KR101761541B1 - 항-ｔｎｆ 약물 및 자가항체의 검출을 위한 검정법 - Google Patents

항-ｔｎｆ 약물 및 자가항체의 검출을 위한 검정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물 치료제 및 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하고 측정하기 위한 검정법을 제공한다. 본 발명은 치료를 최적화하고 약물에 대한 자가항체 (예를 들면, HACA 및/또는 HAHA)의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 항-TNFα 약물 치료를 받고 있는 환자를 관찰하기에 유용하다.

Description

항-ＴＮＦ 약물 및 자가항체의 검출을 위한 검정법{ASSAYS FOR THE DETECTION OF ANTI-TNF DRUGS AND AUTOANTIBODIES}
관련 기술의 상호-참조
본 출원은 2009년 10월 26일 출원된 미국 가특허출원 제61/255,048호, 2009년 11월 19일 출원된 미국 가특허출원 제61/262,877호, 2010년 4월 15일 출원된 미국 가특허출원 제61/324,635호, 2010년 5월 17일 출원된 미국 가특허출원 제61/345,567호, 2010년 6월 3일에 출원된 미국 가특허출원 제61/351 ,269호, 2010년 10월 4일 출원된 가특허출원 제61/389,672호, 및 2010년 10월 15일에 출원된 미국 가특허출원 제61/393,581호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합된다.
자가면역 장애는 중요하고 광범위하게 퍼진 의료 문제이다. 예를 들면, 류마티스 관절염 (RA)은 약 2백만 이상의 미국인에게 영향을 미치고 있는 자가면역 질환이다. RA는 골절의 만성 염증을 야기하고 전형적으로 골절 파괴 및 기능적 불능을 야기할 수 있는 잠재력을 가지는 진행성 질병이다. 비록 유전적 소인, 감염 인자 및 환경적 인자가 모두 상기 질병의 병인에 관여하고 있지만, 류마티스 관절염의 원인은 알려져 있지 않다. 활성 RA에서, 증상은 피로, 식욕 부진, 미열, 근육 및 골절의 통증 및 강성을 포함할 수 있다. 질병이 발병되는 동안, 관절은 활막(synovium)의 염증으로 인해, 종종 붉게 부풀어오르고, 통증을 느끼며 약해진다. 또한, RA는 전신적인 질병이기 때문에, 눈과 입의 선, 폐 라이닝(lining), 심낭막 및 혈관을 포함하는, 관절 이외의 다른 신체의 기관 및 영역이 감염될 수 있다.
RA 및 다른 자가면역 장애를 관리하기 위한 통상적인 치료방법은 "1차 약물"로 빠른 조치를 취하고 "2차 약물"로 느린 조치를 취하는 것이다. 1차 약물은 통증 및 염증을 경감시킨다. 그러한 1차 약물의 예는 아스피린, 아프록센, 이부프로펜, 에토도락 및 다른 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID) 뿐만 아니라 코르티코스테로이드를 포함하고, 상기 약물은 경구적으로 또는 조직 및 관절로 직접 주입된다. 2차 약물은 질병을 완화시키고 진행성 관절 파괴를 막는 것으로 질병-변형 항-류마티그 약물 또는 DMARD에 관한 것이다. 상기 2차 약물은 하이드로 클로로퀴닌, 아주르피딘 및 면역억제제, 예를 들면 메토트렉세이트, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 클로라부실 및 시클로스포린을 포함한다. 그러나, 상기 약물의 대부분은 치명적인 부작용을 가질 수 있다. 따라서, 류마티스 관절염 및 다른 자가면역 장애와 관련된 추가적인 치료가 모색되고 있다.
종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)는 단핵구 및 대식세포를 포함하는, 많은 세포들로부터 생성된 사이토카인으로, 특정 마우스 종양의 괴사를 유도하는 능력을 기초로 확인된다. 그 다음 카켁시아(cachexia)와 관련된 카체틴으로 불리는 인자들이 TNF-α와 동일한 것으로 나타났다. TNF-α는 쇼크, 패혈증, 감염, 자가면역 질환, RA, 크론병, 이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질병을 포함하는, 다양한 인간 질병 및 장애의 병리생리학에 관여한다.
다양한 인간 장애에서의 인간 TNF-α (hTNF-α)의 해로운 역할로 인해, hTNF-α 활성을 억제하거나 중화시키기 위한 치료적 전략이 설계되어 왔다. 특히, hTNF-α에 결합할 수 있고, 이를 중성화시킬 수 있는 항체들이 hTNF-α 활성을 억제하기 위한 수단으로서 모색되어 왔다. 가장 최초의, 그러한 항체로서 마우스의 림프구로부터 제조된 하이브리도마에 의해 분비되는, 마우스 치료 항체 (mAbs)가 있다 (예를 들면, 미국 특허 제5,231,024 Moeller et al 참고) 이러한 마우스 항-hTNF-α 항체는 hTNF-α에 대한 높은 친화성을 나타내고 hTNF-α 활성을 중화시킬 수 있으나, 인 비보에서의 그들의 사용은 짧은 혈청 반감기, 특정 인간 영향인자 가능의 유발 불능, 및 인간 내의 마우스 항체에 대한 원치않는 면역 반응 ("인간 항-마우스 항체" (HAMA) 반응)과 같은 인간에서의 마우스 항체의 투여와 관련된 문제들로 인해 제한적이었다.
가장 최근, 생물학적 치료가 류마티스 관절염과 같은 자가면역 장애의 치료에 적용되어 왔다. 예를 들면, 4개의 TNFα 억제인자, REMICADE™ (인플릭시마브), 키메라 항-TNFα mAb, ENBREL™ (아타너셉트), TNFR-Ig Fc 융합 단백질, HUMIRA™ (아달리무마브), 인간 항-TNFα mAb, 및 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 페길화된 Fab 단편이 류마티스 관절염의 치료를 위해 FDA의 승인을 받았다. CIMZIA®는 심각한 크론병 (CD)을 경감시키기 위한 치료제로 사용된다. 그러한 생물학적 치료제가 류마티스 관절염 및 CD와 같은 다른 자가면역 장애의 치료에 성공적임이 입증되었지만, 모든 치료받은 환자들이 그러한 치료에 반응을 하거나 잘 반응하는 것은 아니다. 게다가, TNFα 억제인자의 투여는 약물에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)와 같은 자가항체의 생산을 야기할 수 있다. 그러한 HACA, HAHA, 또는 HAMA 면역 반응은 약물로 추가적인 치료를 방해하는 면역치료학적 TNFα 억제인자의 초민감도 반응 및 약제동력학 및 생체분배에서의 급격한 변화와 관련될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에서는 TNFα 억제인자 치료을 관찰하고 치료 결정을 안내하기 위하여, 환자 샘플 내의 항-TNFα 생물학적 제제 및 그들의 자가항체의 존재를 검출하기 위한 검정법의 필요성이 요구되고 있다.
발명의 간단한 설명
TNFα는 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 악성종양, 및/또는 신경퇴행성 질환에 관여하고 있는 것으로, 류마티스 관절염 및 크론병과 같은 질병의 특정 생물학적 치료요법에서 유용한 표적이다. 항-TNFα 항체와 같은 TNFα 억제인자는 치료제의 중요한 클래스이다.
이와 같이, 일 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 TNFα를 항-TNFα 약물을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 항-TNFα 약물을 갖는 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 컨쥬게이트)를 형성하는 단계 (즉, 여기서 상기 표지된 TNFα 및 항-TNFα 약물은 서로 공유결합되지 않는다);
(b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 (예를 들면, 표지된 유리 TNFα로부터) 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 검출한다.
특정 예에서, 상기 방법은 샘플, 예를 들면 상기 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 샘플 내의 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), 및 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)의 수준을 측정하기에 유용하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물을 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 자가항체를 갖는 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 컨쥬게이트)를 형성하는 단계 (즉, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 자가항체는 서로 공유결합되지 않는다);
(b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 (예를 들면, 표지된 유리 항-TNFα 약물로부터) 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 자가항체의 존재 또는 수준을 검출한다.
특정 예에서, 상기 방법은 샘플, 예를 들면 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 샘플 내의 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함하는 자가항체를 측정하기에 유용하지만, 상기에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα을 항-TNFα 약물에 대한 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물, 표지된 TNFα, 및 자가항체의 제1 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 컨쥬게이트) (즉, 여기서 상기 제1 표지된 복합체의 구성성분들은 서로 공유결합되지 않는다)와 표지된 항-TNFα 약물 및 자가항체의 제2 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 컨쥬게이트) (즉, 여기서 상기 제2 표지된 복합체의 구성성분들은 서로 공유결합되지 않는다)를 형성하는 단계, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 상기 표지된 TNFα는 다른 표지물질을 포함하고;
(b) 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 (예를 들면, 서로로부터 및 표지된 유리 TNFα 및 표지된 유리 항-TNFα 약물로부터) 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체가 존재할 때 자가항체의 비-중성화 형태 (즉, 여기서 상기 자가항체는 항-TNFα 약물과 TNFα 사이의 결합을 방해하지 않는다)의 존재 또는 수준을 검출하고, 그리고 오직 제2 표지된 복합체만 존재할 때 자가항체의 중성화 형태 (즉, 여기서 자가항체는 항-TNFα 약물과 TNFα 사이의 결합을 방해한다)의 존재 또는 수준을 검출한다.
특정 예에서, 상기 방법은 샘플, 예를 들면, 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 샘플 내의 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함하는 자가항체를 측정하기에 유용하지만, 상기에 제한되는 것은 아니다.
관련 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물을 항-TNFα 약물에 대한 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물 및 자가항체의 제1 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 콘쥬게이트)를 형성하는 단계 (즉, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 자가항체는 서로 공유결합되지 않는다);
(b) 상기 제1 표지된 복합체를 제1 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 (예를 들면, 표지된 유리 항-TNFα 약물로부터) 제1 표지된 복합체를 분리하는 단계;
(c) 상기 제1 표지된 복합체를 검출하는 것에 의해, 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계;
(d) 표지된 TNFα을 제1 표지된 복합체와 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα의 제2 표지된 복합체 (즉, 면역-복합체 또는 컨쥬게이트)를 형성하는 단계 (즉, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα는 서로 공듀결합되지 않는다), 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα는 다른 표지물질을 포함한다;
(e) 상기 제2 표지된 복합체를 제2 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 (예를 들면, 표지된 유리 TNFα로부터) 제2 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(f) 상기 제2 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 자가항체의 중성화 형태의 존재 또는 수준을 검출 (즉, 여기서 상기 자가항체는 항-TNFα 약물과 TNFα 사이의 결합을 방해한다)한다.
특정 예에서, 상기 방법은 샘플, 예를 들면 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 환자로부터 샘플 내의 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함하는 자가항체를 측정하기에 유용하지만, 상기에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체에서 항-TNFα 약물의 유효량을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기의 단계를 포함하는 방법으로, 피검체로부터 제1 샘플 내의 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계:
(i) 상기 제1 샘플을 소정의 표지된 TNFα와 접촉시킴으로써 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα를 포함하는 제1 복합체를 형성하는 단계;
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 상기 제1 복합체를 검출하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 측정하는 단계;
(b) 하기의 단계를 포함하는 방법으로, 피검체로부터 제2 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계:
(i) 상기 제2 샘플을 소정의 표지된 항-TNFα 약물과 접촉시킴으로써 자가항체와 표지된 항-TNFα 약물을 포함하는 제2 복합체를 형성하는 단계;
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 상기 제2 복합체를 검출하는 것에 의해, 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 단계 (a)에서 측정된 항-TNFα 약물의 수준으로부터 단계 (b)에서 측정된 자가항체의 수준을 뺄셈하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 유효량을 측정한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 본 발명의 방법에 따라 항-TNFα 약물의 유효량을 측정하는 단계;
(b) 상기 항-TNFα 약물의 유효량을 항-TNFα 약물의 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 비교를 바탕으로 피검체를 위한 항-TNFα 약물의 후속 용량을 결정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 치료요법을 최적화하고 및/또는 항-TNFα 약물의 독성을 경감시키기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 피검체로부터 제1 샘플 내의 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 피검체로부터 제2 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 항-TNFα 약물 및 자가항체의 수준을 바탕으로 피검체를 위한 후속의 치료요법 과정을 결정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 치료요법을 최적화하고 및/또는 항-TNFα 약물에 대한 독성을 경감시킨다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플 내의 내부 컨트롤과 관련된 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 소정의 표지된 TNFα 및 소정의 표지된 내부 컨트롤을 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 TNFα과 항-TNFα 약물의 복합체를 형성하는 단계;
(b) 크기 배제 크로마토그래피로 상기 표지된 TNFα 및 표지된 내부 컨트롤을 검출하는 단계;
(c) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 TNFα의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(d) 크기 배지 크로마토그래피로부터 용출 시간에 대한 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 내부 컨트롤의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(e) 표지된 TNFα의 양을 표지된 내부 컨트롤의 양으로 나눔으로써 제1 비율을 측정하는 단계;
(f) 단계 (c)로부터의 적분 결과를 단계 (d)로부터의 적분 결과로 나눔으로써 제2 비율을 측정하는 단계; 및
(g) 단계 (e)에서 측정된 제1 비율을 단계 (f)에서 측정된 제2 비율과 비교하는 단계를 포함하는 것에 의해, 내부 콘트롤과 관련된 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 측정한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은: 상기 단락의 단계 (e)에서의 표지된 내부 컨트롤에 대한 표지된 TNFα의 비율과 상기 단락의 단계 (f)에서의 표지된 내부 컨트롤에 대한 표지된 TNFα의 비율의 비교를 바탕으로 피검체를 위한 항-TNFα 약물의 후속 용량을 결정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심 되는 샘플 내의 내부 컨트롤과 관련된 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 소정의 표지된 항-TNFα 약물과 소정의 표지된 내부 컨트롤을 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 복합체를 형성하는 단계;
(b) 크기 배제 크로마토그래피로 상기 표지된 항-TNFα 및 표지된 내부 컨트롤을 검출하는 단계;
(c) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 항-TNFα 약물의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(d) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 내부 컨트롤의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(e) 표지된 항-TNFα 약물의 양을 표지된 내부 컨트롤의 양으로 나눔으로써 제1 비율을 측정하는 단계; 및
(f) 단계 (c)와 (d)의 적분 결과를 나눔으로써 제2 비율을 측정하는 단계; 및
(g) 단계 (e)에서 측정된 제1 비율과 단계 (f)에서 측정된 제2 비율을 비교하는 단계를 포함하는 것에 의해, 내부 컨트롤과 관련된 자가항체의 존재 또는 수준을 측정한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준 및 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는:
(a) 소정의 표지된 TNFα를 포함하는 제1 측정 기질;
(b) 소정의 항-TNFα를 포함하는 제2 측정 기질;
(c) 임의적으로 소정의 표지된 TNFα와 소정의 표지된 내부 컨트롤을 포함하는 제3 측정 기질;
(d) 임의적으로 소저의 표지된 항-TNFα 약물과 소정의 표지된 내부 컨트롤을 포함하는 제4 측정 기질;
(e) 임의적으로 피검체로부터 샘플을 추출하기 위한 수단; 및
(f) 임의적으로 키트의 사용을 위한 사용지시 팜플렛을 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점들은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 검정법에 대한 예시적인 구현예를 나타내는 것으로, 여기서 크기 배제 HPLC가 TNFα-Alexa647과 HUMIRA™의 결합을 검출하기 위하여 사용된다.
도 2는 TNFα-Alexa647에 결합하는 HUMIRA™의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 3은 가교 검정법으로 알려진, HACA 수준을 측정하기 위한 현재의 ELISA-기반 방법을 나타낸다.
도 4는 REMICADE™에 의해 발생되는 HACA/HAHA의 농도를 측정하기 위한 본 발명의 자가항체 검출 검정법의 예시적인 개요를 나타낸다.
도 5는 REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-인간 IgG 항체의 용량 반응 분석을 나타낸다.
도 6은 REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-인간 IgG 항체의 제2 용량 반응 분석을 나타낸다.
도 7은 REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-인간 IgG 항체의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 8은 보통의 인간 혈청 및 HACA 양성 혈청 내의 REMICADE™-Alexa647 면역복합체 형성을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 가교 검정법 또는 이동성 검정법을 사용하여 수행된 20명의 환자 혈청 샘플로부터 HACA 측정의 요약을 제공한다.
도 10은 HACA의 혈청 농도를 측정하기 위한 현재의 방법과 본 발명의 신규한 HACA 검정법의 요약 및 비교를 제공한다.
도 11은 보통의 (NHS) 또는 HACA-양성(HPS) 혈청으로 인큐베이션된 형광물질 (Fl)-표지된 IFX의 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다. 인큐베이션 혼합물에 HACA-양성 혈청의 양을 증가시키면, IFX-Fl 피크가 더 높은 분자량 용출 위치, C1 및 C2로 용량-의존적으로 이동된다.
도 12는 이동성 검정법에 의해 측정된 HACA-양성 혈청의 희석량을 증가시키면서 생성되는 결합 및 유리 IFX-F1의 용량-반응 곡선을 나타낸다. (A) HACA-양성 혈청의 희석을 증가시키면서 37.5 ng의 IFX-F1과 인큐베이션하였다. 희석이 증가할수록 (HACA 미만), 더 많은 유리 IFX-F1가 SE-HPLC 분석에서 발견되었다. (B) HACA-양성 혈청의 희석을 증가시키면서 37.5 ng의 IFX-F1와 인큐베이션하였다. 희석이 증가할수록 (HACA 미만) 더 적은 HACA 결합 IFX-F1이 SE-HPLC 분석에서 발견되었다.
도 13은 보통의 (NHS) 또는 IFX-스파이크된 혈청과 인큐베이션된 TNFα-Fl의 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다. 인큐베이션 혼합물에 첨가된 IFX-스파이크된 혈청의 양이 증가할수록, 형광 TNFα 피크는 더 높은 분자량 용출 위치로 용량-의존적으로 이동한다.
도 14는 이동성 검정법에 의해 측정된 IFX-스파이크된 혈청의 희석을 증가시키는 것에 의해 발생된 결합 및 유리 TNFα의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 인큐베이션에 첨가된 IFX의 농도가 증가하면, 결합 TNFα의 백분율을 증가하는 반면, 유리 TNFα의 백분율을 감소한다 .
도 15는 이동성 검정법에 의해 다른 시점에서 IFX로 치료받은 IBD 환자 내의 상대적인 HACA 수준 및 IFX 농도의 측정을 나타낸다.
도 16은 다른 시점에서 IFX로 치료받은 IBD 환자 혈청 내의 HACA 수준 및 IFX 농도의 환자 조절-측정을 나타낸다.
도 17은 HACA와 같은 (A) 비-중성화 또는 (B) 중성화 자가항체의 존재를 검출하기 위한 본 발명의 검정법의 예시적인 구현예를 나타낸다.
도 18은 HACA와 같은 중성화 자가항체의 존재를 검출하기 위한 본 발명의 검정법의 대체적인 구현예를 나타낸다.
도 19는 항-인간 IgG의 다른 양이 존재시 보통의 인간 혈청 (NHS)과 인큐베이션된 Fl-표지된 ADL의 이동성 프로파일을 나타낸다. 인큐베이션 혼합물에 항-인간의 첨가량을 증가시키면, 유리 Fl-ADL 피크 (FA)는 더 높은 분자량 위치, C1 및C2로 용량-의존적으로 이동하는 반면, 내부 컨트롤(IC) 피크는 변화하지 않는다.
도 20은 유리 Fl-ADL의 이동시 항-인간 IgG의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 항-인간 IgG의 양을 증가시키면서, 37.5 ng의 Fl-ADL 및 내부 컨트롤과 인큐베이션하였다. 더 많은 항체를 반응 혼합물에 첨가할수록 내부 컨트롤에 대한 유리 Fl-ADL 비율을 낮아진다.
도 21은 다른 양의 ADL의 존재시 보통의 인간 혈청 (NHS)과 인큐베이션된 Fl-표지된 TNF-α의 이동성 프로파일을 나타낸다. Ex = 494 nm; Em = 519 nm. 인큐베이션 혼합물에 ADL의 첨가량을 증가시키면, 유리 TNF-F1 피크 (FT)는 더 높은 분자량 용출 위치로 용량-의존적으로 이동하는 반면, 내부 컨트롤(IC) 피크는 변화하지 않는다.
도 22는 유리 TNF-α-Fl의 이동 상의 ADL의 용량-반응 곡선을 나타낸다. ADL의 양을 증가시키면서 100 ng의 TNF-α-Fl 및 내부 컨트롤과 인큐베이션하였다. 항체 ADL이 반응 혼합물에 많이 첨가될수록, 내부 컨트롤에 대한 유리 TNF-α-Fl의 비율을 낮아진다.
도 23은 보통의 (NHS) 또는 풀링된 HACA 양성 환자 혈청과 인큐베이션된 Fl-표지된 Remicade (IFX)의 이동성 프로파일을 나타낸다.
도 24는 보통의 (NHS) 또는 마우스 항-인간 IgG l 항체와 인큐베이션된 Fl -표지된 HUMIRA (ADL)의 이동성 프로파일을 나타낸다.
도 25는 보통의 (NHS) 또는 풀링된 HAHA 양성 환자 혈청과 인큐베이션된 Fl -표지된 HUMIRA (ADL)의 이동성 프로파일을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하는 동종 이동성 검정법이 특히 TNFα 억제인자뿐만 아니라 그들에 의해 생성되는 자가항체 (예를 들면, HACA, HAHA, 등)의 존재 또는 수준을 측정함에 있어서 유리하다는 발견을 바탕으로 한다. 특히, 본 발명은 임의의 세척 단계를 요구하지 않는 "혼합 및 판독" 검정법을 제공한다. 그 결과, 복합체 및 비복합체 단백질 치료제가 서로 용이하게 분리된다. 게다가, 유리 약물을 방해할 임의의 가능성이 본 발명의 검정법을 사용하여 최소화된다. 반면, HACA 또는 HAHA 수준을 측정하기 위한 통상의 ELISA 는 TNFα 억제인자가 체내로부터 제거될 때까지 수행될 수 없는 것으로, 이는 약 3개월이 소요될 수 있다. 게다가, 본 발명은 일반적으로 항-TNFα 항체 이외에 다양한 단백질 치료제에 적용가능하다. 본 발명의 검정법은 또한 고체 표면에 항원을 부착하지 않고, 무관한 IgG의 비-특이적 결합을 제거하고, 약한 친화도를 갖는 항체를 검출하고, 그리고 효소 면역검정법과 같은 현재 이용가능한 검출 방법 보다 증가된 민감도 및 특이도를 나타내므로 유리하다.
항-TNFα 생물학적 제제 뿐만 아니라 다른 면역체료제의 혈청 농도의 측정의 중요성은 FDA가 약물동력학 및 순응성 (예를 들면, 면역 반응) 연구를 임상 시도 동안 수행될 것을 요구한다는 사실에 의해 입증된다. 본 발명은 또한 그들이 정확한 용량을 받고 있는지, 약물이 체내로부터 너무 빨리 제거되지는 않는지, 그들이 약물에 대한 면역반응을 일으키지 않는지 여부를 확인하기 위하여, 이러한 약물을 받고 있는 환자를 관찰함에 있어서 유용성을 발견하였다. 또한, 본 발명은 초기 약물로 실패로 인한 다른 약물 사이의 교체를 안내함에 있어서 유용하다 .
II . 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 하기의 용어들은 달리 구체화되어 있지 않는한, 그들 본래의 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항-TNFα 약물(anti-TNFα drug)" 또는 "TNFα 억제인자(TNFα inhibitor)"는 단백질, 항체, 항체 단편, 융합 단백질 (예를 들면, Ig 융합 단백질 또는 Fc 융합 단백질), 다가 결합 단백질 (예를 들면, DVD Ig), 소분자 TNF α 길항체 및 유사한 천연적으로- 또는 비천연적으로-발생된 분자, 및/또는 재조합체 및/또는 그것의 가공된 형태와 같이, 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들면 TNFα와 TNFα에 대한 세포 표면 수용체와의 상호작용을 억제하는 것에 의해, TNFα 단백질 생산을 억제하는 것에 의해, TNFα 유전자 발현을 억제하는 것에 의해, 세포로부터의 TNFα 분비를 억제하는 것에 의해, 피검체 내의 TNFα 활성을 감소시키는 TNFα 수용체 신호전달 또는 다른 임의의 수단을 억제시키는 것에 의해, TNFα 활성을 억제시키는 작용제를 포함한다. 상기 용어 "항-TNFα 약물" 또는 "TNFα 억제인자"는 바람직하게는 TNFα 활성을 방해하는 작용제를 포함한다. TNFα 억제인자의 예는 아타너셉트 (ENBREL™, Amgen), 인플릭시마브 (REMICADE™, Johnson and Johnson), 인간 항-TNF 모노클로날 항체 아달리무마브 (D2E7/HUMIRA™, Abbott Laboratories), 세프톨리주마브 패골 (CIMZIA®, UCB, Inc.), CDP 571 (Celltech), 및 CDP 870 (Celltech), 뿐만 아니라 TNFα 활성이 유해한 장애 (예를 들면, RA)로 고생하고 있거나 고생할 위험이 있는 피검체에 투여될 때, 장애가 치료되도록 하는, TNFα 활성을 억제하는 다른 화합물들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "TNFα 억제인자에 대한 반응성 예측(predicting responsiveness to a TNFα inhibitor"은 TNFα 억제인자를 이용한 피검체의 치료가 피검체 내에서 유효하거나 유효하지 않을 (예를 들면, 피검체에 측정가능한 이점을 제공하는) 가능성을 평가하기 위한 능력을 의미하는 것이다. 특히, 치료가 유효하거나 유효하지 않을 가능성을 평가하기 위한 능력은 치료가 시작된 이후에, 그리고 유효성에 대한 지시인자 (예를 들면, 측정가능한 이점의 지시ㅇ인)가 피검체에서 발견된 이후에 발휘된다. 특히 바람직한 TNFα 억제인자는 예를 들면, 류마티스 관절염, 또는 염증성 장 질환 (IBD)과 같은 TNFα-매개 질병 또는 장애의 치료시 인간에게 사용하기 위하여 FDA로부터 승인을 받은 생물학적 작용제로서, 상기 작용제는 아달리무마브 (HUMIRA™), 인플릭시마브 (REMICADE™) 아타너셉트 (ENBREL™), 및 세프톨리주마브 패골 (CIMZIA®, UCB, Inc.)를 포함한다.
용어 "크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)" (SEC)는 용액 내의 분자들이 그들의 크기 및/또는 유체역학적 부피를 바탕으로 분리되는 크로마토그래피 방법을 포함하는 것이다. 그것은 단백질 및 그들의 컨쥬게이트와 같은 큰 분자 또는 거대분자 복합체에 적용된다. 통상적으로, 수용액이 컬럼을 통한 샘플의 이동에 사용되는 경우, 상기 기술은 겔 여과 크로마토그래피로 알려져 있다.
용어 "복합체(complex)", "면역-복합체(immuno-complex)", "컨쥬게이트(conjugate)", 및 "면역컨쥬게이트(immunoconjugate)"는 항-TNFα 약물에 (예를 들면, 비-공유결합 수단에 의해) 결합된 TNFα, 항-TNFα 약물에 대한 자가항체에 (예를 들면, 비-공유결합 수단에 의해) 결합된 항-TNFα 약물 , 및 TNFα 및 항-TNFα 약물에 대한 자가항체에 (예를 들면, 비-공유결합 수단에 의해) 결합된 항-TNFα 약물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표지된(labeled)"에 의해 변형된 개체는 임의의 개체, 분자, 단백질, 효소, 항체, 항체 단편, 사이토카인, 또는 경험적으로 검출가능한 다른 분자 또는 화학물질과 컨쥬게이트된 관련 종을 포함한다. 표지된-개체의 표지물질로서 적합한 화학 종은 형광 염료, 예를 들면 Alexa Fluor® 647와 같은 Alexa Fluor® 염료, 양자점, 광학 염료, 발광 염료, 및 방사선, 예를 들면 125I 를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "유효량(effective amount)"은 피검체에서 그들의 필요에 따른 치료적 효과를 달성할 수 있는 약물의 용량 뿐만 아니라 구성물질의 생체이용가능한 양을 포함한다. 용어 "생체이용가능(bioavailable)"은 치료적 활성에 이용가능한 약물의 투여된 용량의 단편을 포함한다. 예를 들면, TNF-α가 쇼크, 패혈증, 감염, 자가면역 질환, RA, 크론병, 이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환과 같은 병리생리학에 관여하는 질병 및 장애의 치료에 유용한 약물의 유효량은 일 또는 그 이상의 상기와 관련된 증후를 예방하거나 경감시킬 수 있는 양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
문구 "곡선-하-면적(area-under-the-curve)"은 2차원적 파일롯의 부분에 대한 적분을 기술하기 위해 사용되는 당해 기술분야의 수학적인 용어이다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피로부터의 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서, 상기 파일롯 내의 다양한 피크는 특정 분자의 검출을 나타낸다. 이러한 피크들의 적분은 최소한의 y-축 값, 예를 들면 2차원적 파일롯의 기저에 의해 둘러싸이고, 2차원적 파일롯 자체에 의해 둘러싸이는 영역을 포함한다. 피크의 적분은 또한 계산 공식에 의해 기술되는 바와 같다. 곡선-하-면적
Figure 112017002553715-pct00001
, 상기 식에서 f(x)는 2차원적 파일롯을 설명하는 함수이고, 변수 "a" 및 "b"는 적분되는 피크의 x-축 극한점을 나타낸다.
문구 "형광 표지 검출(fluorescence label detection)"은 형광 표지물질을 검출하기 위한 수단을 포함한다. 검출 수단은 예를 들면, Agilent-1200 HPLC System이 있으나, 이에 제한되지 것은 아닌, 예를 들면, 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피가 있으나, 이에 제한되는 것은 아닌, 크로마토그래피 기구에 공통적으로 통합된, 분광광도계, 형광계, 광도계, 검출기구를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
괄호 "[ ]" 는 괄호 내부의 종들에 대한 그들의 농도를 의미한다.
문구 "치료요법의 최적화(optimize therapy)"는 특정 치료요법의 용량 (예를 들면, 유효량 또는 수준) 및/또는 유형을 최적화하는 것을 포함한다. 예를 들면, 항-TNFα 약물의 용량의 최적화는 피검체에 후속적으로 투여되는 항-TNFα 약물의 양을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 특정 예에서, 항-TNFα 약물의 유형의 최적화는 하나의 약물로부터의 투여된 항-TNFα 약물을 다른 약물 (예를 들면, 다른 항-TNFα 약물)로 교체하는 것을 포함한다. 특정 다른 예에서, 치료요법의 최적화는 면역억제성 약물과 함께, 항-TNFα 약물의 용량을 (예를 들면, 이전의 투여량에 비해 증가되거나, 감소되거나, 또는 동일한 용량으로) 병용-투여하는 것을 포함한다.
용어 "병용-투여(co-administer)"는 하나의 활성 작용제의 생리학적으로 유효한 기간이 제2 활성 작용제의 생리학적으로 유효한 기간과 겹쳐지도록, 하나 이상의 작용제를 투여하는 것을 포함한다.
용어 "피검체(subject)", "환자(patient)", 또는 "개체(individual)"는 통상적으로 인간을 의미하는 것이지만, 다른 동물 예를 들면, 다른 영장류, 설치류, 개과, 고양이과, 말과, 양과, 돼지과 등을 포함한다.
용어 "치료요법 과정(course of therapy)"은 TNFα-매개 질병 또는 장애와 관련된 일 또는 그 이상의 증상을 경감시키거나 예방하기 위해 받고 있는 임의의 치료학적 접근법을 포함한다. 상기 용어는 TNFα-매개 질환 또는 장애를 갖는 개체의 건강을 개선하기에 유용한 임의의 화합물, 약물, 절차, 및/또는 요법을 투여하는 것을 포함하는 것으로, 본 명세서에 기술된 임의의 치료제를 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 기술자들은 치료요법 과정 또는 현재 치료요법 과정의 용량이 항-TNFα 약물 및/또는 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 농도 수준에 따라 바뀔 수 있음 (예를 들면, 증가되거나 감소될 수 있음)을 이해할 것이다.
용어 "면역억제성 약물(immunosuppressive drug)" 또는 "면역억제제(immunosuppressive agent)"는 면역억제성 효과 예를 들면, 방사선 또는 항-대사산물, 항-림프구 혈청 항체 등과 같은 약물의 투여에 의해 면역 반응의 예방 또는 경감을 달성할 수 있는 임의의 성분들을 포함한다. 적합한 면역억제성 약물의 예는 아자티오프린 (AZA)과 같은 티오푸린 약물 및 그것의 대사산물; 메토트렉세이트 (MTX)와 같은 항-대사산물; 시롤리무스 (라파마이신); 템시로리무스; 에베로리무스; 타크로리무스 (FK-506); FK-778; 항-림프구 글로불린 항체, 항-융선 글로불린 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 및 항체-독성 컨쥬게이트; 시클로스포린; 마이코페놀레이트; 미조리빈 모노포스페이트; 스코파론; 갈라티라머 아세테이트; 그것의 대사산물; 그것의 약제학적으로 허용가능한 염; 그것의 유도체; 그것의 전구약물; 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "티오푸린 약물(thiopurine dug)"은 아자티오프린 (AZA), 6-머캅토퓨린 (6-MP), 또는 치료적 효능을 갖는 임의의 대사산물로서 6-티오구아닌 (6-TG), 6-메틸머캅토퓨린 리보사이드, 6-티오인노신 뉴클레오티드 (예를 들면, 6-티오인노신 모노포스페이트, 6-티오인노신 디포스페이트, 6-티오인노신 트리포스페이트), 6-티오구아닌 뉴클레오티드 (예를 들면, 6-티오구아노신 모노포스페이트, 6-티오구아노신 디포스페이트, 6-티오구아노신 트리포스페이트), 6-티오산토신 뉴클레오티드 (예를 들면, 6-티오산토신 모노포스페이트, 6-티오산토신 디포스페이트, 6-티오산토신 트리포스페이트), 그것의 유도체, 그것의 유사체, 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "샘플(sample)"은 개체로부터 수득된 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 대변, 눈물, 임의의 다른 체액, 조직 샘플 (예를 들면, 생검), 및 그것의 세포 추출액 (예를 들면, 적혈구 세포 추출액)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 상기 샘플은 혈청 샘플이다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 혈청 샘플과 같은 샘플은 분석 전에 희석될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 예에서, 용어 "샘플"은 혈액, 신체 조직, 혈액 혈청, 림프액, 림프절 조직, 비장 조직, 골수, 또는 일 또는 그 이상의 이러한 조직으로부터 유래된 면역글로불린 풍부 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 예에서, 용어 "샘플"은 혈액 혈청을 포함하는 것으로, 혈액 혈청 또는 혈액으로부터 유도된 면역글로불린 풍부 단편이다. 특정 예에서, 용어 "샘플"은 체액을 포함한다.
III . 구현예의 설명
본 발명의 방법 내의 단계들은 반드시 그것들이 존재하는 특정 순서에 따라 수행되어야 하는 것은 아니다. 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명의 방법 내의 단계들의 다른 순서들도 본 발명의 범위 내에 포함되어 있음을 이해할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 TNF를 항-TNFα 약물을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 항-TNFα 약물을 갖는 표지된 복합체를 형성하는 단계;
(b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물을 검출한다.
특정 예에서, 상기 방법은 특히 하기의 항-TNFα 항체: REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), 및 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)에 유용하다.
종양 괴사 인자 α (Tumor necrosis factor α, TNFα)는 전신 염증과 관련된 사이토카인으로, 급성기 반응을 자극하는 사이토카인의 군 중 일원이다. TNFα의 주요 역할은 면역 세포를 조절하는 것이다. TNFα는 또한 아포프토틱(apoptotic) 세포 사멸을 유도할 수 있고, 염증을 유도할 수 있고, 그리고 종양생성 및 바이러스 복제를 억제할 수 있다. TNF는 주로 안정한 동형삼량체(homotrimer) 내에 정렬된 212-아미노산-길이 타입 II 막횡단 단백질로서 생산된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "TNF-α"는 비공유결합에 의한 17 kDa 분자들의 삼량체를 구성하는, 17 kDa 분비 형태 및 26 kDa 막 관련 형태, 생물학적 활성 형태로 존재하는 인간 사이토카인을 포함한다. TNF-α의 구조는 예를 들면, 문헌 [Jones, et al. (1989) Nature, 338:225-228]에 상세히 기술되어 있다. 용어 TNF-α는 인간, 재조합 인간 TNF-α (rhTNF-α), 또는 인간 TNFα 단백질과 적어도 약 80% 동일체를 포함한다. 인간 TNFα는 35개의 아미노산 (aa) 세포질 도메인, 21 aa 막횡단 단편, 및 177 aa 세포외 도메인 (ECD)으로 이루어져 있다 (문헌 [Pennica, D. et al. (1984) Nature 312:724l]). ECD 내부에, 인간 TNFα는 레서스(rhesus)와 97% aa 염기서열 동일성을 공유하고, 소과, 개과, 코튼 랫, 말과, 고양이과, 마우스, 돼지과, 및 랫 TNFα와 71% 92% 동일성을 공유한다. TNFα는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상업적으로 구매될 수 있다 (R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, Minn.).
특정 구현예에서, "TNF-α"는 항-TNF-α 분자에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 상기 분자의 부분인, "항원"이다. TNF-α는 일 또는 그 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 특정 예에서, TNF-α는 매우 선택적인 방법으로, 항-TNF-α 항체와 반응할 것이다. 본 발명의 항체, 항-TNFα 항체의 단편 및 영역에 결합하는 바람직한 항원은 SEQ ID NO. 1 중 적어도 5개의 아미노산을 포함한다. 특정 예에서, TNF-α는 항-TNF-α 항체, 그것의 단편 및 영역에 결합시킬 수 있는 충분한 길이의 TNFα의 에피토프로 존재한다.
특정 구현예에서, 항-TNF-α 항체, 그것의 단편 및 영역을 결합시키기에 충분한 길이의 에피토프를 갖는 TNF-α의 길이는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220개의 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, 사용된 TNF-α는 SEQ ID NO 1의 잔기 77-233를 포함한다.
특정 예에서, TNF-α의 가용성 부분 내의 적어도 하나의 아미노산, 즉 SEQ ID NO 1의 잔기 77-233가 표지된다. 특정 예에서, 아민 반응성 형광물질 유도체가 사용된다. 대부분의 예에서, 아민 반응기는 아민과 반응시에 카르복사미드, 술폰아미드 또는 티오우레아를 형성하는 아실화제이다. 사실, 모든 단백질은 리신 잔기를 가지며, 대부분은 N-말단에 유리 아민을 가지므로, 표지 부착 지점으로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 잔기 77이 표지되고, 사용된 TNF-α는 SEQ ID NO 1의 잔기 77-233을 포함한다. 다른 구현예에서, 많은 1차 아민이 표지되고 TNF-α가 다양하게 표지된다.
특정 예에서, TNF-α의 부분, 즉 항체에 의해 인식되는 부분, 및 그것의 단편 및 영역은 표지되지 않는다. 바꾸어 말하면, TNF-α 항원의 특정 부분은 항-TNFα 활성 항체, 그것의 단편, 및 다양한 영역에 의해 인식되고 및/또는 상기와 결합하는 TNF의 지형학적이거나 3차원적인 에피토프를 제공한다. 이러한 부분은 바람직하기는 결합되지 않으므로, 표지되지 않는다. 그들은 SEQ ID NO: l의 136-157 및 164-185를 포함한다.
Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile; 및
Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly.
TNFα 또는 항-TNFα 약물은 다양한 검출가능한 군(들)로 표지될 수 있다. 바람직하기는, TNFα 또는 항-TNFα 약물은 형광물질 또는 형광 염료로 표지된다. 본 발명에서 사용되기에 적합한 예시적인 형광물질은 참조로서 본 명세서에 통합되는, Molecular Probes Catalogue에 나열되어 있는 것들을 포함한다 (문헌 [R. Haugland, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th Edition, Molecular probes, Inc. (2005)] 참고). 그러한 예시적인 형광물질은 Alexa Fluor® 염료 예를 들면 Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, 및/또는 Alexa Fluor® 790 뿐만 아니라, 다른 형광 물질 예를 들면 Dansyl Chloride (DNS-CI), 5-(이오도아세타미다)플루오로세인 (5-IAF), 플루오로세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 6-아크릴로일-2-디메틸아미노아프탈렌 (아크릴로단), 7-니트로벤조-2-옥사-l,3-디아졸-4-일 클로라이드 (NBD-Cl), 에티디엄 브로마이드, 루시퍼 옐로우, 5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, Texas Red™ 술포닐 클로라이드, BODIPY™, 나프탈아민 술폰산 (예를 들면, 1-아닐리노나프탈렌-8-술폰산 (ANS), 6-(p-토루이디닐)나프탈렌-이-2-술폰산 (TNS), 및 등), 안트로일 지방산, DPH, 파리나린산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파디틸에탄올아민, Texas Red-포스파디틸에탄올아민, 피레닐-포파티딜콜린, 플루오레닐-포스포티딜콜린, 메로시아닌 540,1-(3-술포나토프로필)-4-[β-[2[(디-n-부틸아미노)-6 나프틸]비닐]피리디니움 베타인 (나프틸 스티릴), 3,3'디프로필티아디카르보시아닌 (디S-C3-(5)), 4-(p-디펜틸 아미노스티릴)-l-메틸피리디니움 (디-5-ASP), Cy-3 요오드 아세타미드, Cy-5-N-하이드록시숙신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, 로다민 800, IR-125, 티아졸 오렌지, 아주르 B, 나일 블루, Al 프탈로시아닌, 옥사신 1,4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지, 에티디엄 동종이량체, N(에톡시카보닐메틸)-6-움메톡시퀴노리엄 (MQAE), Fura-2, 칼슘 그린, 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린, 피토플루오르즈, 코로넨, 금속-리간드 복합체, IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY676, DY680, DY682, DY780, 및 그것의 혼합물을 포함한다. 추가적으로 적합한 형광물질은 효소-보조인자; 란타니드, 그린 형광 단백질, 옐로우 형광 단백질, 레드 형광 단백질, 또는 그것의 돌연변이체 및 유도체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 특이적 결합쌍의 제2 일원은 거기에 부착되는 검출가능한 기를 가진다.
통상적으로, 형광 군은 폴리메틴, 프탈로시아닌, 시아닌, 산테닌, 플루오렌, 로다민, 쿠마린, 플루오레세인 및 BODIPY™를 포함하는 염의 카테고리로부터 선택되는 형광물질이다.
일 구현예에서, 상기 형광 군은 약 650 내지 약 900 nm 사이의 범위에서 방출되는 근-적외선 (NIR) 형광물질이다. 근 적외선 형광 기술의 사용은 그것이 실질적으로 생체기질의 자동 형광으로부터 백그라운드를 없애거나 경감시키기 때문에 생물학적 검정에서 이점을 가진다. 근-IR 형광 기술의 다른 이점은 산란 강도가 파장의 여기원으로부터의 산란된 빛의 역 4 제곱에 비례하기 때문에, 여기원으로부터 산란된 빛이 크게 감소된다는 점이다. 낮은 백그라운드 형광 및 낮은 산란은 높은 민감도 검출에 필수적인, 높은 신호 대 노이즈 비율을 초래한다. 더욱이, 생물학적 조직 내의 근-IR 영역 (650 nm 내지 900 nm)에서 시각적으로 투명한 창은 NIR 형광을 생물학적 성분을 통한 빛의 통과를 요구하는 인 비보 이미지 및 세포아세포 검출 적용하기에 유용하다. 이 구현예의 측면 내에서, 상기 형광 군은 바람직하기는 IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY 676, DY680, DY682 및 DY780로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 예에서, 근 적외선 군은 IRDye® 800CW, IRDye® 800, IRDye® 700DX, IRDye® 700, 또는 Dynomic DY676이다.
형광 표지는 형광물질의 화학적 반응성 유도체를 사용하여 달성된다. 통상적인 반응기는 FITC 및 TRITC와 같은 이소티오시아네이트 유도체 (플루오레세인 및 로다민의 유도체), NHS-플루오레세인과 같은 아민 반응성 숙시니미딜 에스테르, 및 플루오레세인-5-말레이미드와 같은 술프히드릴 반응성 말레이미드 활성화된 플루오르를 포함하는 것으로, 상기 물질들은 상업적으로 이용가능하다. TNFα 또는 항-TNFα 약물과 임의의 상기 반응성 염료의 반응은 형광물질과 TNFα 또는 항-TNFα 약물 사이에 형성되는 안정한 공유결합을 초래한다.
특정 예에서, 형광 표지 반응 이후에, 종종 표지된 표적 분자들로부터 임의의 비반응된 형광물질을 제거하는 것이 요구된다. 이것은 종종 형광물질과 표지된 부분 사이의 크기 차이의 이점을 갖는, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 달성된다.
반응성 형광 안료는 많은 공급원으로부터 이용가능하다. 그들은 표적 분자 내부의 다양한 기능기에 부착하기 위해 다수의 반응기로 수득될 수 있다. 그들은 또한 표지 반응을 수행하기 위해 모든 성분들을 함유하는 표지 키트에서 이용가능하다. 일 바람직한 측면에서, Invitrogen로부터의 Alexa Fluor® 647 C2 말레이미드가 사용된다 (Cat. No. A-20347).
항-TNFα 항체와 TNFα의 결합 또는 항-약물 항체 (ADA)와 항-TNFα 항체의 특이적인 면역학적 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적 표지는 항체에 부착하는, 형광 또는 발광 태그, 금속, 염료, 방사성핵종 등을 포함한다. 특정 예에서, 요오드-125 (125I)로 표지된 TNFα 또는 항-TNFα 항체가 각각 샘플 내의 항-TNFα 항체 또는 ADA의 농도 수준을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 예에서, 샘플 내의 항-TNFα 항체 또는 ADA에 특이적인 화학발광 TNFα 또는 항-TNFα 항체를 사용하는 화학발광 검정법은 각각 항-TNFα 항체 또는 ADA 농도 수준의 특이적, 비-방사성 검출에 적합하다. 특정 예에서, 형광체로 표지된 TNFα 또는 항-TNFα 항체는 또한 각각 샘플 내의 항-TNFα 항체 또는 ADA의 농도 수준을 측정하기에 적합하다. 형광체의 예는 Alexa Fluor® 염료, DAPI, 플루오레세인, Hoechst 33258, R-피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 로다민, 텍사스 레드, 및 리싸민을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형광체에 링크된 2차 항체는 상업적으로 얻어질 수 있는 것으로, 예를 들면 염소 F(ab')2 항-인간 IgG-FITC는 Tago Immunologicals (Burlingame, CA)로부터 이용가능하다.
직접적 표지는 호스라디시 페록사이드 (HRP), 알칼라인 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 우레아제, 등과 같은 당해 기술분야에서 잘 알려진 다양한 항체를 포함한다. 호스라디시-페록사이드 검출 시스템은 예를 들면, 450 nm에서 검출가능한 하이드로겐 퍼옥사이드의 존재 하에 가용성 생산물을 산출하는, 발색성 기질 테트라메틸 벤지딘 (TMB)과 함께 사용될 수 있다. 알칼라인 포스파타제 검출 시스템은 예를 들면, 405 nm에서 용이하게 검출가능한 가용성 생산물을 산출하는, 발색성 기질 p-니트로페닐 포스페이트와 함께 사용될 수 있다. 마찬가지로, β-갈락토시다제 검출 시스템은 410 nm에서 검출가능한 가용성 생산물을 산출하는, 발색성 기질 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (ONPG)와 함께 사용될 수 있다. 우레아제 검출 시스템은 우레아-브로모크레솔 퍼플 (Sigma Immunochemicals; St. Louis, MO)과 같은 기질과 함께 사용될 수 있다. 효소에 링크되기에 유용한 2차 항체는 다수의 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있는 것으로, 예를 들면 염소 (ab')2 항-인간 IgG-알칼라인 포스파타제는 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA.)로부터 입수될 수 있다.
직접적 또는 간접적 표지로부터의 신호는 예를 들면, 발색성 기질로부터 색채를 검출하기 위한 분광광도계; 125IDML 검출을 위한 감마 측정기와 같은 방사선을 검출하기 위한 방사선 측정기; 또는 특정 파장의 빛의 존재시 형광을 검출하기 위한 형광계를 사용하여 분석될 수 있다. 효소-링크 항체의 검출을 위하여, 항-TNFα 항체의 양 또는 ADA 수준의 정량적 분석은 제조사의 사용지시에 따라 EMAX Microplate Reader (Molecular Devices; Menlo Park, CA)와 같은 분광광도계를 사용하여 이루어질 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 검정법은 자동화되거나 로보트로 수행될 수 있고, 다수의 샘플로부터의 신호는 동시에 검출될 수 있다.
특정 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피가 사용된다. SEC의 기본 원리는 다른 크기의 입자들이 다른 속도로 고정상을 통하여 용출 (여과)된다는 것이다. 이는 크기를 바탕으로 입자들의 용액을 분리하는 것이다. 모든 입자들이 동시에 또는 거의 동시에 로딩되면, 동일한 크기의 입자들이 함께 용출된다. 각각의 크기 배제 컬럼은 분리될 수 있는 분자량의 범위를 가진다. 배제 한계는 분자들이 고정상에서 포획되기에 너무 큰 범위의 상한에서 분자량을 제한한다. 투과 한계는 분리 범위의 하한에서 분자량을 제한하고 충분히 작은 크기의 분자량은 고정상의 구멍에서 완전히 투과될 수 있으며 이 분자량 이하의 모든 분자들은 단일 밴드로 용출되기에 너무 작다.
특정 측면에서, 용출물은 일정 부피, 또는 분획물로 수거된다. 입자들은 크기가 유사할수록, 그들은 동일한 분획물로 존재하고 개별적으로 검출되지 않는 경향이 있다. 바람직하게는, 수거된 분획물은 분광 기술로 평가됨으로써 용출된 입자들의 농도가 측정된다. 통상적으로, 본 발명에서 유용한 분광 검출 기술은 형광분석법, 굴절율 (RI), 및 자외선 (UV)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 예에서, 용출 부피는 분자 유체역학적 부피의 로그에 매우 선형적으로 감소한다 (즉, 무거운 모이어티가 우선 나온다).
특정 측면에서, 상기 방법은 예를 들면, REMICADE™ (인플릭시마브), 키메라 항-TNFα mAb, ENBREL™ (아타너셉트), TNFR-Ig Fc 융합 단백질, HUMIRA™ (아달리무마브), 인간 항-TNFα mAb, 및 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 페길화된(PEGylated) Fab 단편을 포함하는 항체와 같은 항-TNFα 약물의 양을 검출하기에 유용하다.
특정 예에서, 항-TNFα 약물 (예를 들면, 항-TNFα 항체)이 검출된 이후에, 상기 항-TNFα 약물은 표준 곡선을 사용하여 측정된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물을 샘플과 접촉시킴으로써 자가항체를 갖는 표지된 복합체를 형성하는 단계;
(b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 상기 표지된 복합체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 자가항체를 검출한다.
특정 예에서, 상기 자가항체는 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα를 항-TNFα 약물에 대한 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써, 표지된 항-TNFα 약물, 표지된 TNFα, 및 자가항체의 제1 표지된 복합체와 표지된 항-TNFα 약물 및 자가항체의 제2 표지된 복합체를 형성하는 단계, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα는 다른 표지물질을 포함하고;
(b) 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(c) 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 제1 표지된 복합체 및 제2 표지된 복합체가 모두 존재할 때 자가항체의 비-중성화 형태를 검출하고, 제2 표지된 복합체만 존재할 때는 자가항체의 중성화 형태를 검출한다.
특정 예에서, 상기 자가항체는 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 표지된 항-TNFα 약물을 항-TNFα 약물을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 제1 표지된 복합체를 형성하는 단계;
(b) 제1 표지된 복합체를 제1 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 제1 표지된 복합체를 분리하는 단계;
(c) 제1 표지된 복합체를 검출하는 것에 의해, 자가항체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계;
(d) 표지된 TNFα를 제1 표지된 복합체와 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα의 제2 표지된 복합체를 형성하는 단계, 여기서 상기 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 TNFα는 다른 표지물질을 포함하고;
(e) 제2 표지된 복합체를 제2 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 제2 표지된 복합체를 분리하는 단계; 및
(f) 제2 표지된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 자가항체의 중성화 형태의 존재 또는 수준을 검출한다.
특정 예에서, 상기 자가항체는 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 포함한다.
다른 예에서, 본 명세서에 기술된 검정 분석법은 TNFα 억제인자, 특히 자가면역 장애 (예를 들면, 류마티스 관절염, 크론병 등)을 갖고 있는 피검체 내의 항-TNFα 항체에 대한 반응성을 예측하기 위하여 사용될 수 있다. 이 방법에서, 항-TNFα 항체의 정확한 또는 치료적 용량, 즉 치료학적 농도 수준에서 피검체를 분석하는 것에 의해, 개체가 치료요법에 반응성이 있는지 여부를 예측하는 것이 가능하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 자가면역 장애를 갖고 있는 피검체에서 자가면역 장애를 관찰하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 방법은 치료 동안, 항-TNFα 항체의 정확한 또는 치료적 용량, 즉 치료학적 농도 수준에서 피검체를 분석하는 것을 포함한다. 이 방법으로, 개체가 주어진 시간 기간 동안 치료요법에 반응성이 있는지 여부를 예측하는 것이 가능하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체에서 항-TNFα 약물의 유효량을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 하기의 단계를 포함하는 방법으로, 피검체로부터 제1 샘플 내의 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계:
(i) 제1 샘플을 소정의 표지된 TNFα와 접촉시킴으로써 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα를 포함하는 제1 복합체를 형성하는 단계; 및
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 상기 제1 복합체를 검출하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계;
(b) 하기의 단계를 포함하는 방법으로, 피검체로부터 제2 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계:
(i) 제2 샘플을 소정의 표지된 항-TNFα 약물과 접촉시킴으로써 자가항체와 표지된 항-TNFα 약물을 포함하는 제2 복합체를 형성하는 단계;
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 제2 복합체를 검출하는 것에 의해, 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 단계 (a)에서 측정된 항-TNFα 약물의 수준으로부터 단계 (b)에서 측정된 자가항체의 수준을 뺄셈하는 단계를 포함하는 것에 의해 항-TNFα 약물의 유효량을 측정한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 단계 (a)(ii)에서의 검출이:
(1) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 제1 파일롯에서 표지된 TNFα의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(2) 제1 파일롯에서 제1 복합체의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(3) 단계 (2)로부터의 적분 결과를 단계 (1)로부터의 적분 결과로 나눔으로써 비율을 측정하는 단계; 및
(4) 상기 표지된 TNFα의 양을 단계 (3)의 비율과 곱셈하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 단계 (b)(ii)에서의 검출이:
(1) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 제2 파일롯에서 표지된 항-TNFα 약물의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(2) 제2 파일롯에서 제2 복합체의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(3) 단계 (2)로부터의 적분 결과를 단계 (1)로부터의 적분 결과로 나눔으로써 비율을 측정하는 단계; 및
(4) 상기 표지된 항-TNFα 약물을 단계 (3)의 비율과 곱하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 제1 샘플 뿐만 아니라 제2 샘플이 혈청 샘플인 것을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명은 제1 샘플 뿐만 아니라 제2 샘플이 항-TNFα 약물로 치료요법 동안 피검체로부터 수득된 것을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명은 단계 (a)(ii) 및/또는 단계 (b)(ii)에서 검출이 형광 표지 검출을 포함하는 것을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 본 발명의 방법에 따라 항-TNFα 약물의 유효량을 측정하는 단계;
(b) 상기 항-TNFα 약물의 유효량을 항-TNFα 약물의 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 단계 (c)의 비교를 바탕으로 피검체를 위한 항-TNFα 약물의 후속 용량을 측정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물의 유효량이 항-TNFα 약물의 수준 미만일 경우 항-TNFα 약물의 후속 용량을 증가시키는 것을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물의 유효량이 항-TNFα 약물의 수준과 거의 동일하도록, 항-TNFα 약물의 후속 용량을 증가시키는 것을 제공한다.
몇몇 다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물이 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원인 것을 추가로 제공한다.
몇몇 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 인플릭시마브 (REMICADE™)이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아달리무마브 (HUMIRA™)이다. 다른 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아타너셉트 (ENBREL™)이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)이다. 다른 구현예에서, 상기 표지된 TNFα은 형광물질 표지된 TNFα이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 측정된 항-TNFα 약물은 정량화된다. 몇몇 구현예에서, 상기 측정된 TNFα는 정량화된다. 다른 구현예에서, 상기 표지된 복합체가 우선 용출되고 그 다음 표지된 유리 TNFα가 용출된다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 표지된 복합체가 우선 용출되고 그 다음 표지된 유리 항-TNFα가 용출된다. 몇몇 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래프는 크기 배제-고속 수행 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)이다. 몇몇 다른 구현예에서, 자가항체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 또는 그것의 조합물로부터 선택되는 일원이다. 몇몇 구현예에서, 상기 측정된 자가항체는 정량화된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 치료요법을 최적화시키고 및/또는 항-TNFα 약물에 대한 독성을 경감시키기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 피검체로부터 제1 샘플 내의 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 단계;
(b) 피검체로부터 제2 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 항-TNFα 약물 및 자가항체의 수준을 바탕으로 피검체를 위한 후속의 치료요법 과정을 결정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 치료요법을 최적화시키고 및/또는 항-TNFα 약물에 대한 독성을 경감시킨다.
관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 높고 자가항체의 수준은 낮은 경우, 후속의 치료요법 과정은 항-TNFα 약물과 함께 면역억제성 약물을 병용-투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 보통의 수준이고 자가항체의 수준은 낮은 경우, 후속의 치료요법 과정은 항-TNFα 약물의 수준을 증가시키고, 면역억제성 약물을 공통-투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 보통의 수준이고 자가항체의 수준도 보통의 수준인 경우, 후속의 치료요법의 과정은 다른 항-TNFα 약물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 낮은 수준이고 자가항체의 수준은 높은 수준인 경우, 후속의 치료요법 과정은 다른 항-TNFα 약물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 아달리무마브 (HUMIRA™)가 인플릭시마브 (REMICADE™) 대신에 투여된다.
몇몇 구현예에서, 상기 문구 "항-TNFα 약물의 높은 수준"은 약 10 내지 약 100 ng/10㎕, 약 10 내지 약 70 ng/10㎕, 또는 약 10 내지 약 50 ng/10㎕의 약물 수준을 포함한다. 다른 구현예에서, 문구 "항-TNFα 약물의 높은 수준"은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 ng/10㎕ 이상의 약물 수준을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 문구 "항-TNFα 약물의 보통 수준"은 약 5.0 내지 약 50 ng/10㎕, 약 5.0 내지 약 30 ng/10㎕, 약 5.0 내지 약 20 ng/10㎕, 또는 약 5.0 내지 약 10 ng/10㎕의 약물 수준을 포함한다. 다른 구현예에서, 문구 "항-TNFα 약물의 보통 수준"은 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ng/ 10㎕의 약물 수준을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 문구 "항-TNFα 약물의 낮은 수준"은 약 0 내지 약 10 ng/10㎕, 약 0 내지 약 8 ng/10㎕, 또는 약 0 내지 약 5 ng/10㎕의 약물 수준을 포함한다. 다른 구현예에서, "항-TNFα 약물의 낮은 수준"은 약 10, 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 또는 0.5 ng/ 10㎕ 미만의 약물 수준을 포함한다.
상기 두문자어 "ADA"는 문구 "항-약물 항체"를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 문구 "항-약물 항체의 높은 수준"은 약 3.0 내지 약 100 ng/10㎕, 약 3.0 내지 약 50 ng/10㎕, 약 10 내지 약 100 ng/10㎕, 약 10 내지 약 50 ng/10㎕, 또는 약 20 내지 약 50 ng/10㎕의 항-약물 항체 수준을 포함한다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 문구 "항-약물 항체의 높은 수준"은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 ng/10㎕ 이상의 항-약물 항체 수준을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 문구 "항-약물 항체의 보통 수준"은 약 0.5 내지 약 20 ng/10㎕, 약 0.5 내지 약 10 ng/10㎕, 약 2.0 내지 약 20 ng/10㎕, 약 2.0 내지 약 10 ng/10㎕, 약 2.0 내지 약 5.0 ng/10㎕, 또는 약 2.0 내지 약 5.0 ng/10㎕의 항-약물 항체 수준을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 문구 "항-약물 항체의 낮은 수준"은 약 0.0 내지 약 5.0 ng/10㎕, 약 0.1 내지 약 5.0 ng/10㎕, 약 0.0 내지 약 2.0 ng/10㎕, 약 0.1 내지 약 2.0 ng/10㎕, 또는 약 0.5 내지 약 2.0 ng/10㎕의 항-약물 항체 수준을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 문구 "항-약물 항체의 낮은 수준"은 약 5.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 또는 0.5 ng/10㎕ 미만의 항-약물 항체 수준을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 항-TNFα 약물이:
(i) 제1 샘플을 소정의 표지된 TNFα과 접촉시킴으로써 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα를 포함하는 제1 복합체를 형성하는 단계; 및
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 제1 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 수준을 측정하는 검정법으로 측정되는 것인 방법을 추가로 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 자가항체가:
(i) 제2 샘플을 소정의 표지된 항-TNFα 약물과 접촉시킴으로써 자가항체와 표지된 항-TNFα 약물을 포함하는 제2 복합체를 형성하는 단계; 및
(ii) 크기 배제 크로마토그래피로 제2 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것에 의해, 자가항체의 수준을 측정하는 검정법으로 측정되는 것인 방법을 추가로 제공한다.
관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 항-TNFα 약물이 REMIC ADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 항-TNFα 약물이 인플릭시마브 (REMIC ADE™)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아달리무마브 (HUMIRA™)이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아달리무마브 (HUMIRA™)이다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 항-TNFα 약물이 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 측정된 항-TNFα 약물이 정량화되는 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 제1 샘플 뿐만 아니라 제2 샘플이 혈청인 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 제1 샘플 뿐만 아니라 제2 항체 샘플이 항-TNFα 약물로 치료요법 동안 피검체로부터 수득되는 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 자가항체가 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 또는 그것의 조합물로부터 선택되는 일원인 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 측정된 자가항체가 정량화되는 것인 방법을 추가로 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물을 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플 내의 내부 컨트롤과 관련된 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 소정의 표지된 TNFα과 소정의 표지된 내부 컨트롤을 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 TNFα와 항-TNFα 약물의 복합체를 형성하는 단계;
(b) 크기 배제 크로마토그래피로 표지된 TNFα 및 표지된 내부 컨트롤을 측정하는 단계;
(c) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 TNFα의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(d) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 내부 컨트롤의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(e) 상기 표지된 TNFα의 양을 표지된 내부 컨트롤의 양으로 나눔으로써 제1 비율을 측정하는 단계;
(f) 단계 (c)로부터의 적분 결과를 단계 (d)로부터의 적분 결과로 나눔으로써 제2 비율을 측정하는 단계; 및
(g) 단계 (e)에서 측정된 제1 비율과 단계 (f)에서 측정된 제2 비율을 비교하는 단계를 포함하는 것에 의해, 내부 컨트롤과 관련된 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준을 측정한다.
관련 구현예에서, 본 발명은 단계 (e)에서 측정된 제1 비율이 약 80:1 내지 약 100:1인 것인 방법을 추가로 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 단계 (e)에서 측정된 제1 비율이 약 100:1인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 표지된 내부 컨트롤이 Biocytin-Alexa 488인 것인 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 1 내지 약 25 ng인 것인 방법을 추가로 제공한다. 특정 다른 구현예에서, 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 5 내지 약 25, 100㎕ 중 약 5 내지 약 20 ng, 100㎕ 중 약 1 내지 약 20 ng, 100㎕ 중 약 1 내지 약 10 ng, 또는 100㎕ 중 약 1 내지 약 5 ng인 것인 방법을 추가로 제공한다. 추가 구현예에서, 상기 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 1, 5, 10, 15, 20, 또는 25 ng인 것인 방법을 추가로 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체 내의 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은: 본 발명의 방법에 따른 제1 비율과 제2 비율의 비교를 바탕으로 피검체를 위한 항-TNFα 약물의 후속 용량을 측정하는 단계를 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 방법이: 제1 비율이 약 100:1이고 제2 비율이 약 95:1 미만인 경우, 항-TNFα 약물의 후속 용량을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 것에 의해, 항-TNFα 약물의 치료량을 최적화하는 방법을 제공한다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 및 그것의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 항-TNFα 약물이 인플릭시마브 (REMICADE™)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물이 아달리무마브 (HUMIRA™)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물이 아타너셉트 (ENBREL™)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 항-TNFα 약물이 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 표지된 TNFα가 형광물질 표지된 TNFα인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 검출된 항-TNFα 약물이 정량화되는 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 표지된 복합체가 우선 용출되고, 그 다음 표지된 유리 TNFα가 용출되는 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 샘플이 혈청인 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 샘플이 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 수득되는 것인 방법을 추가로 제공한다. 관련 구현예에서, 본 발명은 상기 크기 배제 크로마토그래피가 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)인 것인 방법을 추가로 제공한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 자가항체를 갖고 있거나 갖고 있는 것으로 의심되는 샘플 내의 내부 컨트롤과 관련된 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 소정의 표지된 항-TNFα 약물과 소정의 표지된 내부 컨트롤을 샘플과 접촉시킴으로써 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 복합체를 형성하는 단계;
(b) 크기 배제 크로마토그래피로 표지된 항-TNFα 및 표지된 내부 컨트롤을 측정하는 단계;
(c) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 항-TNFα 약물의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(d) 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 표지된 내부 컨트롤의 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하는 단계;
(e) 상기 표지된 항-TNFα 약물의 양을 상기 표지된 내부 컨트롤의 양으로 나눔으로써 제1 비율을 측정하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (c)와 (d)로부터의 적분 결과를 나눔으로써 제2 비율을 측정하는 단계; 및
(g) 단계 (e)에서 측정된 제1 비율과 단계 (f)에서 측정된 제2 비율을 비교하는 단계를 포함하는 것에 의해, 내부 컨트롤과 관련된 자가항체의 존재 또는 수준을 측정한다.
관련 구현예에서, 단계 (e)에서 측정된 제1 비율은 약 80:1 내지 약 100:1이다. 다른 관련 구현예에서, 단계 (e)에서 측정된 제1 비율은 약 100:1이다. 관련 구현예에서, 표지된 내부 컨트롤은 Biocytin-Alexa 488이다. 특정 구현예에서, 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 50 내지 약 200이다. 특정 다른 구현예에서, 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 100 내지 약 200 pg, 100㎕ 중 약 150 내지 약 200, 100㎕ 중 약 50 내지 약 150 pg, 또는 100㎕ 중 약 50 내지 약 100 pg이다. 추가 구현예에서, 상기 표지된 내부 컨트롤 (예를 들면, Biocytin-Alexa 488)의 양은 분석된 샘플 100㎕ 중 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200이다.
관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 및 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원이다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 인플릭시마브 (REMICADE™)이다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아달리무마브 (HUMIRA™)이다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 아타너셉트 (ENBREL™)이다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 CIMZIA® (세프톨리주마브 패골)이다. 관련 구현예에서, 상기 검출된 자가항체는 정량화된다. 관련 구현예에서, 상기 표지된 복합체가 우선 용출되고, 그 다음 표지된 유리 항-TNFα 항체가 용출된다. 관련 구현예에서, 상기 샘플은 혈청이다. 관련 구현예에서, 상기 샘플은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 수득된다. 관련 구현예에서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)이다. 관련 구현예에서, 상기 자가항체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원이다. 관련 구현예에서, 상기 검출된 자가항체는 정량화된다.
관련 구현예에서, 본 발명의 방법은 후속의 치료요법 과정을 결정하는 단계를 추가로 제공한다. 항-TNFα 약물의 수준은 높은 수준이고 자가항체의 수준은 낮은 항체인 경우, 후속의 치료요법 과정은 항-TNFα 약물과 면역억제성 약물을 병용-투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 보통의 수준이고 자가항체의 수준은 낮은 수준인 경우, 후속의 치료요법 과정은 항-TNFα 약물의 수준을 증가시키고 면역억제성 약물과 병용-투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 보통의 수준이고 자가항체의 수준도 보통의 수준인 경우 후속의 치료요법 과정은 다른 항-TNFα 약물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 항-TNFα 약물의 수준은 낮은 수준이고 자가항체의 수준은 높은 수준인 경우 다른 항-TNFα 약물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 관련 구현예에서, 상기 아달리무마브 (HUMIRA™)가 인플릭시마브 (REMICADE™) 대신에 투여된다.
몇몇 구현예에서, 본 발명은 항-TNFα 약물의 존재 또는 수준 및 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 수준을 측정하기 위한 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는:
(a) 소정의 표지된 TNFα을 포함하는 제1 측정 기질;
(b) 소정의 표지된 항-TNFα 약물을 포함하는 제2 측정 기질;
(c) 임의적으로 소정의 표지된 TNFα 및 소정의 표지된 내부 컨트롤을 포함하는 제3 측정 기질;
(d) 임의적으로 소정의 표지된 항-TNFα 약물 및 소정의 표지된 내부 컨트롤을 포함하는 제4 측정 기질;
(e) 임의적으로 피검체로부터 샘플을 추출하기 위한 수단; 및
(f) 임의적으로 상기 키트의 사용에 대한 사용지시 팜플렛을 포함한다.
관련 구현예에서, 상기 기질은 본 발명의 화학물질과 증착될 수 있는 임의의 물질을 포함하는 것으로, 니트로셀룰로오스, 실리카 젤, 박-막 크로마토그래피 기질, 나무 스틱, 셀룰로오스, 코튼, 폴리에틸렌, 그들의 조합물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 관련 구현예에서, 본 발명의 화학물질은 정렬된 어레이, 매트릭스, 또는 매트릭스 어레이 내의 상기의 물질 상에 증착될 수 있다.
관련 구현예에서, 상기 키트는 표지된 TNFα, 표지된 항-TNFα 약물, 및/또는 표지된 내부 컨트롤을 검출하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 관련 구현예에서, 상기 키트는 검출을 위한 수단을 추가로 포함하는 것으로, 형광 표지 검출, UV-방사선 검출, 또는 요오드 노출을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 관련 구현예에서, 상기 키트는 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 기구를 추가로 포함한다. 관련 구현예에서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 측정 기질은 니트로셀롤로오스, 실리카 젤, 및 크기-배제 크로마토그래피 매질로부터 선택된다. 관련 구현예에서, 상기 항-TNFα 약물은 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원이다. 관련 구현예에서, 상기 표지된 TNFα는 형광물질 표지된 TNFα이다. 관련 구현예에서, 상기 샘플은 혈청이다. 관련 구현예에서, 상기 샘플은 항-TNFα 약물로 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 수득된다. 관련 구현예에서, 상기 자가항체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원이다.
IV . 본 발명과 관련된 생리학적 범위 및 종의 수준
REMICADE™로 치료받은 환자 내의 REMICADE™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 1 내지 10 mg REMICADE™의 범위 내이다. 몇몇 구현예에서, REMICADE™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 3 내지 8 mg REMICADE™의 범위 내이다. 몇몇 다른 구현예에서, REMICADE™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 5 mg REMICADE™이다.
REMICADE™ (인플릭시마브)의 통상적인 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 80 μg 범위 내이다. 몇몇 구현예에서, REMICADE™의 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 50 μg 범위 내이다, 몇몇 다른 구현예에서, REMICADE™의 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 30 μg이다. 몇몇 구현예에서, REMICADE™의 용량은 ml 당 약 30 μg이다. 몇몇 다른 구현예에서, REMICADE™의 용량은 ml 당 약 50 μg 이다.
HUMIRA™로 치료받은 환자 내의 HUMIRA™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 0.1 내지 10 mg HUMIRA™ 범위 내이다. 몇몇 구현예에서, HUMIRA™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 0.1 내지 8 mg HUMIRA™ 범위 내이다. 몇몇 다른 구현예에서, HUMIRA™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 1 mg HUMIRA™ 이다. 몇몇 구현예에서, HUMIRA™의 치료학적으로 유효한 수준은 환자 체중 kg 당 약 0.8 mg HUMIRA™이다.
HUMIRA의 통상적인 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 150 μg 범위 내이다. 몇몇 구현예에서, HUMIRA™의 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 100 μg 범위 내이다. 몇몇 다른 구현예에서, HUMIRA™의 용량은 ml 당 약 0.05 μg 내지 약 50 μg 범위 내이다. 몇몇 구현예에서, HUMIRA™의 용량은 ml 당 약 30 μg이다. 몇몇 구현예에서, HUMIRA™의 용량은 ml 당 약 32 μg이다. 몇몇 다른 구현예에서, HUMIRA™의 용량은 ml 당 약 50 μg이다.
V. 예시적인 질병 및 그것의 치료를 위한 치료 항체
특정 구현예에서, 본 발명은 치료학적 모노클로날 항체를 사용할 수도 있다. 표 1은 승인받고 현재 개발 중에 있는 치료학적 모노클로날 항체의 예시적인 목록을 제공한다. 임상적 개발품 및 승인된 생산물 내의 모노클로날 항체 치료제에 대한 광범위한 목록은 문헌 [2006 PhRMA Report entitled '418 Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal Against Disease'.]에 개시되어 있다.
특히 바람직한 치료 항체는 예를 들면, (1) Remicade™ (인플릭시마브), 마우스-인간 IgG I-카파 항TNFα 치료 항체, (2) Enbrel™ (아타너셉트), 인간 TNF 수용체 2 및 인간 IgG I의 융합 단백질, 및 (3) Humira™ (아달리무마브), 전체 인간 IgGl-카파 항TNFα 치료 항체와 같은 항-TNFα 치료 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 2개의 다른 항-TNFα 항체 작제물: (4) Cimzia™ CDP870 (셀토리늘루나브 페골), 인간화 항-TNFα 치료 항체의 페길화된 Fab 단편, 및 (5) CNTO 148 (골리므루나브), 전체 IgG I-카파 항TNFα가 상기 몇몇의 동일한 질병을 갖고 있는 환자의 제3상 임상시험에서 가능성을 나타내었다.
치료 항체의 바람직한 클래스는 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직성 척추염 (베크테레브병), 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 심각한 건선, 만성 포도막염, 심각한 사르코이드증, 및 베게너 융아종증과 같은 다양한 자가면역 질환의 치료에 사용되는 항-TNFα 단쇄 치료 항체이다.
항-TNFα 항체의 생체이용가능성/농도를 측정함에 있어서 유용한 것 이외에, 본 발명은 또한 치료학적 또는 진단학적 목적을 위하여, 체내에서 사용되는 임의의 치료 항체의 생체이용가능성/농도의 측정시 사용되기에도 적합하다. 하기의 표 1은 인 비보에서 사용되는 다양한 치료학적 모노클로날 항체와 상관관계가 있는 약물 용도의 목록을 제공한다.
추가적 구현예에서, 본 발명의 방법은 치료 항체에 대한 자가항체의 존재 또는 농도 수준의 측정시 사용하기에 적합하다.
따라서, 본 발명은 치료 (또는 진단)이 피검체에 대한 치료 항체를 투여하는 것을 포함하는 것인, 치료요법을 최적화하는 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법은 일 또는 그 이상의 하기를 포함하는, 본 명세서에 참고된 일 또는 그 이상의 질병 또는 장애의 치료 (또는 진단)을 최적화하기 위한 것일 수 있다:
감염성 질환(infectious disease) : 호흡기 신시치아 바이러스 (respiratory syncytial virus, RSV), HIV, 탄저병(anthrax), 칸디다증(candidiasis), 스타피로코커스 감염, C형 간염.
자가면역 질환(autoimmune disease) : 류마티스 관절염, 크론병, B-세포 비호치킨 림프종(non hodgkin's 림프종), 다발성 경화증(multiple scleorisis), SLE, 강직성 척추염, 루푸스(lupus), 건성 관절염(psoriatic arthritis), 낭창(erythematosus).
염증성 장애(inflammatory disorder) : 류마티스 관절염 (RA), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopatmc arthritis), 강직성 척추염 (베크테레브병), 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 심각한 건선, 만성 포도막염, 유육종증(sarcoidosis), 베게너 융아종증, 및 주요한 특징으로서 염증을 갖는 다른 질병.
혈액 장애 : 패혈증, 패혈증(septic) 쇼크, 발작성 야간 혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 및 융혈성 요독 증후군.
암 : 대장암, 비-호치킨 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, 미분화 대-세포 림프종, 두부 및 경부 편평세포암종, HER2-과발현 전이성 유방암의 치료, 급성 골수성 백혈병, 전립선암 (예를 들면, 선암), 소-세포 폐암, 갑상선암, 악성 흑색종, 고형 종양, 유방암, 초기 단계의 HER2-양성 유방암, 1차 비-편평성 NSCLC 암, AML, 모발상 세포 백혈병, 신경모세포종, 신장암, 뇌암, 골수종, 다발성 골수종, 골 전이, SCLC, 두부/경부 암, 1차 췌장암, SCLC, NSCLC, 두부 및 경부 암, 혈액암 및 고형 종양, 진행성 고형 종양, 위장관암, 췌장암, 피부 T-세포 림프종, 비-피부 T-세포 림프종, CLL, 난소, 전립선, 신장 세포 암, 메소텔린-발현성 종양, 신경교아종, 전이성 췌장, 혈액암 악성종양, 피부 역형성 대-세포 MAb 림프종, AML, 골수이형성 증후군.
심혈관계 질환 : 동맥경화증, 급성 심근 경색, 심폐 바이패스, 협심증.
대사 장애 : 타입 I 당뇨병과 같은 당뇨병.
소화 장애 : 크론병, C. 다이피셀 질환, 궤양성 대장염.
안구 장애 : 포도막염.
유전 장애 : 발작성 야간 혈색뇨증 (PNH).
신경계 장애 : 골관절염 통증 및 알츠하이머병.
호흡계 장애 : 호흡계 질병, 천식, 만성 폐쇄성 폐병 (COPD), 비용종, 소아 천식.
피부 질환 : 만성 보통 내지 심각한 플라그 건선을 포함하는, 건선.
이식 거부반응 : 급성 신장 이식 거부반응, 심장 간 역행 이식 거부반응, 신장 이식 거부반응 방지, 급성 신장 이식 거부반응 예방, 신장 이식 거부반응.
기타 장애 : 맹장염, 신장 염증, 갱년기 골다공증 (골 징애), 과호산구성 증후군, 호산구성 식도염 및 피넛 알러지의 진단.
일 구현예에서, 상기 질병은 특정 질병 및 장애로 이루어지는 상기 군의 일 또는 그 이상으로부터 선택된다.
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VI . 치료요법 및 치료 관찰
일단 항-TNF 약물 치료요법을 받고 있는 피검체의 진단 또는 예후가 측정되거나 TNFα가 병리생리학에 관여하는 질병 및 장애, 예를 들면, 쇼크, 패혈증, 감염, 자가면역 질환, RA, 크론병, 이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아닌, 질병 및 장애를 갖는 것으로 진단된 개체에서 항-TNFα 약물에의 반응 가능성이 예측되면, 본 발명은 추가로 진단, 예후, 또는 예측을 기초로 치료요법 과정을 추천하는 것을 추가로 포함할 수도 있다. 특정 예에서, 본 발명은 TNF-α가 병리생리학에 관여하는 질환 및 질병과 관련된 일 또는 그 이상의 증상을 치료하기에 유용한 항-TNFα 약물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함할 수도 있다. 치료학적 적용에서, 항-TNFα 약물은 단독으로 투여되거나, 또는 일 또는 그 이상의 추가적인 항-TNFα 약물 및/또는 항-TNFα 약물과 관련된 부작용을 경감시키는 일 또는 그 이상의 약물 (예를 들면, 면역억제제)과 함께 병용-투여될 수 있다. 항-TNFα 약물은 본 명세서에 기술되어 있는 것으로, REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세프톨리주마브 패골), 생물학적 작용제, 통상적인 약물, 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이, 본 발명은 유리하게도 임상 의사가 정확한 약물을 정확한 시간에 정확한 환자에게 제공할 수 있도록, 항-TNFα 약물로의 치료 결정을 안내하고 치료요법 선택 및 최적화를 알려줌으로써 "개인 맞춤 의약품"을 실행할 수 있도록 한다.
항-TNFα 약물은 필요에 따라 적합한 약제학적 부형제로 투여될 수 있고, 임의의 허용된 투여 방법을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 투여는 예를 들면, 정맥, 국소, 피하, 경피(transcutaneous), 경피(transdermal), 근내, 경구, 구강, 설하, 잇몸, 입천장, 관절-내, 비경구, 소동맥-내, 진피내, 뇌실내, 두개내, 복막내, 병변내, 비내, 직장, 질내, 또는 흡입에 의해 수행될 수 있다. 용어 "병용-투여하다(co-administer)은 항-TNFα 약물이 제2의 약물 (예를 들면, 다른 항-TNFα 약물, 항-TNFα 약물의 부작용을 경감시키기에 유용한 약물 등)의 투여와 동시에, 또는 바로 직전에, 또는 상기의 투여 이후에 투여됨을 의미한다.
항-TNFα 약물의 치료학적 유효량은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상의 횟수로 반복적으로 투여되거나, 상기 용량은 연속 주입으로 투여될 수도 있다. 용량은 고체, 반-고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여량 형태, 예를 들면, 정제, 환, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁제, 에멀젼, 좌제, 체류 관장제(retention enemas), 크림, 연고, 로션, 젤, 에어졸, 기포 등으로, 바람직하게는, 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여량 형태를 가질 수도 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "단위 투여량 형태(unit dosage form)"는 인간 피검체 및 다른 포유동물을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 포함하는 것으로, 각각의 유닛은 적합한 약제학적 부형제 (예를 들면, 앰플)와 관련된, 원하는 개시, 내성, 및/또는 치료적 효과를 생산할 수 있도록 계산된 소정의 항암 약물을 함유한다. 또한, 더 농축된 투여량 형태가 제조될 수도 있고, 그 이후에 더 희석된 단위 투여량 형태가 생산될 수 있다. 따라서 상기 더 농축된 투여량 형태는 예를 들면, 항-TNFα 약물의 양의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상 실질적으로 더 많은 양을 함유할 것이다.
그러한 투여량 형태를 제조하는 방법은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)] 참조). 투여량 형태는 전형적으로 종래의 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 다른 의약제(medicinal agents), 담체, 애주번트, 희석제, 조직 투과 증강제, 가용화제(solubilizers) 등을 추가로 포함할 수도 있다. 적절한 부형제는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 특정 투여량 형태 및 투여 경로에 따라 조절될 수 있다 (예를 들면, 상기 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES] 참조).
적합한 부형제의 예는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트라가캔쓰, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 살린, 시럽, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 카르보폴(Carbopols)과 같은 폴리아크릴산, 예를 들면, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여량 형태는 추가적으로, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 에멀젼화제; 현탁제; 메틸-, 에틸-, 및 프로필-히드록시-벤조에이트 (즉, 파라벤)과 같은 보존제; 무기 및 유기산 및 염기와 같은 pH 조절제; 감미제(sweetening agents); 및 착향제(flavoring agents)를 포함한다. 투여량 형태는 또한 생분해성 폴리머 비드, 덱스트란, 및 시클로덱스트린 포함 복합체를 포함할 수 있다.
경구 투여 투여의 경우, 치료학적으로 유효한 용량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁제, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말, 및 지연-방출 제형의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 셀룰로오스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 치료학적 유효량은 환, 정제, 또는 캡슐의 형일 수 있으므로, 상기 투여량 형태는 항-TNFα 약물과 함께, 하기한 것들 중 임의의 것들을 함유할 수 있다: 락토오스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등과 같은 희석제; 전분 또는 이의 유도체와 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 윤활제; 및 전분, 검 아카시아, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 이의 유도체와 같은 결합제(binder). 항-TNFα 약물은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 담체 중에 배치된 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 투여량 형태는 예를 들면, 경구, 국소, 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 현탁액을 형성시키기 위하여, 예를 들면, 수성 살린 (예를 들면, 0.9% w/v 소듐 클로라이드), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 중에 항-TNFα 약물 및 임으적으로 일 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 애주번트를 용해 또는 분산시키는 것에 의해 제조될 수 있다. 항-TNFα 약물은 또한 체류 관장제로 제형화될 수 있다.
국소 투여의 경우, 치료학적으로 유효한 용량은 에멀젼, 로션, 젤, 기포, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고, 및 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 항-TNFα 약물은 네뷸라이저들 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 치료학적으로 유효한 용량은 멸균 주사가능 용액 및 멸균 패키지된 분말의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사가능 용액은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH로 제형화된다.
치료학적으로 유효한 용량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 그러한 투여량 형태는, 투여 직전에 재구성을 위한, 완충액, 예를 들면 바이카보네이트를 포함할 수도 있고, 또는 상기 완충액은 예를 들면, 물로의 재구성을 위한 동결건조된 투여량으로 포함될 수도 있다. 동결건조된 투여량 형태는 적합한 혈관수축제 예를 들면, 에피네프린을 추가로 포함할 수도 있다. 동결건조된 투여량 형태는 재구성된 투여량 형태가 즉시 개체에 즉시 투여될 수 있도록, 임의적으로 재구성을 위한 완중액과 함께 패키지된, 주사기로 제공될 수 있다.
TNFα가 병리생리학에 관여하는 질병 및 장애의 치료를 위한 치료학적 용도에서, 항-TNFα 약물은 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg의 초기 투여량으로 투여될 수 있다. 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 범위의 일일 용량이 사용될 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 개체의 요구사항, 질병, 장애 또는 증상의 중증도, 및 사용되는 항-TNFα 약물에 따라 바뀔 수도 있다. 예를 들면, 투여량은 본 명세서에 기술된 방법에 따라 질병, 장애 및/또는 증상의 유형 및 중증도를 고려하여 경험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 개체에 투여되는 용량은 시간에 따라 개체에서 유리한 치료학적 반응을 제공하기에 충분하여야 한다. 용량의 크기는 또한 개체 내의 특정 항-TNFα 약물의 투여시 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 범위에 의해 결정될 수 있다. 특정 상황에서 적절한 투여량의 결정은 의사의 재량 내에 있다. 일반적으로, 치료는 항-TNFα 약물의 최적의 용량 미만의 작은 투여량으로 시작된다. 그 이후에, 상기 투여량은 그러한 상황 하에 최적의 효과가 도달할 때까지 조금씩 증가시킴으로써 늘어난다. 편의상, 전체 일일 투여량은 필요에 따라, 하루 동안 부분으로 나누어 투여될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항-TNFα 약물"은 TNF-α가 병리생리학에 관여하는 질병 및 장애와 관련된 일 또는 그 이상의 증상을 치료하기에 유용한 약물의 모든 약제학적으로 허용가능한 형태를 포함한다. 예를 들면, 상기 항-TNFα 약물은 라세미체(racemic) 또는 이성질체(isomeric) 혼합물, 이온 교환 수지에 결합된 고체 복합물 등의 형태일 수 있다. 또한, 항-TNFα 약물은 용매화된 형태일 수 있다. 상기 용어는 또한 기술된 항-TNFα 약물의 모든 약제학적으로 허용가능한 염, 유도체, 및 유사체 뿐만 아니라 그것의 조합물을 포함한다. 예를 들면, 항-TNFα 약물의 약제학적으로 허용가능한 염은 타르트레이트, 숙시네이트, 타르타레이트, 비타르타레이트, 디하이드로클로라이드, 살리시레이트, 헤미숙시네이트, 시트레이트, 말레이트, 하이드로클로라이드, 카바메이트, 설페이트, 니트레이트, 및 그것의 벤조에이트 염 형태 뿐만 아니라 그것의 조합물 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항-TNFα 약물의 임의의 형태, 예를 들면, 항-TNFα 약물의 약제학적으로 허용가능한 염, 항-TNFα 약물의 유리 염기, 또는 그것의 혼합물이 본 발명의 방법에서 사용되기에 적합하다. 적합한 항-TNFα 약물의 예는 생물학적 작용제, 통상적인 약물, 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료학제 예를 들면, 항-사이토카인 및 항-종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 항체와 같은 케모카인 항체를 포함한다. 항-TNFα 항체의 비-제한적 예는 키메라 IgGl 항-TNFα 치료 항체인, 인플릭시마브 (Remicade®) (Centocor, Inc.; Horsham, PA)와 같은 키메라 치료 항체; CDP571및 페길화된 CDP870와 같은 인간화 치료 항체; 아달리무마브 (Humira®) (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL)와 같은 전체 인간 치료 항체; 아타너셉트 (Enbrel®) (Amgen; Thousand Oaks, CA; Wyeth Pharmaceuticals Inc.; Collegeville, PA)와 같은 p75 융합 단백질, 소분자 (예를 들면, MAP 키나제 억제인자); 및 그것의 조합물을 포함한다. 문헌 [Ghosh, Novartis Found Symp. , 263: 193-205 (2004)] 참고.
다른 생물학적 작용제는 예를 들면, 세포 부착 분자 α4-인테그린에 대한 인간화 치료 항체인, 나타리주마브 Tysabri®) (Elan Pharmaceuticals, Inc.; Dublin, Ireland; Biogen Idee; Cambridge, MA), 및 인간화 IgGl 항-a4p7-인테그린 치료 항체인, MLN-02 (Millennium Pharmaceuticals; Cambridge, MA)와 같은 항-세포 부착 항체; 항-T 세포 작용제; 인간화 IgG2M3 항-CD3 모노클로날 항체인, 비시리주마브 (Nuvion®) (PDL BioPharma; Incline Village, NV)와 같은 항-CD3 항체; 키메라 항-CD4 치료 항체인, 프리리시마브 (cM-T412) (Centocor, Inc.; Horsham, PA)와 같은 항-CD4 항체; 인간화 IgGl 항-CD25 치료 항체인, 다크리주마브 (Zenapax®) (PDL BioPharma; Incline Village, NV; Roche; Nutley, NJ), 및 키메라 IgG l 항-CD25 치료 항체인, 바시리시마브 (Simulect®) (Novartis; Basel, Switzerland)와 같은 항-IL-2 수용체 알파 (CD25) 항체; 및 그것의 조합물을 포함한다.
개체는 또한 개체의 샘플로부터 진단, 예후 및/또는 예측 정보가 얻어지면, 특정 치료적 요법의 효능을 평가하기 위하여 주기적인 시간 간격으로 관찰될 수 있다. 예를 들면, 치료 항체 및/또는 치료 항체와 관련된 자가항체의 존재 또는 농도는 치료 항체를 사용한 치료의 치료학적 효과를 바탕으로 바뀔 수도 있다. 특정 구현예에서, 환자는 개별화된 접근법으로 특정 약물 및 치료에 대한 반응을 평가하고 효과를 이해하기 위하여 관찰될 수 있다. 추가적으로, 환자가 약물에 반응하지 않았지만, 항체의 수준이 바뀐 경우, 상기 환자들은 그들의 항체 수준에 의해 확인될 수 있는 특별한 집단 (비 반응성)에 속함을 나타낸다. 이러한 환자들은 그들의 현재 치료요법은 중단되고, 대체적인 치료가 처방될 수 있다.
개체는 또한 다양한 항체의 농도 또는 수준을 평가하기 위하여 주기적인 시간 간격으로 관찰될 수 있다. 다양한 시점에서의 항체 수준뿐만 아니라 전체 시간에 걸친 항체 수준의 변화율은 유의적이다. 특정 예에서, 개체 내의 일 또는 그 이상의 항체 (예를 들면, 항-TNFα 항체에 대한 자가항체)의 임계량(threshold amount) 이상의 증가율은 개체가 유의적으로 합병증으로 발전될 고위험 또는 부작용의 위험을 가짐을 나타낸다. 마커 속도 형태의 연속 시험 (즉, 전체 시간 간격에 걸친 항체 수준의 변화)으로부터 얻어진 정보는 질병의 중증도, 질병의 합병증 위험, 및/또는 부작용 위험과 관련될 수도 있다.
본 발명은 또한 예를 들면, 치료학적 모노클로날 항체로 치료하는 경우, 주요한 비- 또는 낮은-반응자를 확인하기 위해 제공된다. 이러한 주요한 비- 또는 낮은 반응자는 예를 들면, 치료제에 대해 선천적인 또는 이미-발전된 면역글로불린 반응을 갖는 환자일 수도 있다. 치료제가 진단 항체일 경우, 주요한 비- 또는 낮은 반응자의 확인은 각각의 개별적인 환자에 적합한 치료제의 선택을 가능하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 2차 반응 실패한 환자를 확인하기 위하여 사용될 수도 있다. 2차 반응 실패는 무증상, 즉 치료가 덜 유효하거나 또는 심지어 비-유효하게 되는 증상일 수 있다. 특정 예에서, 본 발명의 방법은 환자 또는 의료학적 의사가 치료가 덜 유효한 것으로 통지하기 이전에 2차 반응 실패 현상을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 더 높은 투여량의 치료는 또한 인 비보 농도의 정확성을 달성하거나 대체적인 치료를 선택하거나, 또는 그것의 조합을 모두 보장하기 위하여 적용될 수도 있다. 치료제가 진단학적 작용제인 경우, 2차 반응 실패 현상은 특히 돌발적일 수 있다. 방사능-표지 치료 항체는 일반적으로 질병/작용제의 크기 및/또는 위치를 결정하는 것이 중요한, 암 및 일부 감염성 질환과 같은 질병을 관찰하기 위하여, 예를 들면, 임의의 2차 전이의 존재 및/또는 위치를 확인하기 위하여 사용된다. 반응 실패 (1차 또는 2차) 현상의 발생이 통지되지 않은 경우, 환자는 '모두 없음'이 즉, 종종 매우 발생되고 가능한 탁월한 상태에서, 질병의 치료 중단 및 늦은 재발을 야기할 수 있는, 음성 오류 결과가 주어질 수도 있다.
반응 실패의 추가적 카테고리는 부작용과 관련된 반응 실패 현상 (예를 들면, 2차)이다. 피검체 내의 숙주-면역 반응의 현상은 해롭거나 불쾌한 부작용에 의해 동반될 수 있다. 이는 다른 숙주 면역글로불린과 구별하지 못하는 인간 또는 인간화 치료제를 인식하는 항체의 발전에 의해 야기될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 치료제에 선천적 또는 이미-발전된 면역 반응을 가지는 피검체, 예를 들면 반응 실패와 관련된 부작용에 노출된 피검체를 확인하기에 적합하다.
본 발명의 방법은 환자에 모노클로날 치료제의 투여를 포함하는 치료 요법의 선별 및 조절에 적합하다. 따라서, 본 명세서에 기술된 치료 항체의 농도 또는 생체이용가능성을 측정하기 위한 방법은 질병 또는 장애의 치료 방법과 통합될 수 있다. 치료학적 치료 과정 동안 본 발명의 방법을 사용하는 환자의 면역학적 상태를 관찰함으로써, 치료제의 선택 및/또는 투여는 고가의 치료제의 비용-효과적인 사용과 함께, 환자에게 최대한의 치료학적 이점을 제공할 수 있도록 조절될 수 있다.
본 발명의 방법은 환자가 변경된 치료제 (예를 들면, 치료 항체)의 투여 요법 또는 대체적인 약제학적 치료요법을 요구하는지 여부를 측정하기 위하여 사용될 수도 있다.
본 발명의 방법은 환자 내의 치료제 (예를 들면, 치료 항체)의 혈청 농도 또는 생체이용가능성의 주기적 평가를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 환자가 치료 항체와 같은 치료제에 면역 반응을 진행하는지 여부를 측정하는 것을 제공한다.
본 발명은 또한 환자 내의 치료 반응의 결함이 예를 들면, 항-TNFα 항체와 같은 치료 항체에 대한 환자-유도된 면역글로불린의 형성으로 인한 것인지 여부를 측정하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 치료 항체로 치료가능한 질병으로부터 고생하고 있는 환자에게 적당한 약물 치료를 선별하기 위한 방법을 추가로 제공한다. .
본 발명은 또한 환자가 치료 항체에 2차 반응 실패로 발전될 가능성이 있는지 여부를 측정하기 위한 예후적 방법을 제공한다.
VII . 실시예
본 발명은 특정의 실시예에 의해 더욱 상세히 기술될 것이다. 하기의 실시예들은 예시적인 목적으로 제공된 것일 뿐, 본 발명을 임의의 방법으로 제한하려는 의도는 아니다. 본 기술분야의 당업자들은 필수적으로 동일한 결과를 산출하기 위하여 변경하거나 변화될 수 있는 중요하지 않은 다양한 파라미터를 용이하게 인식하고 있을 것이다.
실시예 1: 항- TNF α 생물학적 제제의 수준을 측정하기 위한 신규한 이동성 검정법.
본 실시예는 형광 표지된 TNFα에 대한 항-TNFα 약물의 결합을 측정하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 환자 샘플 (예를 들면, 혈정) 내의 항-TNFα 약물 농도를 측정하기 위한 신규한 균일 검정법을 예시한다. 본 검정법은 세척 단계의 필요성을 제거하고, 백그라운드 및 혈청 방해 문제를 감소시키고, 형광 표지 검출의 높은 민감도로 인해 낮은 역가를 사용하여 환자 내의 항-TNFα 약물 검출 능력을 낮은 증가시키는 가시광선 및/또는 형광 스펙트럼 상의 검출을 가능하게 하는 형광물질을 사용하고, 그리고 액체 상 반응으로 발생함으로써, ELISA 플레이트와 같은 고체 표면에 부착하는 것에 의한 에피토프 내의 임의의 변화 가능성을 경감시키는 이점을 가진다.
일 예시적인 구현예에서, TNFα는 형광물질 (예를 들면, Alexa647)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두 상에 검출될 수 있다. 상기 표지된 TNFα는 액체 상 반응에서 인간 혈청과 인큐베이션됨으로써 혈청내 존재하는 항-TNFα 약물과 결합한다. 상기 표지된 TNFα는 또한 표준 곡선을 형성하기 위하여 액체 상 반응으로 항-TNFα 약물의 공지된 양과 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼상에 직접 로딩된다. 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα의 결합은 표지된 TNFα 단독의 경우와 비교해 볼 때 피크가 왼쪽으로 이동된다. 혈청 샘플 내에 존재하는 항-TNFα 약물의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다.
도 1은 본 발명의 검정법의 예를 나타내는 것으로, 여기서 크기 배제 HPLC은 TNFα-Alexa647와 HUMIRA™ (아달리무마브)의 결합을 검출하기 위하여 사용된다. 도 1에 나타낸 바와 같이, HUMIRA™와 TNFα-Alexa647의 결합은 TNFα-Alexa647 피크를 왼쪽으로 이동시켰다.
도 2는 TNFα-Alexa647에 결합하는 HUMIRA™의 반응 곡선을 나타낸다. 특히, 도 2A는 HUMIRA™가 크기 배제 크로마토그래피 검정법에서 TNFα-Alexa647의 이동을 용량-의존적으로 증가시킴을 나타낸다. 도 2B는 1% 인간 혈청의 존재가 크기 배제 크로마토그래피 검정법에서 TNFα-Alexa647의 이동에 유의적으로 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 도 2C는 풀링된 RF-양성 혈청의 존재가 크기 배제 크로마토그래피 검정법에서 TNFα-Alexa647의 이동에 유의적으로 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
이와 같이, 본 실시예는: (1) 적절한 약물 투여량의 측정을 안내하기 위하여; (2) 약물동력학을 평가하기 위하여, 예를 들면 상기 약물이 신체로부터 빨리 제거되는지 여부를 측정하기 위하여; 그리고 (3) 치료 결정, 예를 들면 현재 항-TNFα 약물을 다른 TNFα 억제인자 또는 다른 유형의 치료요법으로 교체해야 하는지 여부를 안내하기 위하여, HUMIRA™와 같은 항-TNFα 약물을 받고 있는 환자를 관찰함에 있어서, 본 발명의 유용성을 입증한다.
실시예 2: HACA 및 HAHA 수준을 측정하기 위한 신규한 이동성 검정법.
본 실시예는 형광으로 표지된 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 결합을 검출하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 환자 샘플 (예를 들면, 혈청) 내의 자가항체 (예를 들면, HACA 및/또는 HAHA)의 농도를 측정하기 위한 신규한 동종 검정법을 예시한다. 본 검정법은 낮은 친화도 HACA 및 HAHA를 제거하는 세척 단계의 필요성을 제거하고, 백그라운드 및 혈청 방해 문제를 감소시키고 형광 표지 검출의 높은 민감도로 인한 낮은 역가를 사용하여 환자 내의 HACA 및 HAHA 검출 능력을 증가시키는 가시광선 및/또는 형광 스펙트럼 상의 검출을 가능하게 하는 형광물질을 사용하고, 그리고 액체 상 반응으로 발생시킴으로써, ELISA 플레이트와 같은 고체 표면에 부착하는 것에 의한 에피토프 내의 임의의 변화의 가능성을 감소시키기 때문에 유리하다.
TNFα 억제인자에 대해 발생되는 자가항체 (예를 들면, HACA, HAHA, 등)을 측정하는 임상적 실용성은 HACA가 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 10 mg/kg 인플릭시마브로 치료 받은 류마티스 관절염 환자의 53%, 21 %, 및 7%에서 검출된다는 사실에 의해 입증된다. 인플릭시마브가 메토트렉세이트와 조합되는 경우, 항체의 발생은 15%, 7%, 및 0% 이하로, 병용투여된 면역억제 치료요법이 항-약물 반응을 낮추는데 효과적임을 나타내지만, 또한 항-TNFα 약물의 높은 용량이 내성을 야기할 수 있음을 나타낸다. 크론병에서, 더 높은 발생이 보고었고; 5번째 융합 이후에, 환자의 61 %가 HACA를 가졌다. 임상적 반응은 HACA가 존재할 때 단축되었다. 문헌 [Rutgeerts, N. Engl. J. Med. , 348:601 -608 (2003)] 참고. 155명의 환자에서 2005년부터 2008년까지 3년 동안에 걸쳐 측정된 인플릭시마브 및 HACA의 소급 연구는, HACA가 염증성 장 질환을 갖는 환자의 22.6% (N = 35)에서 관찰되었음을 나타낸다. 문헌 ["Clinical Utility of Measuring Infliximab and Human Anti-Chimeric Antibody Levels in Patients with Inflammatory Bowel Disease"]; 및 논문 [Digestive Disease Week; May 30-June 3, 2009; Chicago, IL] 참고. 상기 저자들은 임상적인 증상 만을 기초로 한 치료의 변경은 부적절한 조절을 야기할 수도 있다는 결론을 내렸다.
본 발명의 방법은 항-TNFα 약물의 방해 없이 (예를 들면, 가교 검정법에 의한 HACA의 측정은 항-TNFα 약물의 트로프 수준에서 수행되어야 한다), 및 항체의 다원자가에 의존함이 없이 (예를 들면, IgG4 항체는 이특이적이고 동일 항원과 가교-결합할 수 없기 때문에, IgG4 항체는 가교 검정법을 사용하여 검출될 수 없다), ELISA 플레이트에서의 비-특이적 결합 및 고체 상 방해 없이 HACA와 같은 자가항체의 농도를 측정할 수 있기 때문에, 동종 이동성 검정법은 환자 샘플 내의 자가항체 (예를 들면, HACA 및/또는 HAHA) 농도를 측정하기 위해 도 3에 나타낸 가교 검정법과 같이 현재 사용되는 방법 이상의 이점을 가진다. 이과 같이, 본 발명은 하기와 같이 현재의 방법 이상의 이점을 가진다: 고체 표면에 항원의 부착을 피할 수 있고 (변형을 피할 수 있다); IgG4 효과를 제거할 수 있고; 치료 항체 트로프 문제를 극복할 수 있고; 약한 친화도를 갖는 항체를 검출할 수 있고; 무관한 IgG로의 비-특이적 결합을 제거할 수 있고; 그리고 검출 민감도 및 특이도를 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 항-TNFα 약물 (예를 들면, REMICADE™)은 형광물질 (예를 들면, Alexa647)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두 상에 검출될 수 있다. 상기 표지된 항-TNFα 약물은 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이션됨으로써 혈청 내에 존재하는 HACA 및 HAHA과 결합한다. 상기 표지된 항-TNFα 약물은 또한 표준 곡선을 생성하기 위하여 액체 상 반응으로 항-IgG 항체의 공지된 양과 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼 상에 직접 로딩된다. 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 결합은 표지된 약물 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다. 혈청 샘플 내에 존재하는 HACA 및 HAHA의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다. 도 4는 REMICADE™에 의해 발생된 HACA/HAHA의 농도를 측정하기 위한 본 발명의 자가항체 검출 검정법의 예시적인 개요를 나타낸다. 특정 예에서, 높은 HACA/HAHA 수준은 REMICADE™를 사용하는 현재 치료요법이 HUMIRA™와 같은 다른 항-TNFα 약물로 교체되어야 함을 나타낸다.
이 검정법의 원리는 복합체의 분자량의 증가로 인한 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 상의 유리 Alexa647-표지된 REMICADE™에 대한 항체 결합된 Alexa647-표지된 REMICADE™ 복합체의 이동성을 기반으로 한다.
본 실시예에서 크로마토그래피는 650 nm에서 UV 검출을 사용하는 분자량 분획 범위 5,000 - 700,000 및 이동상 1X PBS, 7.4 pH, 유속 0.5 mL/min을 갖는 Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼 (Phenomenex)을 사용하여, Agilent-1200 HPLC System 상에서 수행되었다. Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼을 사용하는 Agilent-1200 HPLC System의 앞에, BioSep 75x7.8 mm SEC-3000인 분석적 사전-컬럼이 있다. 100 ㎕샘플 부피가 각각의 분석을 위해 컬럼 상에 로딩된다.
항체 결합 Alexa647-표지된 REMICADE™ 복합체는 SE-HPLC 분석 전에 1시간 동안 실온에서 1X PBS, pH 7.3 용출 완충액에서 항체 및 Alexa647-표지된 REMICADE™의 공지의 양과 인큐베이션함으로써 형성된다.
도 5는 본 발명의 크기 배제 크로마토그래피 검정법을 사용하여 검출된, REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-인간 IgG 항체의 용량 반응 분석을 나타낸다. 항-IgG 항체와 REMICADE™-Alexa647의 결합은 REMICADE™-Alexa647 피크를 왼쪽으로 이동시켰다. 도 6은 본 발명의 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 검출된, REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-인간 IgG 항체의 제2 용량 반응 분석을 나타낸다. 항-IgG 항체의 양이 많을수록 항-IgG/REMICADE™-Alexa647 복합체의 형성이 용량-의존적으로 증가됨으로써, REMICADE™-Alexa647 피크를 왼쪽으로 이동시켰다. 도 7은 REMICADE™-Alexa647에 결합하는 항-IgG 항체의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 8은 100㎕의 양으로 주입된 샘플을 본 발명의 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분석한, 보통 인간 혈청 및 HACA 양성 혈청 내의 REMICADE™-Alexa647 면역복합체 형성을 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 환자 샘플내 존재하는 HACA와 REMICADE™-Alexa647의 결합은 REMICADE™-Alexa647 피크를 왼쪽으로 이동시켰다. 이와 같이, 본 발명의 크기 배제 크로마토그래피 검정법은 특히, REMICADE™의 존재시 HACA를 측정하기 때문에, 환자가 치료요법을 받고 있는 동안에도 이용될 수 있고, 약하고 강한 HACA 결합을 측정할 수 있고, 혼합 및 용이한 이동성 검정법으로서 HACA 및 REMICADE™와 평형을 이루기 위해 표지된 REMICADE™을 사용하는 다른 접근법으로 확장될 수 있기 때문에 유리하다.
도 9는 본 발명의 가교 검정법 또는 이동성 검정법을 사용하여 수행된 20명의 환자 혈청 샘플로부터의 HACA 측정 요약을 제공한다. 이 비교분석법은 가교 검정법을 사용하여 측정된 HACA에 음성적인 3개의 샘플이 본 발명의 이동상 검정법을 사용하여 특정될 때에는 HACA에 양성적이기 때문에 현재 방법 이상의 증가된 민감도를 갖는다 (특허 # SK07070305, SK07070595, 및 SK07110035 참조)
이와 같이, 본 실시예는 약물에 대한 자가항체 (예를 들면, HACA 및/또는 HAHA)의 존재 또는 수준을 검출하기 위하여 항-TNFα 약물 (예를 들면, REMICADE™)을 받고 있는 환자를 관찰함에 있어서, 그러한 면역 반응이 약물 치료를 불가능하게 하는 항-TNFα 약물의 고민감성 반응 및 약물동역학 및 생체분포 내의 급진적인 변화와 관련될 수 있기 때문에, 본 발명의 유용성을 입증한다.
결론적으로, 실시예 1 및 2는 TNFα 및 항-TNFα 항체가 Alexa647로 유효하게 표지될 수 있음을 입증한다. 표지된 TNFα-Alexa647가 항-TNFα 항체와 인큐베이션 되면, 표지된 TNFα/항-TNFα 약물 복합체의 체류 시간은 이동되기 때문에, 상기 이동을 야기하는 항-TNFα 약물의 양은 HPLC로 정량화될 수 있다. 또한, 표지된 항-TNFα 약물이 항-인간 IgG 항체와 인큐베이션될 때, 표지된 항-TNFα 약물/항-IgG 항체 복합체의 체류 시간은 이동되기 때문에, 상기 이동을 야기하는 항-IgG 항체의 양은 HPLC로 정량화될 수 있다. 또한, 상기 검정법 시스템 내의 낮은 혈청 함량은 HPLC 분석에 조금 영향을 미치는 것으로 나타났다. 마지막으로, 표준 곡선은 항-TNFα 약물 및 HACA/HAHA 검정법에 의해 생성될 수 있고, 환자 혈청 항-TNFα 약물 또는 HACA/HAHA 수준을 정량화하기 위하여 사용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 특정 측면에서, 약물 및 약물에 대한 항체를 측정하기 위하여 개발된 균질혼합측정법과 같은 이동성 검정법을 제공한다. 표준 곡선은 항-TNFα 생물학적 제제 REMICADE™ 및 HUMIRA, 또한 REMICADE™에 대한 HACA 항체에 대해 생성된다. ELISA와 달리, 이동성 검정법 형태는 고체 표면에 항체가 코팅되지 않고, 무관한 IgG의 비-특이적 결합에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 검정법 형태는 단순하고, 매우 민감도가 높으며 또한 환자 혈청 내의 모든 항-TNFα 생물학적 제제 (예를 들면, REMICAD™, HUMIRA, Enbrel 및 Cimzia) 뿐만 아니라 중성화 항체 (항-REMICADE™)를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 3: 신규한 이동성 검정법을 사용하여 환자 혈청 내의 인간 항- 키메라 항체 ( HACA ) 및 인플릭시마브 ( IFX ) 수준의 측정.
요약
배경: 인플릭시마브 (IFX)는 류마티스 관절염 (RA) 및 염증성 장 질환 (IBD)과 같은 자가면역 질환을 치료함에 있어서 유효성을 나타내는 TNFα에 대한 키메라 모노클로날 항체 치료제이다. 그러나, IFX에 대한 항체는 약물의 효능을 감소시키고 부작용을 유도할 수도 있는, 인간 항-키메라 항체 (HACA)의 검출 동안 일부 IFX-치료 환자에서 발견된다. 각각의 환자 내의 HACA 및 IFX 수준의 관찰은 IFX로의 투여와 치료를 최적화하는데 도움을 줄 수도 있다. HACA를 검출하기 위한 현재의 방법들은 고체-상 검정법을 기반으로 하는 것으로, 순환시 IFX의 존재는 HACA의 존재를 숨길 수 있으므로, 측정이 IFX의 투여 이후의 적어도 8주 내에 수행되어야만 하다는 제한이 있다. 더욱이, 상기 시간-경과는 혈액 순환시 높은 분자량 면역 복합체의 빠른 제거로 인해 검정을 혼란스럽게 한다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 IFX로 치료받은 환자 내의 혈청 IFX 및 HACA의 수준을 측정하기 위한 신규한 방법을 개발하고 이를 평가하였다.
방법: 신규한, 비-방사성 표지된, 액체-상, 크기-배제 (SE)-HPLC 이동성 검정법이 IFX로 치료받은 환자로부터의 혈청 내의 HACA 및 IFX 수준을 측정하기 위하여 개발되었다. 상기 면역-복합체 (예를 들면, TNFα/IFX 또는 IFX/HACA), 유리 TNFα 또는 IFX, 및 결합/유리 비율이 결정될 수 있고, 높은 민감도로 산출될 수 있다. IFX 또는 HACA의 혈청 농도는 다른 농도의 IFX 또는 풀링된 HACA-양성 혈청과 인큐베이션하여 생성된 표준 곡선으로 측정된다. 이 신규한 검정법을 사용하여, 본 발명자들은 IFX로 치료받는 IBD 재발 환자로부터 수거된 혈청 내의 IFX 및 HACA를 측정하고, 통상적인 가교 ELISA 검정법에 의해 얻어진 결과와 비교하였다.
결과: 용량-반응 곡선이 높은 민감도를 가지며 신규한 검정법으로부터 생성되었다. HACA의 검출은 과량의 IFX의 존재시 입증되었다. IFX로 치료받은 환자로부터의 117개의 혈청 샘플 중에서, 65개의 샘플이 검출 한계 이상의 IFX 수준을 갖는 것으로 발견되었고, 상기 평균은 11.0+6.9 mg/mL이었다. HACA 수준의 경우, 33 (28.2%)개의 샘플에서 양성으로 발견된 반면, 가교 ELISA 검정법에 의해서는 단지 24개의 샘플에서 양성이 발견되었다. 본 발명자들은 또한 가교 검정법에 의해 측정된 샘플로부터 9개의 양성 오류 및 9개의 음성 오류를 확인하였다. HACA 수준은 IFX 치료 과정 동안 11명의 환자에서 증가된 것으로 확인된 반면, IFX 수준은 유의적으로 감소된 것으로 확인되었다.
결론: 신규한 비-방사능 표지, 액체-상, 이동성 검정법은 IFX로 치료받은 환자로부터의 혈청 내의 IFX 및 HACA 수준을 측정하기 위해 개발되었다. 본 검정법은 높은 민감도 및 정확도를 가질 뿐만 아니라, 동일한 결과의 재현이 가능하다. 본 신규한 검정법은 유리하게도 환자가 치료요법을 받고 있는 동안 HACA 및 IFX 수준을 측정하기 위하여 사용될 수 있다.
도입
종양 괴사 인자-알파 (TNFα)는 크론병 (CD) 및 류마티스 관절염 (RA)과 같은 자가면역 질환의 발병에 중추적인 역할을 한다. 인플릭시마브 (인간-무린 키메라 치료학적 IgGκ) 또는 아달리무마브 (전체 인간 모노클로날 항체)와 같은 치료 항체로 TNFα를 차단하는 것은 CD 및 RA 내의 질병 활성을 감소시키는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 약 30-40%의 환자들은 항-TNFα 치료요법에 반응하지 않으며, 일부 환자들은 충분한 반응의 결핍으로 인해 더 높은 용량 또는 투여 빈도 조절이 요구된다. 각각의 환자 내의 약물 생체이용가능성 및 약물동역학의 차이는 치료의 실패에 기여할 수도 있다. 환자가 HACA/HAHA를 진행하도록 하는 약물의 면역원성은 보통의 쇼크에서부터 과민성 쇼크까지 범위의 불리한 반응을 야기할 수 있다. 이러한 문자는 현재 많은 연구자들, 약물-조절 기구, 건강 보험 기구, 및 제약 회사에 의해 인식되고 있다. 또한, 하나의 항-TNFα 약물에 대한 2차 반응 실패를 갖는 많은 환자들은 다른 항-TNFα 약물로의 교체시 이점을 가지므로, 이는 치료에 사용되는 단백질에 대한 특이적으로 검출되는 중성화 항체의 역할을 제시한다 (문헌 [Radstake et ah , Ann. Rheum. Dis. , 68(1 1 ): 1739-45 (2009)] 참고). 환자 내의 약물 및 HACA/HAHA 수준의 관찰은 따라서 약물 투여가 개개의 환자에 따라 조절될 수 있고, 연장된 치료요법이 환자에 대한 거의 아무런 위험 없이 효과적이고 경제적으로 제공될 수 있도록 한다 (문헌 [Bendtzen et ah, Scand. J. Gastroenterol. , 44(7):774-81 (2009)] 참고).
다수의 효소-결합 면역검정법이 약물 및 HACA/HAHA의 순환 수준을 평가하기 위하여 사용되어 왔다. 도 10은 본 발명의 신규한 HACA 검정법과 HACA의 측정에서 이용가능한 현재의 검정법의 비교한 요약을 제공한다. 현재 방법의 제한 중 하나는 항체 수준이 순환시 약물의 측정가능한 양으로 존재하는 경우, 측정되기 어렵다는 점에 있다. 측정이 IFX의 투여 이후 적어도 8주 이내에 수행되어야 하는 HACA을 검출하기 위한 현재의 고체-상 방법과 반대로, 본 발명의 신규한 검정법은 비-방사능표지된, 액체-상, 크기-배제 (SE)-HPLC 검정법으로 IFX로 치료받는 동안에도 환자로부터 혈청 내의 HACA 및 IFX 수준을 측정할 수 있다.
하기는 환자 내의 항-TNF 생물학적 약물 및 TNFα 생물학적 약물에 대한 항체의 혈청 농도를 측정하기 위한 근거를 나타낸다; (1) 임상적 시도에서 PK 연구를 위한 것이다; (2) 생물학적 약물에 대한 환자의 면역 반응을 관찰할 수 있도록 임상적 시도 동안 FDA에 의해 요구될 수도 있다; (3) 각각의 환자를 위해 약물 투여를 안내할 수 있도록 HACA 또는 HAHA를 측정하는 것에 의해 생물학적 약물에 대한 환자의 반응을 관찰하기 위한 것이다; 및 (4) 초기 약물 실패시 다른 생물학적 약물로 교체하기 위한 안내로 사용하기 위한 것이다. .
방법
환자 혈청 내의 인플릭시마브 (IFX) 수준의 SE-HPLC 분석. 인간 재조합 TNFα를 제조사의 사용지시에 따라 형광물질 ("Fl", 예를 들면, Alexa Fluor® 488)로 표지하였다. 표지된 TNFα를 다른 양의 IFX 또는 환자 혈청과 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션 하였다. 100㎕ 부피의 샘플들을 HPLC 시스템 상에서 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. FLD을 사용함으로써, 유리 TNFα-Fl 및 결합 TNFα-Fl 면역-복합체를, 그들의 체류 시간을 바탕으로 관찰하였다. 혈청 IFX 수준을 표준 곡선으로부터 계산하였다.
환자 혈청 내의 HACA 수준의 SE-HPLC 분석. 정제된 IFX를 Fl로 표지하였다. 표지된 IFX를 풀링된 HACA-양성 혈청의 다른 희석물 및 희석된 환자 혈청과 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션 하였다. 100㎕ 부피의 샘플을 HPLC 시스템 상의 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. FLD을 사용하여, 유리 IFX-F1 및 결합 IFX-F1 면역-복합체를 그들의 체류 시간을 바탕으로 관찰하였다. 결합 및 유리 IFX- Fl 비율을 사용하여 HACA 수준을 측정하였다.
혈청 내의 HACA를 측정하기 위한 이동상 검정법 과정. 본 검정법의 원리는 복합체의 분자량 증가로 인한, 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 상의 유리 Fl-표지된 IFX에 대한 HACA 결합 Fl-표지된 인플릭시마브 (IFX) 복합체의 이동성을 바탕으로 한다. 상기 크로마토그래피는 FLD 검출로, 분자량 분획 범위 5,000-700,000 및 이동상 1X PBS, pH 7.3, 유속 0.5 mL/min을 갖는 Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼 (Phenomenex)을 이용하는, Agilent-1200 HPLC System 상에서 수행된다. Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼을 갖는 Agilent-1200 HPLC System의 앞에, BioSep 75x7.8 mm SEC-3000인 분석적인 사전-컬럼이 존재한다. 100㎕의 샘플 부피는 각각의 분석을 위한 컬럼 상에 로딩된다. HACA 결합 Fl-표지된 IFX 복합체는 SE-HPLC 분석 전에 1X PBS, pH 7.3, 용출 완충액으로 IFX 치료받은 환자 및 Fl-표지된 IFX로부터의 혈청을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 것에 의해 형성된다.
결과
도 11은 고 분자량 복합체의 이동성으로 인한 유리 IFX-F1로부터 HACA 결합 IFX-F1 복합체의 분리를 나타낸다. 구획 c 및 d로부터 알 수 있듯이, 형광 피크의 체류 시간은 21.8 분에서부터 15.5-19.0 분으로 이동하였다. 더 많은 HACA가 반응 혼합물 내에 존재할수록, 더 적은 IFX-F1가 크로마토그램 내에 남아있고 더 많은 면역-복합체가 형성된다. 도 12는 HACA의 첨가에 의해 야기되는 형광 피크 이동의 용량-반응 곡선을 나타낸다. HACA 양성 샘플을 사용함으로써, 본 발명자들은 혈청의 1:1000 희석물로도 피크 이동을 검출할 수 있었다.
도 13은 고 분자량 복합체의 이동성으로 이한 유리 TNFα-Fl로부터 IFX 결합 TNFα-Fl 복합체의 분리를 나타낸다. 구획 c 및 d로부터 알 수 있듯이, 형광 피크의 체류 시간은 24 분에서부터 13-19.5 분으로 이동하였다. 더 많은 IFX가 반응 혼합물 내에 존재할수록, 적은 양의 유리 TNFα-Fl가 크로마토그램 내에 남아있고, 더 많은 양의 면역-복합체가 형성된다. 도 14는 IFX의 첨가에 의해 야기되는 TNFα-Fl 피크 이동의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 첨가된 IFX를 바탕으로, 검출 한계는 혈청 내의 IFX의 10 ng/mL이다.
본 발명의 신규한 이동상 검정법은 가교 검정법 (표 2)에 의해 측정된 HACA 양성 및 음성 환자로부터의 혈청 샘플을 실험하는 것에 의해 입증되었다. 본 분석법을 사용함으로써, 본 발명자들은 50명의 건강한 피검체 및 IFX로 치료받는 117명의 IBD 환자로부터의 혈청 샘플을 분석하였다. 50명의 건강한 피검체는 모두 검출 한계 이하의 IFX 수준을 가졌으나, 환자 샘플 중 65개는 평균 IFX 농도 11.0 μg/ml를 가졌다. 표 3은 가교 검정법 및 이동상 검정법에 의해 측정된 건강한 대조군 및 IFX로 치료받는 IBD 환자의 혈청 내의 HACA 수준을 나타낸다. 가교 검정법은 이동상 검정법 보다 HACA-양성 환자가 덜 검출되었으며, 더 많은 음성 오류뿐만 아니라 더 많은 양성 오류가 검출되었다.
표 2. 가교 검정법상의 강한 양성 및 음성과 SE - HPLC 검정법의 환자 혈청 내의 상대적인 HACA 수준의 상호관계
Figure 112012042313099-pct00013
표 3. 가교 검정법 ( 컷 오프 1.69 μg/ ml ) 및 HPLC 이동 검정법 ( 컷 오프 0.19, 결합 및 유리 IFX 비율)로 HACA 의 혈청 수준 상의 환자 샘플 분석
Figure 112012042313099-pct00014
음성 오류 결과는 HACA 측정 상의 가교 검정법을 방해하는 높은 수준의 IFX를 함유하는 환자 혈청으로부터 야기되는 반면, SE-HPLC 검정법은 영향받지 않는다. 양성 오류 결과는 가교 검정법을 방해할 수도 있는 높은 수준의 비-특이적 방해 물질을 함유하는 환자 혈청에 의해 야기된다.
도 15는 IFX 치료 과정 동안 IBD 환자 내의 HACA 수준과 IFX 농도의 관계를 나타낸다. HACA는 V 10 (30 주) 만큼 빨리 검출될 수 있고, IFX 치료 동안 일부 환자에서 지속적으로 증가될 수 있다. 도 16은 HACA가 본 발명의 검출법을 사용하여 IFX의 존재시 검출될 수 있음을 나타낸다. 혈청 내의 HACA의 더 높은 수준은 검출될 수 있는 IFX의 낮은 수준 (예를 들면, 생체이용성의 감소)와 관련된다. 이와 같이, IFX로 치료 동안 HACA의 초기 검출은 다른 의사 및/또는 환자에게 다른 항-TNF 약물로 교체하거나 또는 IFX의 용량을 증가시킬 것을 안내할 수 있다.
결론
항-TNFα 생물학적 약물은 형광물질 ("Fl")로 용이하게 표지될 수 있고, HACA/HAHA를 측정하기 위해 사용되는 이동성 검정법 형태는 통상적인 ELISA에서 고체 표지상에 항원 코팅 및 다수의 세척 및 인큐베이션 단계를 없앤 동종 검정법이다. Fl-표지된 IFX와 HACA-양성 혈청의 인큐베이션은 SE-HPLC 내의 유리 Fl-표지된 IFX이 비해 다른 위치에서 용출되는 면역 복합체를 형성하므로, HACA의 양은 정량화될 수 있다. 다른 혈청 성분의 존재는 이동상 검정법에 거의 영향을 미치지 않는다. ELISA와 달리, 상기 이동성 검정법 형태는 무관한 IgG의 비-특이적 결합에 의해 영향받지 않고 IgG4 동종형을 검출한다. 건강한 혈청 샘플은 Fl-표지된 IFX의 이동을 야기하지 않으며, IFX로 치료받은 환자의 28.2%가 본 발명의 검정법에 의해 HACA를 갖는 것으로 발견되었다. 이와 같이, 본 명세서에 기술된 검정법 형태는 매우 민감하고 환자 혈청 내의 모든 생물학적 약물 HACA (예를 들면, REMICADE™, HUMIRA, Enbrel 및 Cimzia) 뿐만 아니라 그들의 항체 (예를 들면, 항-REMICADE™, 항-HUMIRA, 항-Enbrel 및 항-Cimzia)을 검출하기 위하여 적용될 수 있다. 놀랍게도, HACA는 본 발명의 이동성 검정법을 사용하여 IFX의 존재시 검출될 수 있기 때문에, IFX 치료 동안 HACA의 초기 검출은 의사 및/또는 환자에게 다른 항-TNF 약물로 교체하거나 IFX의 후속 용량을 증가시킬 것을 안내할 수 있다.
본 발명자는 IFX로 치료받는 환자로부터 수득된 혈청 샘플 내의 IFX 및 HACA 수준을 측정하기 위하여 비-방사능 표지된, 액체-상, SE-HPLC 검정법을 개발하였다. 본 신규한 검정법은 높은 민감도, 정확성, 및 정밀도를 가지며, 높은 재현가능성을 가지는 것으로, 본 검정법은 다수의 인간 혈청 샘플의 일반적인 실험에 적합하다. ELISA와 달리, 새로운 검정법 형태는 항원을 고체 표면에 코팅하지 않고 무관한 IgG의 비-특이적 결합에 의해 영향받지 않는다. 본 명세서에 기술된 검정법 형태의 이러한 이점은 실험의 양성 오류 및 음성 오류 결과를 감소시킨다. 유리하게는, 본 발명의 검정법 형태는 매우 민감하므로, 환자가 치료받는 동안 혈청 내에 존재하는 모든 생물학적 약물뿐만 아니라 그들의 항체를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 4. 신규한 이동상 검정법을 이용한 중성 및 비-중성 인간 항- 키메라 항체 ( HACA )의 차이.
본 실시예는 형광으로 표지된 TNFα 내에 존재하는 형광으로 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 결합을 검출하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 환자 샘플 (예를 들면, 혈청) 내의 자가항체 (예를 들면, HACA)를 측정하고 그러한 자가항체가 중성 또는 비-중성 자가항체인지 여부를 확인하기 위한 신규한 동종 검정법을 예시한다. 본 검정법은 낮은 친화도 HACA를 제거하는 세척 단계의 필요성을 제거하고, 백그라운드 및 혈청 방해 문제를 감소시키는 가시광선 및/또는 형광 스펙트럼으로 검출을 가능하게 하는 별개의 형광물질을 사용하고, 형광 표지 검출의 높은 민감도로 인한 낮은 역가를 사용하여 환자 내의 중성 또는 비-중성 HACA를 검출 능력을 증가시키고, 그리고 액체 상 반응을 발생시킴으로써, ELISA 플레이트와 같은 고체 표면에 부착되는 것에 의한 에피토트 내의 임의의 변화 가능성을 줄이는 이점을 가진다.
일 예시적인 구현예에서, 항-TNFα 약물 (예를 들면, REMICADE™)은 형광물질 "Fl " (예를 들면, 도 17A 참고)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 뿐만 아니라 형광 스펙트럼 또는 상기 모두 상에서 검출될 수 있다. 마찬가지로, TNFα는 형광물질 "F2" (예를 들면, 도 17A 참고)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 뿐만 아니라 형광 스펙트럼 또는 상기 모두 상에 검출될 수 있고, 그리고 여기서 "Fl" 및 "F2"는 다른 형광물질이다. 상기 표지된 항-TNFα 약물은 액체 상 반응에서 인간 혈청과 인큐베이션되고, 상기 표지된 TNFα는 상기 반응에 첨가됨으로써 혈청 내에 존재하는 표지된 항-TNFα 약물, 표지된 TNFα, 및/또는 HACA의 복합체 (즉, 면역-복합체)를 형성한다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 크로마토그래피 상에 바로 로딩된다. 표지된 항-TNFα 약물로의 자가항체 (예를 들면, HACA) 및 표지된 TNFα의 결합은 자가항체와 표지된 항-TNFα 약물 (예를 들면, 도 17A 내의 "면역-복합체 2")의 이성분 복합체의 경우와 비교할 때, 표지된 약물 단독의 경우와 비교할 때, 또는 표지된 TNFα 단독의 경우와 비교할 때, 피크 (예를 들면, 도 17A 내의 "면역-복합체 1")를 왼쪽으로 이동시킨다. 자가항체 (예를 들면, HACA), 표지된 TNFα, 및 표지된 항-TNFα 약물의 삼성분 복합체의 존재는 자가항체가 항-TNFα 약물 및 TNFα의 결합을 방해하지 않도록, 혈청 샘플 내에 존재하는 자가항체가 자가항체 (예를 들면, HACA)의 비-중성 형태임을 나타낸다. 특정 구현예에서, 도 17A 에 나타낸 바와 같이, 비-중성 HACA가 혈청 내에 존재하지 않으면, Fl-REMICADE™ 및 F2-TNFα에서 이동이 관찰되므로, 이로 인해 면역-복합체 1 및 면역-복합체 2 피크는 증가되고 유리 Fl-REMICADE™ 및 유리 F2-TNFα 피크는 감소된다. 그러나, 자가항체 (예를 들면, HACA), 표지된 TNFα, 및 표지된 항-TNFα 약물의 삼성분 복합체의 부재시 자가항체 (예를 들면, HACA) 및 표지된 항-TNFα 약물의 이성분 복합체 (예를 들면, 도 17B 내의 "면역-복합체 2")의 존재는 자가항체가 항-TNFα 약물과 TNFα 사이의 결합을 방해하지 않도록, 혈청 샘플 내에 존재하는 자가항체는 자가항체 (예를 들면, HACA)의 중성 형태임을 나타낸다. 일 특정의 구현예에서, 도 17B에 나타낸 바와 같이, 중성 HACA가 혈청 내에 존재하면, Fl-REMICADE™에서 이동이 관찰되므로, 면역-복합체 2 피크는 증가되고, 유리 면역-복합체 2 피크는 감소되며 유리 F2-TNFα 피크는 변화하지 않는다. 특정 예에서, 중성 HACA의 존재는 REMICADE™에 의한 현재 치료요법이 HUMIRA™와 같은 다른 항-TNFα 약물로 교체되어야 함을 나타낸다.
대체적인 구현예에서, 표지된 항-TNFα 약물는 우선 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이셤 됨으로써 혈정 내에 존재하는 표지된 항-TNFα 약물과 HACA의 복합체 (즉, 면역-복합체)를 형성한다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기-배제 컬럼으로 직접 로딩된다. 표지된 항-TNFα 약물과의 자가항체 (예를 들면, HACA)의 결합은 표지된 약물 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다 (예를 들면, 도 18 내의 "면역-복합체 2" 참고). 그 다음 표지된 TNFα이 상기 반응에 첨가됨으로써 그것이 표지된 항-TNFα 약물에 결합하기 위한 자가항체 (예를 들면, HACA)를 대신하는 (예를 들면, 상기와 경쟁하는) 것에 의해, 표지된 항-TNFα 약물과 표지된 TNFα 사이의 복합체 형성이 가능한지 여부가 측정된다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 제2 크기 배제 컬럼 상에 직접 로딩된다. 표지된 TNFα과 표지된 항-TNFα 약물의 결합은 표지된 TNFα 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다 (예를 들면, 도 18 내의 "면역-복합체 3"). 표지된 TNFα에 의한 자가항체 (예를 들면, HACA) 및 표지된 항-TNFα 약물 사이의 결합 방해는 자가항체가 항-TNFα 약물과 TNFα 사이의 결합을 방해하지 않도록, 혈청 샘플 내에 존재하는 자가항체가 자가항체 (예를 들면, HACA)의 중성 형태임을 나타낸다. 특정 예에서, 중성 HACA의 존재는 현재 REMICADE™에 의한 치료요법이 HUMIRA™와 같은 다른 항-TNFα 약물로 교체되어야 함을 나타낸다.
실시예 5. 신규한 동종 이동성 검정법으로 환자 혈청 내의 아달리무마브에 대한 인간 항-약물 항체 ( ADA )의 분석
배경 및 목적: 인플릭시마브 (IFX), 아달리무마브 (HUMIRA™), 및 세프토리주마브와 같은 TNF-α에 대한 치료 항체는 염증성 장 질환 (IBD) 및 다른 염증성 장애를 치료함에 있어서 유효한 것으로 나타나 있다. 항-약물 항체 (ADA)는 약물의 효능을 감소시킬 수도 있으며 및/또는 부작용을 유도할 수도 있다. 그러나, ADA는 키메라 항체 인플릭시마브로 치료받은 환자 내에서 뿐만 아니라, 인간화 항체 아달리무마브로 치료받은 환자 내에서도 발견되었다. 개별적인 환자 내의 ADA 및 약물 수준을 관찰하는 것은 환자의 치료 및 투여량을 최적화함에 있어서 도움을 줄 수도 있다. 본 발명자는 환자로부터 HACA (인간 항-키메라 항체) 뿐만 아니라 IFX의 혈청 내에서 정확한 측정을 위한 비-방사능 표지된 액체-상 동종 이동상 검정법을 개발하였다. 본 검정법 방법은 HACA 검출시 현재 고체-상 분석의 중요한 한계, 즉 순환에서 IFX 존재시 HACA 검출의 정확성 부족을 극복하였다. 본 연구에서, 본 발명자들은 인간화 항체 약물, 아달리무마브로 치료받은 환자 내의 혈청 ADA 및 약물 수준을 측정하기 위한 새로운 방법을 평가하였다.
방법: 본 이동성 검정법은 크기-배제 분리 상의 유리 항원에 대한 항원-항체 면역복합체의 체류 시간 내의의 이동을 바탕으로 한다. 형광물질-표지된 아달리무마브 또는 TNF-α 및 내부 컨트롤을 혈청 샘플과 혼합함으로써, ADA 또는 약물 존재시 유리 아달리무마브 및 TNF-α의 이동성을 측정하였다. 내부 컨트롤에 대한 유리 아달리무마브 또는 TNF-α의 비율에서의 변화를 항-인간 IgG 항체 또는 정제된 아달리무마브의 다른 농도로 인큐베이션 함으로써 생성된 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. 이동성 검정법을 사용함으로써, 본 발명자들은 반응성을 잃어버린 아달리무마브로 치료받은 IBD 환자로부터 수거된 혈청 내의 아달리무마브 및 ADA 수준을 측정하였다.
결과: 투여-반응 곡선이 표지된 아달리무마브의 이동성의 측정에서 항-인간 IgG 항체를 사용하여 생성되었다. 상기 검정법의 검출 한계는 항-인간 IgG의 1 ng이었다. 50명의 건강한 대조군으로부터의 혈청으로 ADA를 실험하였고, 모든 샘플은 검출 한계 이하의 ADA 수준을 가졌다 (즉, 표지된 유리-아달리무마브는 이동하지 않음). ADA의 검출은 또한 외부에서 첨가된 아달리무마브의 존재 하에 입증되었다. 아달리무마브로 치료받은 환자 내의 약물 농도를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 표지된 TNF-α의 이동성 상의 아달리무마브의 다른 양으로 표준 곡선을 생성하였고, 아달리무마브의 검출 한계는 10 ng이었다.
결론: 본 발명의 비-방사성 표지된 액체-상 동종 이동성 검출법은 아달리무마브로 치료받은 환자로부터의 혈청 샘플 내의 ADA 및 아달리무마브 수준을 측정하기 위해 적용되었다. 상기 검정법은 높은 민감도 및 정확도로 재현가능한 것으로 발견되었고, 아달리무마브로 치료받은 환자로부터의 혈청 샘플 내의 ADA 수준을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 6. 신규한 본 발명자 소유의 이동성 검정법을 사용하여 환자 혈청 내의 아달리무마브에 대한 항-약물 항체 ( ADA )의 분석
요약
배경: 인플릭시마브 (IFX) 및 아달리무마브 (ADL)와 같은 항-TNF-α 약물은 염증성 장 질환 (IBD)을 치료함에 있어서 유효한 것으로 나타나있다. 그러나, 치료된 환자 내의 ADA 유도는 약물 효능을 감소시킬 수도 있으며 및/또는 부작용을 유도할 수도 있다. 사실 ADA는 IFX로 치료받은 환자에서만 발견되는 것이 아니라, ADL로 치료받은 환자에서도 발견된다. 개별적인 환자 내의 ADA 및 약물 수준의 관찰은 환자의 치료 및 투여를 최적화함에 있어서 도움을 줄 수도 있다. 본 발명자들은 HACA (인간 항-키메라 항체) 뿐만 아니라 IFX-치료받은 환자로부터의 IFX 혈청 내에서 정확한 측정을 위한 본 발명자 소유의 이동성 검정법을 개발하였다. 본 검정법은 HACA를 검출하기 위한 현재의 고체-상 검정법의 주요한 한계, 즉 순환에서 IFX의 존재시 HACA의 부정확한 검출을 극복한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 전체 인간 항체 약물, ADL로 치료받은 환자 내의 혈청 ADA 및 약물 수준을 측정하기 위한 새로운 검정법을 평가하였다.
방법: 이동성 검정법은 크기-배제 크로마토그래피 상의 유리 항원에 대한 항원-항체 면역복합체의 체류 시간에서의 이동성을 바탕으로 한다. 형광물질-표지된 ADL 또는 TNF-α 및 내부 컨트롤을 혈청 샘플과 혼합함으로써 ADA 또는 약물의 존재 하에 표지된 ADL 및 TNF-α의 이동성을 측정하였다. 내부 컨트롤에 대한 유리 ADL 또는 TNF-α의 비율에서의 변화는 면역복합체 형성을 나타낸다. ADA 또는 ADL의 혈청 농도는 항-인간 IgG 항체 또는 정제된 ADL의 다른 농도와 인큐베이션 함으로써 생성된 표준 곡선으로 측정되었다. 상기 검정법을 사용함으로써, 본 발명자들은 ADL로 치료받은 IBD 환자로부터 수거된 혈청 내의 ADL 및 ADA 수준을 측정하였다.
결과: 투여-반응 곡선이 표지된 ADL의 이동성 측정을 위한 항-인간 IgG 항체에 의해 생성되었다. 상기 검정법의 검출 한계는 항-인간 IgG 10 ng이었다. 100명의 건강한 대조군으로부터의 혈청으로 ADA를 실험하였고, 모든 샘플은 검출 한계 이하의 ADA 수준을 가졌다 (표지된 유리 ADL은 이동하지 않음). ADA의 검출은 ADL로 치료받은 114명의 IBD 환자 샘플 중 5개에서 발견되었다. ADL로 치료받은 환자 내의 약물 농도를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 10 ng의 검출 한계를 갖는 표지된 TNF-α의 이동 상의 ADL의 다른 양으로 표준 곡선을 생성하였다.
결론: 본 발명자들은 ADL로 치료받은 환자로부터의 혈청 내의 ADA 및 ADL 수준을 측정하기 위하여 본 발명자 소유의 비-방사능 표지된 액체-상 동종 이동성 검정법을 적용하였다. 본 검정법은 높은 민감도 및 정확도로 재현가능하고, ADL로 치료받은 환자로부터의 혈청 샘플 내의 ADL 수준을 평가하기에 유용하다.
도입
인플릭시마브 (IFX), 아타너셉트, 아달리무마브 (ADL) 및 세프톨리주마브 패골와 같은 항-종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 생물학적 제제는 크론병 (CD) 및 류마티스 관절염 (RA)을 포함하는, 다수의 자가면역 질환에서 질병 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 일부 환자들은 항-TNF-α 치료요법에 반응을 하지 못하는 반면, 다른 환자들은 충분한 반응성이 부족하거나 융합 반응으로 진행하기 때문에 더 높은 투여 또는 더 잦은 투여가 요구된다.
환자가 약물에 대한 항체를 갖도록 야기하는 치료 항체의 면역원성은 치료 및 융합 반응의 실패에 기여할 수도 있다. IFX와 같은 키메라 항체는 ADL와 같은 전체 인간화 항체에 비해 항체 생성의 더 높은 유도 가능성을 가진다. RA 환자 내의 IFX (HACA)에 대한 항체의 발생은 12% 내지 44%로 다양하고 환자 혈청 내의 IFX의 수준 및 치료학적 반응에 역비례한다. 전체 인간화 ADL가 뮤린 또는 키메라 항체에 비해 면역원성이 적은 것으로 제안되는데 반해, 몇몇의 연구는 인간 항체의 형성을 보고하고 있고 RA 및 CD 환자 내의 1% 내지 87%의 항체 형성의 우세함을 나타낸다 (문헌 [Aikawa et al , Immunogenicity of Anti-TNF-alpha agents in autoimmune diseases. Clin. Rev. Allergy Immunol. , 38(2-3):82-9 (2010)].
하나의 항-TNF-α 약물에 대한 2차 반응에 실패한 많은 환자들은 다른 항-TNF-α 약물로 교체되거나 투여량 및/또는 투여 빈도를 증가시키는게 유리할 수도 있다. 따라서, 환자의 약물 및 항-약물 항체 (ADA) 수준을 관찰하는 것은 약물 투여가 개개인의 환자에 따라 조절될 수 있음을 보장한다. 이러한 접근법은 보장될 때 조절 또는 ADA 수준이 존재할 때 약물의 중단을 가능하게 한다. 문헌 [(Bendtzen et al., Individual medicine in inflammatory bowel disease: monitoring bioavailability, pharmacokinetics and immunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. Scand. J. Gastroenterol , 44(7):774-81 (2009); Afif et al , Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol, 105(5): 1 133-9 (2010))] 참고.
많은 검정법들이 HACA 및 HAHA를 측정하기 위해 개발되어 왔다. 현재 방법들의 제한 중 하나는 순환시 약물이 높은 수준으로 존재할 때 ADA 수준이 제대로 측정되지 않는다는 점이다.
본 발명자들은 혈청 내의 약물의 존재에 의해 영향을 받지 않는 ADL로 치료 받은 환자로부터의 혈청 내 ADA 및 ADL 수준을 측정하기 위한 본 발명자 소유의 비-방사성 표지된, 액체-상, 이동성 검정법을 개발하였다.
방법
형광물질 (Fl)-표지된 ADL을 환자 혈청과 인큐베이션 함으로서 면역복합체를 형성하였다. Fl-표지된 소 펩티드는 각각의 반응에서 내부 컨트롤로서 포함되어 있다. 다른 양의 항-인간 IgG를 사용함으로서 표준 곡선을 생성시키고 혈청 ADA 수준을 측정하였다. 유리 Fl-표지된 ADL를 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 그것의 분자량을 바탕으로 복합체에 결합된 항체로부터 분리하였다. 각각의 샘플로부터의 내부 컨트롤에 대한 유리 Fl-표지된 ADL의 비율을 사용하여 표준 곡선으로부터 HAHA 농도를 추론하였다. 유사한 방법을 사용하여 Fl-표지된 TNF-α로 환자 혈청 샘플 내의 ADL 수준을 측정하였다.
결과
도 19는 고 분자량 복합체의 이동성으로 인한 유리 Fl-ADL로부터의 항-인간 IgG 결합된 Fl-ADL 복합체의 분리는 나타낸다. 구획 c 내지 h로부터 알 수 있듯이, 형광 피크의 체류 시간은 10.1 분으로부터 7.3-9.5 분으로 이동하였다. 더 많은 양의 항-인간 IgG를 반응 혼합물에 첨가할수록, 더 적은 양의 유리 ADL가 크로마토그램 내에 남아있고 더 많은 양의 면역복합체가 발견되었다 (h 내지 c). 내부 컨트롤의 체류 시간은 13.5 분이었다.
도 20은 항-인간 IgG의 첨가에 의해 야기된 형광 피크 이동의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 항-인간 IgG의 농도의 증가는 면역복합체의 형성으로 인해 내부 컨트롤에 대한 유리 ADL의 비율을 감소시킨다. 본 분석법의 민감도는 항-인간 IgG의 lOng/ml이었다. 내부 컨트롤 "Fl-BioCyt"는 비오틴 및 알데하이드-고정가능한 일차 아민 (리신) (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA)과 그린-형광 Alexa Fluor® 488 형광물질이 조합된 Alexa Fluor® 488-biocytin (BioCyt)와 동일하다 .
도 21은 고 분자량 복합체의 이동성으로 인한 유리 TNF-α-Fl로부터 ADL 결합 TNF-α-Fl 복합체의 분리를 나타낸다. 구획 c 및 j에서 알 수 있듯이, 형광 피크의 체류 시간은 11.9 분에서부터 6.5-10.5 분으로 이동하였다. 더 많은 양의 ADL가 반응 혼합물에 첨가될수록, 더 적은 양의 유리 TNF-α-Fl 피크가 크로마토그램 내에 잔존하고 더 많은 양의 면역-복합체가 형성된다.
도 22는 ADL의 첨가에 의해 야기된 TNF-α-Fl 피크 이동에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸다. 첨가된 ADL을 바탕으로, 혈청 내의 ADL의 검출 한계는 lOng/ml이다.
도 4는 100 명의 건강한 피검체 및 ADL로 치료받은 114명의 IBD 환자로부터의 혈청 샘플 내의 ADA 및 ADL 수준을 본 발명의 이동성 검정법을 사용하여 분석한 것을 나타낸다. 100명의 건강한 피검체 샘플은 모두 검출 한계 이하의 ADA 수준을 가졌으나, 114명의 환자 샘플 중 5개는 0.012 내지 >20 g/ml의 ADA 농도를 가졌다. 100명의 건강한 피검체 샘플 내의 ADL 수준의 평균은 0.76±1.0 μg/ml (0 내지 9.4 μg/ml 범위)이었다. ADL로 치료받은 환자로부터의 114개의 혈청 샘플 내의 ADL 수준의 평균은 10.8±17.8 g/ml (0-139 μg/ml 범위) 이었다. ADL 양성 샘플 5개 중 4개는 검출불가능한 ADL 수준을 가졌다.
표 4. 이동성 검정법에 의해 측정된 ADA 및 ADL 의 환자 혈청 수준
Figure 112012042313099-pct00015
표 5는 100 명의 건강한 피검체 및 ADL로 치료받은 114 명의 IBD 환자로부터 혈청 샘플의 추가적 분석을 제공한다. 특히, 0-4μg/ml ADL를 사용한 42명의 환자 샘플 중 4개는 0.012 내지 >20μg/ml의 평균 ADA 농도를 가졌다. ADA 양성 샘플 4개 중 4개가 검출불가능한 수준의 ADA를 가졌다. ADA의 검출을 위해, ADA로 치료 받은 114 명의 IBD 환자를 2 카테고리, ADL 0-4μg/ml 및 ADL >4μg/ml로 나누었다. ADL를 4μg/ml 이상 사용한 환자들은 ADL와 ADL의 순환 경쟁을 해결하기 위하여 더 많은 양의 ADL-F1로 실험될 수 있다.
표 5. 이동성 검정법에 의해 측정된 ADA 및 ADL 의 환자 혈청 수준
Figure 112012042313099-pct00016
결론
HACA/IFX를 측정하기 위해 사용된 이동성 검정법 형태는 전형적인 ELISA에서의 고체 표면상의 항원의 코팅과, 다수의 세척 및 인큐베이션 단계가 제외된 동종 검정법이다. 본 검정법은 ADA 및 항-TNF 약물을 측정함에 적용될 수 있다. 검정법의 민감도 (μg/ml 범위 내)는 ELISA 방법 (mg/ml 범위 내)과 비교하여 환자 혈청으로 ADA 및 ADL 측정시 더 높다. 건강한 대조군 혈청 샘플은 Fl-표지된 ADL의 이동성을 야기하지 않았고, ADL로 치료받는 환자의 4.3%는 본 분석법에 의해 ADA를 갖고 있는 것으로 발견되었다. 특히, 0.4 μg/ml ADL를 사용한 환자의 9.52%가 본 분석법에서 ADA를 갖는 것으로 발견되었다. 더욱 높은 농도의 ADL-F1를 사용하여 보통의 샘플 및 환자 샘플의 추가적 평가가 수행될 것이다. 비록 건강한 대조군 혈청 샘플이 TNF-α의 수용성 유리 수용체의 존재로 인해 발생할 수도 있는, Fl-표지된 TNF-α의 이동성을 야기하였지만, ADL로 치료받은 환자 내의 ADL의 평균은 더 높았다 (10.8 vs. 0.76 g/ml). 환자가 ADL 치료를 받고 있는 동안 ADA의 초기 검출 및 ADL 약물 수준의 관찰은 의사가 ADL의 용량을 최적화하고 적절한 때 다른 항-TNF-α 약물로 교체할 수 있게 함으로써 환자의 질병에 대한 전체적인 조절을 최적화한다.
실시예 7: DREMICADE ™ 및 인간 항-약물 항체의 농도 수준 측정
본 실시예는 혈청 샘플 내의 항-TNF-α 약물, 예를 들면 REMICADE™ (인플릭시마브)의 수준을 측정할 뿐만 아니라 인간 항-약물 항체, 예를 들면 REMICADE™ (인플릭시마브)에 대한 인간 항-키메라 항체 (HACA)의 수준을 측정하기 위한 방법을 기술한다.
단계 1: 샘플 내의 REMICADE ™ (인플릭시마브)의 농도 수준 측정
일 예시적인 구현예에서, TNFα는 형광물질 (예를 들면 Alexa647)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두로 검출될 수 있다. 표지된 TNFα를 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이션됨으로써 혈청 내에 존재하는 항-TNFα 약물과 결합한다. 상기 표지된 TNFα는 또한 표준 곡선을 생성하기 위하여 액체 상 반응으로 소정의 항-TNFα 약물과 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼으로 직접 로딩된다. 표지된 TNFα에 대한 항-TNFα 약물의 결합은 표지된 TNFα 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다. 혈청 샘플 내에 존재하는 항-TNFα 약물의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다.
환자 혈청 내의 REMICADE ™ (인플릭시마브) 수준의 SE - HPLC 분석
인간 재조합 TNFα를 제조사의 사용지시에 따라, 형광물질, Alexa Fluor® 488로 표지하였다. 표지된 TNFα를 다른 양의 REMICADE™ 또는 환자 혈청과 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 100㎕부피의 샘플들을 HPLC 시스템 상에서 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. 형광 표지 검출을 사용하여 그들의 체류 시간을 바탕으로 표지된 유리 TNFα 및 결합된 표지된 TNFα 면역-복합체를 관찰하였다. 혈청 REMICADE™ 수준을 표준 곡선으로부터 계산하였다.
하기의 공신은 본 분석법과 관련된다:
공식 I: 표지된-TNFα + REMICADE™ → (표지된-TNFα·REMICADE™)복합체
공식 II: [REMICADE™]표지된 - TNF α-존재-없음 = [(표지된-TNFα·REMICADE™)복합체]
공식 III: [REMICADE™] = [(표지된-TNFα·REMICADE™)복합체]/[표지된-TNFα] x [표지된-TNFα]
단계 1에서, 소정의 표지된-TNFα는 REMICADE™-함유 혈청 샘플과 접촉된다. 상기 표지된-TNFα 및 REMICADE™는 복합체, (표지된-TNFα·REMICADE™)복합체를 형성한다. 공식 I 참고. 대부분의 REMICADE™가 표지된-TNFα와 복합체를 형성하므로, 표지된-TNFα의 도입 전에 존재하는 REMICADE™의 농도는 측정된 표지된-TNFα·REMICADE™복합체의 농도와 일치한다. 공식 II 참고. REMICADE™의 농도 수준은 [(표지된-TNFα·REMICADE™)복합체]/[표지된-TNFα] 비율을 [표지된-TNFα]로 곱하는 것에 의해 계산된다. 공식 III 참고. 비율, [(표지된-TNF·REMICADE™)복합체]/[표지된-TNFα]는 크기 배제 HPLC으로부터의 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서, (표지-TNFα·REMICADE™)복합체 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, 상기 결과를 파일롯에서 표지된-TNFα 피크에 대한 곡선의-하부-면적의 적분 결과로 나누는 것에 의해 얻어진다. [표지된-TNFα]는 사전에 이미 알려져 있다.
단계 2: 인간 항- 키메라 항체, HACA 의 수준 측정.
일 예시적인 구현예에서, 인간 항-키메라 항체, HACA는 형광물질, 예를 들면, Alexa647로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두에 의해 검출될 수 있다. 상기 표지된 항-TNFα 약물은 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이션됨으로서 혈청 내 존재하는 임의의 HACA와 결합한다. 표지된 항-TNFα 약물은 또한 소정의 항-IgG 항체 또는 액체 상 반응 내의 풀링된 양성 환자 혈청과 인큐베이션됨으로써 표준 곡선을 생성할 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼 상에 바로 로딩된다. 표지된 항-TNFα 약물과 자가항체의 결합은 표지된 약물 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다. 혈청 샘플 내에 존재하는 HACA의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다. .
환자 혈청 내의 HACA 수준의 SE-HPLC 분석. 정제된 REMICADE™를 형광물질로 표지하였다. 표지된 REMICADE™를 다른 희석량의 풀링된 HACA-양성 혈청 또는 희석된 환자 혈청으로 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL 부피의 샘플을 HPLC 시스템 상의 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. 형광 표지 검출법을 사용하여 표지된 유리 REMICADE™ 및 결합된 표지된 REMICADE™ 면역-복합체를 관찰하였다. 결합된 것과 표지된 유리 REMICADE™의 비율을 사용하여 하기에 기술된 바와 같이 HACA 수준을 측정하였다.
혈청 내의 HACA 측정을 위한 이동성 검정법 과정. 본 검정법의 원리는 복합체의 분자량 증가에 의한 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 상에서, 유리 Alexa647-표지된 REMICADE™에 대한 항-약물 항체, 예를 들면 HACA와 Alexa647-표지된 REMICADE™의 복합체의 이동성을 바탕으로 한다. 상기 크로마토그래피는 형광 표지 검출법, 예를 들면 650 nm에서의 UV 검출법으로, 분자량 분획 범위 5,000-700,000 및 이동 상 1X PBS, pH 7.3, 유속 0.5 -1.0 mL/min을 갖는 Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼 (Phenomenex)를 사용하여, Agilent-1200 HPLC System에서 수행된다. Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼을 갖는 Agilent-1200 HPLC System 앞에, BioSep 75x7.8 mm SEC-3000인 분석적 사전-컬럼이 있다. 100㎕ 샘플 부피는 각각의 분석을 위한 컬럼으로 로딩된다. HACA 및 표지된 REMICADE™ 복합체의 복합체는 SE-HPLC 분석 전에 1시간 동안 실온에서 1X PBS, pH 7.3 용출 완충액 내에서 EMICADE™-처리된 환자로부터의 혈청과 표지된 REMICADE™을 인큐베이션 하는 것에 의해 형성된다.
하기의 공식들은 본 검정법과 관련된다:
공식 IV: REMICADE™ + 표지된-REMICADE™ + HACA→
(REMICADE™·HACA)복합체 + (표지된-REMICADE™·HACA)복합체
공식 V: [REMICADE™]/[REMICADE™·HACA복합체] = [표지된-REMICADE™]/[ 표지된-REMICADE™·HACA복합체]
공식 VI: [HACA] = [REMICADE™·HACA]복합체 + [표지된-REMICADE™·HACA]복합체
공식 VII: [REMICADE™·HACA복합체] = [REMICADE™] x [표지된-REMICADE™·HACA복합체]/[표지된-REMICADE™]
공식 VIII: [표지된-REMICADE™·HACA복합체] = [표지된-REMICADE™] x
[표지된-REMICADE™·HACA복합체]/[표지된-REMICADE™]
공식 IX: [REMICADE™]유효-량 = [REMICADE™] - [HACA]
인간 항- TNF α 약물 항체, 예를 들면 HACA 의 농도 수준 측정. 공지된 농도의 표지된-REMICADE™가 혈청 샘플에 첨가된다. HACA는 REMICADE™ 또는 표지된-REMICADE™를 갖는 복합체를 형성한다, 공식 IV 참고. 상기 [REMICADE™]는 상기의 단계 1에서 측정된다. REMICADE™ 또는 표지된-REMICADE™에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고 상기 결과를 표지된 유리-REMICADE™에 대한 곡선의-하부-면적에 대한 적분 결과로 나누는 것에 의해, [표지된-REMICADE™]에 대한 [표지된-REMICADE™·HACA복합체]의 비율을 얻는다. [REMICADE™·HACA복합체]에 대한 [REMICADE™]의 비율은 [표지된-REMICADE™·HACA)복합체]에 대한 [표지된-REMICADE™]의 비율과 동일하다. 공식 V 참고. HACA가 평형을 이루고, REMICADE™ 뿐만 아니라 표지된-REMICADE™를 갖는 복합체를 형성하기 때문에, HACA의 전체 양은 REMICADE™·HACA복합체의 양과 표지된-REMICADE™·HACA복합체의 양의 합과 동일하다. 공식 VI 참고. [REMICADE™·HACA복합체]에 대한 [REMICADE™] 비율이 [표지된-REMICADE™·HACA복합체]에 대한 [표지된-REMICADE™]의 비율과 동일하기 때문에, [REMICADE™-HACA]복합체 뿐만 아니라 [표지된-REMICADE™-HACA복합체]는 [표지된-REMICADE™·HACA복합체)] [표지된-REMICADE™] 비율을 각각 사전에 공지된, 단계 1에서 측정된 REMICADE™의 농도양 및 표지된-REMICADE™의 농도양과 곱하는 것에 의해 측정된다. 공식 VII 및 VIII 참고. 따라서, HACA의 전체 양은 (1) 단계 1로부터의 [REMICADE™]와 [표지된- REMICADE™·HACA)복합체]/[표지된-REMICADE™]의 곱, 및 (2) 사전이 공지된, [표지된 REMICADE™]와 [표지된-REMICADE™·HACA)복합체]/ [표지된-REMICADE™]의 곱의 합과 동일하다.
REMICADE ™의 유효 농도 수준의 측정. HACA가 REMICADE™와 복합체를 형성하기 때문에, 혈청 샘플 내에서 이용가능한 REMICADE™의 유효량은 단계 1에서 측정된 REMICADE™ 양으로부터 단계 2에서 측정된 HACA 양을 뺀 것이다. 공식 IX 참고.
예시적인 계산. V10 상의 환자 JAG에서, [REMICADE™]는 7.5 μg/ml로 측정되었다. 도 16c 참고. 이 결과는 단계 1 이후에 공식 I- III를 사용하여 얻어졌다. 7.5 μg/ml는 30 ng/4㎕와 같다, 4㎕의 샘플이 단계 2에서의 측정에서 사용되기 때문에, 30.0 ng의 REMICADE™가 분석된 샘플 내에 존재하였다. VI0 상의 환자 JAG에서 [표지된-REMICADE™·HACA]복합체/[표지된-REMICADE™]의 비율은 0.25 이였다. 도 16b 참고. 샘플 내로 도입된 [표지된-REMICADE™]는 37.5 ng/100μL이었다. 100μL의 표지된-REMICADE가 단계 2에서의 측정에서 사용되었기 때문에, 전체 표지된-REMICADE™의 37.5 ng이 분석된 샘플 내에 존재하였다. 공식 VII를 사용하면, REMICADE™·HACA복합체의 전체 양은 37.5 ng를 0.25로 곱한 값으로, 9.4 ng 표지된-REMICADE™·HACA복합체와 같다. 공식 VI를 사용하면, HACA의 전체 양은 9.4 ng와 7.5 ng의 합으로, 16.9 ng HACA이다. 16.9 ng HACA이 4 μL의 샘플 내에 존재하였다. [HACA]는 16.9 ng/4μL로서, 4.23 μg/ml와 같다. 공식 IX을 사용하면, REMICADE™의 유효량은 단계 1로부터 측정된 7.5 μg/ml REMICADE™에서 단계 2로부터 측정된 4.23 μg/ml HACA를 뺀 값과 같았다. 이 예시적인 계산에서, 유효량 [REMICADE™]는 3.27g/ml이다.
실시예 8: HUMIRA ™ 및 인간 항-약물 항체의 농도 수준 측정
본 실시예는 혈청 샘플 내의 HUMIRA™ 수준을 측정 뿐만 아니라 인간 항-인간 항체 (HAHA)이 수준을 측정하기 위한 방법을 기술한다.
단계 1: 샘플 내의 HUMIRA ™의 농도 수준 측정.
일 예시적인 구현예에서, TNFα는 형광물질 (예를 들면 Alexa647)로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두로 검출될 수 있다. 상기 표지된 TNFα는 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이션됨으로써 혈청 내 존재하는 항-TNFα 약물과 결합된다. 표지된 TNFα는 또한 표준 곡선을 형성하기 위하여 액체 상 반응 내의 이미 알려진 양의 항-TNFα 약물과 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼 상에 바로 로딩된다. 표지된 TNFα과의 항-TNFα 약물의 결합은 표지된 TNFα 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다. 혈청 샘플 내에 존재하는 항-TNFα 약물의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다. .
인간 혈청 내의 HUMIRA™ 수준의 분석. 인간 재조합 TNFα를 제조사의 사용지시에 따라 형광물질, Alexa Fluor® 488로 표지하였다. 표지된 TNFα를 다른 양의 HUMIRA™ 또는 환자 혈청으로 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL 부피의 샘플을 HPLC 시스템 상의 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. 형광 표지 검출법을 사용하여 표지된 유리 TNFα 및 결합된 표지된 TNFα 면역-복합체를 그들의 체류 시간을 바탕으로 관찰하였다. 혈청 HUMIRA™ 수준을 표준 곡선으로부터 계산하였다.
하기의 공식은 본 검정법과 관련된다:
공식 X: 표지된-TNFα + HUMIRA™ → (표지된-TNFα·HUMIRA™)복합체
공식 XI: [HUMIRA™] = [(표지된-TNFα·HUMIRA)복합체]
공식 XII: [HUMIRA™] = [(표지-TNFα·HUMIRA™)복합체]/[표지된-TNFα] x
[표지된-TNFα]
단계 1에서, 알려진 양의 표지된-TNFα는 HUMIRA™-함유 혈청 샘플과 접촉된다. 상기 표지된-TNFα 및 HUMIRA™는 복합체, (표지된-TNFα·HUMIRA™)복합체를 형성한다. 공식 X 참고. 대부분의 HUMIRA™가 표지된-TNFα를 갖는 복합체를 형성하기 때문에, 표지된-TNFα의 도입 전에 존재하는 [HUMIRA™]는 측정된 [(표지된-TNFα·HUMIRA™)복합체]와 동일하다. 공식 XI 참고. [HUMIRA™]는 [(표지-TNFα·HUMIRA™)복합체]/[표지된-TNFα]의 비율을 [표지된-TNFα]와 곱하여 계산된다. 공식 XII 참고. 표지된-TNFα에 대한 곡선의-하부-면적 및 표지된-TNFα·HUMIRA™)복합체에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, (표지된-TNFα·HUMIRA™)복합체에 대한 적분 결과를 표지된-TNFα에 대한 적분 결과로 나눔으로써, [표지된-TNFα]에 대한 [(표지-TNFα·HUMIRA™)복합체]의 비율이 얻어진다. [표지된-TNFα]는 사전에 공지되어 있다.
단계 2: 인간 항-인간 항체, 예를 들면 HAHA 의 수준 측정
일 예시적인 구현예에서, 항-TNFα 약물, 예를 들면, HUMIRA™는 형광물질, 예를 들면, Alexa647로 표지되고, 여기서 상기 형광물질은 가시광선 또는 형광 스펙트럼 또는 상기 모두에 의해 검출될 수 있다. 표지된 항-TNFα 약물은 액체 상 반응으로 인간 혈청과 인큐베이션 됨으로써 혈청 내에 존재하는 임의의 HAHA와 결합된다. 상기 표지된 항-TNFα 약물은 또한 소정의 항-IgG 항체 또는 풀링된 양성 활자 혈청과 액체 상 반응으로 인큐베이션됨으로써 표준 곡선을 형성할 수 있다. 인큐베이션 이후에, 상기 샘플은 크기 배제 컬럼 상에 바로 로딩된다. 표지된 항-TNFα 약물에 자가항체의 결합은 표지된 약물 단독의 경우에 비해 피크를 왼쪽으로 이동시킨다. 혈청 샘플 내에 존재하는 HAHA의 농도는 그 다음 표준 곡선 및 대조군과 비교될 수 있다. .
환자 혈청 내의 HAHA 수준의 SE-HPLC 분석. 정제된 HUMIRA™를 형광물질로 표지하였다. 표지된 HUMIRA™를 다른 희석량의 풀링된 HAHA-양성 혈청 또는 희석된 환자 혈청과 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 100㎕ 부피의 샘플을 HPLC 시스템 상의 크기-배제 크로마토그래피로 분석하였다. 형광 표지 검출법을 사용하여 표지된 유리 HUMIRA™ 및 결합된 표지된 HUMIRA™ 면역-복합체를 그들의 체류 시간을 바탕으로 관찰하였다. 결합된 것과 표지된 유리 HUMIRA™의 비율을 사용하여 하기에 기술된 바와 같이 HAHA 수준을 측정하였다.
혈청 내의 HAHA를 측정하기 위한 이동상 검정법 과정. 본 검정법의 원리는 복합체의 분자량의 증가로 인한, 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 상의 유리 Alexa647-표지된 HUMIRA™에 대한 항체, 예를 들면 HAHA, 결합된 Alexa647-표지된 HUMIRA™ 복합체의 이동성을 바탕으로 한다. 상기 크로마토그래피는 형광 표지 검출법, 예를 들면 650 nm에서 UV 검출법으로 분자량 분획 범위 5,000-700,000 및 이동 상 1X PBS, pH 7.3, 유속 0.5- 1.0 mL/min를 갖는 Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼 (Phenomenex)를 사용하는, Agilent- 1200 HPLC Syste에서 수행된다. Bio-Sep 300x7.8 mm SEC-3000 컬럼을 갖는 Agilent-1200 HPLC System 앞에 BioSep 75x7.8 mm SEC-300인 분석적 사전-컬럼이 있다. 100 μL의 샘플 부피를 각각의 분석을 위한 컬럼 상에 로딩한다. HAHA 결합 표지된 HUMIRA™ 복합체가 SE-HPLC 분석 전에 1시간 동안 실온에서 1X PBS, pH 7.3, 용출 완충액 내의 HUMIRA-치료 받은 환자 및 표지된 HUMIRA™로부터 혈청을 인큐베이션함으로써 형성된다.
공식 XIII: HUMIRA™ + 표지된-HUMIRA™ + HAHA→
(HUMIRA™·HAHA)복합체 + (표지된-HUMIRA™·HAHA)복합체
공식 XIV: [HUMIRA™]/[HUMIRA™·HAHA복합체] = [표지된-HUMIRA™]/[표지된-HUMIRA-HAHA복합체]
공식 XV: [HAHA] = [HUMIRA™·HAHA 복합체] + [표지된-HUMIRA™ -HAHA 복합체]
공식 XVI: [HUMIRA™·HAHA복합체] = [HUMIRA™] x [표지된-HUMIRA™·HAHA복합체]/[표지된-HUMIRA™]
공식 XVII: [표지된-HUMIRA™·HAHA복합체] = [표지된-HUMIRA™] x [표지된-HUMIRA™·HAHA복합체]/[표지된-HUMIRA™]
공식 XVIII:[HUMIRA™]유효-량 = [HUMIRA™] - [HAHA]
단계 2에서 계산: 표지된-HUMIRA™의 공지된 농도가 혈청 샘플에 첨가된다. HAHA는 HUMIRA™ 또는 표지된-HUMIRA™와 복합체를 형성한다. 공식 XIII 참조. [HUMIRA]는 상기 기술한 바와 같이 단계 1에서 측정된다. 표지된-HUMIRA™·HAHA복합체의 곡선의-하부-면적과 표지된-HUMIRA™에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고 표지된-HUMIR A™ ·HAHA복합체에서의 적분 결과를 표지된-HUMIRA™에 대한 적분 결과로 나눔으로써, [표지된-HUMIRA™]에 대한 [HUMIRA™]의 비율이 얻어진다. [HUMIRA™·HAHA복합체]에 대한 [HUMIRA™]의 비율은 [표지된-HUMIRA™·HAHA복합체]에 대한 [표지된-HUMIRA™]의 비율과 동일하다. 공식 XIV 참고. HAHA가 평형을 이루고 HUMIRA 뿐만 아니라 표지된-HUMIRA™와 복합체를 형성하기 때문에, HAHA의 전체 양은 HUMIRA™·HAHA복합체 및 표지된-HUMIRA™-HAHA복합체의 양의 합과 동일하다. 공식 XV 참고. [HUMIRA™·HAHA복합체]에 대한 [HUMIRA™]의 비율이 [표지된-HUMIRA™·HAHA복합체]에 대한 [표지된-HUMIRA]의 비율과 동일하기 때문에, [HUMIRA™-HAHA복합체] 뿐만 아니라 [표지된-HUMIRA™-HAHA복합체]의 농도는 [표지된-HUMIRA·HAHA복합체]/ [표지된-HUMIRA]를 단계 1에서 측정된, [HUMIRA™] 및 사전에 공지된 [표지된-HUMIRA™]로 곱하는 것에 의해 측정된다. HAHA가 HUMIRA™와 복합체를 형성하기 때문에, 혈청 샘플 내에서 이용가능한 HUMIRA™의 유효량은 단계 1에서 측정된 HUMIRA의 양을 단계 2에서 측정된 HAHA의 양으로 뺀 것이다. 공식 XVIII 참고.
예시적인 계산. 도 25를 참고하면 환자 SL03246013에서, [HUMIRA™]는 16.9 μg/ml로 측정되었다. 도 25 참고. 상기 결과는 단계 1 이후에 공식 X- XII를 사용하여 얻어졌다. 16.9 μg/ml는 67.6 ng/ 4μL와 같다. 4 μL 샘플이 단계 2에서의 측정에서 사용되기 때문에, 전체 67.6 ng의 HUMIRA™이 분석된 샘플 내에 존재하였다. 환자 SL03246013에서 [표지된-HUMIRA™·HAHA]복합체/[표지된-HUMIRA™]의 비율은 0.055이었다. 도 25 참고. 샘플 내로 도입된 [표지된-HUMIRA™]는 37.5 ng/ 100μ1이었다. 표지된-HUMIRA™의 100μL이 단계 2에서의 측정에서 사용되었기 때문에, 전체 37.5 ng의 표지된-HUMIRA™가 분석된 샘플 내에 존재하였다. 공식 XVI를 사용하면, HUMIRA™·HAHA복합체의 전체 양은 67.6 ng를 0.055와 곱한 것으로, 3.71 ng 표지된-HUMIRA™·HAHA복합체와 같다. 공식 XVII를 사용하면, 표지된-HUMIRA™·HAHA복합체의 전체 양은 37.5 ng를 0.055와 곱한 것으로, 2.06 ng 표지된-HUMIRA™·HAHA복합체와 같다. 공식 XV를 사용하면, HAHA의 전체 양은 3.71 ng와 2.06 ng의 합으로, 5.77 ng HAHA와 같다. 5.77 ng HAHA가 4μL의 샘플 내에 존재한다. [HAHA]는 5.77 ng/4μ으로, 44 μg/ml와 동일하다. 공식 XVIII를 사용하면, HUMIRA™의 유효량은 단계 1로부터 측정된 16.99 μg/ml HUMIRA™에서 단계 2로부터 측정된 1.44 u.g/ml HAHA를 뺀 것이다. 본 예시적인 계산에서, [HUMIRA™]의 유효량은 15.46 μg/ml이다.
실시예 9: REMICADE ™, 표지된 - REMICADE ™, HUMIRA , 또는 표지된 - HUMIRA 를 갖는 HACA 또는 HAHA 의 복합체의 양 측정
본 실시예는 내부 표준과 관련된 REMICADE™, 표지된-REMICADE™, HUMIRA, 또는 표지된-HUMIRA™를 갖는 HACA 또는 HAHA의 복합체의 양을 측정하는 방법을 기술한다.
내부 컨트롤, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488을 사용하면, 본 실험으로부터 다른 실험으로까지의 혈청 인공물 및 변형물이 확인되고 적절히 분석될 수 있다. 내부 컨트롤 예를 들면 Biocytin-Alexa 488의 양은 분석된 100㎕ 중 약 50 내지 약 200 pg이다.
형광물질 (Fl)-표지된 HUMIRA™는 환자 혈청과 인큐베이션됨으로써 면역복합체가 형성된다. Fl-표지된 소 펩티드, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488는 각 반응에서 내부 컨트롤로서 포함되었다. 일 예에서, 다른 양의 항-인간 IgG를 사용함으로써 혈청 HAHA 수준을 측정하기 위한 표준 곡선을 형성하였다. 다른 예에서, 정제된 HAHA로 칼리브레이션하여 적정된 풀링된 양성 환자 혈청을 사용하여 혈청 HAHA 수준을 측정하기 위한 표준 곡선을 생성하였다. 예를 예로서, 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 혈청 HAHA 수준을 측정하기 위한 표준 곡선을 형성하였다. 유리 표지 HUMIRA를 크기-배제 크로마토그래피에 의한 그것의 분자량을 바탕으로 항체 결합 복합체로부터 분리하였다. 각각의 샘플로부터의 내부 컨트롤에 대한 표지된 유리 HUMIRA의 비율을 사용하여 표준 곡선으로부터 HAHA 농도를 추론하였다. 유사한 방법을 사용하여 표지된 TNF-α로 환자 혈청 샘플 내의 HUMIRA 수준을 측정하였다.
내부 컨트롤에 대한 표지된-약물, 즉 표지된-REMICADE™ 또는 표지된-HUMIRA의 초기 비율은 100이다. 도 23 및 24에 설명된 바와 같이, 내부 컨트롤에 대한 표지된-약물의 비율이 95 이하로 떨어지면, 표지된-약물은 약물 결합 화합물, 예를 들면 HACA, HAHA와 복합체를 형성하는 것으로 추정된다. [내부 컨트롤]에 대한 [표지된-약물]의 비율은 표지된 약물 및 내부 컨트롤에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, 상기 표지된-약물에 대한 적분 결과를 내부 컨트롤에 대한 적분 결과로 나눔으로써 얻어진다.
실시에 10: 비복합체 항- TNF α 약물에 대한 복합체 항- TNF α 약물의 비율 측정
비복합체 항-TNFα 약물에 대한 복합체 항-TNFα 약물의 비율은 복합체 항-TNFα 약물 및 비복합체 항-TNFα 약물에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, 복합체 항-TNFα에 대한 적분 결과를 비복합체 항-TNFα 약물에 대한 적분 결과로 나눔으로써 얻어진다.
일 구현예에서, 비복합체 항-TNFα 약물은 샘플 내에서 약 0 ng 내지 100 ng 사이의 수준을 갖는 REMICADE™이다. 표지된-REMICADE™의 양은 약 37.5 ng이다.
내부 컨트롤, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488를 사용하면, 하나의 실험으로부터 다른 실험으로까지의 혈청 인공물 및 변형물이 확인되고 적절히 분석될 수 있다. 내부 컨트롤, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488의 양은 분석된 100㎕ 중 약 50 내지 약 200 pg이다.
표지된 내부 컨트롤에 대한 표지된 항-TNFα 약물, 예를 들면 REMICADE™ 또는 HUMIRA™의 비율은 표지된 항-TNFα 약물 및 표지된 내부 컨트롤에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, 표지된 항-TNFα 약물에 대한 적분 결과를 표지된 내부 컨트롤에 대한 적분 결과로 나눔으로써 얻어진다.
[(표지된-항-TNFα 약물·자가항체)복합체]/[내부 컨트롤]의 비율은 크기 배제 HPLC로부터 용출 시간의 함수로서 신호 강도의 파일롯에서 (표지된-항-TNFα 약물·자가항체)복합체 피크에 대한 곡선의-하부-면적을 적분하고, 상기 결과를 상기 파일롯에서 내부 컨트롤 피크에 대한 곡선의-하부-면적으로 나눔으로써 얻어진다. 몇몇 구현예에서, 상기 표지된 항-TNFα 약물은 표지된 REMICADE™이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 표지된 항-TNFα 약물은 HUMIRA™로 표지된다.
실시예 11: 유리 및 복합체 표지된 TNF 의 비율 측정
본 실시예는 내부 표준과 관련된 REMICADE™ 또는 HUMIRA™를 갖는 표지된-TNFα의 복합체의 양을 측정하기 위한 방법을 기술한다.
내부 컨트롤, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488를 사용하면, 하나의 실험으로부터 다른 실험으로까지의 혈청 인공물 및 변형물은 확인되고 적절히 분석될 수 있다. 내부 컨트롤, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488의 양은 분석된 100㎕ 중 약 1 내지 약 25 ng이다.
일 구현예에서, 비복합체 표지된 TNFα은 샘플 내에서 약 50 ng 내지 150 ng 사이의 수준을 가진다. 특정 예에서, 표지된-TNF의 양은 약 100.0 ng이다.
형광물질 (Fl)-표지된 TNFα는 환자 혈청과 인큐베이션됨으로써 면역복합체를 형성하였다. Fl-표지된 소 펩티드, 예를 들면 Biocytin-Alexa 488은 각 반응에서 내부 컨트롤로서 포함되었다. 표준 곡선이 μg/mL의 단위 내 농도로 측정될 수 있도록, 공지된 농도의 정제된 항-TNFα 약물을 스파이킹하고 곡선으로부터 추론함으로써 생성되었다.
내부 컨트롤에 대한 표지된-TNFα의 초기 비율은 100이다. 내부 컨트롤에 대한 표지된-TNFα의 비율이 95 이하로 떨어지면, 표지된-TNFα는 항-TNFα 약물, 예를 들면 Remicade™, Humira™와 복합체를 형성한 추정된다. [내부 컨트롤]에 대한 [표지된-TNFα]의 비율은 표지된-TNFα 및 내부 컨트롤에 대한 곡선의-하부-면적을 적분한 후 표지된-TNFα에 대한 적분 결과를 내부 컨트롤에 대한 적분 결과로 나눔으로써 얻어진다.
실시예 12: 항- TNF α 약물 및/또는 항-약물 항체 ( ADA ) 수준을 측정함으로써 항- TNF α 약물 치료요법의 최적화
본 실시예는 항-TNFα 약물 치료요법을 최적화하고, 항-TNFα 약물 치료요법과 관련된 독성을 경감시키기 위한 방법, 및/또는 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 샘플 내의 항-TNFα 약물 (예를 들면, 유리 항-TNFα 치료 항체의 수준) 및/또는 항-약물 항체 (ADA) (예를 들면, 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준)의 양을 측정하는 것에 의해 항-TNFα 약물로 치료제의 효능을 관찰하기 위한 방법을 기술한다. 따라서, 본 발명의 실시예에 기술된 방법은 예를 들면 항-TNFα 약물의 후속 용량을 언제 또는 어떻게 조절할 것인지 또는 변경할 것인지 (예를 들면, 증가시키거나 감소시킬지) 결정함으로써, 메토트렉세이트 (MTX) 또는 아자티오프린과 같은 일 또는 그 이상의 면역억제제와 함께 항-TNFα 약물을 언제 또는 어떻게 조합할 것인지 (예를 들면, 증가시키거나, 감소시키거나 또는 동일하게 투여할 것인지)를 결정함으로써, 및/또는 치료요법의 현재 과정을 언제 또는 어떻게 변경할 것인지 (예를 들면, 다른 항-TNFα 약물과 교체할 것인지)를 결정함으로써, 치료 결정을 안내하기에 유용한 정보를 제공한다.
설명할 목적을 위해서만, 하기의 시나리오가 항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있는 피검체로부터 샘플 내의 항-TNFα 약물 (예를 들면, 유리 항-TNFα 치료 항체의 수준) 및/또는 ADA (예를 들면, 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 수준)의 수준을 바탕으로 어떻게 본 발명의 방법이 치료요법을 최적화하고 독성을 경감시키거나 최소화하는 것을 유리하게 하는지에 대한 설명을 제공한다. 항-TNFα 약물 및 ADA의 수준은 본 명세서에 기술된 신규한 검정법으로 측정될 수 있다.
시나리오 #1 : 낮은 수준의 항-약물 항체 ( ADA )와 높은 수준의 항- TNF α 약물.
약물 수준 = 10-50 ng/10㎕; ADA 수준 = 0.1-2 ng/10㎕. 상기 프로파일을 갖는 환자 샘플은 비지트 10 (visit 10, "V 10") 상의 환자 BAB 및 JAA로부터 샘플을 포함한다. 도 16b 참고
항-TNFα 약물을 받고 있고 상기 특정 프로파일을 갖는 환자들은 항-TNFα 약물 (예를 들면, 인플릭시마브)와 함께 아자티오프린 (AZA)과 같은 면역억제성 약물로 치료받아야 한다 .
시나리오 #2: 보통의 수준의 항- TNF α 약물과 낮은 수준의 ADA .
약물 수준 = 5-20 ng/10㎕; ADA 수준 = 0.1-2ng/10㎕. 상기 프로파일을 갖는 환자 샘플은 V10 상의 환자 DGO, JAG, 및 JJH로부터 샘플을 포함한다. 도 16b 포함.
항-TNFα 약물을 받고 있고 상기 특정 프로파일을 갖는 환자들은 항-TNFα 약물 (예를 들면, 인플릭시마브)의 높은 투여와 함께 아자티오프린 (AZA)와 같은 면역억제성 약물로 치료받아야 한다. 본 기술분야의 당업자들은 약물 치료요법이 최적화될 수 있도록 현재의 치료요법 과정보다 적합하게 높거나 낮게 조절될 수 있음을 이해할 것이고, 예를 들면, 후속 용량은 현재 용량 보다 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 이상 또는 이하일 수 있다.
시나리오 #3: 보통의 수준의 항- TNF α 약물 및 보통의 수준의 ADA .
약물 수준 = 5-20 ng/㎕; ADA 수준 = 0.5-10 ng/10㎕. 상기 프로파일을 갖는 환자 샘플은 비스트 10 ("V10") 상의 환자 JMM 및 비스트 14 ("V14") 상의 환자 J-L 로부터의 샘플을 포함한다.
항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있고 상기 특정 프로파일을 갖는 환자는 다른 약물로 치료받아야 한다. 비-제한적 예로서, 인플릭시마브 (IFX) 치료요법 및 IFX 및 ADA (즉, HACA)의 보통 수준을 갖는 환자는 아달리무마브 (HUMIRA™)로 치료요법을 교체하여야 한다.
시나리오 #4: 낮은 수준의 항- TNF α 약물 및 높은 수준의 ADA .
약물 수준 = 0-5 ng/10㎕; ADA 수준 = 3.0-50 ng/10 ㎕. 상기 프로파일을 갖는 환자 샘플은 도 16b에서 V14 상의 모든 환자로부터 샘플을 포함한다.
항-TNFα 약물 치료요법을 받고 있고 상기 특정 프로파일을 갖는 환자는 다른 약물로 치료받아야 한다.비-제한적 예로서, 인플릭시마브 (IFX) 치료요법 중으로 낮은 수준의 IFX 및 높은 수준의 ADA (즉, HACA)를 갖는 환자는 아달리무마브 (HUMIRA™)로 치료요법을 교체하여야 한다 .
비록 상기 발명은 이해를 명확하게 할 목적으로 도면 및 실시예에 의해 상세히 기술되고 있지만, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 특정 변형 및 변경이 첨부된 청구항의 범위 내에서 예측될 수도 있음을 이해할 것이다. 게다가, 본 명세서에 제공된 각각의 참고는 각각의 참고가 참고로서 개별적으로 통합되는 바와 같이, 그것의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 통합된다.

Claims (84)

  1. 샘플 내의 항-TNFα 약물의 존재 또는 농도를 측정하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    (a) 표지된 TNFα 를 항-TNFα 약물을 갖는 샘플과 접촉시킴으로써 상기 항-TNFα 약물과의 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 표지된 유리 TNFα 로부터 상기 표지된 복합체를 분리하고, 상기 표지된 복합체의 양 및 상기 표지된 유리 TNFα 의 양을 검출하는 단계; 및
    (c) 단계 (b) 에서 검출된 상기 표지된 복합체의 양 및 상기 표지된 유리 TNFα 의 양을 상기 항-TNFα 약물의 공지된 양의 표준 곡선과 비교하는 단계
    를 포함하는 것에 의해, 상기 항-TNFα 약물의 존재 또는 농도를 측정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    표준 곡선이 표지된 TNFα 를 항-TNFα 약물의 공지된 양과 인큐베이션함으로써 생성되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    표지된 TNFα 는 형광물질 표지된 TNFα 인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    형광물질이 Alexa Fluor® 염료인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    표지된 복합체가 우선 용출되고, 그 다음 표지된 유리 TNFα 가 용출되는 방법.
  6. 샘플 내의 항-TNFα 약물에 대한 자가항체의 존재 또는 농도를 측정하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    (a) 표지된 항-TNFα 약물을 상기 샘플과 접촉시킴으로써 자가항체와의 표지된 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 상기 표지된 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 제공함으로써 표지된 유리 항-TNFα 약물로부터 상기 표지된 복합체를 분리하고, 상기 표지된 복합체의 양 및 상기 표지된 유리 항-TNFα 약물의 양을 검출하는 단계; 및
    (c) 단계 (b) 에서 검출된 상기 표지된 복합체의 양 및 상기 표지된 유리 항-TNFα 약물의 양을 상기 자가항체의 공지된 양의 표준 곡선과 비교하는 단계
    를 포함하는 것에 의해, 상기 자가항체의 존재 또는 농도를 측정하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    표준 곡선이 표지된 항-TNFα 약물을 자가항체에 양성인 혈청과 인큐베이션함으로써 생성되는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    자가항체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA), 인간 항-키메라 항체 (HACA), 인간 항-인간화 항체 (HAHA), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    표지된 항-TNFα 약물은 형광물질 표지된 항-TNFα 약물인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    형광물질이 Alexa Fluor® 염료인 방법.
  11. 제 6 항에 있어서,
    표지된 복합체가 우선 용출되고, 그 다음 표지된 유리 항-TNFα 약물이 용출되는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서,
    내부 컨트롤에 대한 표지된 유리 항-TNFα 약물의 비율을 측정하고 사용하여 표준 곡선으로부터 자가항체의 농도를 추론하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 혈청인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-TNFα 약물은 REMICADE™ (인플릭시마브), ENBREL™ (아타너셉트), HUMIRA™ (아달리무마브), CIMZIA® (세르톨리주마브 패골), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 일원인 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    크기 배제 크로마토그래피는 크기 배제-고속 액체 크로마토그래피 (size exclusion-high performance liquid chromatography, SE-HPLC) 인 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 항-TNFα 약물로 치료를 받고 있는 피검체로부터 수득되는 방법.
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Cited By (1)

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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2626268T3 (es) 2002-09-11 2017-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de purificación de proteínas
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
RU2571489C2 (ru) 2009-10-26 2015-12-20 Нестек С.А. Способы выявления препаратов и аутоантител против tnf
BR112013009376A2 (pt) * 2010-10-18 2016-07-26 Nestec Sa métodos para determinar isótipos de anticorpos antifármacos
BR112013020981A2 (pt) 2011-02-17 2016-10-11 Nestec Sa ensaios para a detecção de auto-anticorpos para os fármacos anti-tnf<244>
SG194710A1 (en) 2011-05-10 2013-12-30 Nestec Sa Methods of disease activity profiling for personalized therapy management
MX343324B (es) * 2011-07-06 2016-11-01 Nestec Sa Ensayos para detectar auto anticuerpos neutralizadores de la terapia biologica con tnf alpha.
WO2013080050A2 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Universitaetsklinikum Erlangen Methods and compositions for determining responsiveness to treatment with a tnf-alpha inhibitor
RU2638812C2 (ru) * 2012-03-08 2017-12-15 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиплексный иммунохроматографический способ определения циркулирующих иммунокомплексов
US20130295685A1 (en) * 2012-04-10 2013-11-07 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies
US10132736B2 (en) 2012-05-24 2018-11-20 Abbvie Inc. Methods for inspection of protein particles in a liquid beneficial agent
WO2014046474A2 (ko) * 2012-09-21 2014-03-27 가톨릭대학교 산학협력단 메트포민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101501375B1 (ko) 2012-09-21 2015-03-10 가톨릭대학교 산학협력단 메트포민을 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014054013A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 Nestec S.A. Methods for predicting and monitoring mucosal healing
BR112015012482A2 (pt) * 2012-11-30 2017-07-11 Nestec Sa ensaios para detecção de autoanticorpos neutralizantes à terapia com produtos biológicos
WO2014122600A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Methods of selecting combination therapy for colorectal cancer patients
EP2997371B1 (en) * 2013-05-16 2018-11-07 University of Pretoria A method of diagnosing tuberculosis
WO2015083085A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Nestec S.A. Signaling pathways in tissues from inflammatory bowel disease patients
EP3077818B1 (en) 2013-12-03 2020-02-05 Prometheus Biosciences, Inc. Methods for predicting post-operative recurrence of crohn's disease
WO2015110989A1 (en) 2014-01-23 2015-07-30 Nestec S.A. Biomarker panel for assessment of mucosal healing
WO2015166461A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Nestec S.A. Methods of selecting treatment regimen using tnf alpha and anti-tnf alpha drug levels
WO2016063223A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Nestec S.A. Methods for predicting clinical outcomes in subjects afflicted with ulcerative colitis
WO2016063204A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Nestec S.A. Methods for prediction of anti-tnf alpha drug levels and autoantibody formation
WO2016088068A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Nestec S.A. Methods for establishing a vedolizumab dosing regimen to treat patients with irritable bowel disease
BR112017011545A2 (pt) * 2014-12-05 2018-03-13 Nestec Sa ensaio de desvio de mobilidade homogênea indireto para a detecção de produtos biológicos nas amostras do paciente
CN107110853A (zh) * 2015-01-09 2017-08-29 阿通诺米斯公司 确定TNFα抑制药及其相应抗药抗体的量的通用测定法
WO2016135707A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Nestec S.A. Diagnosis of major depressive disorder, mild cognitive impairment, and alzheimer's disease and other neurologic and psychiatric disorders
EP3165922B1 (en) 2015-11-06 2020-06-17 Promise Proteomics A method for quantifying therapeutic antibodies
EP3165928B1 (en) * 2015-11-06 2019-01-09 Promise Advanced Proteomics A method for quantifying anti-tnf antibodies
WO2017201142A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Treatment of lung adenocarcinoma
JP2019522199A (ja) 2016-07-08 2019-08-08 アトノミックス アクティーゼルスカブ 試料中の治療用モノクローナル抗体及びそれらの対応する抗薬物抗体の量を確定するためのユニバーサルアッセイ
WO2019073391A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Nestec S.A. METHODS OF MONITORING VEDOLIZUMAB TREATMENT
EP3514541A1 (de) * 2018-01-17 2019-07-24 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur quantitativen bestimmung eines therapeutischen tnf-alpha inhibitors
US11079361B2 (en) * 2018-04-20 2021-08-03 Janssen Biotech, Inc. Chromatography column qualification in manufacturing methods for producing anti-IL12/IL23 antibody compositions
CA3130462A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-10 Amgen Inc. In vivo reversibility of high molecular weight species

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090035216A1 (en) 2007-08-03 2009-02-05 Biomonitor Aps Method for determining in vivo biopharmaceutical concentration or bioavailability

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700466A (en) 1981-09-08 1997-12-23 The Rockefeller University Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
US4459359A (en) 1981-11-19 1984-07-10 New York Blood Center, Inc. Sensitive immunoassays of antigens or antibodies sequestered within immune complexes
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4857456A (en) 1985-04-30 1989-08-15 The Regents Of The University Of California Assay of Bone morphogenetic protein (BMP) and anti-BMP antibody for the diagnosis of bone disorders
FR2590674B1 (fr) 1985-11-25 1989-03-03 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs de diagnostic
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US5223395A (en) 1988-12-01 1993-06-29 Centocor, Inc. Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples
EP0440044A1 (en) 1990-01-31 1991-08-07 Abbott Laboratories Avoidance of human anti-mouse antibody interference in in vitro diagnostic testing
US5094740A (en) 1990-02-16 1992-03-10 Glycomed, Inc. Two-dimensional electrophoretic separation of carbohydrates
GB9028123D0 (en) 1990-12-28 1991-02-13 Erba Carlo Spa Monoclonal antibodies against human tumor necrosis factor alpha
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US5582998A (en) 1991-06-19 1996-12-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor
JPH0566222A (ja) 1991-09-09 1993-03-19 Tosoh Corp 物質の分析方法
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
ES2150970T3 (es) 1993-09-07 2000-12-16 Wako Pure Chem Ind Ltd Procedimiento y reactivo para la medida de la actividad del complemento.
JPH07110331A (ja) * 1993-09-07 1995-04-25 Wako Pure Chem Ind Ltd ヒト補体価測定方法及びヒト補体価測定用試薬組成物
JPH07140144A (ja) 1993-11-19 1995-06-02 S R L:Kk アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の測定方法および抗原抗体複合体の測定方法
WO1996020219A2 (en) 1994-12-28 1996-07-04 University Of Kentucky Murine monoclonal anti-idiotype antibody 3h1
SI9720020B (en) * 1996-02-09 2001-12-31 Basf Ag Human antibodies that bind human TNF alpha
JP3718435B2 (ja) * 1996-08-12 2005-11-24 積水化学工業株式会社 細胞機能測定用容器及び細胞機能測定方法
CN1198815A (zh) 1996-08-12 1998-11-11 积水化学工业株式会社 用于测定细胞功能的容器、用于测定细胞功能的试剂盒以及用于测定细胞功能的方法
US6391622B1 (en) 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6309888B1 (en) 1998-09-04 2001-10-30 Leuven Research & Development Vzw Detection and determination of the stages of coronary artery disease
US6818749B1 (en) * 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
EP1127148B1 (en) * 1998-10-31 2012-08-08 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Variants of humanized anti-carcinoma monoclonal antibody cc49
DE19858777B4 (de) * 1998-12-18 2006-07-27 Delta Biotechnology Ltd. Verfahren zur teilweisen oder vollständigen Trennung von glykosilierten und nicht-glykosilierten Proteinen
US6680209B1 (en) 1999-12-06 2004-01-20 Biosite, Incorporated Human antibodies as diagnostic reagents
AU776395B2 (en) * 1999-12-06 2004-09-09 Leo Pharmaceutical Products Ltd. A/S (Lovens Kemiske Fabrik Produktionsaktieselskab) Aminobenzophenones as inhibitors of IL-1beta and TNF-alpha
AR026946A1 (es) 1999-12-16 2003-03-05 Amgen Inc Osteoprotegerina/receptores de factores de necrosis de tumores
UA81743C2 (uk) * 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
ATE476654T1 (de) 2001-03-02 2010-08-15 Activx Biosciences Inc Plattform für protein-profiling
US7256257B2 (en) * 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030040027A1 (en) 2001-08-16 2003-02-27 Gerd Ritter Method for determining protein component in a biological sample
MXPA04004417A (es) 2001-11-12 2004-08-11 Merck Patent Gmbh Anticuerpo anti-tnf alfa modificado.
US20060110407A1 (en) 2001-12-05 2006-05-25 Shelley Stopera Immune globulin formulations for the treatment and prevention of an orthopoxvirus infection
GB0208817D0 (en) 2002-04-17 2002-05-29 European Molecular Biology Lab Embl Method for producing monoclonal antibodies
US20040022792A1 (en) 2002-06-17 2004-02-05 Ralph Klinke Method of stabilizing proteins at low pH
US20060078944A1 (en) 2002-08-01 2006-04-13 Jun Kuai Methods and reagents relating to inflammation and apoptosis
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US7662569B2 (en) 2003-04-11 2010-02-16 Cedars-Sinai Medical Center Methods of assessing Crohn's disease patient phenotype by I2 serologic response
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
WO2005094200A2 (en) 2003-06-20 2005-10-13 University Of Florida Biomarkers for differentiating between type 2 and type 2 diabetes
WO2005012353A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Amgen Inc. Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides
JP2007528868A (ja) 2003-08-14 2007-10-18 ワイス 抗ルイスｙ抗イディオタイプ抗体およびその使用
EP1519194A1 (en) 2003-09-24 2005-03-30 Roche Diagnostics GmbH Use of gfap for identification of intracerebral hemorrhage
US20090275496A1 (en) 2004-05-07 2009-11-05 Peptimmune, Inc. Effective quantitation of complex peptide mixtures in tissue samples and improved therapeutic methods
CA2572263A1 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Centocor, Inc. Detection or measurement of antibodies to antigenic proteins in biological tissues or samples
US20060253263A1 (en) 2005-04-11 2006-11-09 Meshkin Brian J Method to optimize drug selection, dosing and evaluation and to help predict therapeutic response and toxicity from immunosuppressant therapy
US7601335B2 (en) 2005-05-20 2009-10-13 Genentech, Inc. Pretreatment of a biological sample from an autoimmune disease subject
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
CA2615846A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Genmab A/S Potency assays for antibody drug substance binding to an fc receptor
US20090162374A1 (en) 2005-09-14 2009-06-25 Geraghty Daniel E Specific removal of activated immune cells
US7542502B2 (en) 2005-09-27 2009-06-02 Cymer, Inc. Thermal-expansion tolerant, preionizer electrode for a gas discharge laser
JP2009514977A (ja) * 2005-11-08 2009-04-09 メダレックス インコーポレーティッド 免疫刺激性治療用抗体による治療に付随した腸炎に対するＴＮＦ−α遮断剤処置法
JP2007147367A (ja) 2005-11-25 2007-06-14 Sekisui Chem Co Ltd サイトカイン産生能の測定方法
DE102005057920A1 (de) 2005-12-02 2007-06-28 Strohner, Pavel, Dr. Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben
WO2008008349A2 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Drexel University Methods of quantitatively assessing inflammation with biosensing nanoparticles
US20080286774A1 (en) 2007-05-16 2008-11-20 The Regents Of The University Of California Real-time individualized therapy evaluation
EP2200613B1 (en) * 2007-09-21 2018-09-05 The Johns Hopkins University Phenazine derivatives and uses thereof
CA2712021A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Methods and kits for detecting antibodies against therapeutic antibodies
EP2263085A4 (en) 2008-03-05 2011-07-06 Singulex Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGHLY SENSITIVE DETECTION OF MOLECULES
RU2571489C2 (ru) 2009-10-26 2015-12-20 Нестек С.А. Способы выявления препаратов и аутоантител против tnf
BR112013009376A2 (pt) 2010-10-18 2016-07-26 Nestec Sa métodos para determinar isótipos de anticorpos antifármacos
BR112013020981A2 (pt) 2011-02-17 2016-10-11 Nestec Sa ensaios para a detecção de auto-anticorpos para os fármacos anti-tnf<244>
US20130266963A1 (en) 2011-07-06 2013-10-10 Nestec S.A. Assay for detecting neutralizing autoantibodies to biologic therapy
MX343324B (es) 2011-07-06 2016-11-01 Nestec Sa Ensayos para detectar auto anticuerpos neutralizadores de la terapia biologica con tnf alpha.
US20130295685A1 (en) 2012-04-10 2013-11-07 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies
US20140051184A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Nestec S.A. Mobility shift assays for detecting anti-tnf alpha drugs and autoantibodies thereto
BR112015012482A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Nestec Sa ensaios para detecção de autoanticorpos neutralizantes à terapia com produtos biológicos
BR112017011545A2 (pt) 2014-12-05 2018-03-13 Nestec Sa ensaio de desvio de mobilidade homogênea indireto para a detecção de produtos biológicos nas amostras do paciente

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090035216A1 (en) 2007-08-03 2009-02-05 Biomonitor Aps Method for determining in vivo biopharmaceutical concentration or bioavailability

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ann Rheum Dis., (2007), 66, pp 253-256.
ARTHRITIS & RHEUMATISM, (2006), Vol. 54, No. 12, pp 3782-3789.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220063800A (ko) 2020-11-09 2022-05-18 바디텍메드(주) 항tnf-알파 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트
KR102562006B1 (ko) 2020-11-09 2023-08-02 바디텍메드(주) 항tnf-알파 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016106222A (ja) 2016-06-16
ZA201504548B (en) 2019-10-30
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US20140057367A1 (en) 2014-02-27
AU2010315547A1 (en) 2012-05-10
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JP5697677B2 (ja) 2015-04-08
US20150024404A1 (en) 2015-01-22
WO2011056590A1 (en) 2011-05-12
AU2015202899A1 (en) 2015-06-18
AU2019205009A1 (en) 2019-08-01
US8574855B2 (en) 2013-11-05
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EP2494352A1 (en) 2012-09-05
JP6082831B2 (ja) 2017-02-15
NZ621655A (en) 2015-08-28
RU2012121710A (ru) 2013-12-10
NZ706187A (en) 2016-09-30
IL219315B (en) 2018-01-31
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NZ599456A (en) 2014-06-27
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JP2015148616A (ja) 2015-08-20
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JP2013508739A (ja) 2013-03-07
AU2017213584B2 (en) 2019-04-18
US9506920B2 (en) 2016-11-29
AU2010315547B2 (en) 2015-03-05
CN104634955A (zh) 2015-05-20
KR20120108978A (ko) 2012-10-05
CN104634955B (zh) 2016-09-14
US8865417B2 (en) 2014-10-21
IL219315A0 (en) 2012-06-28
CN102695955B (zh) 2015-03-18
ES2796530T3 (es) 2020-11-27
KR20170088437A (ko) 2017-08-01
EP2494352B1 (en) 2020-04-08

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