CN109791142A

CN109791142A - 用于确定样品中治疗性单克隆抗体及其相应抗药物抗体的量的通用测定

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Publication number: CN109791142A
Application number: CN201780046668.1A
Authority: CN
Inventors: P·瓦尔霍; G·亨里克·林德尔
Original assignee: W Health Co
Current assignee: W Health Co
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: EP3482199A1; US11119096B2; WO2018007327A1; JP2019522199A; CN109791142B; US20190162718A1

Abstract

本发明涉及用于确定生物样品中一种或多种治疗性单克隆抗体药物和/或治疗性单克隆抗体抑制剂药物抗体的存在和量的部件试剂盒和方法，该方法包括以下步骤：提供反应液，所述反应液包含：样品、包含治疗性单克隆抗体的靶标和第一缀合部分的第一缀合物、及包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，然后当治疗性单克隆抗体药物、第一种缀合物和第二种缀合物之间形成复合物时，检测分光光度信号的变化。

Description

用于确定样品中治疗性单克隆抗体及其相应抗药物抗体的量的通用测定

技术领域

本发明涉及在可能已经对治疗性单克隆抗体治疗产生免疫应答的患者中监测或测定生物样品中是否存在治疗性单克隆抗体及其抗体，如抗药物抗体(ADA)。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及测定生物样品中治疗性单克隆抗体的量的方法，所述生物样品优选血液样品，优选血液样品，优选包含小于200μl。

在另一实施方式中，本发明涉及测定生物样品(优选血液样品，优选包含小于200μl)中的针对抗治疗性单克隆抗体的一种或多种抗药物抗体(ADA)的量的方法。

在另一实施方式中，本发明涉及测定生物样品(优选血液样品，优选包含小于200μl的样品)中治疗性单克隆抗体及其抗体的量的方法。

此外，本发明涉及用于测定生物样品(优选血液样品，优选包含小于200μl的样品)中的治疗性单克隆抗体及其抗体的量的组件的试剂盒。

背景技术

治疗性单克隆抗体越来越多地用于对抗一系列疾病。

然而，由于若干原因，不管之前对治疗的反应是否充分，接受治疗性单克隆抗体治疗的患者对其治疗反应不佳。通常，不良反应者的血液中游离药物(治疗性单克隆抗体)含量较低-低于由给予的剂量预期所得。因此，重要的是能够监测患者血流中的药物(治疗性单克隆抗体)的水平。如果血液中的药物水平低，则可以推荐增加相关治疗性单克隆抗体的剂量。然而，对治疗反应差的原因通常是患者的免疫系统已经产生针对正在用以治疗患者的特定治疗性单克隆抗体的抗体。因此，本领域还需要监测抗药物抗体(ADA)，即针对患者血液中的治疗性单克隆抗体的抗体的(潜在)存在。

作为一个实例，抗肿瘤坏死因子(TNF)疗法已成为用于处理几种慢性免疫炎性疾病的重要因素。目前，批准了三种临床用于患有诸如类风湿性关节炎(RA)、克罗恩氏病和严重银屑病等各种慢性炎症疾病患者的重组抗TNFα药物：1)Remicade_TM(英夫利昔单抗)，小鼠-人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体，2)Enbrel^TM(依那西普)，人TNF受体2和人IgG1的融合蛋白，和3)Humira^TM(阿达木单抗)，完全人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体。两种其他抗TNF-α抗体构建体在患有某些同样的疾病的患者的关键III期试验中显示出前景：4)Cimzia^TM CDP870(赛妥珠单抗)，人源化抗TNF-α单克隆抗体的PEG化Fab片段，和5)CNTO 148(戈利木单抗)，完全人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体。所有这些蛋白质都显著降低了疾病活动，并且在某些患者中可以诱导缓解。

然而，不幸的是，并非所有患者都对抗TNFα药物反应良好。某些患者或者根本没有反应(初次应答失败)或者他们最初反应但是后来复发(二次应答失败)，尽管增加了剂量和/或更频繁地施用药物。这些应答失败的原因并不总是很清楚，但个体间甚至个体内生物利用度和药代动力学的差异可能导致这个问题。导致患者产生抗-抗体的药物的免疫原性是许多研究者、药物控制机构、健康保险公司和药物制造商现在认识到的问题。因此，需要监测患者功能性抗TNFα药物和抗-抗体的发展的循环水平，以便可以针对个体患者订制给药，从而可以有效且经济地提供延长的治疗，而对患者几乎没有风险或没有风险。

在重复输注后，中和性抗TNFα药物的形成成为需要增加剂量或更频繁给药的问题，并且由于二次应答失败和/或输注相关的副作用可能需要停止治疗；在RA患者和其他免疫炎症疾性患者中都观察到了这种情况。然而，在临床实践中，患有RA或任何其他用英夫利昔单抗治疗的慢性炎性疾病的患者可能与随机临床试验中的普通患者显著不同。例如，即使英夫利昔单抗的初始生物利用度由于静脉内施用药物而接近100％，药代动力学的差异可能导致个体患者在输注之间延长的时间段内药物水平不足。抗体的出现可以加剧这个问题。许多研究报道了RA和克罗恩氏病患者中针对TNF-α的治疗性蛋白质的浓度-效应关系以及药物水平与ADA之间的反比关系。

在用其他治疗性单克隆抗体治疗期间发生类似问题。

实际上，由于针对生物药物(特别是治疗性单克隆抗体)的抗体(ADA)的诱导而引起的应答失败越来越多地出现。当长期递送药物，即在数月或数年的时间内定期施用时，针对生物药物的宿主(患者)抗体的发展是特别相关的。通常，抗TNFα药物是长期递送的。在测量ADA时，重要的是从非中和性ADA中识别中和性ADA。

宿主抗体的发展可以通过增加剂量来补救，尽管这通常是延迟的而且甚至是临时反应，因为通常只是一旦患者症状明显恶化时增加处方剂量，并且增加的剂量可能导致患者免疫系统的进一步增强。通常，更优选的治疗方法是改变治疗方案并使用另一种药物(即另一种治疗性单克隆抗体)。

因此，正确评估来自患者的生物样品中治疗性单克隆抗体及其抗体(ADA)的量对药物实施者提出了普遍存在的挑战。

已经使用不同的方法来评估治疗性单克隆抗体及其抗药物抗体的循环水平。其中某些是基于酶免疫测定(EIA)，其中治疗性单克隆抗体被固定在塑料珠或孔上，并使用通过抗药物抗体桥接经标记的治疗性单克隆抗体的结合作为读数。其他测定通过选择性吸收检测抗药物抗体和治疗性单克隆抗体的复合物，例如通过免疫球蛋白TNFα抑制剂的Fab与蛋白A的结合，或与抗轻链Fab的抗体的结合。

然而，这些方法是麻烦且对于给定的治疗性单克隆抗体是特异的(该方法不具有能普遍应用于几种不同的治疗性单克隆抗体的功能)。此外，这些方法可能不适合在同一测定程序中同时检测和定量治疗性单克隆抗体及其抗体。

US 2013/0295685 A1和WO 2011/056590 A1公开了迁移率变动测定，其中样品与标记的TNF-α复合物接触，之后使用尺寸排阻色谱法检测样品中TNF-α抑制性药物的存在。

Hock等.(The Drug Monit，第38卷，第1期，32-41页，2016年2月)描述了一种基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法，用于在接受阿达木单抗或英夫利昔单抗的患者中检测药物和ADA。

然而，这些技术既麻烦又耗时。

因此，开发可用于监测几种治疗性单克隆抗体的生物利用度和针对几种治疗性单克隆抗体的抗体发展的测定具有直接的临床重要性。特别是，本领域需要快速且可靠的方法，其可以在患者访问诊所时进行。

因此，本领域持续需要用于确定治疗性单克隆抗体及其抗体的替代方法，尤其是普遍适用并提供增加的准确性并提高再现性的方法。

本发明的目的在于提供这些方法和用于所述方法的部件的试剂盒。

特别是，本领域需要可以普遍应用的部件的试剂盒和方法，其意义在于医学实践者可以使用相同测定评估不同的个体患者(可能使用不同处方药物的患者)。本发明的目的在于提供这样的方法和部件的试剂盒。

通过患者友好和用户友好设备测量血液样品中的分析物通常旨在分析由少于200μl血液组成的血液样品。这些量很容易通过个体患者获得，而不会与严重的健康风险相关联。

因此，本领域需要能够分析血液样品中治疗性单克隆抗体及其抗体量的方法和装置。此类血液样品通常包含少于200μl的血液。因此，更具体而言，本领域需要能够分析血液样品中的治疗性单克隆抗体及其抗体量的方法和装置，所述血液样品包含少于200μl的血液，如小于180μl血液，如小于150μl，如小于100μl，如小于50μl，如小于20μl，如小于10μl，如小于9μl，如小于8μl，如小于7μl，如小于6μl，如小于5μl，如小于4μl，如小于3μl，如2μl以下血液。本发明的目的在于提供这样的方法。

另一个挑战是增加每次分析的容易程度，优选达到在没有医学实践者的帮助的情况下由患者进行血液中治疗性单克隆抗体及其抗体的测量的水平。此外，将每个测量成本降低到消费者可承受的水平也是一个挑战。

因此，本领域需要方法和患者友好的部件的试剂盒，其允许准确且容易地测量血液样品中治疗性单克隆抗体及其抗体的水平。此外，本领域需要能够简单且容易地处理样品和血液分析的方法和部件的试剂盒。本发明的目的在于提供这样的方法。

具体实施方式

本发明涉及样品中治疗性单克隆抗体(药物)的检测和定量，特别是涉及同时对样品中治疗性单克隆抗体的检测以及针对治疗性单克隆抗体(抗药物抗体)的抗体的检测。

治疗性单克隆抗体

根据本发明的治疗性单克隆抗体是通过结合人体中的特定靶标而发挥其功能的抗体药物。

根据本发明，“靶标”是指包含相关治疗性单克隆抗体在施展其相关生物学功能时所结合的分子表位的物质或结构。

表1(参考维基百科“治疗性单克隆抗体列表”2016年6月30日；https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_therapeutic_monoclonal_antibodies)包括经批准的和研究的治疗性单克隆抗体(“药物”)以及已退出市场的治疗性单克隆抗体(“药物”)。因此，“使用”栏不一定表示临床使用。表1中出现的药物和靶标是根据本发明的特别优选的治疗性单克隆抗体和特别优选的治疗性单克隆抗体靶标。

本发明的发明人先前已提交了涉及本申请的发明构思的专利申请。然而，该申请仅针对TNF-α结合药物的检测。

自提交该申请以来，本发明的发明人惊讶地发现本发明构思适用于检测样品中基本上所有的治疗性单克隆抗体(药物)，特别是同时检测样品中的其相应的抗体(抗药物抗体)。

因此，一方面，本发明涉及治疗性单克隆抗体和/或其相应的抗药物抗体的检测方法，条件是治疗性单克隆抗体不是TNF-α抑制药物或物质。

因此，另一方面，本发明涉及治疗性单克隆抗体和/或其相应的抗药物抗体的检测方法，条件是该方法中使用的通用配体(靶标)不是TNF-α。

一方面，本发明涉及检测选自包含以下治疗性单克隆抗体的治疗性单克隆抗体；3F8、8H9、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比珠单抗(Abituzumab)、阿布里单抗(Abrilumab)、阿卡单抗(Actoxumab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿比珠单抗(Abituzumab)、阿布里单抗(Abrilumab)、阿卡单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿达卡莫单抗(Adecatumumab)、阿杜单抗(Aducanumab)、阿芙土珠单抗(Afutuzumab)、PEG化的阿拉西马单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿妥莫单抗(Alirocumab)、戊妥莫单抗喷替酸(Altumomab pentetate)、阿马昔单抗(Amatuximab)、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安替单抗瑞伐坦(Anetumabravtansine)、阿尼弗洛姆单抗(Anifrolumab)、安鲁单抗(Anrukinzumab,＝IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿斯库昔单抗(Ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、安妥明单抗()Atinumab、阿特立单抗(Atlizumab,＝托珠单抗)、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝格洛姆单抗(Begelomab)、贝利木单抗(Belimumab)、贝拉珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝佐洛单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、双马单抗(Bimagrumab)、贝美珠单抗(Bimekizumab)、莫比瓦妥单抗(Bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、布洛唑单抗(Blosozumab)、博科齐单抗(Bococizumab)、维本妥昔单抗(Brentuximabvedotin)、布里亚明单抗(Briakinumab)、溴达拉单抗(Brodalumab)、溴化丙单抗(Brolucizumab)、支舒巴单抗(Brontictuzumab)、卡那单抗(Canakinumab)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、坎妥单抗瑞伐坦(Cantuzumab ravtansine)、卡普利单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽偶联物(Capromab pendetide)、卡伦单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-多柔比星免疫偶联物(cBR96-doxorubicinimmunoconjugate)、西利珠单抗(Cedelizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、Ch.14.18、伯格西他土珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉扎珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumabtetraxetan)、钴妥珠单抗(Codrituzumab)、考土昔单抗-DM4偶联物(Coltuximabravtansine)、康妥单抗(Conatumumab)、康昔单抗(Concizumab)、克伦单抗(Crenezumab)、CR6261、达塞珠单抗(Dacetuzumab)、达利珠单抗(Daclizumab)、达妥珠单抗(Dalotuzumab)、PEG化的达匹罗单抗(Dapirolizumab pegol)、达雷木单抗(Daratumuma)、癸曲单抗(Dectrekumab)、地昔单抗(Demcizumab)、丹因珠单抗-MMAF偶联物(Denintuzumabmafodotin)、地诺单抗(Denosumab)、地洛昔单抗-生物素(Derlotuximab biotin)、地莫单抗(Detumomab)、丁妥昔单抗(Dinutuximab)、地利达莫单抗(Diridavumab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、屈西他单抗(Drozitumab)、杜利他单抗(Duligotumab)、杜普单抗(Dupilumab)、杜伐单抗(Durvalumab)、杜昔单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依屈洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、埃尔德单抗(Eldelumab)、埃格曼图姆单抗(Elgemtumab)、伊洛珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、艾马珠单抗(Emactuzumab)、依米妥珠单抗(Emibetuzumab)、恩伐珠单抗(Enavatuzumab)、伊凡珠单抗-维多汀偶联物(Enfortumab vedotin)、PEG化恩莫单抗(Enlimomab pegol)、恩比利珠单抗(Enoblituzumab)、依诺珠单抗(Enokizumab)、依诺替单抗(Enoticumab)、恩师妥昔单抗(Ensituximab)、西依匹莫单抗(Epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、依他珠单抗(Etaracizumab)、依曲利珠单抗(Etrolizumab)、依伐单抗(Evinacumab)、依福单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法鲁珠单抗(Farletuzumab)、法辛单抗(Fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(Felvizumab)、费扎尼单抗(Fezakinumab)、非卡妥珠单抗(Ficlatuzumab)、菲妥木单抗(Figitumumab)、福利木单抗(Firivumab)、法兰妥单抗(Flanvotumab)、福利替单抗(Fletikumab)、芬特妥珠单抗(Fontolizumab)、福拉木单抗(Foralumab)、福韦单抗(Foravirumab)、去甲美马单抗(Fresolimumab)、富拉单抗(Fulranumab)、伏妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、加尼单抗(Ganitumab)、冈特莫单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、格图单抗-奥佐米星偶联物(Gemtuzumabozogamicin)、格伐克单抗(Gevokizumab)、吉妥昔单抗(Girentuximab)、维格列巴单抗(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Gomiliximab)、古塞尔库姆单抗(Guselkumab)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、伊立莫单抗替西坦偶联物(Ibritumomab tiuxetan)、伊鲁库单抗(Icrucumab)、伊达鲁单抗(Idarucizumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、伊马单抗(Imalumab)、英西单抗(Imciromab)、伊马曲单抗(Imgatuzumab)、伊克拉单抗(Inclacumab)、吲妥昔单抗瑞伐坦(Indatuximab ravtansine)、维因度单抗(Indusatumabvedotin)、英特单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物偶联物(Inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、伊拉单抗(Iratumumab)、伊沙昔单抗(Isatuximab)、伊托珠单抗(Itolizumab)、伊克珠单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉托唑单抗(Labetuzumab)、兰布利单抗(Lambrolizumab)、拉帕单抗(Lampalizumab)、利勃珠单抗(Lebrikizumab)、利马索单抗(Lemalesomab)、仑齐鲁单抗(Lenzilumab)、勒德利木单抗(Lerdelimumab)、莱卡单抗(Lexatumumab)、利比维单抗(Libivirumab)、维利伐妥单抗(Lifastuzumab vedotin)、利格珠单抗(Ligelizumab)、利洛单抗-赛塔坦偶联物(Lilotomab satetraxetan)、络德昔单抗(Lodelcizumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、立鲁单抗(Lirilumab)、洛克韦单抗(Lokivetmab)、莫洛伐妥单抗(Lorvotuzumab mertansine)、卢卡珠单抗(Lucatumumab)、PEG化的卢利珠单抗(Lulizumab pegol)、鲁米昔单抗(Lumiliximab)、鲁曲单抗Lumretuzumab()、马塔单抗(Mapatumumab)、马妥昔单抗(Margetuximab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马维里单抗(Mavrilimumab)、马妥单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、迈他珠单抗(Milatuzumab)、米拉珠单抗(Metelimumab)、明妥莫单抗(Minretumomab)、米维妥昔单抗-索拉素偶联物(Mirvetuximab soravtansine)、米托单抗(Mitumomab)、莫加利单抗(Mogamulizumab)、莫洛莫单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(Moxetumomab pasudotox)、穆罗莫纳-CD3(Muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(Nacolomab tafenatox)、纳霉单抗(Namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(Naptumomab estafenatox)、纳妥单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈米单抗(Necitumumab)、奈莫利珠单抗(Nemolizumab)、奈西伐单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、尼沃单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(Nofetumomabmerpentan)、奥比妥昔单抗(Obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥卡伦单抗(Ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、阿法单抗(Ofatumumab,)、奥拉他单抗(Olaratumab)、奥昔单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、阿那妥单抗(Onartuzumab)、恩妥昔单抗(Ontuxizumab)、阿昔单抗(Opicinumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替单抗(Orticumab)、奥利昔珠单抗(Otelixizumab)、奥特鲁单抗(Otlertuzumab)、奥索单抗(Oxelumab)、奥扎尼单抗(Ozanezumab)、帕吉巴昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、潘科曼单抗(Pankomab)、泛巴单抗(Panobacumab)、帕撒单抗(Parsatuzumab)、帕昔单抗(Pascolizumab)、帕索妥昔单抗(Pasotuxizumab)、帕特利珠单抗(Pateclizumab)、帕特利单抗(Patritumab)、彭布利单抗(Pembrolizumab)、培马单抗(Pemtumomab)、哌拉单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培昔单抗(Pexelizumab)、匹利珠单抗(Pidilizumab)、维匹那妥单抗(Pinatuzumab vedotin)、品妥莫单抗(Pintumomab)、普鲁单抗(Placulumab)、维波达单抗(Polatuzumab 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vedotin)、范蒂姆单抗(Vantictumab)、维库珠单抗(Vanucizumab)、伐昔单抗(Vapaliximab)、伐利单抗(Varlilumab)、伐他珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏罗昔单抗(Volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(Vorsetuzumabmafodotin)、伏妥单抗(Votumumab)、扎鲁单抗(Zalutumumab)、扎诺米单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉明单抗(Ziralimumab)、阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(Zolimomab aritox)以及来自人类患者的样品中的相应抗药物抗体。

换句话说，本发明涉及选自包含靶向表1中提到的分子靶标之一的治疗性单克隆抗体组的治疗性单克隆抗体(及其相应的抗药物抗体)的检测，条件是该组不包含靶向TNF-α的治疗性单克隆抗体。

表1

本发明特别优选的方面涉及检测靶向IL17A的治疗性单克隆抗体，例如溴达拉单抗、塞库单抗和伊克珠单抗以及相应的抗药物抗体。

如上所述，本领域普遍需要方法和患者友好的部件试剂盒，其提供生物样品中的(多种)治疗性单克隆抗体及其抗体水平的准确、灵敏和可再现的测量。在某些实施方式中，根据本发明的生物样品选自由以下组成的组：血液、血清、淋巴液、淋巴结组织、脾组织、骨髓或衍生自这些组织中的一种或多种的富含免疫球蛋白的级分。根据本发明，血液样品是指来自患者的全血样品或由其衍生的材料(如血清)。

本发明的上述目的根据本发明解决，其提供了一种用于检测样品中治疗性单克隆抗体及其抗体的水平的高效灵敏的检测方法。

该检测方法的基本原理是使用治疗性单克隆抗体的经“标记”靶标作为治疗性单克隆抗体特异性的通用配体。通用配体以这样的方式进行标记：即它在治疗性单克隆抗体存在下形成分子复合物。发现由此形成的复合物能够改善分光光度信号。据信，这种能力的原因是携带两个表位结合序列的(大部分)单克隆抗体的双功能性。因此，单一治疗性单克隆抗体能够结合两个(相同或不同)部分并将其桥接在一起。因此，多个治疗性单克隆抗体和多个靶标在大分子网络中结合在一起，当使用固体颗粒时，其在分光光度测试中改变样品的吸光度。在作为另一种选择的方面中，所述部分可以是双套功能部分，如酶及其底物或者荧光团和猝灭剂。

因此，在第一实施方式中，本发明提供了一种测定一种或多种血液样品中治疗性单克隆抗体的存在和量的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供包含治疗性单克隆抗体的靶标和第一缀合部分的第一缀合物，

b.提供包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，

c.提供包含第一缀合物和第二缀合物的反应液，并使样品与反应液接触，由此形成检测液，所述检测液包含：可能包含治疗性单克隆抗体的样品、以及第一缀合物和第二缀合物，

d.在步骤c中使样品与反应液接触后(当形成包含治疗性单克隆抗体以及第一缀合物和第二缀合物的复合物时)检测分光光度信号的变化，和

e.确定治疗性单克隆抗体的量。

优选地，通过将所得结果与内标比较来执行步骤e。

内标可以通过预先生成的标准曲线提供，该标准曲线通过在具有已知(加标)含量的特定治疗性单克隆抗体药物的相应样品中进行的上述方法产生的信号绘制。由于结合亲和力的差异，对不同治疗性单克隆抗体药物需要不同的内标，因此该测定对于不同的治疗性单克隆抗体药物以不同的方式进行。

在本发明的一个实施方式中，还测量血红蛋白水平并用于评估血液样品中治疗性单克隆抗体及其抗体的相对水平。

第一缀合物和第二缀合物

在某些实施方式中，根据本发明的缀合物(第一和第二)可以是相同的，并且在其他实施方式中，成对地起作用。

在一个高度优选的实施方式中，缀合物是用相关治疗性单克隆抗体的靶标包被的固体颗粒。在这些实施方式中，第一和第二部分是固体颗粒，并且通过形成包含相关治疗性单克隆抗体以及第一和第二缀合物的复合物而提供的可检测信号可以例如是检测液浊度的变化。惊讶地观察到，在这样的实施方式中，单一治疗性单克隆抗体药物能够结合并固定多于一种的缀合物(颗粒)，从而产生与药物浓度成比例的可检测的网状物。

然而，发现在相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合位点以外的位点处将各治疗性单克隆抗体结合一起的另外的配体，即，治疗性单克隆抗体结合剂的添加大大提高了测定性能。治疗性单克隆抗体结合剂必须能够在除相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合位点以外的位点处将两种治疗性单克隆抗体结合在一起。因此，抗体是优选的治疗性单克隆抗体结合剂。作为这种治疗性抗体结合剂的实例(参见下面的实施例1)，可以加入多克隆兔抗人IgG Fc，其在除相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合位点以外的位点处将大部分相关治疗性单克隆抗体分子结合在一起。

因此，在一个高度优选的实施方式中，本发明的方法包括向反应液中进一步加入治疗性单克隆抗体结合剂，该治疗性单克隆抗体结合剂能够在除相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合位点以外的位点处将各个治疗性单克隆抗体分子结合在一起，即该结合不妨碍治疗性单克隆抗体与其靶标之间结合。优选地，这种另外的配体是针对治疗性单克隆抗体的多克隆抗体，其指向治疗性单克隆抗体分子中的不与相关治疗性单克隆抗体的靶标结合相互作用的区域。作为这样的治疗性单克隆抗体结合剂，可以使用任何化合物或蛋白质(优选抗体)，其以或多或少的特异性结合两种以上相关治疗性单克隆抗体，但不在相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合中相互作用。此类试剂可选自由以下组成的组：抗Ig抗体，如Fc特异性或Fab特异性抗体，蛋白G，蛋白A，蛋白H，蛋白L和蛋白A/G融合蛋白。因此，可以选择治疗性单克隆抗体结合剂以特异性结合TNFα抑制剂的特定亚型，例如当使用蛋白A以高亲和力结合人IgG1和IgG2时。

应当理解的是，治疗性单克隆抗体结合剂通常不旨在对特定治疗性单克隆抗体具有特异性。通常，治疗性单克隆抗体结合剂将在相同或不同类别或亚型抗体中以具有不同特异性结合不同抗体。

此外，重要的是，在测定中添加治疗性单克隆抗体结合剂(即能够在除相关治疗性单克隆抗体的靶标的结合位点以外的位点处将各个治疗性单克隆抗体分子结合在一起的试剂)允许该测定能够检测中和性抗药物抗体并忽略非中和性抗药物抗体。这被认为是由于治疗性单克隆抗体结合剂本身作为人工添加的非中和性抗体的功能而结合治疗性单克隆抗体，从而促进了测定的增强。

因此，一方面，本发明涉及针对治疗性单克隆抗体的中和性抗体的特异性检测。在该特定测定中，治疗性单克隆抗体结合剂应优选以与加入测定的治疗性单克隆抗体的靶标量对应的量(摩尔)加入，即，其加入量应为测定中靶标量的至少0.1倍，如测定中靶标量的至少0.5倍，例如测定中靶标量的至少1.0倍。

在本发明的高度优选的实施方式中，第一和第二部分都是相同或不同大小的固体颗粒，例如聚苯乙烯颗粒、胶乳颗粒、琼脂糖凝胶或琼脂糖珠或者其他多糖聚合物的珠，或者磁性或顺磁性珠。此外，在高度优选的实施方式中，当第一和第二部分是不成对起作用的部分，即都是固体颗粒时，优选使用能够将一种治疗性单克隆抗体与另一种治疗性单克隆抗体连接的治疗性单克隆抗体结合剂。

在本发明的另一个优选实施方式中，缀合物包含成对起作用的第一和第二缀合物。所述对是例如包含与酶缀合的治疗性单克隆抗体的靶标的第一缀合物、和包含与该酶的底物缀合的治疗性单克隆抗体的靶标的第二缀合物。因此，在本发明的优选实施方式中，第一部分是酶，第二部分是第一部分的底物。作为这种系统的优选实例是辣根过氧化物酶(HRP)系统。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述对是例如包含与荧光团缀合的治疗性单克隆抗体的靶标的第一缀合物、和包含与荧光团的调节剂(如淬灭剂)缀合的治疗性单克隆抗体的靶标的第二缀合物。因此，在本发明的优选实施方式中，第一部分是荧光团，第二部分是由第一部分提供的荧光的调节剂。作为所述系统的优选实例是基于均质抗体的邻近延伸测定(proximity extension assay)，如来自Perkin Elmer的基于荧光的α筛选或来自Beckman Coulter的基于化学发光的SPARCL(空间邻近分析物试剂捕获发光)技术。

根据本发明，荧光团是指试剂或要素，其在反应和检测液中的存在引起可检测的电磁辐射(光)的发射，如光致发光或化学发光标记化合物。在优选的实施方式中，荧光团是响应于以不同波长的光接触或照射而发射可检测光的试剂。

加标测定

惊讶地发现可以验证通过根据本发明的方法测量的治疗性单克隆抗体的量的测量(通过检测患者来源的抗药物抗体的存在/不存在)，和/或通过使用间接测量在同一测定中检测和定量样品中患者衍生的抗药物抗体的水平，其中样品加标有已知量的相应治疗性单克隆抗体。

通过将获得的测量结果与这种测量的预期结果(包括加标量的治疗性单克隆抗体)进行比较，可以确立样品中抗药物抗体的存在/不存在。如果存在这种中和性抗药物抗体，则治疗性单克隆抗体的测定量小于加标样品中的预期(真实)量。如果样品中存在非中和性抗药物抗体，则治疗性单克隆抗体的测定量与加标样品中的预期(真实)量相同或更高。如果存在非中和性抗药物抗体，并且测定(包括对内标测量的测定)包括添加足量的治疗性单克隆抗体结合剂(大大超过非中和性抗体的存在)，则治疗性单克隆抗体的测定量与加标样品中的预期(真实)量相同。

通过将超过一个的所得测量值与这种测量的相应预期结果进行比较，可以确立样品中抗药物抗体的量(参见下面的实施例2)。

因此，惊讶的是，相关治疗性单克隆抗体及其相应的抗药物抗体的存在可以同时在单一测定中进行。

在其最简单的方面，样品中相关治疗性单克隆抗体的量可以在一种或多种已知量的相关治疗性单克隆抗体(可以在检测之前添加到检测液或样品中)的存在下测定，并且确定包括加标添加物的相关治疗性单克隆抗体的量。在不存在抗药物抗体(ADA)的情况下，所得结果将反映最初的存在量和通过加标添加的量。然而，如果所得结果低于由通过加标添加的量预期的，则确认存在中和ADA。更进一步地，然后可以通过将所得结果与内标比较，来数学地确定相关治疗性单克隆抗体及其ADA的量(参见下面的实施例)。加标加入相关治疗性单克隆抗体的量于是应优选高于样品中存在的预期量或与其一样高。甚至更优选的是，可以对样品进行两种或更多种测定，所述测定包括不同量的相关治疗性单克隆抗体的加标加入，在这种情况下，相关治疗性单克隆抗体及其ADA的真实量可以通过数学方法确定(参见下面的实施例)。

因此，在高度优选的实施方式中，根据本发明的方法包括在步骤d中进行检测之前用一种或多种已知量的相关治疗性单克隆抗体对样品或反应液加标的附加步骤，从而提供了一种测定样品中相关治疗性单克隆抗体存在的测量有效性的方法，并进一步提供了测定样品中针对相关治疗性单克隆抗体的一种或多种不同抗体(ADA)的存在和量的方法。

作为本发明的另一个高度优选的方面，可以在根据本发明的第一种测定中测定样品中相关治疗性单克隆抗体的量，然后在已知加标量的相关治疗性单克隆抗体存在下重复测定(可以简单地将加标物添加到检测液中，然后可以通过分光光度法再次测定反应)。如果在加标后获得的结果反映了通过加标添加的量，则证实不存在抗药物抗体(ADA)。但是，如果所得结果低于由通过加标添加的量预期的，则确认存在中和性ADA。更进一步地，然后还可以从已知的添加量(加标量)和相应的观察信号数学地确定相关治疗性单克隆抗体及其ADA的量(参见下面的实施例)。然而，定量测定需要对至少两种不同加标的样品进行测量。

因此，本发明于是涉及用于确定治疗性单克隆抗体的存在和量的方法，和/或用于确定针对治疗性单克隆抗体的抗体的存在和量的方法，和/或用于确定治疗性单克隆抗体的存在和量以及随后确定血液样品中相应的治疗性单克隆抗体-抗体(ADA)的存在和量的方法，该方法包括以下步骤：

c.提供包含第一和第二缀合物的反应液并将样品加入到反应液中，从而形成包含样品(可能包含治疗性单克隆抗体)以及第一和第二缀合物的第一检测液，

d.通过分光光度法测量第一检测液，检测在步骤c中加入样品后(当形成包含治疗性单克隆抗体和第一和第二缀合物的复合物时)检测液的分光光度信号(例如吸光度或发光)变化，和

e.确定第一检测液中治疗性单克隆抗体的表观量，

f.向第一检测液中加入已知量的治疗性单克隆抗体，从而形成第二检测液，其包含：已知量的治疗性单克隆抗体、样品(可能包含治疗性单克隆抗体)、第一和第二缀合物，

g.通过分光光度法测量第二检测液，检测在步骤f中加入已知量的治疗性单克隆抗体后(当形成包含治疗性单克隆抗体和第一和第二缀合物的复合物时)第二检测液的分光光度信号(例如吸光度或发光)变化，和

h.确定第二检测液中治疗性单克隆抗体的表观量，和

i.确定治疗性单克隆抗体、和/或治疗性单克隆抗体的抗体的存在或不存在。

步骤e)和h)中的测定简单地通过参考包含已知量的治疗性单克隆抗体的内标样品进行。

如果第二检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量(例如，减去第一检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量)反映了治疗性单克隆抗体的添加(加标)量，则第一检测液中治疗性单克隆抗体的表观量反映了样品中存在的治疗性单克隆抗体的真实量。

如果第二检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量(例如，减去第一检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量)低于由治疗性单克隆抗体的添加(加标)量预期的，确认存在中和性治疗性单克隆抗体的抗体。治疗性单克隆抗体和相应的中和性治疗性单克隆抗体的抗体(ADA)的真实量可以数学地确定(如以下实施例中所示)，需要对至少两种不同加标的样品进行测量。

如果第二检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量(例如，减去第一检测液中的治疗性单克隆抗体的表观量)高于由治疗性单克隆抗体的添加(加标)量预期的，确认存在非中和性治疗性单克隆抗体的抗体。治疗性单克隆抗体和相应的非中和性治疗性单克隆抗体的抗体(ADA)的真实量可以数学地确定(如以下实施例中所示)。

有趣的是，本发明的测定能够区分“中和”的治疗性单克隆抗体抗体(ADA)和“非中和”的ADA。中和ADA是值得特别关注的，因为这些ADA抑制治疗性单克隆药物的功能(通过抑制靶标和治疗性单克隆抗体之间的结合)。只有样品中存在中和性抗体才会导致信号减弱(浊度测定中复合物形成减少)，而非中和性抗体的存在在某些情况下会导致信号稍微增加(例如在浊度测定中复合物形成增加)。

通常，优选从测定中排除非中和性抗体的影响，从而提供用于确定游离治疗性单克隆抗体的真实量以及中和治疗性单克隆抗体的抗体(ADA)的存在/不存在的快速且可靠的测定。这可以通过在加入样品之前在步骤b)中向反应液中加入治疗性单克隆抗体结合剂来实现。显然，在本发明的这个方面，还必须相应地执行内标参考测量。

如本文使用的术语治疗性单克隆抗体的抗体(ADA)是指多种抗体，其可以衍生自受试者的生物样品并且特异性识别特定的治疗性单克隆抗体。它可以是同一抗体类别或同种型中的多种抗体，例如IgG、IgE、IgA、IgD和IgM。因此，在某些实施方式中，检测或测量的ADA在抗体的特定同种型内，如IgG和/或IgE。通常，生物样品的特异性抗体尚未针对任何特定组分纯化，如生物样品的特异性抗体。本文中ADA量的测量是指确定受试者(例如在样品中，或对应于样品的组织)中针对治疗性单克隆抗体的宿主来源抗体的浓度。

因此，本发明还涉及用于确定一种或多种血液样品中一种或多种不同治疗性单克隆抗体(ADA)的存在和量的方法，该方法包括以下步骤：

c.提供包含第一和第二缀合物的反应液，并将已知量的治疗性单克隆抗体加入到反应液中，并使样品与反应液接触，由此形成包含样品(可能包含治疗性单克隆抗体)、加标量的治疗性单克隆抗体、与第一和第二缀合物的检测液(治疗性单克隆抗体的加标量可以加入到样品或反应液中)，

d.在步骤c后(当形成包含治疗性单克隆抗体以及第一和第二缀合物的复合物时)检测检测液的分光光度信号的变化，和

e.通过将所得结果与内标进行比较，来确定治疗性单克隆抗体的量，

f.通过将所得测量值与从添加的已知量的治疗性单克隆抗体预期的测量值进行比较，来确定治疗性单克隆抗体抗体的存在或不存在。

在反应液中加入样品和加标后信号变化小于预期，表明存在治疗性单克隆抗体。

在优选实施方式中，步骤a-f的至少一次重复用已知量的治疗性单克隆抗体的第二次加标进行，或者作为另一种选择包括提供已知量的治疗性单克隆抗体的第二加标的额外步骤g和h，在步骤d之后将第二加标加入检测液中，随后检测通过加入第二加标提供的信号变化，并确定样品中治疗性单克隆抗体的量。

本发明的另一方面，包含与第一加标中添加的治疗性单克隆抗体不同的治疗性单克隆抗体的第二加标的添加，允许评估第二治疗性单克隆抗体的潜在中和作用。因此，可以告知患者两种不同治疗性单克隆抗体之间的治疗转换是否成功(例如，在患者血液中存在ADA的情况下)。

由于根据本发明的方法可以在不同类型的治疗性单克隆抗体上普遍进行，因此根据本发明的方法非常适合于提供直接适用于临床的通用测定法，用于测量个体患者中处方药物的水平。

因此，在本发明的优选实施方式中，治疗性单克隆抗体是处方药。目前优选的处方药物选自依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)。

然而，在本发明的某些方面，靶向TNF-α的治疗性单克隆抗体不是优选的，并且不包括本发明的某些方面。

在一个实施方式中，本发明是用于确定样品中治疗性单克隆抗体的量和/或用于确定样品中治疗性单克隆抗体-的量的试剂盒，所述试剂盒包括：

a.包含治疗性单克隆抗体的靶标和第一缀合部分的第一缀合物，

b.包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，

c.一种或多种各自包含已知量的治疗性单克隆抗体药物的标准溶液。

根据本发明的用于检测测量的优选装置是能够检测在200μl以下样品检测液中产生或改善的信号的装置。这些装置包括例如，和类似的装置，如根据例如EP2281631的装置和以Atonomics A/S名义的相关申请。

优选地，所述试剂盒包含多于一种治疗性单克隆抗体的标准溶液(加标溶液)，如优选至少两种不同的加标标准溶液，其包含至少两种不同的治疗性单克隆抗体。在优选的实施方式中，所述试剂盒包含至少三种，例如至少四种不同的加标标准溶液，其包含至少三种，例如至少四种不同的治疗性单克隆抗体药物。

在本发明的高度优选的实施方式中，所述试剂盒包含至少一种治疗性单克隆抗体的标准加标溶液。

在优选实施方式中，所述试剂盒还包含治疗性单克隆抗体结合剂，即能够将各个治疗性单克隆抗体结合在一起的配体。优选地，这种另外的配体是多克隆抗体，或针对治疗性单克隆抗体分子中不与治疗性单克隆抗体的靶标结合的区域的抗体。

在测量ADA时，重要的是从非中和性ADA中识别中和性ADA。将患者的无应答者概况与本专利申请中描述的加标回收方法相结合，可以为对特定药物的临床反应不足的患者提出治疗方案。

根据本发明的测定还可以包括测量潜在中和ADA库中的IgG4抗体。检测IgG4抗体对于基于“桥”的ELISA测定一直是挑战，因为IgG4抗体是单价的。

在另一个实施方式中，本发明涉及用治疗性单克隆抗体药物治疗的患者疾病的治疗方法，所述方法包括对源自患者的样品进行根据本发明的方法以确定患者是否需要改变治疗性单克隆抗体药物的剂量方案或替代治疗性单克隆抗体药物或替代性药物治疗。

根据本发明的方法还可以用于鉴定特定治疗性单克隆抗体治疗的初次无应答者或低应答者。例如，这些可能是碰巧对治疗性单克隆抗体具有先天或预先获得的免疫球蛋白反应的患者。

因此，在另一个实施方式中，本发明涉及患者疾病的最佳治疗性单克隆抗体药物治疗的鉴定方法，所述方法包括对源自患者的样品进行根据本发明的方法以确定患者是否需要：改变治疗性单克隆抗体药物的剂量方案、或替代治疗性单克隆抗体药物、或替代性药物治疗。

根据本发明的方法还可以例如用于识别具有二次应答失败的患者。二次应答失败可以是无症状的，即唯一的症状是治疗变得不那么有效甚至无效。在这种情况下，根据本发明的方法的使用可以用于在患者或医疗从业者注意到治疗效果较差之前识别二次应答失败的发展。可以应用更高剂量的治疗以确保实现正确和有效的体内浓度，或者可以选择替代治疗，或其组合。

因此，本发明包括确定患者中缺乏治疗反应是否是由于形成针对治疗性单克隆抗体的患者来源抗体的方法。因此，本发明提供了一种为患有可用治疗性单克隆抗体治疗的疾病的患者选择合适的药物治疗的方法(使用本文所述的方法步骤)。

实施例

测定原理

将TNFα(人)固定在羧化聚苯乙烯颗粒(R1)上。TNF-α抑制剂药物与TNFα包被的颗粒结合并促进颗粒凝集。为了增强颗粒凝集反应(响应于TFα抑制剂药物的存在)，加入多克隆兔抗人IgG Fc(R2)，其与TNF-α抑制剂分子相互作用。

试剂1(反应液)：HEPES pH 7.2 10mmol/L聚乙二醇(PEG)，NaCl，与羧化聚苯乙烯颗粒结合的人TNFα分子，去垢剂和稳定剂。

试剂2：硼酸盐缓冲液4.6mmol/L。多克隆兔抗人IgG Fc，聚乙二醇(PEG)，NaCl，去垢剂和稳定剂。

实施例1.治疗性单克隆抗体测定

实施例1的目的是研究是否可以在单独的测定(Enbrel阵列和Humira阵列)中使用使相同亲和配体(TNFα)附着于颗粒的开发的测定原理(在颗粒增强的免疫比浊测量的实施方式中)测量不同的TNFα药物(Enbrel和Humira)。

样品

将依那西普加标入人血浆中，该血浆不含任何种类的药物或抗药物抗体，并使用颗粒增强免疫比浊法测量。数据如表2所示。

将阿达木单抗(Humira)加标入人血浆中，其不含任何种类的药物或抗药物抗体，并使用颗粒增强免疫比浊法测量。数据如表2所示。

测定原理

测定

将含有TNF-α抑制剂的样品加入到含有试剂1的反应液中。将试剂2加入到反应中，测量570nm处吸光度的变化。

表2

使用颗粒增强免疫比浊法测量阿达木单抗和依那西普。

如表2中所见，两种TNFα抑制性抗炎药物中的每一种在免疫比浊测定装置中在不同浓度下产生不同的信号，这很可能是由于对固定在聚苯乙烯颗粒上的TNFα分子的亲和力不同。

阿达木单抗吸光度的数据显示y＝0.0202x+0.0011(R²＝0.9976)的线性响应。依那西普吸光度的数据显示y＝0.0378x+0.0029(R²＝0.9989)的线性响应。

该实施例表明，通过使用所述方法，可以精确测量人样品(不含抗药物抗体)中不同TNF-α抑制剂的浓度。

表2的数据可被视为阿达木单抗和依那西普的内标。

在样品中不存在ADA的情况下，对具有未知浓度的阿达木单抗/依那西普的样品的初始测通过参考表2的标准定应该容易地给出与样品中的真实浓度相关的分光光度读数。

然而，检测样品中中和ADA的存在/不存在(从而确认/不确认初始测量的可靠性)，用已知量的阿达木单抗/依那西普加标样品，并对加标样品进行测量是必要的。在存在中和ADA的情况下，对含有加标量的阿达木单抗/依那西普的样品进行测定，应通过参考表2的标准(曲线的下斜率)，给出比样品中真实浓度所预期的低的测量读数。

阿达木单抗/依那西普和中和ADA的量可以如下所示以数学方式确定，然而，需要对不同的加标样品进行至少两次测量。

实施例2.测量抗药物抗体(ADA)的存在

实施例2的目的是研究该方法是否可用于检测ADA的存在。

加标和回收可用于验证免疫测定的分析有效性。如果没有其他种类的结合剂来竞争分析物，并且将已知量的分析物添加到人血液、血清或血浆样品中，则随后对加标样品的分析应该在测定的误差范围内产生100％的加标量的分析物，误差范围通常为+/-5％。

例如，如果将2μg/mL药物加入正常人体样品中，则可以预期在随后的分析中将发现1.90μg/mL至2.10μg/mL之间的药物。

然而，将已知量的药物加入已经皮下注射该药物几个月的患者(或其中的样品)中可能会由于存在ADA而得到相当少的回收。

两个以上加标和回收点可以定量测定ADA的浓度及其平均亲和常数。

诸如抗体等结合蛋白与其靶分析物之间的相互作用受质量作用定律(Eq 1)控制

1. K＝C/(Ag)(Ab)

其中C是抗体-分析物复合物的摩尔浓度，Ag是游离或未结合分析物的浓度，Ab是未与分析物结合在复合物中的抗体浓度。

该等式可以用x改写，x是复合物中结合的总分析物(Ag0)的分数

2. C＝x Ago其中

3. Ag＝(1-x)Ago

4. Ab＝Abo-xAgo

代入产生等式5

5. K＝xAgo/((1-x)Ago*(Abo-xAgo))

其简化为等式6

6. K＝x/(1-x)(Abo-xAgo)

乘以并转置得到等式7

7.(1-x)*(Abo-xAgo)＝x/K其可以进一步简化为等式8

8.Abo-x(Ago+Abo)+x^²Ago＝x/K然后产生等式9

9. X^²Ago-x(Ago+Abo+1/K)+Abo＝0

在检验时，等式9采用二次方程的形式，并且具有等式10中给出的解

10. X＝((b^2-4ac)^1/2)/@＝2a

其中a＝Ago，b＝Ago+Abo+1/K并且c＝Abo

表3

对于K和Abo的假定值，该表显示了对于不同水平总药物(Ago)的结合药物和游离药物的量

在存在抗药物抗体的情况下，在测定中仅能够测量游离药物。由于空间位阻，结合在抗药物抗体复合物中的药物不能参与另一种结合相互作用。

在药物总量为8μg/mL的情况下，游离药物的表观量将测量为1.18μg/mL。

如果我们加标额外的4μg/mL药物，总药物浓度现在为12μg/mL。但只能看到游离药物水平的观察者只能检测到1.90μg/mL而不是1.18μg/mL加上4μg/mL加标或5.18μg/mL。只能看到预期药物水平的36.6％，因为绝大多数内源性药物和加标药物都与抗药物复合物结合。

因此，该方法可用于估计样品中ADA的真实水平。

实施例3药物测定程序(IL17A)

实施例3的目的是研究是否可以使用(在颗粒增强免疫比浊测量的实施方式中)所开发的测定原理测量不同的治疗性单克隆抗体(IL17A靶向药物)。

测定原理

IL17A(人)固定在羧化聚苯乙烯颗粒(R1)上。

IL17A抑制剂药物与IL17a包被的颗粒结合并促进颗粒凝集。为了增强颗粒凝集反应(响应于IL17A抑制剂药物的存在)，加入多克隆兔抗人IgG Fc(R2)，其与IL17A抑制剂分子相互作用。

试剂1：HEPES pH 7.2 10mmol/L聚乙二醇(PEG)，NaCl，与羧化聚苯乙烯颗粒结合的人IL17A分子，去垢剂和稳定剂。

试剂2：硼酸盐缓冲液4.6mmol/L.多克隆兔抗人IgG Fc，聚乙二醇(PEG)，NaCl，去垢剂和稳定剂。

IL17A药物测定程序

实施例3的目的是研究是否可以使用在单独的测定(如溴达拉单抗、塞库单抗或伊克珠单抗)中使用使相同亲和配体(IL17A)附着于颗粒的开发的测定原理(在颗粒增强的免疫比浊测量的实施方式中)测量IL17A药物(如溴达拉单抗或塞库单抗)。

样品

将抗IL17A(IL17A-Ab1)的抗体加标入人血浆中，该血浆不含任何种类的IL17A抗体或抗药物抗体，并使用颗粒增强免疫比浊法测量。数据如表2所示。

将抗IL17A(IL17A-Ab2)的抗体加标入人血浆中，其不含任何种类的Il17A抗体或抗药物抗体，并使用颗粒增强免疫比浊法测量。数据如表2所示。

测定原理

测定

将含有IL17A抑制剂抗体IL17A-Ab1或IL17A-Ab2的血浆样品加入到含有试剂1的反应液中。将试剂2加入到反应中，测量570nm处吸光度的变化。

表4

使用颗粒增强的免疫比浊法测量IL17A-Ab1和IL17A-Ab2。

IL17A-Ab1吸光度的数据显示y＝0.039x+0.0036(R²＝0.9994)的线性响应。IL17A-Ab2吸光度的数据显示y＝0.0205x+0.0009(R²＝0.9978)的线性响应。

Claims

1.一种用于确定生物样品中治疗性单克隆抗体的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：

b.提供包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，其中，第一和第二部分均为固体颗粒，或者其中第一部分是酶并且第二部分是第一部分的底物，或者其中第一部分是荧光团并且第二部分是由第一部分提供的荧光的调节剂，

c.提供包含第一缀合物和第二缀合物的反应液并使所述样品与所述反应液接触，由此形成检测液，所述检测液包含：可能包含治疗性单克隆抗体的样品、以及第一缀合物和第二缀合物，

d.在步骤c中使样品与反应液接触后，检测所述检测液的分光光度信号的变化，和

e.确定治疗性单克隆抗体的量。

2.如权利要求1所述的方法，其中，治疗性单克隆抗体的靶标不能是TNF-α。

3.如权利要求2所述的方法，其中，向所述反应液中加入能够将一种治疗性单克隆抗体与另一种治疗性单克隆抗体连接的试剂。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，第一和第二部分是具有相同形状和大小的固体颗粒。

5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，第一部分是辣根过氧化物酶(HRP)，并且第二部分是HRP的底物。

6.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，第一部分是荧光团，并且第二部分是猝灭剂，如SPARCL系统。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，所述方法包括：在步骤d中进行检测之前，用一种或多种已知量的治疗性单克隆抗体加标所述样品或所述反应液的附加步骤。

8.一种用于确定生物样品中的治疗性单克隆抗体和/或针对治疗性单克隆抗体的抗体和/或针对治疗性单克隆抗体的中和性抗体的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：

b.提供包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，其中，第一和第二部分是固体颗粒，或者其中第一部分是酶并且第二部分是第一部分的底物，或者其中第一部分是荧光团并且第二部分是由第一部分提供的荧光的调节剂，

c.提供包含第一缀合物和第二缀合物的反应液，并将已知的加标量的治疗性单克隆抗体加入到所述反应液中，并使所述样品与所述反应液接触，从而形成检测液，所述检测液包含：样品、加标量的治疗性单克隆抗体、以及第一缀合物和第二缀合物，

e.通过将所得结果与内标进行比较来确定治疗性单克隆抗体的量，

f.通过将所得测量结果与根据添加的已知量的治疗性单克隆抗体预期的测量结果进行比较，确定是否存在针对治疗性单克隆抗体的抗体和/或针对治疗性单克隆抗体的中和性抗体。

9.如权利要求8所述的方法，所述方法包括用已知量的治疗性单克隆抗体的第二加标进行步骤d-f的至少一次重复，或者作为另一种选择，包括在步骤d后的附加步骤g和h：提供已知量的治疗性单克隆抗体的第二加标，或者向所述检测液中加入第二加标，随后检测通过加入第二加标提供的分光光度信号的变化，并确定所述样品中治疗性单克隆抗体的量。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，治疗性单克隆抗体是处方药。

11.用于确定样品中治疗性单克隆抗体和/或针对治疗性单克隆抗体的抗体的量的试剂盒，所述试剂盒包括：

a.上述权利要求1～6中所定义的包含治疗性单克隆抗体的靶标和第一缀合部分的第一缀合物，

b.上述权利要求1～6中所定义的包含治疗性单克隆抗体的靶标和第二缀合部分的第二缀合物，

c.一种或多种加标标准溶液，每种溶液含有已知量的治疗性单克隆抗体。

12.如权利要求11所述的试剂盒，所述试剂盒还包含治疗性单克隆抗体结合剂。

13.如权利要求11或12所述的试剂盒，所述试剂盒包含至少两种不同的加标标准溶液，所述加标标准溶液包含不同的治疗性单克隆抗体。