将NAb的百分比除以非NAb的百分比来计算比值，或反之。在其他情况下，通过将NAb的水平除以非NAb的水平来计算比值，或反之。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体(例如抗TNFα单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子，如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受生物制品治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗生物制品的自身抗体。在其他实施方案中，生物制品自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
还在另一方面，本发明提供用于测量样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的百分比或水平的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触，以形成：
(i)标记生物制品和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记生物制品、标记生物制品结合部分和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记生物制品结合部分、游离的标记生物制品和/或标记生物制品和标记生物制品结合部分的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记生物制品结合部分的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比较(例如通过在参考样品的SEC后测量游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)，从而测量中和性形式自身抗体的百分比或水平。
在一些实施方案中，计算样品(例如来自患者)和对照样品的游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC)。在某些实施方案中，标记生物制品结合标记生物制品结合部分并减少测定信号(例如，在与对照样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC相比时，减少了样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC)。在其他实施方案中，中和性形式自身抗体(NAb)中和标记生物制品并恢复测定信号(例如使样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC回复或恢复至与对照样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC的水平相当的水平)。在一些实施方案中，NAb活性与所测量的测定信号成正比。在具体实施方案中，样品中的百分比NAb等于测定信号的百分比恢复。在某些情况下，将百分比NAb计算为样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC与对照样品的游离的标记生物制品结合部分峰的AUC的比值。作为非限制性实例，按照以下公式计算百分比NAb：％恢复＝(样品的游离的标记生物制品结合部分AUC-背景)/(对照样品的游离的标记生物制品结合部分AUC-背景)*100。
在一些情况下，游离的标记生物制品结合部分由基本不含结合的生物制品(例如标记和/或未标记的生物制品)的标记生物制品结合部分组成。
在某些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记生物制品结合部分峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记生物制品结合部分的水平。在其他实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记生物制品结合部分峰的AUC来测量标记生物制品和标记生物制品结合部分之间形成的复合物的水平。
在某些实施方案中，抗生物制品的自身抗体(例如ADA)的亚群是中和性形式自身抗体(例如NAb)。在一些实施方案中，可以通过将按照本发明的方法测量的中和性和非中和性形式自身抗体二者的水平相加来计算样品中抗生物制品的自身抗体的总水平。在具体实施方案中，中和性形式自身抗体存在于包含中和性自身抗体和非中和性自身抗体二者的自身抗体群体中。
在一些实施方案中，将步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平进一步与阴性对照、阳性对照或其组合相比较。在其他实施方案中，将步骤(d)中测定的中和性形式自身抗体(例如NAb)的百分比与例如从自身抗体低阳性的样品建立的截止值或参考范围相比较。在一些实施方案中，截止值或参考范围表示为为了将样品视为NAb阳性而必须具有的NAb阈值百分比。在这类实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比大于(或等于)所建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比小于(或等于)所建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阴性。截止值或参考范围的非限制性实例包括例如至少约0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％、0.90％、1.00％、1.10％、1.15％、1.20％、1.21％、1.22％、1.23％、1.24％、1.25％、1.26％、1.27％、1.28％、1.29％、1.30％、1.40％、1.50％、2.00％、2.50％、2.60％、2.70％、2.80％、2.90％、3.00％、3.01％、3.02％、3.03％、3.04％、3.05％、3.06％、3.07％、3.08％、3.09％、3.10％、3.20％、3.30％、3.40％、3.50％、4.00％、4.50％、5.00％、5.50％、6.00％、6.50％、7.00％、7.50％、8.00％、8.50％、9.00％、9.50％、10.00％NAb、或其中的任意范围。
在一些实施方案中，抗生物制品的所有自身抗体都是中和性抗体，将样品定义为具有100％中和性抗药物抗体(NAb)和/或0％非中和性抗药物抗体(非NAb)。在这些实施方案中，步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平通常与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相同，预测自身抗体完全阻断或干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。
在其他实施方案中，抗生物制品的自身抗体中没有一种是中和性抗体，将样品定义为具有100％非NAb和/或0％NAb。在这些实施方案中，与对照样品中游离的标记生物制品结合部分的水平相比，步骤(c)中测量的游离的标记生物制品结合部分的水平通常缺乏(例如检测不到)，预测自身抗体不完全阻断或干扰生物制品和生物制品结合部分之间的结合。
在其他实施方案中，在样品中存在中和性和非中和性形式自身抗体二者时，每一种类的百分比可以以其自身表示(例如50％NAb或50％非NAb定义为样品中等比例的NAb和非NAb)或表示为比值。在某些情况下，通过将NAb的百分比除以非NAb的百分比来计算比值，或反之。在其他情况下，通过将NAb的水平除以非NAb的水平来计算比值，或反之。
在一些实施方案中，生物制品包括抗体(例如抗TNFα单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子，如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受生物制品治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗生物制品的自身抗体。在其他实施方案中，生物制品自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在另一方面，本发明提供用于确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)生物制品交叉反应的方法，该方法包括：
(a)按照本文所述的测定检测或测量样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式自身抗体阳性还是阴性；如果样品是中和性形式自身抗体阳性，则：
(b)使样品与标记第二生物制品接触，以形成标记第二生物制品和中和性形式自身抗体的标记复合物(即其中标记复合物的成分未相互共价附着)；
(c)对标记复合物进行大小排阻层析，以分开标记复合物(例如从游离的标记第二生物制品)；和
(d)检测标记复合物，从而确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二生物制品交叉反应。
在某些实施方案中，标记复合物的存在是抗第一生物制品的中和性自身抗体与第二生物制品交叉反应的指示，即中和性自身抗体将抑制第一和第二生物药物二者的活性。
在某些其他实施方案中，标记复合物的缺乏是抗第一生物制品的中和性自身抗体不与第二生物制品交叉反应的指示，即中和性自身抗体将不抑制第二生物药物的活性。
在一些实施方案中，第一和第二生物制品独立地选自抗体(例如抗TNFα单克隆抗体)、抗体片段、蛋白质(例如细胞因子，如白介素)、多肽、肽、融合蛋白、多价结合蛋白、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受生物制品治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)、炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))或癌症。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗生物制品的自身抗体。在其他实施方案中，生物制品自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在某些方面，本发明的测定方法进一步包括酸解离步骤，其包括在使样品与标记生物制品和标记生物制品结合部分接触之前、期间和/或之后使样品与酸接触。
在某些其它方面，本发明的测定方法包括检测样品中抗生物制品的一种或多种同种型的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在或水平。
在一个具体方面，本发明提供用于检测样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比较(例如通过在仅含有游离的标记TNFα的参考样品的SEC后测量游离的标记TNFα峰的AUC)，从而检测中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在。
在一些实施方案中，中和性形式自身抗体干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。在其他实施方案中，非中和性形式自身抗体不干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。
在一些情况下，游离的标记TNFα由基本不含结合的抗TNFα药物(例如标记和/或未标记的抗TNFα药物)的标记TNFα组成。
在某些实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相同或基本相同时检测到中和性形式自身抗体。在某些其他实施方案中，在步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比减少(例如实质性减少)或缺乏(例如检测不到)时检测到非中和性形式自身抗体。
在具体实施方案中，在它是在对照样品中测量的游离的标记TNFα的水平的至少约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％时，认为步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平基本相同。在具体实施方案中，在它比在对照样品中测量的游离的标记TNFα的水平低至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％时，认为步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比实质性降低。
在某些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记TNFα的水平。
在一些实施方案中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受抗TNFα药物治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗抗TNFα药物的自身抗体。在其他实施方案中，抗TNFα药物自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在另一具体方面，本发明提供用于测量样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的水平或百分比的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比(例如通过在仅含有游离的标记TNFα的参考样品的SEC后测量并归一化游离的标记TNFα峰的AUC来计算游离的标记TNFα的水平或百分比)相比较，其中对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比对应于中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些实施方案中，对照样品中游离的标记TNFα的归一化水平或百分比和步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平之间的差对应于非中和性形式自身抗体的水平或百分比。
在一些情况下，游离的标记TNFα由基本不含结合的抗TNFα药物(例如标记和/或未标记的抗TNFα药物)的标记TNFα组成。
在具体实施方案中，通过测量标记抗TNFα药物和标记TNFα之间形成的复合物(例如“标记复合物”)的峰面积(例如通过测量AUC)，然后从游离的标记TNFα的峰面积(例如通过测量游离的标记TNFα峰的AUC)减去所测量的标记复合物的峰面积，来归一化对照样品中游离的标记TNFα的水平或百分比。
在某些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记TNFα的水平。在其他实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记TNFα峰的AUC来测量标记抗TNFα药物和标记TNFα之间形成的复合物的水平。
在某些实施方案中，抗抗TNFα药物的自身抗体(例如ADA)的亚群是中和性形式自身抗体(例如NAb)。在一些实施方案中，可以通过将按照本发明的方法测量的中和性和非中和性形式自身抗体二者的水平相加来计算样品中抗抗TNFα药物的自身抗体的总水平。
在一些实施方案中，将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平进一步与阴性对照、阳性对照、或其组合相比较。阴性对照的非限制性实例包括小鼠单克隆抗人IgG1Fc样品和/或兔单克隆抗人IgG1Fc样品。阳性对照的非限制性实例包括混合的ADA阳性患者血清样品和/或抗抗TNFα药物的F(ab’)2片段的兔多克隆抗体的样品。
在其他实施方案中，将步骤(d)中测定的中和性形式自身抗体(例如NAb)的百分比与从健康对照(例如正常人血清)建立的截止值或参考范围相比较。在具体实施方案中，截止值或参考范围表示为为了将样品视为NAb阳性而必须具有的NAb阈值百分比。在这类实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比大于或等于从健康对照建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比小于从健康对照建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阴性。截止值或参考范围的非限制性实例包括例如至少约0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.50％、2.00％、2.50％、2.60％、2.70％、2.80％、2.90％、3.00％、3.01％、3.02％、3.03％、3.04％、3.05％、3.06％、3.07％、3.08％、3.09％、3.10％、3.20％、3.30％、3.40％、3.50％、4.00％、4.50％、5.00％、5.50％、6.00％、6.50％、7.00％、7.50％、8.00％、8.50％、9.00％、9.50％、10.00％NAb、或其中的任意范围。在一些情况下，截止值或参考范围是约3.00％NAb或约3.06％NAb或在约3.00％-3.10％NAb之间。
在一些实施方案中，抗抗TNFα药物的所有自身抗体都是中和性抗体，将样品定义为具有100％中和性抗药物抗体(NAb)和/或0％非中和性抗药物抗体(非NAb)。在这些实施方案中，步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平通常与对照样品中游离的标记TNFα的水平相同，预测自身抗体完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。
在某些其他实施方案中，抗抗TNFα药物的自身抗体中没有一种是中和性抗体，将样品定义为具有100％非NAb和/或0％NAb。在这些实施方案中，与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比，步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平通常缺乏(例如检测不到)，预测自身抗体不完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。
在其他实施方案中，在样品中存在中和性和非中和性形式自身抗体二者时，每一种类的百分比可以以其自身表示(例如50％NAb或50％非NAb定义为样品中等比例的NAb和非NAb)或表示为比值。在某些情况下，通过将NAb的百分比除以非NAb的百分比来计算比值，或反之。在其他情况下，通过将NAb的水平除以非NAb的水平来计算比值，或反之。
在一些实施方案中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受抗TNFα药物治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗抗TNFα药物的自身抗体。在其他实施方案中，抗TNFα药物自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
还在另一具体方面，本发明提供用于测量样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的百分比或水平的方法，该方法包括：
(a)使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)标记抗TNFα药物和自身抗体的第一标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第一标记复合物的成分未相互共价附着)；和/或
(ii)标记抗TNFα药物、标记TNFα和自生抗体的第二标记复合物(即免疫复合物或缀合物)(即其中第二标记复合物的成分未相互共价附着)；
(b)对第一标记复合物和/或第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离(即未结合)的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平(例如通过在大小排阻层析(SEC)后测量游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC))；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平(例如通过在参考样品的SEC后测量游离的标记TNFα峰的AUC)相比较，从而测量中和性形式自身抗体的百分比或水平。
在一些实施方案中，计算样品(例如来自患者)和对照样品的游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC)。在某些实施方案中，标记抗TNFα药物结合标记TNFα并减少测定信号(例如，在与对照样品的游离的标记TNFα峰的AUC相比时，减少了样品的游离的标记TNFα峰的AUC)。在其他实施方案中，中和性形式自身抗体(NAb)中和标记抗TNFα药物并恢复测定信号(例如使样品的游离的标记TNFα峰的AUC回复或恢复至与对照样品的游离的标记TNFα峰的AUC的水平相当的水平)。在一些实施方案中，NAb活性与所测量的测定信号成正比。在具体实施方案中，样品中的百分比NAb等于测定信号的百分比恢复。在某些情况下，将百分比NAb计算为样品的游离的标记TNFα峰的AUC与对照样品的游离的标记TNFα峰的AUC的比值。作为非限制性实例，按照以下公式计算百分比NAb：％恢复＝(样品的游离的标记TNFαAUC-背景)/(对照样品的游离的标记TNFαAUC-背景)*100。
在一些情况下，游离的标记TNFα由基本不含结合的抗TNFα药物(例如标记和/或未标记的抗TNFα药物)的标记TNFα组成。
在某些实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC)来测量游离的标记TNFα的水平。在其他实施方案中，通过从来自大小排阻层析(例如SEC-HPLC)的信号强度作为洗脱时间的函数的图积分游离的标记TNFα峰的AUC来测量标记抗TNFα药物和标记TNFα之间形成的复合物的水平。
在某些实施方案中，抗抗TNFα药物的自身抗体(例如ADA)的亚群是中和性形式自身抗体(例如NAb)。在一些实施方案中，可以通过将按照本发明的方法测量的中和性和非中和性形式自身抗体二者的水平相加来计算样品中抗抗TNFα药物的自身抗体的总水平。在具体实施方案中，中和性形式自身抗体存在于包含中和性自身抗体和非中和性自身抗体二者的自身抗体群体中。
在一些实施方案中，将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平进一步与阴性对照、阳性对照、或其组合相比较。阴性对照的非限制性实例包括小鼠单克隆抗人IgG1Fc样品和/或兔单克隆抗人IgG1Fc样品。阳性对照的非限制性实例包括混合的ADA阳性患者血清样品和/或抗抗TNFα药物的F(ab’)2片段的兔多克隆抗体的样品。
在其他实施方案中，将步骤(d)中测定的中和性形式自身抗体(例如NAb)的百分比与例如从自身抗体低阳性的样品建立的截止值或参考范围相比较。在具体实施方案中，截止值或参考范围表示为为了将样品视为NAb阳性而必须具有的NAb阈值百分比。在这类实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比大于(或等于)所建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阳性。在其他实施方案中，在步骤(d)中测定的NAb百分比小于(或等于)所建立的截止值或参考范围时，样品是NAb阴性。截止值或参考范围的非限制性实例包括例如至少约0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％、0.90％、1.00％、1.10％、1.15％、1.20％、1.21％、1.22％、1.23％、1.24％、1.25％、1.26％、1.27％、1.28％、1.29％、1.30％、1.40％、1.50％、2.00％、2.50％、2.60％、2.70％、2.80％、2.90％、3.00％、3.01％、3.02％、3.03％、3.04％、3.05％、3.06％、3.07％、3.08％、3.09％、3.10％、3.20％、3.30％、3.40％、3.50％、4.00％、4.50％、5.00％、5.50％、6.00％、6.50％、7.00％、7.50％、8.00％、8.50％、9.00％、9.50％、10.00％NAb、或其中的任意范围。在一些情况下，截止值或参考范围是约1.28％NAb或在约1.25％-1.30％NAb之间。
在一些实施方案中，抗抗TNFα药物的所有自身抗体都是中和性抗体，将样品定义为具有100％中和性抗药物抗体(NAb)和/或0％非中和性抗药物抗体(非NAb)。在这些实施方案中，步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平通常与对照样品中游离的标记TNFα的水平相同，预测自身抗体完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。
在某些其他实施方案中，抗抗TNFα药物的自身抗体中没有一种是中和性抗体，将样品定义为具有100％非NAb和/或0％NAb。在这些实施方案中，与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比，步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平通常缺乏(例如检测不到)，预测自身抗体不完全阻断或干扰抗TNFα药物和TNFα之间的结合。
在其他实施方案中，在样品中存在中和性和非中和性形式自身抗体二者时，每一种类的百分比可以以其自身表示(例如50％NAb或50％非NAb定义为样品中等比例的NAb和非NAb)或表示为比值。在某些情况下，通过将NAb的百分比除以非NAb的百分比来计算比值，或反之。在其他情况下，通过将NAb的水平除以非NAb的水平来计算比值，或反之。
在一些实施方案中，抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受抗TNFα药物治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗抗TNFα药物的自身抗体。在其他实施方案中，抗TNFα药物自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
还在另一具体方面，本发明提供用于确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)抗TNFα药物交叉反应的方法，该方法包括：
(a)按照本文所述的测定检测或测量样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比，以确定样品是中和性形式自身抗体阳性还是阴性；如果样品是中和性形式自身抗体阳性，则：
(b)使样品与标记第二抗TNFα药物接触，以形成标记第二抗TNFα药物和中和性形式自身抗体的标记复合物(即其中标记复合物的成分未相互共价附着)；
(c)对标记复合物进行大小排阻层析，以分开标记复合物(例如从游离的标记第二抗TNFα药物)；和
(d)检测标记复合物，从而确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二抗TNFα药物交叉反应。
在某些实施方案中，标记复合物的存在是抗第一抗TNFα药物的中和性自身抗体与第二抗TNFα药物交叉反应的指示，即中和性自身抗体将抑制第一和第二抗TNFα药物二者的活性。
在某些其他实施方案中，标记复合物的缺乏是抗第一抗TNFα药物的中和性自身抗体不与第二抗TNFα药物交叉反应的指示，即中和性自身抗体将不抑制第二抗TNFα药物的活性。
在具体实施方案中，第一和第二抗TNFα药物独立地选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
在其他实施方案中，样品是例如来自接受抗TNFα药物治疗的个体的全血、血清或血浆样品。在优选实施方案中，样品是血清。在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
在某些实施方案中，样品具有或疑似具有抗抗TNFα药物的自身抗体。在其他实施方案中，抗TNFα药物自身抗体包括但不限于人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)和人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
在某些方面，本发明的测定方法进一步包括酸解离步骤，其包括在使样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触之前、期间和/或之后使样品与酸接触。
用酸解离检测抗药物抗体的方法描述于本文中及2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437中，其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
在某些其它方面，本发明的测定方法包括检测样品中抗抗TNFα药物的一种或多种同种型的中和性形式自身抗体和/或非中和性形式自身抗体的存在或水平。作为非限制性实例，本发明的测定可以用来测定来自接受诸如REMICADETM(英夫利昔单抗)或HUMIRATM(阿达木单抗)的抗TNFα药物的ADA阳性患者的样品中的不同的中和性和/或非中和性ADA同种型。在某些实施方案中，该一种或多种同种型包括至少两种、三种、四种、五种或多种同种型中的多个。在其他实施方案中，该一种或多种同种型选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型、其亚类，及其组合。在某些实施方案中，通过其保留时间来表征、鉴定和/或检测每种自身抗体同种型。在其他实施方案中，通过由诸如标记抗TNFα药物的检测部分和对不同抗体同种型特异的标记抗Ig抗体的接近结合产生的信号来表征、鉴定和/或检测每种自身抗体同种型。在某些情况下，该信号包括可通过荧光共振能量转移(FRET)检测的荧光信号。
用于检测抗药物抗体(ADA)同种型的方法进一步描述于PCT申请号WO2012/054532中，其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
可以用多种可检测基团中的任一种标记生物制品(例如抗TNFα药物)或生物制品结合部分(例如TNFα)。在优选实施方案中，生物制品(例如抗TNFα药物)和生物制品结合部分(例如TNFα)包含不同的标记。在某些实施方案中，用荧光团或荧光染料标记生物制品(例如抗TNFα药物)或生物制品结合部分(例如TNFα)。荧光团或荧光染料的非限制性实例包括MolecularProbes目录中所列的那些，MolecularProbes目录在此引入作为参考(参见R.Haugland,TheHandbook-AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies,第10版,Molecularprobes,Inc.(2005))。这类示例性荧光团或荧光染料包括但不限于Alexa染料，如Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa514、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa610、Alexa633、Alexa635、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750和/或Alexa790，以及其他荧光团，包括但不限于丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺)荧光素(5-IAF)、荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-噁-1,3,-二唑-4-基氯(NBD-Cl)、溴化乙锭、荧光黄、5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、TexasRedTM磺酰氯、BODIPYTM、萘磺酸(例如1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)等)、Anthroyl脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、1-(3-磺丙基)-4-[β-[2[(二-正丁氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶甜菜碱(NaphtylStyryl)、3,3’dipropylthiadicarbocyanine(diS-C3-(5))、4-(对二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(di-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、罗丹明800、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、Al酞菁、Oxaxine1、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst33342、TOTO、吖啶橙、锭同二聚体、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofluors、六苯并苯、金属-配体复合物、700DX、700、800RS、800CW、800、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682、DY780及其混合物。其他适宜的荧光团包括酶-辅因子；镧系元素、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其突变体和衍生物。在本发明的一个实施方案中，特异性结合对的第二成员具有附着于其上的可检测基团。
通常，荧光基团是选自包含聚甲炔、酞菁、花菁、氧杂蒽、芴、罗丹明、香豆素、荧光素和BODIPYTM的染料种类的荧光团。
在一个实施方案中，荧光基团是在约650至约900nm的范围内发射的近红外(NIR)荧光团。近红外荧光技术的使用在生物学测定中是有利的，因为它实质性消除或减少了来自生物底物的自发荧光的背景。近IR荧光技术的另一益处是，来自激发源的散射光大幅减少，因为散射强度与波长的负四次方成比例。低背景荧光和低散射产生高灵敏检测所必需的高信噪比。此外，生物组织中在近IR区(650nm至900nm)中的光学透明窗口使NIR荧光成为对需要光线透射通过生物成分的体内成像和亚细胞检测应用有价值的技术。在此实施方案的方面内，荧光基团优选选自700DX、700、800RS、800CW、800、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、Alexa790、Cy5、Cy5.5、Cy7、DY676、DY680、DY682和DY780。在某些实施方案中，近红外基团是800CW、800、700DX、700或DynomicDY676。
用荧光团的化学反应性衍生物实现荧光标记。常用的反应性基团包括胺反应性异硫氰酸酯衍生物如FITC和TRITC(荧光素和罗丹明的衍生物)、胺反应性琥珀酰亚胺酯如NHS-荧光素、及巯基反应性马来酰亚胺活化荧光素如荧光素-5-马来酰亚胺，其中许多可购得。这些反应性染料中的任一种与生物制品(例如抗TNFα药物)或生物制品结合部分(例如TNFα)的反应导致在荧光团和生物制品(例如抗TNFα药物)或生物制品结合部分(例如TNFα)之间形成稳定的共价键。
在某些情况下，荧光标记反应后，通常有必要从标记靶分子去除任意未反应的荧光团。这通常利用荧光团和标记蛋白质之间的大小差异，通过大小排阻层析来实现。
反应性荧光染料可从许多来源获得。它们可以用不同反应性基团附着至靶分子内的多种官能团而获得。它们还可以在包含进行标记反应的所有成分的标记试剂盒中获得。在一个优选方面，使用来自Invitrogen(目录号A-20347)的Alexa647C2马来酰亚胺。
可以直接或间接检测中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体(例如NAb和/或非NAb)与生物制品(例如抗TNFα药物)和/或生物制品结合部分(例如TNFα)的特异性免疫学结合。直接标记包括附着至抗体的荧光或发光标记、金属、染料、放射性核素等。在某些情况下，可以用用不同放射性核素标记的生物制品(例如抗TNFα药物)或生物制品结合部分(例如TNFα)来测定样品中NAb和/或非NAb的存在或水平。在其他情况下，使用化学发光生物制品(例如抗TNFα药物)和生物制品结合部分(例如TNFα)的化学发光测定适合用于样品中NAb和/或非NAb的存在或水平的灵敏、非放射性检测。在具体情况下，用不同荧光染料标记的生物制品(例如抗TNFα药物)和生物制品结合部分(例如TNFα)适合用于检测样品中NAb和/或非NAb的存在或水平。荧光染料的实例包括但不限于Alexa染料、DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。与荧光染料连接的第二抗体可购得，例如山羊F(ab’)2抗人IgG-FITC可从TagoImmunologicals(Burlingame,CA)获得。
间接标记包括本领域公知的多种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。可以使用辣根过氧化物酶检测系统，例如使用生色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在过氧化氢的存在下产生可在450nm检测的可溶性产物。可以使用碱性磷酸酶检测系统，例如使用生色底物对硝基苯磷酸酯，其产生可容易地在405nm检测的可溶性产物。类似地，可以使用β-半乳糖苷酶检测系统，使用生色底物邻硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)，其产生可在410nm检测的可溶性产物。可以使用脲酶检测系统，使用诸如脲-溴甲酚紫(SigmaImmunochemicals；St.Louis,MO)的底物。与酶连接的有用的第二抗体可以获自许多商业来源，例如山羊F(ab’)2抗人IgG-碱性磷酸酶可从JacksonImmunoResearch(WestGrove,PA.)购得。
可以例如用检测来自生色底物的颜色的分光光度计、检测辐射的辐射计数器(如用于检测125I的γ计数器)或在某波长的光存在下检测荧光的荧光计来分析来自直接或间接标记的信号。对于酶联抗体的检测，可以按照厂家的说明用诸如EMAX酶标仪(MolecularDevices；MenloPark,CA)的分光光度计进行NAb和/或非NAb水平的定量分析。如果希望，本发明的测定可以自动化或通过机器人进行，且可以同时检测来自多个样品的信号。
在某些实施方案中，使用大小排阻层析。SEC的潜在原理是，不同大小的颗粒将按不同速率洗脱(过滤)通过固定相。这导致颗粒的溶液基于大小的分离。只要所有颗粒都同时或几乎同时上样，相同大小的颗粒将一起洗脱。每一大小排阻柱具有可以分开的分子量范围。排阻极限定义此范围上端的分子量，是其中分子太大而不能困在固定相中。渗透极限定义分离范围下端的分子量，是其中具有足够小尺寸的分子可以完全渗透入固定相的孔的分子，此分子量以下的所有分子如此小，使得它们作为单条带洗脱。
在某些方面，以恒定体积或积分收集洗脱物。颗粒的大小越相似，越有可能它们将在同一级分中而不能分开检测。优选地，通过光谱技术检查所收集的级分来测定所洗脱的颗粒的浓度。通常，用于本发明的光谱检测技术包括但不限于荧光测定、折射率(RI)和紫外(UV)。在某些情况下，洗脱体积随分子流体动力学体积的对数大致线性减少(即较重的分子先出来)。
在另一方面，本发明提供用于在接受生物制品疗程的个体中监测和/或优化生物制品治疗的方法，该方法包括：
(a)在疗程的多个时间点按照本文所述的测定检测或测量抗生物制品的中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比；
(b)检测中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在某些实施方案中，该多个时间点包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个时间点。
在一个具体方面，本发明提供用于在接受生物制品疗程的个体中监测和/或优化生物制品治疗的方法，该方法包括：
(a)在时间点t0按本文所述测量来自个体的第一样品中抗生物制品的中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(b)在时间点t1按本文所述测量来自个体的第二样品中中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(c)可选地在时间点tn+1用来自个体的n个附加样品重复步骤(b)，其中n是从1至约25的整数(例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任意范围)；
(d)检测中和性形式自身抗体的水平或百分比从时间点t0至t1或从时间点t0至tn+1的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在某些其他实施方案中，在生物制品药物疗程期间的一个或更多个(例如多个)以下周次测量中和性形式自身抗体(例如NAb)的水平或百分比：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、90、100等。
在一些实施方案中，确定用于个体的疗程的后续剂量包括维持、增加或减少用于个体的疗程的后续剂量。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括用不同的生物制品药物治疗。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括用当前疗程连同另一治疗剂治疗。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括改变当前疗程(例如转换至不同生物制品或靶向不同机制的药物)。
在具体实施方案中，中和性形式自身抗体(例如NAb)的水平或百分比的增加指示应为个体建议治疗调整。在某些其他实施方案中，随时间推移从缺乏中和性形式自身抗体(例如NAb)向存在中和性形式自身抗体的改变指示应为个体推荐治疗调整。在这些实施方案中，可以用当前疗程(例如采用现有生物制品)连同一种或多种其他治疗剂治疗个体。在某些备选实施方案中，可以使个体转换至不同生物制品。在某些其它备选实施方案中，可以使个体转换至靶向不同机制的药物(例如生物制品和/或非生物制品)。
在另一方面，本发明提供用于在接受第一生物制品疗程的个体中优化治疗和/或降低毒性的方法，该方法包括：
(a)通过按照本文所述的测定检测或测量来自个体的样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比来确定抗第一生物制品的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)生物制品交叉反应；和
(b)如果中和性形式自身抗体与第二生物制品交叉反应，则确定应对个体施用不同的疗程。
在某些实施方案中，确定应施用不同疗程包括转换至靶向不同机制的药物(例如生物制品和/或非生物制品)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括确定增加或减少当前疗程的后续剂量，或应对个体施用不同疗程(如果中和性形式自身抗体不与第二生物制品交叉反应)。在某些情况下，该不同疗程包括用第二生物制品治疗。在某些其他情况下，该不同疗程包括用第一或第二生物制品连同一种或多种其他治疗剂治疗。
在一个具体方面，本发明提供用于在接受抗TNFα药物疗程的个体中监测和/或优化抗TNFα药物治疗的方法，该方法包括：
(a)在疗程的多个时间点按照本文所述的测定检测或测量抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比；
(b)检测中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在某些实施方案中，该多个时间点包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个时间点。
在另一具体方面，本发明提供用于在接受抗TNFα药物疗程的个体中监测和/或优化抗TNFα药物治疗的方法，该方法包括：
(a)在时间点t0按本文所述测量来自个体的第一样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(b)在时间点t1按本文所述测量来自个体的第二样品中中和性形式自身抗体的水平或百分比；
(c)可选地在时间点tn+1用来自个体的n个附加样品重复步骤(b)，其中n是从1至约25的整数(例如n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，或其中的任意范围)；
(d)检测中和性形式自身抗体的水平或百分比从时间点t0至t1或从时间点t0至tn+1的变化；和
(c)根据中和性形式自身抗体的水平或百分比随时间的变化确定用于个体的疗程的后续剂量或是否应对个体施用不同的疗程。
在某些其他实施方案中，在抗TNFα药物疗程期间的一个或更多个(例如多个)以下周次测量中和性形式自身抗体(例如NAb)的水平或百分比：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、90、100等。
在一些实施方案中，确定用于个体的疗程的后续剂量包括维持、增加或减少用于个体的疗程的后续剂量。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括用不同的抗TNFα药物治疗。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括用当前疗程连同另一治疗剂治疗，该另一治疗剂包括但不限于抗TNFα治疗、免疫抑制剂、糖皮质激素、靶向不同机制的药物、营养治疗及其他联合治疗。在其他实施方案中，确定用于个体的不同疗程包括改变当前疗程(例如转换至不同的抗TNFα药物，或靶向不同机制的药物，如IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子(例如Tysabri,Vedaluzamab)、JAK-2抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，或营养治疗(例如特殊糖类饮食))。
在具体实施方案中，中和性形式自身抗体(例如NAb)的水平或百分比的增加指示应为个体建议治疗调整。在某些其他实施方案中，随时间推移从缺乏中和性形式自身抗体(例如NAb)向存在中和性形式自身抗体的改变指示应为个体推荐治疗调整。在这些实施方案中，可以用当前疗程(例如采用现有抗TNFα药物)连同一种或多种免疫抑制剂(例如氨甲喋呤(MTX)或硫唑嘌呤(AZA))治疗个体。在某些备选实施方案中，可以使个体转换至不同的抗TNFα药物。在某些其它备选实施方案中，可以使个体转换至靶向不同机制的药物(例如非抗TNFα药物)。
还在另一具体方面，本发明提供用于在接受第一抗TNFα药物疗程的个体中优化治疗和/或降低毒性的方法，该方法包括：
(a)通过按照本文所述的测定检测或测量来自个体的样品中中和性形式自身抗体的存在、水平或百分比来确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二(即不同)抗TNFα药物交叉反应；和
(b)如果中和性形式自身抗体与第二抗TNFα药物交叉反应，则确定应对个体施用不同的疗程。
在某些实施方案中，确定应施用不同疗程包括转换至靶向不同机制的药物(例如非抗TNFα药物)。这类药物的非限制性实例包括IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子(例如Tysabri,Vedaluzamab)、JAK-2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、营养治疗(例如特殊糖类饮食)及其混合物。
在一些实施方案中，该方法进一步包括确定增加或减少当前疗程的后续剂量，或应对个体施用不同疗程(如果中和性形式自身抗体不与第二抗TNFα药物交叉反应)。在某些情况下，该不同疗程包括用第二抗TNFα药物治疗。在某些其他情况下，该不同疗程包括用第一或第二抗TNFα药物连同一种或多种免疫抑制剂(如MTX或AZA)治疗。
用于检测抗TNFα药物和抗药物抗体的方法进一步描述于PCT公开号WO2011/056590中，其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
在某些情况下，本发明可以进一步包括对个体施用治疗有效量的疗程，如用于治疗与TNFα介导的疾病或障碍(例如IBD，如CD或UC)相关的一种或多种症状的抗TNFα药物或靶向不同机制的药物(例如非抗TNFα药物)。对于治疗应用，疗程可以单独施用或与本文所述的一种或多种附加治疗剂组合共同施用。因此，通过指导治疗决定及告知治疗选择和抗TNFα药物优化，使得在正确的时间点将正确的药物给与正确的患者，本发明有利地使得临床医生能够实施“个性化用药”。
IV.酸解离
在某些方面，本发明的测定方法进一步包括酸解离步骤，例如，以使得能够平衡免疫复合物用于测量针对诸如抗TNFα药物的生物制品产生的中和性自身抗体(NAb)、非中和性自身抗体(非NAb)和/或其同种型的存在或水平。结果，可以测量抗对有需要的个体施用的生物制品(例如抗TNFα药物)的NAb和/或非NAb的存在或水平，而没有来自也存在于个体样品中的所施用的生物制品的实质性干扰。具体而言，可以将个体的样品与一定量的酸孵育，该量足以提供在生物制品(例如抗TNFα药物)的存在下测量NAb和/或非NAb的存在或水平，而没有来自高生物制品药物水平的实质性干扰。
在一些实施方案中，本发明的测定方法的步骤(a)可以包括：
(a’)使样品与酸接触，以解离预先形成的自身抗体(例如包括其中和性和/或非中和性形式)和生物制品(例如抗TNFα药物)的复合物；
(b’)解离预先形成的复合物后使样品与标记生物制品(例如抗TNFα药物)和标记生物制品结合部分(例如TNFα)接触；
(c’)中和样品中的酸，以形成：
(i)标记生物制品(例如抗TNFα药物)和自身抗体的第一标记复合物；和/或
(ii)标记生物制品(例如抗TNFα药物)、标记生物制品结合部分(例如TNFα)和自身抗体的第二标记复合物。
在一些备选实施方案中，步骤(a’)和(b’)同时进行，例如，同时使样品与酸、标记生物制品(例如抗TNFα药物)和标记生物制品结合部分(例如TNFα)接触。在其他备选实施方案中，步骤(b’)在步骤(a’)之前进行，例如使样品先与标记生物制品(例如抗TNFα药物)和标记生物制品结合部分(例如TNFα)接触，然后与酸接触。在其他实施方案中，步骤(b’)和(c’)同时进行，例如，使样品与标记生物制品(例如抗TNFα药物)和标记生物制品结合部分(例如TNFα)接触，同时中和(例如通过使样品与一种或多种中和剂接触)。
在具体实施方案中，使样品与一定量的酸接触，该量足以解离预先形成的自身抗体和生物制品(例如抗TNFα药物)的复合物，使得标记生物制品结合部分(例如TNFα)、标记生物制品(例如抗TNFα药物)、未标记的生物制品(例如抗TNFα药物)和抗生物制品(例如抗TNFα药物)的自身抗体可以平衡，并在其间形成复合物。在某些实施方案中，可以使样品与一定量的酸接触，该量足以允许在高水平生物制品(例如抗TNFα药物)的存在下检测和/或测量自身抗体。
在一些实施方案中，短语“高水平生物制品”如高水平抗TNFα药物包括从约10至约100μg/mL、约20至约80μg/mL、约30至约70μg/mL或约40至约80μg/mL的药物水平。在其他实施方案中，短语“高水平生物制品”如高水平抗TNFα药物包括大于或等于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/mL的药物水平。
在一些实施方案中，该酸包含有机酸。在其他实施方案中，该酸包含无机酸。在其他实施方案中，该酸包含有机酸和无机酸的混合物。有机酸的非限制性实例包括柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸、乙酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸、三氟乙酸、苯磺酸、氨基甲磺酸、樟脑-10-磺酸、氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、丙酸、丁酸、甘油酸、琥珀酸、苹果酸、天冬氨酸及其组合。无机酸的非限制性实例包括盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氢氟酸、氢溴酸及其组合。
在某些实施方案中，酸的量对应于从约0.01M至约10M、约0.1M至约5M、约0.1M至约2M、约0.2M至约1M、或约0.25M至约0.75M的酸或酸混合物浓度。在其他实施方案中，酸的量对应于大于或等于约0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M、or10M的酸或酸混合物浓度。酸的pH可以是例如约0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。
在一些实施方案中，使样品与酸接触一定的时间量，该量足以解离预先形成的自身抗体和生物制品(例如抗TNFα药物)的复合物。在某些情况下，使样品与酸接触(例如孵育)从约0.1小时至约24小时、约0.2小时至约16小时、约0.5小时至约10小时、约0.5小时至约5小时、或约0.5小时至约2小时的时期。在其他情况下，使样品与酸接触(例如孵育)大于或等于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10小时的时期。样品可以在4℃、室温(RT)或37℃与酸接触。
在某些实施方案中，中和酸的步骤包括提高样品的pH，以允许形成本文所述的第一和/或第二标记复合物。在一些实施方案中，通过加入一种或多种中和剂例如强碱、弱碱、缓冲液及其组合来中和酸。本领域技术人员将理解，中和反应并非必然意味着得到7的pH。在一些情况下，酸中和产生碱性的样品。在其他情况下，酸中和产生酸性(但高于加入中和剂之前的样品的pH)的样品。在具体实施方案中，中和剂包含缓冲液，如pH为约7.3的磷酸缓冲盐溶液(例如10xPBS)。
在一些实施方案中，步骤(b’)进一步包括使内部对照与标记生物制品(例如抗TNFα药物)和标记生物制品结合部分(例如TNFα)一起与样品接触(例如，在解离预先形成的复合物之前、期间或之后)。在某些情况下，内部对照包含标记内部对照，例如生物胞素-Alexa488。在某些其他情况下，标记内部对照的量在每100μL所分析的样品约1ng至约25ng、约5ng至约25ng、约5ng至约20ng、约1ng至约20ng、约1ng至约10ng或约1ng至约5ng的范围内。在其他情况下，标记内部对照的量大于或等于每100μL所分析的样品约1ng、5ng、10ng、15ng、20ng或25ng。
作为本发明的方法的一个非限制性实例，可以用0.5M柠檬酸pH3.0在室温孵育样品如血清样品(例如来自接受抗TNFα药物如Remicade(IFX)治疗的个体的血清)1小时。解离(未标记)抗TNFα药物和抗抗TNFα药物的自身抗体(例如抗药物抗体，如抗IFX抗体(ATI))之间预先形成的复合物后，可以加入标记抗TNFα药物(例如IFX-Alexa488)、标记TNFα(例如TNFα-Alexa532)和可选的内部对照，并用中和剂如10xPBS、pH7.3(例如立即)中和反应混合物。中和后，可以在室温(例如在平板振荡器上)再孵育反应混合物1小时，以允许平衡及完成标记TNFα、标记抗TNFα药物、未标记抗TNFα药物和/或抗抗TNFα药物的自身抗体之间的免疫复合物的重新形成。然后可以过滤样品，并通过本文所述的SEC-HPLC分析。
在具体实施方案中，本发明的方法(例如包括酸解离后的均相液相结合动力学)显著提高IFX药物耐受性，使得可以在至多约60μg/mL的IFX存在下测量NAb和/或非NAbATI。换言之，本发明的方法可以在高水平抗TNFα药物(例如IFX)的存在下检测抗抗TNFα药物的NAb和/或非NAb(如ATI以及抗其他抗TNFα药物的自身抗体)的存在或水平，而没有来自抗TNFα药物的实质性干扰。
使用酸解离的用于检测抗药物抗体的方法进一步描述于2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437中，其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
V.生物制品治疗
本发明的测定适合用于检测和/或测量来自个体(例如接受生物制品治疗的个体)的样品中抗任意生物制品的中和性和/或非中和性自身抗体的存在或缺乏(例如阳性还是阴性)、水平或百分比。生物制品的非限制性实例包括抗体、抗体片段、蛋白质、多肽、肽、融合蛋白(例如Ig融合蛋白或Fc融合蛋白)、多价结合蛋白(例如DVDIg)、抗体-药物缀合物、疫苗、核酸、糖、其重组形式、其改造形式，及其组合。
基于抗体的生物制品的实例包括但不限于治疗性单克隆抗体及其抗原结合片段。在具体实施方案中，抗体包括抗TNFα药物，如REMICADETM(英夫利昔单抗)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)、或其组合。基于抗体的生物制品的其他实例包括抗体-药物缀合物，如AdcetrisTM(brentuximabvedotin)。表1提供已批准或目前正在开发的治疗性单克隆抗体的示例性列表。标题为“418BiotechnologyMedicinesinTestingPromisetoBolstertheArsenalAgainstDisease”的2006年PhRMA报告中提供了处于临床开发中的单克隆抗体治疗剂及已批准产品的广泛列表，其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
基于蛋白质或基于多肽的生物制品的非限制性实例包括细胞因子(例如白介素)、趋化因子、生长因子、血液产生刺激蛋白(例如促红细胞生成素)、激素(例如(促卵泡激素)、生长激素)、酶(例如(阿法脱氧核糖核酸酶))、凝血因子、胰岛素、白蛋白、其片段、其保守修饰变体、其类似物，及其组合。
细胞因子的实例包括但不限于TNFα、TNF相关凋亡弱诱导物(TWEAK)、护骨蛋白(OPG)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白介素(例如IL-1α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、可溶性IL-6受体(sIL-6R)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23和IL-27)、脂肪细胞因子(例如瘦蛋白、脂连蛋白、抗性蛋白、活性或总纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、内脏脂肪素、视黄醇结合蛋白4(RBP4))，及其组合。在具体实施方案中，白介素包括IL-2，如(阿地白介素；重组IL-2)。
趋化因子的实例包括但不限于CXCL1/GRO1/GROα、CXCL2/GRO2、CXCL3/GRO3、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、CXCL17/DMC、CCL1、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、CCL11/Eotaxin、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL17/TARC、CCL18/MIP-4、CCL19/MIP-3β、CCL20/MIP-3α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF1、CCL24/Eotaxin-2、CCL25/TECK、CCL26/Eotaxin-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2、CX3CL1，及其组合。
生长因子的非限制性实例包括表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF；也称为SERPINF1)、双调蛋白(AREG；也称为施万细胞瘤衍生生长因子(SDGF))、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等)、内皮素-1(ET-1)、角质形成细胞生长因子(KGF；也称为FGF7)、骨形态发生蛋白(例如BMP1-BMP15)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、β-神经生长因子(β-NGF)、神经营养因子(例如脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3(NT3)、神经营养蛋白4(NT4)等)、生长分化因子-9(GDF-9)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌肉生长限制因子(GDF-8)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)，及其组合。
基于受体构建体或基于融合蛋白的生物制品的实例包括但不限于与免疫球蛋白框架连接的天然存在的受体(例如(阿巴西普(abatacept)；免疫球蛋白CTLA-4融合蛋白)、(阿法赛特(alefacept)；IgG1融合蛋白)、ENBRELTM(依那西普；重组人TNF-受体融合蛋白))、组合两种不同多肽种类的改造蛋白质(例如(地尼白介素(denileukindiftitox)；包含白介素-2和白喉毒素的改造蛋白质)，及其组合。
因此，本发明可以用于检测和测量来自接受用于本文和表1中提到的一种或多种疾病或障碍的生物制品治疗的个体的样品中抗生物制品(如抗TNFα药物治疗剂)的中和性自身抗体和非中和性自身抗体的存在或水平的方法，该疾病或障碍包括以下中的一种或多种：
炎性疾病，如炎性肠病(IBD)(例如克隆病(CD)和溃疡性结肠炎(UC))、葡萄膜炎、肉样瘤病、韦格纳肉芽肿及其他以炎症作为中心特征的疾病；
自身免疫病，如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎(Bechterew病)、狼疮、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病和红斑狼疮；
癌症，如消化道和胃肠道癌(例如结直肠癌、小肠癌、胃肠道间质瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆道癌、胃癌、食管癌、阑尾癌等)；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；乳腺癌；肺癌(例如非小细胞肺癌)；前列腺癌；卵巢癌；肾癌(例如肾细胞癌)；中枢神经细胞的癌症；皮肤癌；绒毛膜癌；头颈癌；血液系统恶性肿瘤(例如白血病、淋巴瘤，如B细胞非霍奇金淋巴瘤)；骨肉瘤(例如尤因肉瘤)；软组织肉瘤(例如隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、横纹肌肉瘤)；其他软组织恶性肿瘤及乳头状甲状腺癌；
感染性疾病，如艰难梭菌病、呼吸道合胞病毒(RSV)、HIV、炭疽、白假丝酵母病、葡萄球菌感染和丙型肝炎；
血液障碍，如脓毒、败血性休克、阵发性睡眠性血红蛋白尿症和溶血性尿毒症综合症；
心血管疾病，如动脉粥样硬化、急性心肌梗塞、心肺转流术和窒息；
代谢障碍，如糖尿病，例如I型糖尿病；
遗传障碍，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；
神经障碍，如骨关节炎疼痛和阿尔茨海默病；
呼吸系统障碍，如哮喘、慢性阻塞性肺障碍(COPD)、鼻息肉和小儿哮喘；
皮肤疾病，如银屑病，包括慢性中度至严重斑块状银屑病；
移植排斥，如急性肾移植排斥、心脏和肝脏移植排斥的逆转、预防肾移植排斥、预防急性肾移植排斥、及肾移植排斥；和/或
其他障碍，如肾炎、绝经后骨质疏松(骨障碍)、嗜酸性细胞增多综合症、嗜酸细胞性食管炎和花生过敏。
在具体实施方案中，个体患有TNFα介导的疾病或障碍，例如自身免疫病(例如类风湿性关节炎)或炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)，如克隆病(CD)或溃疡性结肠炎(UC))。
VI.实施例
将以具体实施例的方式更详细地描述本发明。以下实施例是为了说明的目的而提供，并非旨在以任意方式限制本发明。本领域技术人员将容易地辨认出可以改变或修改来产生基本相同的结果的多种非关键参数。
来自2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437的实施例在此为了所有目的以其整体引入作为参考。
实施例1.监测IBD患者中中和性抗药物抗体形成的新测定的开发
此实施例说明用于在标记(例如荧光标记)抗TNFα药物和标记TNFα的存在下用大小排阻层析检测或测量患者样品(例如血清)中中和性和/或非中和性抗药物自身抗体(ADA)的存在或水平的新的均相测定。在具体实施方案中，此测定是有利的，因为它免除了对去除低亲和力ADA的洗涤步骤的需要，使用允许在可见和/或IR光谱上检测的不同标记(例如荧光团)，这减少了背景和血清干扰问题，由于荧光标记检测的高灵敏度而提高了检测低效价患者中的中和性和/或非中和性ADA的能力，作为液相反应存在，从而减少了因附着于诸如ELISA平板的固体表面而引起任意表位变化的机会。
英夫利昔单抗(IFX)和阿达木单抗(ADL)是用于治疗炎性肠病(IBD)的抗TNF单克隆抗体。疗程中常出现抗药物抗体(ADA)。这些ADA中的一部分是中和性抗体(NAb)。虽然ADA将负面影响药物药代动力学，但NAb的存在还将通过封闭药物的结合部位而导致药物功效丧失。此实施例描述基于均相迁移率变动测定(HMSA)平台的用于监测接受IFX治疗的IBD患者中NAb的出现的测定，并显示抗英夫利昔单抗抗体(ATI)成熟和NAb形成之间的相关。
方法：通过例如2012年2月16日提交的PCT申请号PCT/US2012/025437和PCT公开号WO2011/056590(其公开内容在此为了所有目的以其整体引入作为参考)中所述的HMSA来测量IFX和ATI的血清浓度。对于NAb测定，首先酸解离含有ATI的患者血清，然后加入两种标记蛋白(例如IFX-Alexa488和TNFα-Alexa532)，然后中和。将溶液稀释至2％血清，通过HPLC注射在大小排阻柱上，并通过荧光来监测复合物。计算对照和患者样品的每个图谱(例如图表或层析图)中游离TNF-Alexa532峰的曲线下面积(AUC)，然后计算百分比NAb。完全阻断抗原结合的ATI定义为100％NAb，50％意指样品中等比例的ATI是非NAb，0％意指所有ATI都是非NAb。用来自75名健康志愿者的血清建立参考范围。分析了来自针对IFX水平和ATI水平筛查的132名残留IBD患者血清的ATI阳性血清样品(>3.13U/mL)的NAb。用混合的ATI阳性患者血清建立阳性对照。
对于数据分析，用峰检测算法来找到每个实验的每个图谱中的所有峰和谷。将三次方平滑样条曲线拟合至每个图谱，峰和谷定义为信号的一阶导数的改变。峰是图谱的斜率从正向负的改变。相反，谷定义为符号从负向正的改变。认为窗口中游离TNF-Alexa532峰(例如11.5至13分钟)的预期位置处最高的峰是游离峰本身。直接处于所检测的游离峰上方和下方的谷定义峰本身的上限和下限。通过用梯形法则积分上述极限内的峰面积来发现结合、游离(TNF和IFX)和阴性对照峰下的面积。然后通过使用以下公式来计算每个样品的TNF-Alexa532峰面积的％：
％＝[(a-b)/c]*100
其中a＝未知样品中TNF-Alexa532峰的AUC，b＝来自NAb阴性对照(例如含IFX-Alexa488+TNF-Alexa532的正常人血清)的TNF-Alexa532峰的AUC，c＝正常人血清中游离的TNF-Alexa532的AUC。对于计算，“c”设为100％，“b”尽可能接近0％，但它可以根据反应条件而变。“b”和“c”之间的范围定义灵敏度的最大窗口。
结果：本发明的NAb测定已证明了高可重复性、准确度和精确度。测定内和测定间精确度小于20％CV，测定准确度在25％内。用本发明的NAb测定获得的精确度和准确度大大好于基于细胞的测定或ELISA。IFX药物耐受为～6μg/mL，而TNFα在高于1.0ng/mL时干扰。来自混合的ATI阳性患者血清的阳性对照从40％至5％NAb线性稀释。健康对照的分析显示，返回≥3％(例如3.06％)的值的样品视为NAb阳性。筛查了超过30份ATI阳性患者血清样品(3.12-199.43U/mL)的NAb，132份ATI阳性患者血清样品中的26份(19.7％)为NAb阳性(平均值22.47％，范围3.29-51.63％)。高于60U/mL的ATI对应于高中和性Ab。NAb阳性样品的进一步分析揭示ATI效价和NAb阳性之间的线性关系。具体而言，图1显示NAb百分比(y轴)和ATI水平之间存在清楚的关系(斯皮尔曼秩相关,rho＝0.564,p<<0.0001)。图2显示ATI浓度≥60U/ml预测NAb阳性(NAb+)。灵敏度＝77.8％；特异性＝98.1％；优势比＝63.6，p<<0.0001，Fisher精确检验。图3显示ATI截止值分析，证明ATI以0.931的ROCAUC预测NAb。真阳性率(TPR)＝灵敏度；假阳性率(FPR)＝1-特异性。
结论：除药物和ADA水平外，监测NAb提供关于ADA应答的必要信息，并帮助指导早期治疗干预。此方法可以应用于抗任意生物制品治疗的ADA的表征。
实施例2：用于监测中和性抗药物抗体随时间推移的形成的患者病例研究
此实施例说明在标记(例如荧光标记)抗TNFα药物和标记TNFα的存在下用大小排阻层析检测或测量患者样品(例如血清)中中和性和/或非中和性抗药物自身抗体(ADA)的存在或水平的新的均相测定的附加实施方案。此外，此实施例显示用于在患者进行治疗时监测中和性抗药物抗体和/或非中和性抗药物抗体的形成和/或从非中和性抗药物抗体向中和性抗药物抗体变动的进行抗TNFα药物治疗的IBD患者的时程病例研究。
1.药物和抗药物抗体测定
图4显示通过本文所述的液相迁移率变动测定检测ATI(即抗IFX的抗体；“HACA”)。例如，将444ngAlexa488标记IFX(18.8μg/ml于100％血清中)掺入样品来竞争出游离IFX。在具体实施方案中，可以对含有IFX和ATI的复合物的患者血清样品进行酸解离，其中进行酸解离平衡和标记加入及随后的中和。
图5显示本发明的示例性ATI/IFX液相迁移率变动测定。例如，将用荧光标记的英夫利昔单抗(IFX-488)平衡的含有多种浓度ATI(标准品或未知样品)的样品在2％血清中注射在大小排阻柱上。图5显示大的IFX-488/ATI复合物先洗脱，然后是较小的复合物，然后是未结合的IFX-488和Alexa488上样对照。通过从标准曲线内推来确定未知浓度。IFX的检测遵循相似的方法。
2.中和性和非中和性抗药物抗体测定
图6和7显示本发明的用于在荧光标记TNFα存在下用大小排阻层析检测这些自身抗体与荧光标记的抗TNFα药物的结合来确定抗药物抗体(如ATI)是中和性自身抗体还是非中和性自身抗体的测定。在一个示例性实施方案中，用荧光团“F1”标记抗TNFα药物如IFX，其中荧光团可以在可见和IR光谱中的任一个或二者上检测。类似地，用荧光团“F2”标记TNFα，其中荧光团也可以在可见和IR光谱中的任一个或二者上检测，其中“F1”和“F2”是不同荧光团。标记抗TNFα药物和标记TNFα在液相反应中与人血清孵育，以允许存在于血清中的标记抗TNFα药物(例如IFX)、标记TNFα和/或抗药物抗体(例如ATI)之间形成复合物(即免疫复合物)。
孵育后，将样品直接上样在大小排阻柱上，进行HPLC迁移率变动测定。图6显示本发明的非中和性抗药物抗体(ADA)测定，其中抗药物抗体(例如ATI)和标记TNFα(例如Alexa532标记的TNFα；“TNF-532”)二者与标记抗TNFα药物(例如Alexa488标记的IFX；“IFX-488”)的结合导致游离TNF-532水平降低。图7显示本发明的中和性ADA测定，其中抗药物抗体(例如ATI)与标记抗TNFα药物(例如IFX-488)结合而不结合标记TNFα(例如TNF-532)产生与TNF-532对照基本相同量的游离TNF-532水平。
3.用于监测中和性和非中和性抗药物抗体的时程研究
图8-11显示用于用本发明的迁移率变动测定确定抗药物抗体如ATI是中和性自身抗体还是非中和性自身抗体的来自UC患者病例研究的数据。例如，图8显示间隔1、2或3个月采集的5份样品的IFX和ATI水平的时程。图9显示测定游离TNFα的百分比随时间的变化的峰分析。具体而言，从所有样品的游离的标记TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的％。特别是，图9显示间隔1、2或3个月采集的5份样品的游离TNFα的水平提高的时程，表明中和性自身抗体水平的提高。图10显示随时间推移从存在非中和性自身抗体向中和性自身抗体变动，如间隔2或3个月采集并掺入IFX的三份样品中所示例。对于“第1年11月”样品，非中和性抗体结合所掺入的IFX，并显示TNF-532峰的减小。对于“第2年1月”样品，相对于起始复合物水平，中和性抗体(NAb)/非中和性抗体(Ab)的混合物显示TNF-532峰小幅减小。随着ATI变得几乎完全为中和性(“第2年4月”样品)，高IFX水平不能克服ATI与IFX的结合，阻止任何TNFα结合。因此，图10显示UC患者ATI谱，其中ATI谱在IFX疗程中从非中和性ATI谱变动至包含中和性ATI和非中和性ATI的混合物的谱，至中和性ATI谱。图11显示测定掺入IFX的样品中游离TNFα的百分比随时间变化的峰分析。具体而言，从所有样品的游离TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的百分比(％)。特别是，图11显示从UC患者采集的样品的游离TNFα水平的时程，表明患者进行IFX治疗时中和性自身抗体水平提高并从非中和性ATI变动至中和性ATI。
图12-14显示用本发明的迁移率变动测定进行的多种对照。具体而言，图12显示用兔抗人IgG1Fc作为非中和性抗体(Ab)对照。图13显示用ATI阳性血清作为混合的中和性抗体(NAb)/非中和性抗体(Ab)对照。图14显示从ATI阳性血清纯化ATI导致亲和力较弱的NAb的丢失。图15显示测定这些多种对照中的游离TNFα的百分比的来自UC患者病例研究的峰分析。具体而言，从所有样品的游离TNFα面积减去TNF-532/IFX-488复合物的峰面积，然后计算游离TNFα的百分比(％)。
图16-18显示来自用于用本发明的迁移率变动测定确定抗药物抗体(如ATI)是中和性自身抗体还是非中和性自身抗体的CD患者病例研究的数据。例如，图16显示来自测定在30周的时期内间隔7或8周采集的4份样品的游离TNFα的百分比的时程的CD患者病例研究的峰分析。此外，图17显示来自测定在50周的时期内采集的3份样品的游离TNFα的百分比的时程的另一CD患者病例研究的峰分析。此外，图18显示来自在诱导或维持治疗期间或之后的特定周测定样品中游离TNFα的百分比的另外4项CD患者病例研究的峰分析。
实施例3：通过HPLC迁移率变动竞争性配体结合测定检测中和性抗体(NAb)活性
此实施例说明用于用HPLC大小排阻层析测定检测或测量患者样品(例如血清)中中和性和/或非中和性抗药物自身抗体(ADA)的存在或水平的新的均相测定的其他实施方案。此外，此实施例显示用于预测和/或确定NAb与备选生物药物(如其他抗TNF药物)的交叉反应性的方法。
在一些实施方案中，免疫原性测试的多层次方法包括首先通过快速、灵敏的筛查测定来筛查药物和抗药物抗体二者。此方法为FDA和EMEA二者所推荐，对大型临床试验和每名患者多个时间点而言是有用的管理工具。确认ADA(如ATI)的存在后，然后进一步针对可具有显著的负面临床结果的中和性抗体的存在检查患者样品。中和性抗体通过结合至活性部位或活性部位附近、或通过诱导构象变化来干扰生物学活性，诱导功效丧失。还可以针对同种型和表位特异性筛查ATI。ADA出现之前和之后患者对产品的临床应答的比较可提供关于ADA出现(和抗体特征)和临床应答之间的关联的信息。
按本文所公开开发了NAb测定，该NAb测定利用HPLC迁移率变动测定。在某些实施方案中，该多层次方法或测试包括以下层次中任意一个、两个或全部三个或由以下层次中任意一个、两个或全部三个组成：(1)筛查以定性确定样品是否是NAb阳性(基于从正常人血清的分析建立的分割点的是/否)；(2)用例如免疫竞争和/或免疫耗竭确认样品是NAb阳性；和/或(3)预测和/或确定NAb与备选生物药物的交叉反应性。
I.筛查层次
确认患者样品为ADA阳性之后，可以针对NAb对它进行筛查。在某些方面，ADA的亚群是NAb。在某些实施方案中，首先用含0.5M柠檬酸的HPLC水在室温(RT)下酸解离含有ADA(例如抗IFX的抗体，也称为“ATI”或“HACA”)的患者血清1小时。在96孔板中制备样品，在平板振荡器上避光进行孵育。然后，加入两种标记蛋白(例如，含有0.1％BSA的HPLC水中的药物-Alexa488(例如IFX-Alexa488)和TNFα-Alexa532)。通过加入10XPBS、pH7.3并在RT下在平板振荡器上避光孵育1小时来中和样品。用附加的10X缓冲液和HPLC水将样品稀释至2％血清。然后通过HPLC将样品注射在大小排阻柱上。分开具有不同大小的复合物或种类，并通过荧光来监测，例如游离TNFα-Alexa532(“TNF532“)、游离IFX-Alexa488(“IFX488”)、TNF532/IFX488复合物、TNF532/IFX488/ATI复合物(非中和性Ab)和ATI/IFX488复合物(NAb)。在将结果与阴性(参见例如图12、19)和阳性(参见例如图13)对照以及从正常人血清建立的截止值(例如3.06％NAb的参考范围)比较之后，可以指明样品为NAb阳性或阴性，并可以测定效价。
图19显示通过迁移率变动测定检测非中和性抗体活性。在将TNF532与IFX488组合时，存在向约8分钟的保留时间变动，表明更高分子量复合物的形成。游离IFX-488峰(约10.5分钟)完全消失，游离TNF-532峰(约12分钟)也几乎完全消失(表明ATI/IFX/TNF三元复合物的形成)。远离IFX活性部位结合的非中和性Ab遵循类似的模式。小鼠单克隆抗体(例如约7分钟)表现如预期。
图13显示通过迁移率变动测定检测中和性抗体活性。完全中和性Ab阻止了IFX结合TNF的能力(例如由于活性部位的封闭)。这在层析图中观察为IFX-488峰随着更高分子量种类的形成而消失。TNF-532峰将不改变。事实上，如在图13中的混合的患者血清(ATI阳性血清，黑色实线)中所观察到，大多数患者经历了非中和性/中和性Ab的组合。抗IFX/Humira的F(ab’)2片段的兔多克隆抗体作为改善的NAb阳性对照也是有用的。
图8显示IFX疗程期间患者中NAb应答随时间推移而出现。虽然它们在所有时间点都是ATI阳性，但直到第2年1月(浅灰色箭头，～12分钟处从上往下第三个)时间点才出现NAb。ATI/IFX-488复合物变动至略微不同的保留时间(～7.8分钟)，指示与TNF532/IFX488/ATI复合物(～8.2和8.8分钟)相比不同大小的复合物。也可以在附加的IFX对无关蛋白质(免疫竞争)的存在下进行中和活性的确认。诸如这样的患者将是进行治疗调整的理想候选者。
图9将数据绘制为剩余的％游离TNF峰的AUC的条形图，清楚地显示患者随时间推移出现NAb。甚至在早期时间点观察到的低水平的NAb出现也预测疾病复发；为显示此活性的患者推荐治疗调整。例如，应使患者接受一种或多种免疫抑制剂，如氨甲喋呤(MTX)或硫唑嘌呤(AZA)，同时使用已有的抗TNF药物和/或转换至不同的抗TNF药物。
II.确认层次
在确认层次中，将药物(例如抗TNFα抗体)按多种浓度(例如1-50μg/mL)掺入样品来测定样品的中和能力。平行地，按相似的水平掺入非特异性IgG。掺入药物的样品应对药物显示剂量响应，可以计算NAb的EC50。非特异性IgG应没有作用。如果必要，还可以进行免疫耗竭来排除基质的影响。
图10显示随时间推移从存在非中和性自身抗体向存在中和性自身抗体变动，如间隔2或3个月采集并掺入IFX的3份样品中所示例。来自每个时间点的患者血清响应所掺入的IFX，显示响应的特异性。随时间推移，NAb变得更具中和性，最终可以中和>20μg/mLIFX(在掺入IFX时，第2年4月样品未减少)。可以进行完整的滴定来在每个时间点测定NAb的EC50。
III.交叉反应性层次
交叉反应性层次尤其用于预测患者是否将响应药物或治疗，例如抗TNFα药物或治疗。
在一些实施方案中，本发明提供根据抗药物抗体(ADA)与一系列不同的抗TNFα治疗剂交叉反应的能力来快速确定哪种治疗药物将在患者(例如，克隆病、溃疡性结肠炎或类风湿性关节炎患者)中起作用或不起作用的方法。作为非限制性实例，可以在具有抗Remicade(英夫利昔单抗)的NAb的患者(例如，克隆病、溃疡性结肠炎和/或类风湿性关节炎患者)中测试以下药物中的一种或多种：Enbrel(依那西普)；Humira(阿达木单抗)；Cimzia(赛妥珠单抗)；及Simponi(戈利木单抗)。用具体药物(例如IFX)测试为NAb阳性后，然后可以用上述起始NAb测试的方法用一系列其他药物(例如荧光标记的药物)进行NAb测定。
本发明的预测性测试用于通过防止将被患者的抗体中和的药物(例如抗TNFα药物)的使用来管理患者治疗。不受限于任意具体理论，中和性ADA的结合部位的序列可能以这样的方式发展，以类似于TNFα的序列(参见图20)。如果NAb中和任意其他抗TNF药物，则那些其他抗TNF药物可能将不是已经施用的药物的好的备选药物，因为患者可能将具有免疫应答。在一些实施方案中，可以用从正常人血清建立的截止值来确定来自患者的测试样品是阳性还是阴性。测试可以在体外背景中以快速、经济的方式进行。
以下非限制性病例研究包括患者1和2，患者1和2用Remicade(英夫利昔单抗)治疗，但随后失去对Remicade的应答。患者1患有UC，患者2患有CD。本文所述的迁移率变动测定清楚地显示，随着他们出现抗Remicade抗体(例如ATI)，患者1和2失去对Remicade的应答。然后显示这些抗Remicade抗体是中和性抗体(例如NAb)。
图21显示患者1和2出现中和性抗体(NAb)。这些NAb与TNFα竞争Remicade结合部位。重要地，这些NAb可能与其他抗TNF治疗剂交叉反应。如果NAb与其他抗TNF治疗剂交叉反应，改变为另一抗TNF治疗剂将无助于这些患者。因此，本发明的预测性测定提供优于目前管理对Remicade失去应答的患者的方法，在目前的方法中，通过改变为另一抗TNF药物来管理阳性HACA(可检测的抗体)(参见例如Afif等,Am.J.Gastroenterol.,105(5):1133-9(2010))。
为了确定响应一种抗TNF药物而产生的NAb与其他抗TNF药物的交叉反应性，针对Humira(阿达木单抗)测试了患者接受Remicade(IFX)时出现的NAb。图21中所示的数据清楚地显示，针对IFX产生的NAb与Humira交叉反应。图21显示，在加入含有NAb的患者血清时，游离Humira峰(10和11分钟之间，每项患者研究的下图)完全变动至更高分子量(～12分钟，患者研究#1；～12分钟，患者研究#2；每项患者研究的下图)。这些结果表明，NAb以这样的方式结合Humira，使得NAb在某种程度上阻止TNFα接近Humira的抗原结合部位。图22针对NAb和非NAb测定示意这一点。
在某些实施方案中，本发明的测定方法预测这些患者将不响应Humira或任意其他抗TNF治疗剂。患者不应用抗TNF治疗来治疗，而应转换至备选治疗选择，包括但不限于用于类风湿性关节炎(RA)的Actemra、Kineret、Orencia、Rituxan和/或Arzerra，或用于克隆病(CD)的Tysabri和/或类固醇。
因此，本发明的方法对通过确定或测量来自患者的样品中中和性抗体(NAb)和/或非NAb的存在和/或浓度水平来预测患者是否将响应抗TNFα治疗尤其有利。在一个实施方案中，如果样品含有抗一种抗TNFα药物的NAb，则这些NAb可能将与其他抗TNFα药物交叉反应，且对其他抗TNFα药物而言是中和性的，使得推荐用于患者的治疗调整将是转换至具有不同作用机制的药物(例如非抗TNFα药物)。在另一实施方案中，如果样品含有抗一种抗TNFα药物的非中和性ADA，则推荐用于患者的治疗调整将是转换至另一抗TNFα药物。
实施例4：用于检测中和性抗药物抗体(NAb)的存在和交叉反应性的测定
此实施例说明与本发明的用于筛查以确定样品是否是NAb阳性并预测和/或确定NAb与备选生物药物的交叉反应性的测定方法(参见例如实施例3)相关的其他实施方案。在具体实施方案中，本文所述的测定方法用于通过确定获自个体的样品是NAb阳性还是是阴性来预测接受第一抗TNFα药物的个体是否将响应备选抗TNFα治疗。如果样品是NAb阳性，则该方法包括确定NAb是否将与第二抗TNFα药物交叉反应，并在NAb与第二抗TNFα药物交叉反应时推荐个体转换至非抗TNFα药物。如果样品是NAb阴性，则该方法包括推荐个体转换至第二抗TNFα药物。
图23显示本发明的示例性NAb标准曲线的产生和使用。将用荧光标记的TNF-532/IFX-488平衡的含有多种浓度的兔(Rb)抗-IFX抗体(ATI)血清的样品(即标准品或未知样品)在2％血清中注射至大小排阻柱上。大的免疫复合物先洗脱，然后是较小的复合物，然后是未结合的IFX-488和TNF-532。可以通过从标准曲线内推来确定未知的浓度。可以组合含有NAb和非NAb的不同混合物的兔血清来制备对照。与11.63％的旧截止值相比，本文所述的NAb测定具有2.72％的改善的截止值(N＝50份正常样品)。表2按患者提供NAb临床研究摘要。
表2.NAb临床摘要-按患者
本发明的交叉反应性测定方法对预测转换至另一生物治疗是否将有利尤其有用。发现患者对一种药物为NAb阳性后，可以在测定中使用荧光标记的备选药物。如果患者血清仍显示中和能力，则新药物将不可能成功。这类方法是有利的，因为它们可以用来以经济和及时的方式筛查一系列药物，以使得能够建议或指示最佳治疗选择。
图24和25提供实施例3中所述和图21中所示的患者研究的附加病例研究。具体而言，将用Remicade(英夫利昔单抗，IFX)治疗但随后对IFX失去应答的患者3和4鉴定为可能将不响应(阿达木单抗，ADL)的患者，因为患者接受IFX时出现的NAb测定为与ADL交叉反应。
图26显示患者研究的非限制性实例，其证明ATI亲和力成熟及交叉反应性ATI的出现。
实施例5：监测IBD患者中的中和性抗药物抗体形成的新测定的开发背景和目的
抗TNF单克隆抗体如英夫利昔单抗(IFX)、阿达木单抗(ADL)及其他抗体用于治疗炎性肠病(IBD)。某些患者将产生抗药物抗体(ADA)，其可以导致药物功效的丧失和不良反应。中和性ADA(NAb)结合抗原结合部位，阻止接近TNF，并直接降低或阻止药物功效。结合ADA与抗原结合部位以外的结构成分相互作用，且不直接影响药物功效，但它们可以改变药物药代动力学。我们基于我们的均相迁移率变动测定(HMSA)平台开发了监测接受IFX或ADL治疗的IBD患者中NAb的出现的测定，并显示ATI/ATA成熟和NAb形成之间的相关。
方法
I.用于ATI的竞争性配体结合NAB测定的原理
酸解离ATI阳性患者血清。
加入IFX-Alexa488和TNF-Alexa532并中和溶液。
将溶液稀释至2％血清，通过HPLC注射在大小排阻柱上，并通过荧光来监测复合物。
计算对照和患者样品的游离TNF-Alexa532峰的曲线下面积(AUC)。
IFX-Alexa488结合TNF-Alexa532，降低测定信号。
NAb中和IFX-Alexa488，并恢复测定信号。
NAb活性与所测量的测定信号成正比。
％恢复＝(TNFAUC_样品–背景)/(TNFAUC_游离标记–BKGD)*100，例如(样品的游离的标记TNFαAUC–背景(即“背景”))/(对照样品的游离的标记TNFαAUC–背景)*100。
图27提供本发明的竞争性配体结合测定的说明。
II.药物和ADA水平测量
通过之前所述的HMSA(参见Wang等,J.Immunol.Methods,2012,382:177)来测量英夫利昔单抗、阿达木单抗和相关ADA的血清浓度。
III.样品
血清来自残余样品或IRB批准的IBD患者研究，健康对照购自GoldenWestBiologics,Inc。
用分离自用英夫利昔单抗或阿达木单抗免疫的兔的血清来产生抗英夫利昔单抗和阿达木单抗的多克隆抗体。通过亲和层析纯化免疫球蛋白级分，并通过UV/VIS分光术测定浓度。将纯化的ATI和ATA掺入正常人血清用于灵敏度和特异性实验。
结果
图28显示中和性测定的临床用途。分析了来自进行常规测试的患者的(左)130份ATI阳性残余血清样品的中和能力(0.0-430U/mL，平均值＝49.22U/mL，中位数＝19.10U/mL)。从测量低ATI阳性的33名患者的亚组中的NAb水平确定测定截止值。通过平均值+2.33xSD的公式计算具有99％单侧置信限的截止值为1.28％。在其余患者中，37/97(38.1％)为NAb阳性(平均值＝7.43％恢复)。测试了来自经历对阿达木单抗治疗失去应答的患者的横向研究的(右)11份ATA阳性血清样品的中和能力(7.93-147.9U/ml，平均值＝36.97U/mL，中位数＝16.39U/mL)。测定截止值设为上文的1.28％。5/11(45.5％)血清样品为NAb阳性(平均值＝8.19％恢复)。此群体中较高百分比的NAb可以反映在这些患者中观察到的应答丧失。
图29显示中和测定的性能特征。按方法章节中所述从兔血清纯化了ATI和ATA。
(A)NAb测定的灵敏度和特异性。将纯化的ATI(19.3μg/mL，左)、纯化的ATA(49.1μg/mL，右)和单克隆小鼠抗人Fc(36.8μg/mL)掺入50％正常人血清，进行2倍系列稀释，并在中和测定中测试。测定灵敏度定义为在NAb测定中产生阳性结果的干净血清中的最低NAb浓度(即大于1.28％，水平虚线)。测定ATI和ATA中和测定的测定灵敏度分别为0.15和0.914μg/mL(干净血清，垂直虚线)。两项测定都对ATI(左)或ATA(右)特异。
(B)英夫利昔单抗在NAb测定中的干扰。在此实验中，在2倍系列稀释的英夫利昔单抗(起始于50μg/mL)存在下测试了高对照。将数据归一化至对照最大信号，并作为信号的％抑制作图(％抑制＝100-％恢复Norm)。最左边的垂直虚线表示使CV增加至大于25％的英夫利昔单抗浓度(4μg/mL)。最右边的垂直虚线表示9.9μg/mL的IC50。
(C)NAb阳性对照的精确度。通过用正常人血清稀释混合的ATI阳性患者血清(通过HMSA测定为200U/mLATI)来制备高、中和低阳性对照。在不同的多天测试每个对照(n＝20)。对于高、中和低对照，每个对照的平均值(CV％)分别为51.35(10.4％)、28.50(15.03％)和10.38(24.22％)。
结论
均相、液相NAb测定可以检测具有中和能力的ATI和ATA二者。可以以高特异性检测分别少至0.15和0.914μg/mL的中和性ATI或ATA。该测定可以在比大多数基于细胞的配体结合测定或其他竞争性配体结合测定高的药物水平(至多4.0μg/mL)存在下检测NAb。NAb测定在扩大的动态范围内具有高准确度和精确度(CV<25％)。中和性抗体的存在可以预测进行英夫利昔单抗或阿达木单抗治疗的患者中的应答丧失。除药物和ADA水平外，监测NAb将提供关于ADA应答的必要信息，帮助指导早期治疗干预。
实施例6：对抗TNF治疗失去应答的患者中的中和性抗药物抗体应答的表征
抗TNF单克隆抗体如英夫利昔单抗(IFX)和阿达木单抗(ADL)用于治疗炎性肠病。某些患者将产生抗药物抗体(ADA)，其可以导致药物功效的丧失和不良反应。中和性ADA(NAb)结合抗原结合部位，阻止接近TNF，并直接阻止药物功效。结合ADA与抗原结合部位以外的结构成分相互作用，且不直接影响药物功效，但它们可以改变药物药代动力学。我们基于我们的均相迁移率变动测定(HMSA)平台开发了监测接受IFX或ADL治疗的IBD患者中NAb的出现的测定，并显示ATI/ATA成熟和NAb形成之间的相关。
方法：从IRB批准的IBD患者研究收集了141名ATI或ATA阳性患者。通过之前所述的HMSA(Wang等,J.Immunol.Methods,2012,382:177)来测量IFX、ADL和相关ADA的血清浓度。健康对照购自GoldenWestBiologics,Inc。用分离自用IFX或ADL免疫的兔的血清来产生抗IFX和ADL的多克隆抗体。将纯化的兔ATI和ATA掺入正常人血清用于灵敏度和特异性实验。对于NAb测定，首先酸解离ATI阳性患者血清。加入IFX-Alexa488和TNF-Alexa532并中和溶液。将溶液稀释至2％血清，通过HPLC注射在大小排阻柱上，并通过荧光来监测复合物。计算对照和患者样品的游离TNF-Alexa532峰的曲线下面积(AUC)。IFX-Alexa488结合TNF-Alexa532，降低测定信号。NAb中和IFX-Alexa488，并恢复测定信号。NAb活性与所测量的测定信号成正比。
结果：NAB测定的验证显示在扩大的动态范围内的高准确度和精确度(CV<25％)。分析了130名ATI阳性患者的中和能力(0.0-430U/mL，平均值＝49.22U/mL，中位数＝19.10U/mL)。从测量低ATI阳性的33名患者的亚组中的NAb水平确定测定截止值。通过平均值+2.33xSD的公式计算具有99％单侧置信限的截止值为1.28％。在其余患者中，37/97(38.1％)为NAb阳性(平均值＝7.43％恢复)。测试了经历对阿达木单抗治疗失去应答的11名ATA阳性患者的中和能力(7.93-147.9U/ml，平均值＝36.97U/mL，中位数＝16.39U/mL)。测定截止值设为上文的1.28％。5/11(45.5％)血清样品为NAb阳性(平均值＝8.19％恢复)。
结论：中和性抗体的存在可以预测进行英夫利昔单抗或阿达木单抗治疗的患者中的应答丧失。除药物和ADA水平外，监测NAb将提供关于ADA应答的必要信息，帮助指导早期治疗干预。
实施例7：用于检测用英夫利昔单抗或阿达木单抗治疗的IBD患者中的中和性抗体(Nab)的改进的均相迁移率变动测定(HMSA)
背景：在用英夫利昔单抗(IFX)和阿达木单抗(ADA)治疗时，某些IBD患者将产生抗英夫利昔单抗或阿达木单抗的抗体(ATI/ATA)，其可以导致药物功效的丧失和不良反应。ATI和ATA可以是中和性抗体(NAb)，其结合药物的抗原结合部位，阻止接近TNF，并直接阻止药物功效。此实施例描述本发明的针对改善的灵敏度和特异性优化的NAbHMSA，并显示与患者样品中的CRP和药物水平的相关。
方法：通过HMSA(参见例如Wang等,J.Immunol.Methods,382:177-88(2012))来测量健康对照及来自常规测试的残余患者样品中的IFX、ADA和相关抗药物抗体的血清浓度。用分离自用IFX或ADA免疫的兔的血清来产生抗IFX和ADA的多克隆抗体，纯化，并掺入正常人血清来建立阳性对照。对于NAb测定，首先酸解离ATI阳性患者血清，加入IFX-Alexa488并中和溶液，然后加入TNF-Alexa488。将溶液稀释至4％血清，通过HPLC注射在大小排阻柱上，并通过荧光来监测复合物。计算对照和患者样品的游离TNF-Alexa488峰的曲线下面积。IFX-Alexa488结合TNF-Alexa488，降低测定信号。NAb中和IFX-Alexa488，并恢复测定信号。NAb活性与所测量的测定信号成正比。
结果：实施例6中所述的NAb测定在扩大的动态范围内显示高准确度和精确度(CV<25％)，阳性截止值为1.28％恢复(29.8ng/mL)。该测定的优化产生检测患者血清中小于10ng/mLNAb的能力，并改善准确度(CV<15％)。测定优化包括对实施例6中所述的NAb测定的以下改变：(1)转换至TNF-Alexa488(保持IFX-Alexa488)；(2)将荧光检测器波长从Ex510_Em540变为Ex494_Em525(Ex＝激发，Em＝发射)；(3)将PMT(即光电倍增管)增益从14变为18；(4)调整TNF:IFX的摩尔比，并减少测定中IFX/TNF的量；及(5)调整孵育条件，即加入IFX，中和30分钟，然后加入TNF30分钟。与实施例6中所述的测定相比，用本文所述的优化的测定分析了ATI阳性患者的中和能力(3.1-200U/mL)。两种测定型式良好地相关；但是，优化的测定检测到更宽范围的中和性抗体(R2＝0.998)。可检测中和性抗体的存在与提高的CRP和降低的药物水平二者相关(p<0.001)。
结论：中和性抗体(NAb)的存在预测进行英夫利昔单抗或阿达木单抗治疗的患者中的应答丧失、CRP提高和药物水平提高。除药物和抗药物抗体水平外，监测NAb将提供关于免疫应答的必要信息，帮助指导早期治疗干预。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求书的范围之内实施某些改变和修改。此外，本文中提供的每篇参考文献以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同单独引入每篇参考文献作为参考一样。

Claims (33)

1.用于测量样品中抗抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的百分比或水平的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与标记抗TNFα药物和标记TNFα接触，以形成：
(i)所述标记抗TNFα药物和所述自身抗体的第一标记复合物；和/或
(ii)所述标记抗TNFα药物、所述标记TNFα和所述自生抗体的第二标记复合物；
(b)对所述第一标记复合物和/或所述第二标记复合物进行大小排阻层析，以将它们从游离的标记TNFα、游离的标记抗TNFα药物和/或标记抗TNFα药物和标记TNFα的复合物分开；
(c)测量大小排阻层析后游离的标记TNFα的水平；和
(d)将步骤(c)中测量的游离的标记TNFα的水平与对照样品中游离的标记TNFα的水平相比较，从而测量中和性形式自身抗体的百分比或水平。
2.权利要求1的方法，其中抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
3.权利要求1或2的方法，其中抗所述抗TNFα药物的自身抗体选自人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)、人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(c)包括测量大小排阻层析后游离的标记TNFα峰的曲线下面积(AUC)。
5.权利要求4的方法，其中通过测量大小排阻层析后对照样品中游离的标记TNFα峰的AUC来计算对照样品中游离的标记TNFα的水平。
6.权利要求5的方法，其中步骤(d)包括计算样品的游离的标记TNFα峰的AUC与对照样品的游离的标记TNFα峰的AUC的比值。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中在所述样品具有大于所建立的中和性形式自身抗体的阈值时，所述样品是中和性形式自身抗体阳性。
8.权利要求7的方法，其中阈值在约1.25％至约1.30％中和性形式自身抗体之间。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中对照样品是仅含有游离的标记TNFα的参考样品。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中样品是血清。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中样品获自接受抗TNFα药物治疗的个体。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中标记抗TNFα药物和标记TNFα包含不同的荧光团或荧光染料。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中中和性形式自身抗体存在于包含中和性自身抗体和非中和性自身抗体的自身抗体群体中。
14.用于确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二抗TNFα药物交叉反应的方法，所述方法包括：
(a)按照权利要求1至13中任一项的方法测量样品中中和性形式自身抗体的百分比或水平，以确定所述样品是中和性形式自身抗体阳性还是阴性；
如果所述样品是中和性形式自身抗体阳性，则：
(b)使所述样品与标记第二抗TNFα药物接触，以形成所述标记第二抗TNFα药物和所述中和性形式自身抗体的标记复合物；
(c)对所述标记复合物进行大小排阻层析，以分开所述标记复合物；和
(d)检测所述标记复合物，从而确定抗第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二抗TNFα药物交叉反应。
15.权利要求14的方法，其中第一和第二抗TNFα药物独立地选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
16.权利要求14或15的方法，其中抗所述第一抗TNFα药物的自身抗体选自人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)、人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
17.权利要求14至16中任一项的方法，其中标记复合物的存在指示抗所述第一抗TNFα药物的中和性自身抗体与所述第二抗TNFα药物交叉反应。
18.权利要求14至16中任一项的方法，其中标记复合物的缺乏指示抗所述第一抗TNFα药物的中和性自身抗体不与所述第二抗TNFα药物交叉反应。
19.权利要求14至18中任一项的方法，其中样品是血清。
20.权利要求14至19中任一项的方法，其中样品获自接受抗TNFα药物治疗的个体。
21.权利要求14至20中任一项的方法，其中标记第二抗TNFα药物包含荧光团或荧光染料。
22.用于在接受抗TNFα药物疗程的个体中监测和/或优化抗TNFα药物治疗的方法，所述方法包括：
(a)在所述疗程的多个时间点按照权利要求1至13中任一项的方法测量抗所述抗TNFα药物的中和性形式自身抗体的百分比或水平；
(b)检测所述中和性形式自身抗体的百分比或水平随时间的变化；和
(c)根据所述中和性形式自身抗体的百分比或水平随时间的变化确定用于所述个体的疗程的后续剂量或是否应对所述个体施用不同的疗程。
23.权利要求22的方法，其中抗TNFα药物选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
24.权利要求22或23的方法，其中抗所述抗TNFα药物的自身抗体选自人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)、人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
25.权利要求22至24中任一项的方法，其中根据所述中和性形式自身抗体的百分比或水平随时间的变化增加、减少或维持所述疗程的后续剂量。
26.权利要求22至24中任一项的方法，其中不同疗程包括不同的抗TNFα药物、当前疗程连同免疫抑制剂、或转换至不是抗TNFα药物的疗程。
27.权利要求26的方法，其中在所述中和性形式自身抗体的百分比或水平随时间推移而增加时施用所述不同疗程。
28.用于在接受第一抗TNFα药物疗程的个体中优化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括：
(a)通过按照权利要求1至13中任一项的方法测量来自所述个体的样品中中和性形式自身抗体的百分比或水平来确定抗所述第一抗TNFα药物的中和性形式自身抗体是否与第二抗TNFα药物交叉反应；和
(b)如果所述中和性形式自身抗体与所述第二抗TNFα药物交叉反应，则确定应对所述个体施用不同的疗程。
29.权利要求28的方法，其中第一和第二抗TNFα药物独立地选自REMICADETM(英夫利昔单抗)、ENBRELTM(依那西普)、HUMIRATM(阿达木单抗)、(赛妥珠单抗)、(戈利木单抗；CNTO148)，及其组合。
30.权利要求28或29的方法，其中抗所述第一抗TNFα药物的自身抗体选自人抗嵌合抗体(HACA)、人抗人源化抗体(HAHA)、人抗小鼠抗体(HAMA)，及其组合。
31.权利要求28至30中任一项的方法，其中不同疗程包括转换至不是抗TNFα药物的疗程。
32.权利要求31的方法，其中非抗TNFα药物选自IL-6受体抑制性单克隆抗体、抗整联蛋白分子、JAK-2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、营养治疗、及其混合物。
33.权利要求28至32中任一项的方法，其中方法进一步包括确定应增加或减少当前疗程的后续剂量，或者如果所述中和性形式自身抗体不与所述第二抗TNFα药物交叉反应，则应对所述个体施用不同疗程。
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