ES2796530T3 - Ensayos para la detección de fármacos anti-TNF y autoanticuerpos - Google Patents

Ensayos para la detección de fármacos anti-TNF y autoanticuerpos Download PDF

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Abstract

Un método para determinar la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, en la que el fármaco anti-TNFa es un anticuerpo para TNFα, comprendiendo el método: (a) poner en contacto un TNFα marcado con una muestra biológica que tiene un fármaco anti-TNFα para formar un complejo marcado con el fármaco anti-TNFa; (b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del TNFα marcado y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del TNFα marcado libre; (c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del TNFα marcado libre detectado en la etapa (b); y (d) determinar la presencia o nivel de fármaco anti-TNFα basándose en la proporción calculada en la etapa (c).

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos para la detección de fármacos anti-TNF y autoanticuerpos
Antecedentes de la invención
Los trastornos autoinmunitarios son un problema médico importante y muy extendido. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmunitaria que afecta a más de dos millones de personas en los Estados Unidos de América. La AR causa inflamación crónica de las articulaciones y normalmente se trata de una enfermedad progresiva que tiene el potencial de provocar destrucción articular y discapacidad funcional. Se desconoce la causa de la artritis reumatoide, aunque se han relacionado con la etiología de la enfermedad la predisposición genética, agentes infecciosos y factores ambientales. En la AR activa, entre los síntomas se pueden incluir la fatiga, falta de apetito, fiebre moderada, dolores musculares y articulares y rigidez. Incluso, durante los brotes de la enfermedad, las articulaciones con frecuencia se enrojecen, se hinchan, duelen y se vuelven sensibles, debido a la inflamación de la membrana sinovial. Asimismo, dado que la AR es una enfermedad sistémica, la inflamación puede afectar a órganos y áreas del cuerpo aparte de las articulaciones, incluyendo las glándulas de los ojos y la boca, la mucosa pulmonar, el pericardio y los vasos sanguíneos.
Los métodos tradicionales para el tratamiento de la AR y otros trastornos autoinmunitarios incluyen los "fármacos de primera línea" de actuación rápida y los "fármacos de segunda línea" de actuación más lenta. Los fármacos de primera línea reducen el dolor y la inflamación. Entre los ejemplos de fármacos de primera línea se incluyen la aspirina, naproxeno, ibuprofeno, etodolac y otros fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE; en inglés, NSAID), así como los corticoesteroides, administrados oralmente o inyectados directamente en tejidos y articulaciones. Los fármacos de segunda línea propician la remisión de la enfermedad y previenen la destrucción progresiva de la articulación y también se es denomina fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME; en inglés, DMARD). Entre los ejemplos de fármacos de segunda línea se incluyen el oro, hidrocloroquina, azulfidina y agentes inmunosupresores, tales como metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida, clorambucilo y ciclosporina. Muchos de estos fármacos, sin embargo, pueden tener efectos secundarios perjudiciales. Por tanto, se han buscado terapias adicionales para la artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios.
El factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) es una citocina que se produce por muchos tipos celulares, incluidos los monocitos y los macrófagos, que se identificó originalmente basándose en su capacidad para inducir la necrosis de ciertos tumores de ratón. Posteriormente, un factor denominado caquectina, asociado con la caquexia, se mostró idéntico al TNF-a. El TNF-a se ha relacionado con la fisiopatología de diversas enfermedades y trastornos humanos, incluyendo el shock, sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, AR, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra huésped.
Debido al papel dañino del TNF-a humano (hTNF-a) sobre diversos trastornos humanos, se han diseñado estrategias terapéuticas para inhibir o contrarrestar la actividad del hTNF-a. En particular, se han buscado anticuerpos que se unan y neutralicen al hTNF-a como forma de inhibir la actividad del hTNF-a. Algunos de los primeros de tales anticuerpos fueron los anticuerpos monoclonales (mAb) de ratón, secretados por hibridomas preparados a partir de linfocitos de ratones inmunizados con hTNF-a (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N°. 5.231.024 de Moeller et al.). Mientras que estos anticuerpos anti-hTNF-a de ratón muestran a menudo afinidad elevada por hTNF-a y fueron capaces de neutralizar la actividad de TNF-a, su utilización in vivo se ha limitado por problemas asociados con la administración de anticuerpos de ratón a seres humanos, tales como una semivida de suero corta, una incapacidad para desencadenar ciertas funciones efectoras humanas y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra el anticuerpo de ratón en un ser humano (la reacción "anticuerpo humano antirratón" (HAMA; del inglés, human anti-mouse antibody)).
Más recientemente, se han aplicado terapias biológicas al tratamiento de trastornos autoinmunitarios tales como la artritis reumatoide. Por ejemplo, la FDA ha aprobado cuatro inhibidores de TNFa, REMICADE™ (infliximab), un mAb quimérico de anti-TNFa, ENBREL™ (etanercept), una proteína de fusión TNFR-Fc de Ig, HUMiRa ™ (adalimumab), un mAb humano anti-TNFa y CIMZIA® (certolizumab pegol), un fragmento Fab PEGilado, para el tratamiento de la artritis reumatoide. También se utiliza CIMZIA® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn (EC) moderada a grave. Mientas que tales terapias biológicas se han demostrado exitosas en el tratamiento de artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios tales como EC, no todos los sujetos tratados respondieron o respondieron bien, a tales terapias. Por otra parte, la administración de inhibidores de TNFa puede inducir una respuesta inmunitaria al fármaco y provocar la producción de anticuerpos tales como los anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA; del inglés, anti-chimeric antibodies), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA; del inglés, human anti-humanized antibodies) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA; del inglés, anti-mouse antibodies). Dichas respuestas inmunitarias HACA, HAHA o HAMA, pueden asociarse con reacciones de hipersensibilidad y cambios drásticos en la farmacocinética y la biodistribución del inhibidor de TNFa inmunoterapéutico que impiden el tratamiento posterior con el fármaco. Por tanto, en la técnica se necesitan ensayos para detectar la presencia de anti-TNFa biológicos y/o sus autoanticuerpos en una muestra de paciente para monitorizar la terapia con inhibidores de TNFa y para guiar las decisiones del tratamiento. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.
Se mencionan también los siguientes documentos:
• Documento n°. US2009/035216 A1, que se refiere a un método para determinar la concentración o biodisponibilidad de biofármacos in vivo;
• Santora et al. (2001) Analytical Biochemistry 229(2): 119-129, que se refiere a la caracterización de complejos no covalentes de antígeno y anticuerpo monoclonales humanos utilizando intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño y BIAcore; y
• Kim et al. (2007) Journal Molecular Biology, 374(5): 1374-1388.
Breve sumario de la invención
El TNF-a ha estado implicado en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, víricas, infecciones bacterianas y parasitarias, neoplasias malignas y/o enfermedades neurodegenerativas y es un objetivo útil para la terapia biológica específica en enfermedades tales como artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Los inhibidores de TNFa tales como los anticuerpos anti-TNFa son una clase de terapéutica importante. Se necesitan métodos de ensayo para detectar la presencia de agentes biológicos anti-TNFa y/o sus autoanticuerpos.
Como tal, en una realización, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, en la que el fármaco anti-TNFa es un anticuerpo para TNFa, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto un TNFa marcado con una muestra biológica que tiene un fármaco anti-TNFa para formar un complejo marcado con el fármaco anti-TNFa;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del TNFa marcado y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del TNFa marcado libre; (c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de fármaco anti-TNFa basándose en la proporción calculada en la etapa (c). En ciertos casos, los métodos son útiles para medir los niveles de REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab) y CIMZIA® (certolizumab pegol) en una muestra, por ejemplo, de un sujeto que recibe tal terapia de fármaco anti-TNFa.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, comprendiendo el método:
a) poner en contacto un fármaco TNFa marcado con la muestra biológica para formar un complejo marcado con el autoanticuerpo;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del fármaco de TNFa marcado libre y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre;
(c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de autoanticuerpo basándose en la proporción calculada en la etapa (c). En ciertos casos, los métodos son útiles para medir los niveles de autoanticuerpos que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA) en una muestra, por ejemplo, de un sujeto que recibe terapia de fármaco anti-TNFa. También se desvela un método para detectar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra, que comprende:
a) poner en contacto un fármaco anti-TNFa marcado y un TNFa marcado con una muestra que tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa para formar un primer complejo marcado (es decir, inmunocomplejo o conjugado) entre el fármaco anti-TNFa marcado, el TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en el que los componentes del primer complejo marcado no están unidos covalentemente entre sí) y un segundo complejo marcado (es decir, inmunocomplejo o conjugado) entre el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en el que los componentes del segundo complejo marcado no están unidos covalentemente entre sí), en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado comprenden marcas diferentes;
(b) someter el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado (por ejemplo, entre sí y del TNFa marcado libre y el fármaco anti-TNFa marcado libre); y
(c) detectar el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado, detectando así la presencia o el nivel de una forma no neutralizante del autoanticuerpo (es decir, en el que el autoanticuerpo no interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa) cuando tanto el primer complejo marcado libre como el segundo complejo marcado libre están presentes y detectando la presencia de una forma neutralizante del autoanticuerpo (es decir, en la que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa) cuando solo el segundo complejo marcado está presente.
En ciertos casos, los métodos son útiles para medir los niveles de autoanticuerpos que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA) en una muestra, por ejemplo, de un sujeto que recibe terapia de fármaco anti-TNFa. También se desvela un método para detectar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra, que comprende:
(a) poner en contacto un fármaco anti-TNFa marcado con una muestra que tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa para formar un primer complejo marcado (es decir, inmunocomplejo o conjugado) entre el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo (es decir, en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo no están unidos covalentemente entre sí);
(b) someter el primer complejo marcado a una primera cromatografía de exclusión por tamaño para separar el primer complejo marcado (por ejemplo, del fármaco anti-TNFa marcado libre);
(c) detectar el primer complejo marcado, detectando así la presencia o el nivel del autoanticuerpo;
(d) poner en contacto el TNFa marcado con el primer complejo marcado para formar un segundo complejo marcado (es decir, immunocomplejo o conjugado) entre el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado (es decir, en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado no están unidos covalentemente entre sí), en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado comprenden marcas diferentes;
(e) someter el segundo complejo marcado a una segunda cromatografía de exclusión por tamaño para separar el segundo complejo marcado (por ejemplo, a partir de TNFa marcado libre); y
(f) detectar el segundo complejo marcado, detectando así la presencia o el nivel de una forma neutralizante del autoanticuerpo (es decir, en la que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa).
En ciertos casos, los métodos son útiles para medir los niveles de autoanticuerpos que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA) en una muestra, por ejemplo, de un sujeto que recibe terapia de fármaco anti-TNFa. También se desvela un método para determinar una cantidad eficaz de un fármaco anti-TNFa para un sujeto que recibe una terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel del fármaco anti-TNFa en una primera muestra del sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto la primera muestra con una cantidad de TNFa marcado para formar un primer complejo que comprende el TNFa marcado con el fármaco anti-TNFa; y
(ii) detectar el primer complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo así el nivel del fármaco anti-TNFa;
(b) medir el nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una segunda muestra del sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto la segunda muestra con una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado para formar un segundo complejo que comprende el fármaco anti-TNFa marcado con el autoanticuerpo; y
(ii) detectar el segundo complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo así el nivel del autoanticuerpo; y
(c) restar el nivel de autoanticuerpo medido en la etapa (b) del nivel del fármaco anti-TNFa medido en la etapa (a),
determinando así la cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa.
También se desvela un método para optimizar la cantidad terapéutica de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) determinar una cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa según un método de la presente invención;
(b) comparar la cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa con el nivel del fármaco anti-TNFa; y
(c) determinar una dosis posterior del fármaco anti-TNFa para el sujeto basándose en la comparación de la etapa (b),
optimizando así la cantidad terapéutica del fármaco anti-TNFa.
También se desvela un método para optimizar la terapia y/o reducir la toxicidad de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel del fármaco anti-TNFa en una primera muestra del sujeto;
(b) medir el nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una segunda muestra del sujeto; y (c) determinar un curso posterior de la terapia para el sujeto basándose en los niveles del fármaco anti-TNFa y del autoanticuerpo,
optimizando así la terapia y/o reduciendo la toxicidad del fármaco anti-TNFa.
También se desvela un método para determinar la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno en una muestra que tiene o se sospecha que tiene un fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método: (a) poner en contacto una cantidad de un fármaco TNFa marcado y una cantidad de un control interno marcado con la muestra para formar un complejo del TNFa marcado y el fármaco anti-TNFa marcado;
(b) detectar el TNFa marcado y el control interno marcado mediante cromatografía de exclusión por tamaño; (c) integrar el área bajo la curva para un pico del TNFa marcado a partir de un gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(d) integrar el área bajo la curva para un pico del control interno marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(e) determinar una primera proporción dividiendo la cantidad de TNFa marcado por la cantidad de control interno marcado;
(f) determinar una segunda proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (c) por la integración resultante de la etapa
(d); y
(g) comparar la primera proporción determinada en la etapa (e) con la segunda proporción determinada en la etapa (f),
determinando así la presencia o el nivel del fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno.
También se desvela un método para optimizar la cantidad terapéutica de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método: determinar la dosis posterior del fármaco anti-TNFa para el sujeto basándose en una comparación de la proporción del TNFa marcado respecto al control interno marcado en el etapa (e) del párrafo previo con la proporción del TNFa marcado respecto al control interno marcado de la etapa (f) en el párrafo anterior, optimizando así la cantidad terapéutica del fármaco anti-TNFa.
También se desvela un método para determinar la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno en una muestra que tiene o se sospecha que tiene el autoanticuerpo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado y una cantidad de un control interno marcado con la muestra para formar un complejo del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo;
(b) detectar el anti-TNFa marcado y el control interno marcado mediante cromatografía de exclusión por tamaño; (c) integrar el área bajo la curva para un pico del fármaco anti-TNFa marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(d) integrar el área bajo la curva para un pico del control interno marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(e) determinar una primera proporción dividiendo la cantidad de fármaco anti-TNFa marcado por la cantidad de control interno marcado; y
(f) determinar una segunda proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (c) y (d); y (g) comparar la primera proporción determinada en la etapa (e) con la segunda proporción determinada en la etapa (f),
determinando así la presencia o el nivel del autoanticuerpo con referencia a un control interno.
También se desvela un kit para medir la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa y la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra, comprendiendo el kit:
(a) un primer sustrato de medición que comprende una cantidad de TNFa marcado;
(b) un segundo sustrato de medición que comprende una cantidad de anti-TNFa marcado;
(c) opcionalmente, un tercer sustrato de medición que comprende una cantidad de TNFa marcado y una cantidad de control interno marcado;
(d) opcionalmente, un cuarto sustrato de medición que comprende una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado y una cantidad de control interno marcado;
(e) opcionalmente, un medio para extraer una muestra de un sujeto; y
(f) opcionalmente, un folleto de instrucciones para utilizar el kit.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una realización ejemplar de los ensayos de la presente invención en la que se utiliza HPLC de exclusión por tamaño para detectar la unión entre TNFa-Alexa647 y HUMIRA™.
La figura 2 muestra las curvas de respuesta a la dosis de la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647.
La figura 3 muestra un método actual basado en ELISA para medir niveles de HACA, conocido como el ensayo de puente.
La figura 4 ilustra una descripción ejemplar de los ensayos de detección de autoanticuerpos de la presente invención para medir las concentraciones de HACA/HAHA generadas contra REMICADE™.
La figura 5 muestra un análisis de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG humana a REMICADE™-Alexa647.
La figura 6 muestra un segundo análisis de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG humana a REMICADE™-Alexa647.
La figura 7 muestra curvas de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG humana a REMICADE™-Alexa647.
La figura 8 muestra la formación del inmunocomplejo REMICADE™-Alexa647 en suero humano normal y en suero positivo para HACA.
La figura 9 proporciona un sumario de las mediciones de HACA a partir de 20 muestras de suero de pacientes que se realizaron utilizando el ensayo de puente o el ensayo de cambio de movilidad de la presente invención. La figura 10 proporciona un sumario y una comparación de los métodos actuales para medir concentraciones de suero de HACA con el ensayo nuevo de HACA de la presente invención.
La figura 11 muestra los perfiles de HPLC-ET de IFX marcado con fluoróforo (Fl) incubado con suero normal (SHN) o con suero positivo para HACA (SPH). La adición de cantidades crecientes de suero positivo para HACA a la mezcla de incubación dependiente de la dosis desplazó el pico IFX-FI a las posiciones de elución de masas moleculares más elevadas, C1 y C2.
La figura 12 muestra las curvas de respuesta a la dosis del IFX-Fl unido y libre generados con diluciones crecientes de suero positivo para HACA como determinó el ensayo de cambio de movilidad. (A) Las diluciones crecientes de suero positivo para HACA se incubaron con 37,5 ng de IFX-Fl. Cuanto mayor fue la dilución (menos HACA) más IFX-FI libre se encontró en el análisis de HPLC-ET. (B) Las diluciones crecientes de suero positivo para HACA se incubaron con 37,5 ng de IFX-Fl. Cuanto mayor fue la dilución (menos HACA) menos IFX-FI unido a HACA se encontró en el análisis de HPLC-ET.
La figura 13 muestra los perfiles de HPLC-ET de TNFa-FI incubado con suero normal (SHN) o enriquecido con IFX. La adición de cantidades crecientes de suero enriquecido con IFX a la mezcla de incubación dependiente de la dosis desplazó el pico fluorescente de TNFa a las posiciones de elución de masas moleculares más elevadas. La figura 14 muestra las curvas de respuesta a la dosis del TNFa unido y libre generadas con diluciones crecientes de suero enriquecido con IFX como determinó el ensayo de cambio de movilidad. Las concentraciones crecientes de IFX añadidas a la mezcla de incubación disminuyen el porcentaje de TNFa libre, mientras incrementan el porcentaje de TNFa unido.
La Figura 15 muestra la medición del nivel de HACA relativo y la concentración de IFX en pacientes con EII tratados con IFX en diferentes puntos temporales mediante el ensayo de cambio de movilidad.
La Figura 16 muestra la gestión de pacientes de la medida del nivel de HACA y concentración de IFX en el suero de pacientes de EII tratados con IFX en diferentes puntos temporales.
La figura 17 muestra realizaciones ejemplares de los ensayos de la presente invención para detectar la presencia de anticuerpos (A) no neutralizantes o (B) neutralizantes tales como HACA.
La figura 18 muestra una realización ejemplar de los ensayos de la presente invención para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes tales como HACA.
La figura 19 muestra perfiles de cambios de movilidad de ADL marcado con Fl incubado con suero humano normal (SHN) en presencia de distintas cantidades de anti-IgG humana. La adición de cantidades crecientes de anti-IgG humana a la mezcla de incubación dependiente de la dosis desplazó el pico de F1-ADL libre (FA) a las posiciones de elución de masas moleculares más elevadas, C1 y C2, mientras que el control interno (CI) no cambió.
La figura 20 muestra una curva de respuesta a la dosis de anti-IgG humana sobre el cambio de Fl-ADL libre. Se incubaron dosis crecientes de anti-IgG humana con 37,5 ng de F1-ADL y con control interno. Cuanto más anticuerpo se añadió a la mezcla de reacción menor fue la proporción de F1-ADL libre respecto al control interno. La figura 21 muestra perfiles de cambios de movilidad de TNF-a marcado con Fl incubado con suero humano normal (SHN) en presencia de distintas cantidades de ADL. Ex = 494 nm; Em = 519 nm. La adición de cantidades crecientes de ADL a la mezcla de incubación dependiente de la dosis desplazó el pico de TNF-Fl libre (FT) a las posiciones de elución de masas moleculares más elevadas, mientras que el pico del control interno (CI) no cambió.
La figura 22 muestra una curva de respuesta a la dosis de ADL sobre el cambio de TNF-a-Fl. Se incubaron dosis crecientes de ADL con 100 ng de TNF-a-Fl y con control interno. Cuanto más anticuerpo de ADL se añadió a la mezcla de reacción menor fue la proporción de TNF-a-Fl libre respecto al control interno.
La figura 23 muestra los perfiles de cambio de movilidad de Remicade marcado con Fl (IFX) incubado con suero normal (SHN) o suero de pacientes agrupado positivo para HACA.
La figura 24 muestra los perfiles de cambio de movilidad de HUMIRA marcado con F1 (ADL) incubado con suero normal (SHN) o anticuerpo de Anti-IgG1 humana de ratón.
La figura 25 muestra los perfiles de cambio de movilidad de HUMIRA marcado con F1 (ADL) incubado con suero normal (SHN) o suero de pacientes agrupado positivo para HACA.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que un ensayo de cambio de movilidad homogéneo que utiliza cromatografía de exclusión por tamaño es particularmente ventajoso para medir la presencia o el nivel de inhibidores de TNFa así como de los anticuerpos (por ejemplo, HACA, HAHA, etc.) que se generan contra ellos. En particular, la presente invención proporciona ensayos de "mezcla y lectura" que no requieren ninguna etapa de lavado. Como resultado, se pueden separar fácilmente entre sí agentes terapéuticos de proteínas en complejos y no en forma de complejos. Además, cualquier interferencia potencial del fármaco libre se minimiza utilizando los ensayos de la presente invención. En cambio, no se puede realizar un ELISA típico para medir los niveles de HACA o HAHA hasta que el inhibidor de TNFa se elimina del cuerpo, lo cual puede llevar hasta 3 meses. Los ensayos de la presente invención son ventajosos también porque evitan la unión de antígenos a superficies sólidas, eliminan las uniones no específicas de IgG no relevantes, detectan anticuerpos con afinidades débiles y exhiben sensibilidad y especificidad creciente sobre cualquier método de detección disponible en la actualidad, tales como los inmunoensayos enzimáticos.
La importancia de medir concentraciones de sueros de agentes biológicos anti-TNFa así como de otras inmunoterapias se ilustra por el hecho de que la FDA requiere estudios de farmacocinética y tolerancia (por ejemplo, respuesta inmunitaria) que se han de realizar durante los ensayos clínicos. La presente invención también considera útil monitorizar pacientes que reciben estos fármacos para asegurar que están recibiendo la dosis adecuada, que el fármaco no se está eliminando del cuerpo demasiado rápido y que no están desarrollando una respuesta inmunitaria contra el fármaco. Asimismo, la presente invención es útil para guiar el cambio entre diferentes fármacos debido al fallo con el fármaco inicial.
II. Definiciones
Como se utiliza en el presente documento, los siguientes términos y expresiones tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique de otra manera.
Las expresiones "fármaco anti-TNFa" o "inhibidor de TNFa" tal como se utilizan en el presente documento tienen por objeto abarcar agentes que incluyen proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión Ig o proteínas de fusión Fc), proteínas de unión multivalente (por ejemplo, Ig DVD), antagonistas de TNFa de molécula pequeña y moléculas similares que se encuentran o no en la naturaleza y/o formas de las mismas recombinantes y/o modificadas genéticamente, que, directa o indirectamente, inhiben la actividad de TNFa, tales como mediante la inhibición de TNFa con un receptor de superficie celular para TNFa, inhibición de la producción de proteínas de TNFa, inhibición de la expresión génica de TNFa, inhibición de la secreción de células de TNFa, inhibición de la señalización del receptor de TNFa o cualquier otro medio que dé como resultado la disminución de la actividad de TNFa en un sujeto. La expresión "fármaco anti-TNFa" o "inhibidor de TNFa" incluye preferentemente agentes que interfieren con la actividad de TNFa. Entre los ejemplos de inhibidores de TNFa se incluyen etanercept (ENBREL™, Amgen), infliximab (REMICADE™, Johnson and Johnson), anticuerpo monoclonal anti-TNF humano adalimumab (D2E7/HUMIRA™, Abbott Laboratories), certolizumab pegol (CIMZIA®, UCB, Inc.), CDP 571 (Celltech) y CDP 870 (Celltech), así como otros compuestos que inhiben la actividad de TNFa, tales como cuando se administra a un sujeto que sufre o está en riesgo de sufrir un trastorno en el que la actividad de TNFa es perjudicial (por ejemplo, AR), el trastorno se trata.
La expresión "que predice la sensibilidad hacia un inhibidor de TNFa", como se utiliza en el presente documento, tiene por objeto referirse a una capacidad de calcular la probabilidad de que el tratamiento de un sujeto con un inhibidor de TNFa será o no efectivo en (por ejemplo, proporcionar un beneficio medible para) el sujeto. En particular, tal capacidad para calcular la probabilidad de que el tratamiento sea o no efectivo, se ejerce normalmente después de que el tratamiento haya comenzado y de que se haya observado un indicador de eficacia (por ejemplo, un indicador de beneficio medible) en el sujeto. Los inhibidores de TNFa preferidos particularmente son agentes biológicos que se han aprobado por la FDA para su uso en seres humanos en el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por TNFa, tales como, por ejemplo, artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria del intestino (EII; en inglés, IBD), dichos agentes incluyen adalimumab (HUMIRA™), infliximab (REMICADE™) etanercept (ENBREL™) y certolizumab pegol (CIMZIA®, UCB, Inc.).
La expresión "cromatografía de exclusión por tamaño" (CET) tiene por objeto incluir un método cromatográfico en el que las moléculas en solución se separan en función de su tamaño y/o volumen hidrodinámico. Se aplica a moléculas grandes o a complejos macromoleculares tales como proteínas y sus conjugados. Normalmente, cuando se utiliza una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, se conoce la técnica como cromatografía de filtración en gel.
Los términos "complejo", "immunocomplejo", "conjugado", e "inmunoconjugado" incluyen, aunque no se limitan a, TNFa unido (por ejemplo, por medios no covalentes) a un fármaco anti-TNFa, un fármaco anti-TNFa unido (por ejemplo, por medios no covalentes) a un anticuerpo contra el fármaco anti-TNFa y un fármaco anti-TNFa unido (por ejemplo, por medios no covalentes) tanto a TNFa como a un anticuerpo contra el fármaco anti-TNFa.
Como se utiliza en el presente documento, una entidad que se ve modificada por el término "marcado" incluye cualquier entidad, molécula, proteína, enzima, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, citocina o especie relacionada que se conjuga con otra molécula o entidad química que es detectable empíricamente. Entre las especies químicas adecuadas como marcas para entidades marcadas se incluyen, aunque no se limitan a, colorantes fluorescentes, por ejemplo, los colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa Fluor® 647, puntos cuánticos, colorantes ópticos, colorantes luminiscentes y radionúclidos, por ejemplo, I125.
La expresión "cantidad eficaz" incluye una dosis de un fármaco que es capaz de alcanzar un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesita al respecto, así como la cantidad biodisponible de una sustancia. El término "biodisponible" incluye la fracción de una dosis administrada de un fármaco que está disponible para la actividad terapéutica. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un fármaco útil para tratar enfermedades y trastornos en los que se ha implicado TNFa en la fisiopatología, por ejemplo, pero sin limitarse a, shock, sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, AR, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra huésped, puede ser la cantidad que es capaz de prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados con la misma.
La expresión "área bajo la curva" es una expresión matemática de la técnica utilizada para describir una integración de una porción de un gráfico bidimensional. Por ejemplo, en un gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de cromatografía de exclusión por tamaño, varios picos en el gráfico indican la detección de moléculas en particular. La integración de estos picos incluye el área circunscrita por un valor mínimo del eje Y, por ejemplo, la línea basal del gráfico bidimensional y la circunscrita por el gráfico bidimensional en sí mismo. La integración de un pico también se describe igualmente por la fórmula de cálculo, Área bajo la curva= Iabf(x)dx, en la que f(x) es una función que describe el gráfico bidimensional y las variables "a" y "b" indican los límites del eje X del pico integrado.
La expresión "detección de marca de fluorescencia" incluye un medio para la detección de una marca fluorescente. Entre los medios de detección se incluyen, aunque no se limitan a, un espectrómetro, un fluorímetro, un fotómetro, un dispositivo de detección incorporado habitualmente con un instrumento de cromatografía, tal como, pero sin limitarse a, una cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño, tal como, pero sin limitarse a, un sistema de HPLC Agilent-1200.
Los corchetes, "[ ]" indican que se hace referencia a las especies dentro de los corchetes por su concentración. La expresión "optimizar la terapia" incluye optimizar la dosis (por ejemplo, la cantidad o el nivel eficaz) y/o el tipo de una terapia en particular. Por ejemplo, optimizar la dosis de un fármaco anti-TNFa incluye aumentar o disminuir la cantidad del fármaco anti-TNFa administrado posteriormente a un sujeto. En ciertos casos, optimizar el tipo de un fármaco anti-TNFa incluye cambiar el fármaco anti-TNFa administrado de un fármaco a otro fármaco diferente (por ejemplo, un fármaco anti-TNFa diferente). En ciertos otros casos, optimizar la terapia incluye coadministrar una dosis de un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis incrementada, disminuida o la misma respecto a la dosis previa), junto con un fármaco inmunosupresor.
El término "coadministrar" incluye administrar más de un agente activo, de modo que la duración del efecto fisiológico de un agente activo solape con el efecto fisiológico de un segundo agente activo.
Los términos "sujeto", "paciente", o "individuo" se refieren normalmente a seres humanos, pero también a otros animales, incluyendo, por ejemplo, otros primates, roedores, cánidos, felinos, équidos, ovinos, porcinos y similares. La expresión "curso de la terapia" incluye cualquier abordaje terapéutico tomado para aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno mediado por TNFa. La expresión abarca la administración de cualquier compuesto, fármaco, procedimiento y/o régimen útil para mejorar la salud de un individuo con una enfermedad o trastorno mediado por TNFa e incluye cualquiera de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento. El experto en la materia apreciará que el curso de la terapia o la dosis del curso de la terapia actual se puede cambiar (por ejemplo, aumentar o disminuir) basándose en el nivel de presencia o concentración de un fármaco anti-TNFa y/o un anticuerpo para el fármaco anti-TNFa.
Las expresiones "fármaco inmunosupresor" o "agente inmunosupresor" incluyen cualquier sustancia capaz de producir un efecto inmunosupresor, por ejemplo, la prevención o la disminución de la respuesta inmunitaria, como a través de radiación o administración de fármacos tales como antimetabolitos, sueros antilinfocitarios, anticuerpos, etc. Entre los ejemplos fármacos inmunosupresores adecuados se incluyen, sin limitación, fármacos tiopurina tales como azatioprina (AZA) y metabolitos del mismo; antimetabolitos tales como el metotrexato (MTX); sirolimus (rapamicina); temsirolimus; everolimus; tacrolimus (FK-506); FK-778; anticuerpos de globulina anti-linfocito, anticuerpos de globulina anti-timocito, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD4 y conjugados de anticuerpotoxina; ciclosporina; micofenolato; monofosfato de mizoribina; escoparona; acetato de glatirámero; metabolitos de los mismos; sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; derivados de los mismos; profármacos de los mismos; y combinaciones de los mismos.
La expresión "fármaco tiopurina" incluye azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP) o cualquier metabolito del mismo que tenga eficacia terapéutica e incluye, sin limitación, 6-tioguanina (6-TG), 6-metilmercaptopurina ribósido, nucleótidos 6-tioinosina (por ejemplo monofosfato de 6-tioinosina, difosfato de 6-tioinosina, trifosfato de 6-tioinosina), nucleótidos 6-tioguanina (por ejemplo monofosfato de 6-tioguanosina, difosfato de 6-tioguanosina, trifosfato de 6-tioguanosina), nucleótidos 6-tioxantosina (por ejemplo monofosfato de 6-tioxantosina, difosfato de 6-tioxantosina, trifosfato de 6-tioxantosina), derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos. El término "muestra" incluye cualquier muestra biológica obtenida de un individuo. Entre las muestras adecuadas para utilizar en la presente invención se incluyen, sin limitación, sangre completa, plasma, suero, saliva, orina, heces, lágrimas, cualquier otro líquido corporal, muestras tisulares (por ejemplo, biopsia) y extractos celulares de los mismos (por ejemplo, extracto de glóbulos rojos). En una realización preferida, la muestra es una muestra de suero. Un experto en la materia apreciará que las muestras tales como muestras de suero se pueden diluir antes del análisis. En ciertos casos, el término "muestra" incluye, pero no se limita a sangre, tejido corporal, suero sanguíneo, fluido linfático, tejido de ganglios linfáticos, tejido del bazo, médula ósea o una fracción enriquecida de inmunoglobulinas derivadas de uno o más de estos tejidos. En ciertos otros casos, el término "muestra" incluye suero sanguíneo o es una fracción enriquecida de inmunoglobulinas derivadas de suero sanguíneo o sangre. En ciertos casos, el término "muestra" incluye un fluido corporal.
III. Descripción de las realizaciones
Las etapas de los métodos de la presente invención no tienen que realizarse necesariamente en el orden en particular en el que se presentan. Un experto en la técnica entendería que otras ordenaciones de las etapas de los métodos de la presente invención se incluyen dentro del alcance de la presente invención.
En una realización, la presente invención proporciona un método que determina la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, en la que el fármaco anti-TNFa es un anticuerpo para TNFa, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto un TNFa marcado con una muestra biológica que tiene un fármaco anti-TNFa para formar un complejo marcado con el fármaco anti-TNFa;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del TNFa marcado y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del TNFa marcado libre; (c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de fármaco anti-TNFa basándose en la proporción calculada en la etapa (c). En ciertos casos, los métodos son especialmente útiles para los siguientes anticuerpos anti-TNFa: REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab) y CIMZIA® (certolizumab pegol).
El factor a de necrosis tumoral (TNFa) es una citocina implicada en la inflamación sistémica y es un miembro de un grupo de citocinas que estimulan la reacción de fase aguda. El papel primario del TNFa es la regulación de células inmunitarias. El TNFa también es capaz de inducir muerte celular por apoptosis, inducir inflamación e inhibir tumorigénesis y replicación vírica. El TNFa se produce primariamente como una proteína transmembrana de tipo II de 212 aminoácidos de longitud organizada en homotrímeros estables.
El término "TNF-a", como se utiliza en el presente documento, tiene por objeto incluir una citocina humana que existe como una forma secretada de 17 kDa y una forma asociada de membrana de 26 kDa, de las cuales la forma activa biológicamente se compone de un trímero de moléculas de 17 kDa unidas no covalentemente. La estructura de TNF-a se describe adicionalmente en, por ejemplo, Jones, et al. (1989) Nature, 338: 225-228. El término "TNF-a" tiene por objeto incluir seres humanos, un TNF-a humano recombinante (rhTNF-a) o al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la proteína TNFa humana. El TNFa humano consiste en un dominio citoplasmático de 35 aminoácidos (aa), un segmento transmembrana de 21 aa y un dominio extracelular de 177 aa (ECD; del inglés, extracellular domain) (Pennica, D. et al. (1984) Nature 312:724). Dentro del ECD, el TNFa humano comparte el 97 % de identidad de secuencia de aa con el macaco rhesus y el 71 % 92 % con TNFa bovino, canino, de rata del algodón, equino, felino, de ratón, porcino y de rata. El TNFa se puede preparar mediante métodos de expresión recombinantes estándar o adquirirse de forma comercial (R & D Systems, Catalog N°. 210-TA, Mineápolis, Minnesota).
En ciertas realizaciones, "TNF-a" es un "antígeno", que es una molécula o una porción de la molécula susceptible de ser ligada por un anticuerpo anti-TNFa. El TNF-a puede tener uno o más epítopos. En ciertos casos, el TNF-a reaccionará, de una manera altamente selectiva, con un anticuerpo anti-TNFa. Los antígenos preferidos que se unen a anticuerpos, los fragmentos y regiones de anticuerpos anti-TNF de la presente invención incluyen al menos 5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, el TNF-a es de una longitud suficiente teniendo un epítopo de TNF a que es capaz de unirse a anticuerpos anti-TNF-a, fragmentos y regiones de los mismos.
En ciertas realizaciones, la longitud del TNF-a que tiene un epítopo de longitud suficiente para unirse a un anticuerpo anti-TNF-a, fragmentos y regiones de los mismos, es de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220 aminoácidos de longitud. En una realización, el TNF-a utilizado incluye los restos 77­ 233 de la SEQ ID NO: 1.
En ciertos casos, se marca al menos un aminoácido en la porción soluble de TNF-a, es decir, los restos 77-233 de la SEQ ID NO: 1. En ciertos casos, se utiliza un derivado de fluoróforo amino reactivo. En la mayoría de los casos, el grupo amino reactivo es un reactivo acilante que forma carboxamidas, sulfonamidas o tioureas al reaccionar con aminas. Todas las proteínas tienen virtualmente restos de lisina y la mayoría tienen una amina libre en el extremo N-terminal y por tanto pueden utilizarse como un punto de unión a una marca. En una realización preferida, se marca el resto 77 y el TNF-a utilizado incluye los restos 77-233 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, se marcan muchas aminas primarias y el TNF-a se marca de forma múltiple.
En ciertos casos, no se marca una porción de TNF-a, es decir, porciones que se reconocen por anticuerpos y fragmentos y regiones de los mismos. En otras palabras, ciertas porciones de los antígenos de TNF-a proporcionan un epítopo topográfico o tridimensional del TNF que se reconoce por y/o se une con actividad anti-TNF, un anticuerpo y fragmentos y regiones variables de los mismos. Estas porciones están preferentemente libres para unirse y por tanto no están marcadas. Estas incluyen los residuos 136-157 y 164-185 de la SEQ ID NO: 1:
Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile; y
Tyr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly.
El TNFa o un fármaco anti-TNFa se puede marcar con diferente(s) grupo(s) detectable (s). Preferentemente, el TNFa o un fármaco anti-TNFa se marca con un fluoróforo o un colorante fluorescente. Entre los fluoróforos ejemplares adecuados para utilizar en la presente invención se incluyen aquellos recogidos en el catálogo de sondas moleculares (en inglés, Molecular Probes Catalogue), incorporada en el presente documento mediante referencia (véase, R. Haugland, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10a edición, Molecular Probes, Inc. (2005)). Tales fluoróforos ejemplares incluyen, aunque no se limitan a, los colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750 y/o Alexa Fluor® 790, así como otros fluoróforos tales como, por ejemplo, cloruro de dansilo (DNS-Cl), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF), 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), 5- (y 6-)isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (Acrylodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo (NBD-Cl), bromuro de etidio, amarillo Lucifer, hidrocloruro de 5-carboxirrodamina 6G, lisamina-rodamina B cloruro de sulfonilo, cloruro de sulfonilo Texas Red™, BODIPY™, ácidos naftalaminasulfónicos (por ejemplo, ácido 1-anilinonaftalén-8-sulfónico (ANS), ácido 6-(p-toluidinil)naftalén-e-2-sulfónico (TNS) y similares), antroil-ácido graso, DPH, ácido parinárico, TMA-DPH, fluorenil-ácido graso, fluoresceína-fosfatidiletanolamina, Texas Redfosfatidiletanolamina, pirenil-fosfatidilcolina, fluorenil-fosfatidilcolina, merocianina 540,1-(3-sulfonatopropil)-4-[p-[2[(din-butilamino)-6 naftil]vinil]piridinio betaína (naftilo estirilo), 3,3'dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentilaminoestiril)-1 -metilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3 yodoacetamida, Cy-5-N-hidroxisuccinimida, Cy-7-Isotiocianato, rodamina 800, IR-125, naranja tiazol, Azul celeste B, azul Nilo, ftalocianina de Al, oxaxín-1,4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, TOTo , naranja de acridina, homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, verde calcio, carboxi SNARF-6, BAPTA, cumarina, fitoflúor, coroneno, complejos de metal-ligando, IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY 676, DY680, DY682, DY780 y mezclas de los mismos. Entre los fluoróforos adicionales adecuados se incluyen cofactores enzimáticos; lantánidos, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente roja o mutantes y derivados de los mismos. En una realización de la invención, el segundo miembro del par de unión específico tiene un grupo detectable unido al mismo.
Normalmente, el grupo fluorescente es un fluoróforo seleccionado de la categoría de colorantes que comprende polimetinas, ftalocianinas, cianinas, xantenos, fluorenos, rodaminas, cumarinas, fluoresceínas and BODIPY™.
En una realización, el grupo fluorescente es un fluoróforo de infrarrojo cercano (FIC; en inglés, NIR) que emite en el intervalo entre aproximadamente 650 a aproximadamente 900 nm. La utilización de tecnología de fluorescencia de infrarrojo cercano resulta ventajosa en ensayos biológicos dado que elimina o reduce considerablemente el fondo de la autofluorescencia de los biosustratos. Otro beneficio de la tecnología fluorescente del IR cercano es que la luz dispersada de la fuente de excitación se reduce en gran medida dado que la intensidad de dispersión es proporcional a la cuarta potencia inversa de la longitud de onda. Baja fluorescencia de fondo y baja dispersión, dan como resultado una elevada proporción de señal respecto al ruido, que es esencial para una detección altamente sensible. Asimismo, la ventana ópticamente transparente en la región del IR cercano (de 650 nm a 900 nm) en el tejido biológico hace que la fluorescencia del IRC sea una tecnología valiosa en aplicaciones de obtención de imágenes y detección subcelular ¡n vivo que requieren la transmisión de luz a través de componentes biológicos. Dentro de los aspectos de esta realización, el grupo fluorescente se selecciona, preferentemente, del grupo que consiste en IRDye® 700DX, IRDye® 700, IRDye® 800RS, IRDye® 800CW, IRDye® 800, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY 676, DY680, DY682 y DY780. En ciertas realizaciones, el grupo cercano al infrarrojo es IRDye® 800CW, IRDye® 800, IRDye® 700DX, IRDye® 700 o Dynomic DY676.
El marcado fluorescente se lleva a cabo utilizando un derivado químicamente reactivo de un fluoróforo. Entre los grupos reactivos comunes se incluyen derivados reactivos de isotiocianato, tales como FITC y TRITC (derivados de fluoresceína y rodamina), ésteres de succinimidilo reactivos con aminas tales como NHS-fluoresceína y compuestos fluorados activados por maleimida reactivos con sulfhidrilo, tales como fluoresceín-5-maleimida, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. La reacción de cualquiera de dichos colorantes reactivos con TNF-a o con un fármaco anti-TNF-a da como resultado un enlace covalente estable formado entre un fluoróforo y TNF-a o un fármaco anti-TNF-a.
En ciertos casos, tras la reacción de marcado fluorescente, a menudo es necesario eliminar cualquier fluoróforo que no haya reaccionado de la molécula diana marcada. Esto se consigue a menudo con cromatografía de exclusión por tamaño, aprovechando la diferencia de tamaños entre el fluoróforo y la proteína marcada.
Los colorantes fluorescentes reactivos se encuentran disponibles desde muchas fuentes. Pueden obtenerse con diferentes grupos reactivos para la unión a diversos grupos funcionales dentro de la molécula diana. También se encuentran disponibles en kits de marcado que contienen todos los componentes para llevar a cabo una reacción de marcado. En un aspecto preferido, se utiliza maleimida Alexa Fluor® 647 C2 de Invitrogen (N°. de catálogo A-20347).
La unión inmunológica específica de un anticuerpo antifármaco (AAF; en inglés, ADA) a un fármaco anti-TNF-a se puede detectar directa o indirectamente. Los marcadores directos incluyen etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, colorantes, radionúclidos y similares, unidos al anticuerpo. En ciertos casos, puede utilizarse TNFa o un anticuerpo anti-TNFa marcado con yodo-125 (I125) para determinar los niveles de concentración de anticuerpo anti-TNFa o AAF en una muestra, respectivamente. En otros casos, un ensayo de quimioluminiscencia que utiliza un TNFa quimioluminiscente o un anticuerpo anti-TNFa específico para un anticuerpo anti-TNFa o AAF en una muestra, respectivamente, es adecuado para la detección sensible no radioactiva de niveles de concentración de anticuerpos anti-TNFa o AAF. En casos particulares, TNFa o un anticuerpo anti-TNFa marcado con un fluorocromo es también adecuado para determinar los niveles de concentración de anticuerpo anti-TNFa o AAF en una muestra, respectivamente. Los ejemplos de fluorocromos incluyen, sin limitación, colorantes Alexa Fluor®, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, Texas red y lisamina. Se pueden obtener en el mercado anticuerpos secundarios ligados a fluorocromos, por ejemplo, F(ab')2 anti-IgG humana-FITC de cabra está disponible en Tago Immunologicals (Burlingame, California).
Las etiquetas indirectas incluyen diversas enzimas bien conocidas en la técnica, tales como peroxidasa de rábano picante (PRP; en inglés, HRP), fosfatasa alcalina (FAL), p-galactosidasa, ureasa y similares. Se puede usar un sistema de detección de peroxidasa de rábano picante, por ejemplo, con el sustrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB), que produce un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que es detectable a 450 nm. Se puede usar un sistema de detección de fosfatasa alcalina con el sustrato cromógeno fosfato de p-nitrofenilo, por ejemplo, que produce un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. De manera similar, se puede usar un sistema de detección de p-galactosidasa con el sustrato cromógeno o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG), que produce un producto soluble detectable a 410 nm. Puede utilizarse un sistema de detección de ureasa con un sustrato tal como urea-azul bromocresol (Sigma Immunochemicals; San Luis, Misuri). Puede obtenerse un anticuerpo secundario útil unido a una enzima a partir de diferentes fuentes comerciales, por ejemplo, ejemplo F(ab')2 anti-IgG humana-fosfatasa alcalina de cabra puede obtenerse de Jackson ImmunoResearch (West Grove, Pensilvania).
Se puede analizar una señal del marcador directo o indirecto, por ejemplo, utilizando un espectofotómetro para detectar color a partir de un sustrato cromógeno; un contador de radiación para detectar radiación tal como un contador gamma para la detección de I125; o un fluorímetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de una longitud de onda determinada. Para la detección de anticuerpos ligados a enzimas, se puede realizar un análisis cuantitativo de la cantidad de anticuerpo anti-TNFa o AAF utilizando un espectofotómetro tal como un lector de microplacas EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, California) según las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos de la presente invención se pueden automatizar o realizar de manera robótica y se puede detectar la señal de múltiples muestras simultáneamente.
Se utiliza la cromatografía de exclusión por tamaño. El principio subyacente de la CET es que las partículas de diferentes tamaños eluirán (se filtrarán) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto da como resultado la separación de una solución de partículas según el tamaño. Dado que todas las partículas se cargan simultáneamente o prácticamente de manera simultánea, las partículas del mismo tamaño eluyen juntas. Cada columna de exclusión por tamaño presenta un intervalo de pesos moleculares que se pueden separar. El límite de exclusión define el peso molecular en el límite superior de este intervalo y es cuando las moléculas son demasiado grandes para resultar atrapadas en la fase estacionaria. El límite de permeabilidad define el peso molecular en el límite inferior del intervalo de separación y es cuando las moléculas de un tamaño suficientemente pequeño pueden penetrar completamente por los poros de la fase estacionaria y todas las moléculas por debajo de esta masa molecular son tan pequeñas que eluyen como una única banda.
En ciertos aspectos, se recoge el eluyente en volúmenes constantes o fracciones. Cuanto mayor la similitud en tamaño de las partículas, mayor probabilidad de encontrarse en la misma fracción y no se detectarán separadas. Preferentemente, las fracciones recogidas se examinan mediante técnicas espectroscópicas para determinar la concentración de las partículas eluidas. Normalmente, entre las técnicas de detección espectroscópica útiles en la presente invención se incluyen, aunque no se limitan a, fluorometría, índice refractivo (IR) y luz ultravioleta (UV). En ciertos casos, el volumen de elución disminuye de manera aproximadamente de manera lineal con el logaritmo del volumen hidrodinámico molecular (es decir, las fracciones más pesadas se desprenden las primeras).
En ciertos aspectos, los métodos son útiles para detectar la cantidad de fármacos anti-TNFa tales como, por ejemplo, anticuerpos incluyendo REMICADE™ (infliximab), un mAb quimérico de anti-TNFa, ENBREL™ (etanercept), una proteína de fusión TNFR-Fc de Ig, HUMIRA™ (adalimumab), un mAb humano anti-TNFa y CIMZIA® (certolizumab pegol), un fragmento Fab PEGilado.
En ciertos casos, después de que se detecte el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, anticuerpo anti-TNFa), se mide el fármaco anti-TNFa utilizando una curva estándar.
En otra realización, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, comprendiendo el método:
a) poner en contacto un fármaco TNFa marcado con la muestra biológica para formar un complejo marcado con el autoanticuerpo;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del fármaco de TNFa marcado libre y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre;
(c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de autoanticuerpo basándose en la proporción calculada en la etapa (c). En ciertos casos, los autoanticuerpos incluyen los anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA).
También se desvela un método para detectar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra, que comprende:
(a) poner en contacto un fármaco anti-TNFa marcado y un TNFa marcado con una muestra que tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa para formar un primer complejo marcado entre el fármaco anti-TNFa marcado, el TNFa marcado y el autoanticuerpo y un segundo complejo marcado entre el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo, en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado comprenden marcas diferentes;
(b) someter el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado; y
(c) detectar el primer complejo marcado y el segundo complejo marcado, detectando de este modo una forma no neutralizante del autoanticuerpo en el que tanto el primer complejo marcado como el segundo complejo marcado están presentes y detectando una forma neutralizante del autoanticuerpo cuando solo el segundo complejo marcado está presente.
En ciertos casos, los autoanticuerpos incluyen los anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA).
También se desvela un método para detectar la presencia o el nivel de un anticuerpo para un fármaco anti-TNFa en una muestra, que comprende:
(a) poner en contacto un fármaco anti-TNFa marcado con una muestra que tiene o se sospecha que tiene un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa para formar un primer complejo marcado entre el fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo;
(b) someter el primer complejo marcado a una primera cromatografía de exclusión por tamaño para separar el primer complejo marcado;
(c) detectar el primer complejo marcado, detectando así la presencia o el nivel del autoanticuerpo;
(d) poner en contacto el TNFa marcado con el primer complejo marcado para formar un segundo complejo marcado entre el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado, en el que el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado comprenden marcas diferentes;
(e) someter el segundo complejo marcado a una segunda cromatografía de exclusión por tamaño para separar el segundo complejo marcado; y
(f) detectar el segundo complejo marcado, detectando así la presencia o el nivel de una forma neutralizante del autoanticuerpo.
En ciertos casos, los autoanticuerpos incluyen los anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y anticuerpos humanos antirratón (HAMA).
En otras realizaciones, los métodos de ensayo descritos en el presente documento se pueden utilizar para predecir la sensibilidad hacia un inhibidor de TNFa, especialmente hacia un anticuerpo anti-TNFa en un sujeto que tiene un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn y similares.). En este método, mediante el análisis del sujeto para la dosis correcta o terapéutica de anticuerpo anti-TNFa, es decir, el nivel de concentración terapéutica, es posible predecir si el individuo responderá a la terapia.
También se desvelan métodos para monitorizar un trastorno autoinmunitario en un sujeto que tiene un trastorno autoinmunitario, en el que el método comprende el análisis del sujeto para la dosis correcta o terapéutica de anticuerpo anti-TNFa, es decir, el nivel de concentración terapéutica, a lo largo del tiempo. De esta manera, es posible predecir si el individuo responderá a la terapia a lo largo de un periodo de tiempo dado.
También se desvela un método para determinar una cantidad eficaz de un fármaco anti-TNFa para un sujeto que recibe una terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel del fármaco anti-TNFa en una primera muestra del sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto la primera muestra con una cantidad de TNFa marcado para formar un primer complejo que comprende el TNFa marcado con el fármaco anti-TNFa; y
(ii) detectar el primer complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo así el nivel del fármaco anti-TNFa;
(b) medir el nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una segunda muestra del sujeto, que comprende:
(i) poner en contacto la segunda muestra con una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado para formar un segundo complejo que comprende el fármaco anti-TNFa marcado con el autoanticuerpo; y
(ii) detectar el segundo complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo así el nivel del autoanticuerpo; y
(c) restar el nivel de autoanticuerpo medido en la etapa (b) del nivel del fármaco anti-TNFa medido en la etapa (a),
determinando así la cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa.
En un caso relacionado, la detección en la etapa (a)(ii) comprende:
(1) integrar el área bajo la curva para un pico del TNFa marcado a partir de un primer gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(2) integrar el área bajo la curva para un pico del primer complejo a partir del primer gráfico;
(3) determinar una proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (2) por la integración resultante de la etapa (1); y
(4) multiplicar la cantidad del TNFa marcado por la proporción de la etapa (3).
En un caso relacionado, la detección en la etapa (b)(ii) comprende:
(1) integrar el área bajo la curva para un pico del fármaco anti-TNFa marcado a partir de un segundo gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(2) integrar el área bajo la curva para un pico del segundo complejo a partir del segundo gráfico;
(3) determinar una proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (2) por la integración resultante de la etapa (1); y
(4) multiplicar la cantidad del fármaco anti-TNFa marcado por la proporción de la etapa (3).
En un aspecto relacionado, la presente invención establece adicionalmente que tanto la primera como la segunda muestra son muestras de suero. En otro aspecto relacionado, la presente invención establece adicionalmente que tanto la primera como la segunda muestra se obtienen del sujeto durante la terapia con el fármaco anti-TNFa. En todavía otro caso relacionado, la presente invención establece adicionalmente que la detección en la etapa (a)(ii) y/o la etapa (b)(ii) comprende(n) la detección de marca de fluorescencia.
También se desvela un método para optimizar la cantidad terapéutica de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) determinar una cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa según los métodos de la presente invención;
(b) comparar la cantidad eficaz del fármaco anti-TNFa con el nivel del fármaco anti-TNFa; y
(c) determinar una dosis posterior del fármaco anti-TNFa para el sujeto basándose en la comparación de la etapa (c),
optimizando así la cantidad terapéutica del fármaco anti-TNFa.
La dosis posterior del fármaco anti-TNFa se puede incrementar cuando la dosis eficaz del fármaco anti-TNFa es menor que el nivel del fármaco anti-TNFa. En un aspecto relacionado, la dosis posterior del fármaco anti-TNFa se puede incrementar de manera que la dosis eficaz del fármaco anti-TNFa es aproximadamente igual que el nivel del fármaco anti-TNFa.
En algunas otras realizaciones, la presente realización establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el fármaco anti-TNFa es infliximab (REMICADE™). En algunas otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa es adalimumab (HUMIRA™). En otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa es etanercept (ENBREL™). En algunas otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa es CIMZIA® (certolizumab pegol). En otras realizaciones, el TNFa marcado es un TNFa marcado con fluoróforo. En algunas otras realizaciones, se cuantifica el fármaco anti-TNFa medido. En algunas realizaciones, se cuantifica el TNFa medido. En otras realizaciones, se eluye primero el complejo marcado, seguido por el TNFa marcado libre. En algunas otras realizaciones, se eluye primero el complejo marcado, seguido por el anticuerpo anti-TNFa marcado libre. En algunas realizaciones, la cromatografía por exclusión de tamaño es la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (HPLC-ET). En algunas otras realizaciones, el autoanticuerpo es un componente seleccionado a partir de anticuerpo humano antirratón (HAMA), anticuerpo humano antiquimérico (HACA), anticuerpo humano antihumanizado (HAHA) o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se cuantifica el autoanticuerpo medido.
También se desvela un método para optimizar la terapia y/o reducir la toxicidad de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) medir el nivel del fármaco anti-TNFa en una primera muestra del sujeto;
(b) medir el nivel de un autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa en una segunda muestra del sujeto; y (c) determinar un curso posterior de la terapia para el sujeto basándose en los niveles del fármaco anti-TNFa y del autoanticuerpo,
optimizando así la terapia y/o reduciendo la toxicidad del fármaco anti-TNFa.
En un aspecto relacionado, el curso posterior de la terapia comprende coadministrar un fármaco inmunosupresor con el fármaco anti-TNFa cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel elevado y el nivel del autoanticuerpo es un nivel bajo. En otro aspecto relacionado, el curso posterior de la terapia comprende incrementar el nivel del fármaco anti-TNFa y coadministrar un fármaco inmunosupresor cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel medio y el nivel del autoanticuerpo es un nivel bajo. En otro aspecto relacionado, el curso posterior de la terapia comprende administrar un fármaco anti-TNFa diferente cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel medio y el nivel del autoanticuerpo es un nivel medio. En todavía otro caso relacionado, el curso posterior de la terapia comprende administrar un fármaco anti-TNFa diferente cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel bajo y el nivel del autoanticuerpo es un nivel elevado. En otro aspecto relacionado, se administra adalimumab (HUMIRA™) en lugar de infliximab (REMICADE™).
En algunas realizaciones, la expresión "nivel elevado de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 ng/ 10 pl, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 ng/ 10 pl o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ 10 pl. En otras realizaciones, la expresión "nivel elevado de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos mayores que aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 ng/10 pl.
En algunas realizaciones, la expresión "nivel medio de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 50 ng/ 10 pl, aproximadamente 5,0 a aproximadamente 30 ng/ 10 pl, aproximadamente 5,0 a aproximadamente 20 ng/ 10 pl, o aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10 ng/ 10 pl. En otras realizaciones, la expresión "nivel medio de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos de aproximadamente 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 ng/10 pl.
En algunas realizaciones, la expresión "nivel bajo de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos de aproximadamente 0 a aproximadamente 10 ng/10 pl, aproximadamente 0 a aproximadamente 8 ng/10 pl, o aproximadamente 0 a aproximadamente 5 ng/10 pl. En otras realizaciones, a expresión "nivel bajo de un fármaco anti-TNFa" incluye niveles de fármacos de aproximadamente menos que aproximadamente 10, 9,0, 8,0, 7,0, 6,0, 5,0, 4,0, 3,0, 2,0, 1,0 o 0,5 ng / 10 pl.
El acrónimo "AAF" (en inglés, ADA) incluye la expresión "anticuerpo antifármaco".
En algunas realizaciones, la expresión "nivel elevado de un anticuerpo antifármaco" incluye niveles de anticuerpo antifármaco de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 100 ng/ 10 pl, aproximadamente 3,0 a aproximadamente 50 ng/ 10 pl, aproximadamente 10 a aproximadamente 100 ng/ 10 pl, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 ng/ 10 pl o aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ng/ 10 pl. En algunas otras realizaciones, la expresión "nivel elevado de un anticuerpo" incluye niveles de anticuerpo antifármaco de aproximadamente mayores que aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 ng/10 pl.
En algunas realizaciones, la expresión "nivel medio de un anticuerpo antifármaco" incluye niveles de anticuerpo antifármaco de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 ng/ 10 pl, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 ng/ 10 pl, aproximadamente 2,0 a aproximadamente 20 ng/ 10 pl, aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10 ng/ 10 pl, aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,0 ng/ 10 pl o aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,0 ng/ 10 pl.
En algunas realizaciones, la expresión "nivel bajo de un anticuerpo antifármaco" incluye niveles de anticuerpo antifármaco de aproximadamente 0,0 a aproximadamente 5,0 ng/ 10 pl, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5,0 ng/ 10 pl, aproximadamente 0,0 a aproximadamente 2,0 ng/ 10 pl, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,0 ng/ 10 pl o aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 ng/ 10 pl. En otras realizaciones, la expresión "nivel bajo de anticuerpo antifármaco" incluye niveles de anticuerpo antifármaco de aproximadamente inferiores a aproximadamente 5,0, 4,0, 3,0, 2,0, 1,0 o 0,5 ng/10 pl.
En algunos casos, los métodos establecen adicionalmente que el fármaco anti-TNFa se mide con un ensayo que comprende:
(i) poner en contacto la primera muestra con una cantidad de TNFa marcado para formar un primer complejo que comprende el TNFa marcado con el fármaco anti-TNFa; y
(ii) detectar el primer complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño,
midiendo así el nivel del fármaco anti-TNFa.
En algunos casos, los métodos establecen adicionalmente que el autoanticuerpo se mide con un ensayo que comprende:
(i) poner en contacto la segunda muestra con una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado para formar un segundo complejo que comprende el fármaco anti-TNFa marcado con el autoanticuerpo; y
(ii) detectar el segundo complejo mediante cromatografía de exclusión por tamaño,
midiendo así el nivel del autoanticuerpo.
En una realización relacionada, los métodos de la presente realización establecen adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos. En una realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es infliximab (REMICADE™). En algunas otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa es adalimumab (HUMIRA™). En algunas otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa es etanercept (ENBREL™). En otra realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es CIMZIA® (certolizumab pegol). En otra realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que se cuantifica el fármaco anti-TNFa medido. En otra realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que tanto la primera como la segunda muestra son muestras de suero. En otro aspecto relacionado, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que tanto la primera como la segunda muestra se obtienen del sujeto durante la terapia con el fármaco anti-TNFa. En otro aspecto relacionado, los métodos establecen adicionalmente que el autoanticuerpo es un componente seleccionado a partir de anticuerpo humano antirratón (HAMA), anticuerpo humano antiquimérico (HACA), anticuerpo humano antihumanizado (HAHA) o combinaciones de los mismos. En otra realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente que se cuantifica el autoanticuerpo medido.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno en una muestra que tiene o se sospecha que tiene un fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una cantidad de un fármaco TNFa marcado y una cantidad de un control interno marcado con la muestra para formar un complejo del TNFa marcado y el fármaco anti-TNFa marcado;
(b) detectar el TNFa marcado y el control interno marcado mediante cromatografía de exclusión por tamaño; (c) integrar el área bajo la curva para un pico del TNFa marcado a partir de un gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(d) integrar el área bajo la curva para un pico del control interno marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(e) determinar una primera proporción dividiendo la cantidad de TNFa marcado por la cantidad de control interno marcado;
(f) determinar una segunda proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (c) por la integración resultante de la etapa (d); y
(g) comparar la primera proporción determinada en la etapa (e) con la segunda proporción determinada en la etapa (f),
determinando así la presencia o el nivel del fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno.
En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que la primera proporción determinada en la etapa (e) es de aproximadamente 80:1 a aproximadamente 100:1. En otra realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que la primera proporción determinada en la etapa (e) es de aproximadamente 100:1. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el control interno marcado es Biocitina-Alexa 488. En ciertas realizaciones, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 ng por 100 pl de muestra analizada. En ciertas otras realizaciones, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 ng por 100 pl, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 ng por 100 pl, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 ng por 100 pl, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 ng por 100 pl o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 ng por 100 pl de muestra analizada. En realizaciones adicionales, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o 25 ng por 100 pl de muestra analizada.
También se desvela un método para optimizar la cantidad terapéutica de un fármaco anti-TNFa en un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa, comprendiendo el método: determinar una dosis posterior del fármaco anti-TNFa para el sujeto basándose en la comparación de las proporciones primera y segunda según los métodos de la presente invención, optimizando así la cantidad terapéutica del fármaco anti-TNFa. En un aspecto relacionado, la presente invención establece adicionalmente que el método comprende adicionalmente: incrementar la dosis posterior del fármaco anti-TNFa cuando la primera proporción es aproximadamente 100:1 y la segunda proporción es menor de aproximadamente 95:1, optimizando así la cantidad terapéutica del fármaco anti-TNFa. En otra realización relacionada, la presente realización establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es infliximab (REMICADE™). En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es adalimumab (HUMIRA™). En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es etanercept (ENBREL™). En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el fármaco anti-TNFa es CIMZIA® (certolizumab pegol). En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el TNFa marcado es un TNFa marcado con fluoróforo. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que se cuantifica el fármaco anti-TNFa detectado. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que el complejo marcado se eluye primero, seguido por el TNFa marcado libre. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que la muestra es suero. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que la muestra se obtiene de un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa. En una realización relacionada, la presente invención establece adicionalmente que la cromatografía por exclusión de tamaño es la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (HPLC-ET).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa con referencia a un control interno en una muestra que tiene o se sospecha que tiene el autoanticuerpo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado y una cantidad de un control interno marcado con la muestra para formar un complejo del fármaco anti-TNFa marcado y el autoanticuerpo;
(b) detectar el anti-TNFa marcado y el control interno marcado mediante cromatografía de exclusión por tamaño; (c) integrar el área bajo la curva para un pico del fármaco anti-TNFa marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(d) integrar el área bajo la curva para un pico del control interno marcado a partir del gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la cromatografía de exclusión por tamaño;
(e) determinar una primera proporción dividiendo la cantidad de fármaco anti-TNFa marcado por la cantidad de control interno marcado; y
(f) determinar una segunda proporción dividiendo la integración resultante a partir de la etapa (c) y (d); y (g) comparar la primera proporción determinada en la etapa (e) con la segunda proporción determinada en la etapa (f),
determinando así la presencia o el nivel del autoanticuerpo con referencia a un control interno.
En una realización relacionada, la primera proporción determinada en la etapa (e) es de aproximadamente 80:1 a aproximadamente 100:1. En otra realización relacionada, la primera proporción determinada en la etapa (e) es de aproximadamente 100:1. En una realización relacionada, el control interno marcado es Biocitina-Alexa 488. En ciertas realizaciones, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 pg por 100 pl de muestra analizada. En ciertas otras realizaciones, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 pg por 100 pl, de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 pg por 100 pl, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 pg por 100 pl o de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 pg por 100 pl de muestra analizada. En realizaciones adicionales, la cantidad de control interno marcado (por ejemplo, Biocitina-Alexa 488) es de aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 pg por 100 pl de muestra analizada.
En una realización relacionada, el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos. En una realización relacionada, el fármaco anti-TNFa es infliximab (REMICADE™). En una realización relacionada, el fármaco anti-TNFa es adalimumab (HUMIRA™). En una realización relacionada, el fármaco anti-TNFa es etanercept (ENBREL™). En una realización relacionada, el fármaco anti-TNFa es CIMZIA® (certolizumab pegol). En una realización relacionada, se cuantifica el autoanticuerpo detectado. En una realización relacionada, se eluye primero el complejo marcado, seguido por el anticuerpo anti-TNFa marcado libre. En una realización relacionada, la muestra es suero. En una realización relacionada, la muestra se obtiene de un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa. En una realización relacionada, la cromatografía por exclusión de tamaño es la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (HPLC-ET). En una realización relacionada, el autoanticuerpo es un componente seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo humano antirratón (HAMA), anticuerpo humano antiquimérico (HACA), anticuerpo humano antihumanizado (HAHA) y combinaciones de los mismos. En una realización relacionada, se cuantifica el autoanticuerpo detectado.
En una realización relacionada, los métodos de la presente invención establecen adicionalmente determinar un curso posterior de la terapia. El curso posterior de la terapia comprende coadministrar un fármaco inmunosupresor con el fármaco anti-TNFa cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel elevado y el nivel del autoanticuerpo es un nivel bajo. En otro aspecto relacionado, el curso posterior de la terapia comprende incrementar el nivel del fármaco anti-TNFa y coadministrar un fármaco inmunosupresor cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel medio y el nivel del autoanticuerpo es un nivel bajo. En otro aspecto relacionado, el curso posterior de la terapia comprende administrar un fármaco anti-TNFa diferente cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel medio y el nivel del autoanticuerpo es un nivel medio. En todavía otro caso relacionado, el curso posterior de la terapia comprende administrar un fármaco anti-TNFa diferente cuando el nivel del fármaco anti-TNFa es un nivel bajo y el nivel del autoanticuerpo es un nivel elevado. En otro aspecto relacionado, se administra el adalimumab (HUMIRA™) en lugar de infliximab (REMICADE™).
También se desvela un kit para medir la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa y la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra, comprendiendo el kit:
(a) un primer sustrato de medición que comprende una cantidad de TNFa marcado;
(b) un segundo sustrato de medición que comprende una cantidad de fármaco anti-TNFa marcado;
(c) opcionalmente, un tercer sustrato de medición que comprende una cantidad de TNFa marcado y una cantidad de control interno marcado;
(d) opcionalmente, un cuarto sustrato de medición que comprende una cantidad de un fármaco anti-TNFa marcado y una cantidad de control interno marcado;
(e) opcionalmente, un medio para extraer una muestra de un sujeto; y
(f) opcionalmente, un folleto de instrucciones para utilizar el kit.
En un aspecto relacionado, el sustrato comprende cualquier material que pueda depositarse con los productos químicos de la presente invención e incluyen, aunque no se limitan a, nitrocelulosa, gel de sílice, sustratos de cromatografía de capa fina, varillas de madera, celulosa, algodón, polietileno, combinaciones de los mismos y similares. En otro aspecto relacionado, los productos químicos de la presente invención se pueden depositar sobre los materiales mencionados anteriormente en una formación ordenada, matriz o formación de matriz.
En un aspecto relacionado, el kit puede comprender adicionalmente un medio para detectar el TNFa marcado, el anti-TNFa marcado y/o el control interno marcado. En un aspecto relacionado, el kit comprende adicionalmente medios de detección que incluyen, pero sin limitarse a, detección de marca de fluorescencia, detección de radiación UV o exposición al yodo. En un aspecto relacionado, el kit comprende una cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC-Et ). En un aspecto relacionado, el primer, segundo, tercer y cuarto sustrato de medición se seleccionan a partir de nitrocelulosa, gel de sílice y un medio cromatográfico de exclusión por tamaño. En un aspecto relacionado, el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos. En un aspecto relacionado, el TNFa marcado es un TNFa marcado con fluoróforo. En un aspecto relacionado, la muestra es suero. En un aspecto relacionado, la muestra se obtiene de un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa. En un aspecto relacionado, el autoanticuerpo es un componente seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo humano antirratón (HAMA), anticuerpo humano antiquimérico (HACA), anticuerpo humano antihumanizado (HAHA) y combinaciones de los mismos.
IV. Intervalos y niveles fisiológicos de especies relevantes para la presente invención
Los niveles terapéuticos eficaces de REMICADE™ en un paciente tratado con REMICADE™ están en el intervalo de aproximadamente 1 a 10 mg de REMICADE™ por kg de peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, los niveles terapéuticos eficaces de REMICADE™ están en el intervalo de aproximadamente 3 a 8 mg de REMICADE™ por kg de peso corporal del paciente. En algunas otras realizaciones, los niveles terapéuticos eficaces de REMICADE™ son aproximadamente 5 mg de REMICADE™ por kg de peso corporal del paciente.
Una dosis típica de REMICADE™ (infliximab) está en el intervalo de aproximadamente 0,05 |jg a aproximadamente 80 jg por ml. En algunas realizaciones, una dosis de REMICADE™ está en el intervalo de aproximadamente 0,05 jg a aproximadamente 50 jg por ml. En algunas otras realizaciones, una dosis de REMICADE™ es aproximadamente 0,05 jg a aproximadamente 30 jg por ml. En algunas realizaciones, una dosis de REMICADE™ es aproximadamente 30 jg por ml. En algunas otras realizaciones, una dosis de REMICADE™ es aproximadamente 50 jg por ml.
Los niveles terapéuticos eficaces de HUMIRA™ en un paciente tratado con HUMIRA™ están en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 10 mg de HUMIRA™ por kg de peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, los niveles terapéuticos eficaces de HUMIRA™ están en el intervalo de 0,1 a 8 mg de HUMIRA™ por kg de peso corporal del paciente. En algunas otras realizaciones, los niveles terapéuticos eficaces de HUMIRA™ son aproximadamente 1 mg de HUMIRA™ por kg de peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, los niveles terapéuticos eficaces de HUMIRA™ son aproximadamente 0,8 mg de HUMIRA™ por kg de peso corporal del paciente.
Una dosis típica de HUMIRA™ está en el intervalo de aproximadamente 0,05 jg a aproximadamente 150 jg por ml. En algunas realizaciones, una dosis de HUMIRA™ está en el intervalo de aproximadamente 0,05 jg a aproximadamente 100 jg por ml. En algunas otras realizaciones, una dosis de HUMIRA™ es aproximadamente 0,05 jg a aproximadamente 50 jg por ml. En algunas realizaciones, una dosis de HUMIRA™ es aproximadamente 30 jg por ml. En algunas realizaciones, una dosis de HUMIRA™ es aproximadamente 32 jg por ml. En algunas otras realizaciones, una dosis de HUMIRA™ es aproximadamente 50 |jg por ml.
V. Enfermedades ejemplares y anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de las mismas
En ciertas realizaciones, la presente invención puede emplear anticuerpos monoclonales terapéuticos. La tabla 1 proporciona una lista ejemplar de anticuerpos monoclonales terapéuticos que se han aprobado o que están en desarrollo actualmente. La invención se emplea en fármacos anti-TNFa, en particular fármacos de anticuerpos de anti-TNFa. En el informe PhRMA Report de 2006, titulado '418 medicamentos biotecnológicos a evaluación prometen reforzar el arsenal contra las enfermedades' (en inglés, '418 Biotechnology Medicines in Testing Promise to Bolster the Arsenal Against Disease').
En particular, los anticuerpos terapéuticos preferidos incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos anti-TNFa monoclonales tales como, por ejemplo, (1) Remicade™ (infliximab), un anticuerpo monoclonal kappa IgG I humana antiTNFa de ratón, (2) Enbrel™ (etanercept), una proteína de fusión de receptor 2 de TNF humano e IgG I y (3) Humira™ (adalimumab), un anticuerpo monoclonal kappa IgG1 humana antiTNFa completo. Otros dos constructos de anticuerpos anti-TNFa han resultado prometedores en ensayos pilotos en fase III en pacientes con alguna de las mismas enfermedades: (4) Cimzia™ CDP870 (certolizlunab pegol), un fragmento Fab PEGilado de un anticuerpo monoclonal humanizado anti-TNFa y (5) CNTO 148 (golimlunab), un anticuerpo monoclonal kappa IgG I humana antiTNFa completo.
Una clase preferida de anticuerpos terapéuticos son los anticuerpos monoclonales de cadena simple anti-TNFa utilizados en el tratamiento de numerosas enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante (enfermedad de Bechterew), enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), psoriasis severa, uveítis crónica, sarcoidosis severa y granulomatosis de Wegener.
La tabla 1 más adelante proporciona también una lista de indicaciones médicas que se correlacionan con diversos anticuerpos monoclonales terapéuticos utilizados in vivo.
En realizaciones adicionales, los métodos de la presente invención son adecuados para utilizar en la determinación de los niveles de presencia o concentración de autoanticuerpos contra los anticuerpos anti-TNFa terapéuticos. La presente invención puede utilizarse por tanto en una terapia de optimización anti-TNFa, en la que el tratamiento (o diagnosis) comprende la administración al sujeto de un anticuerpo anti-TNFa terapéutico. Los métodos pueden ser para optimizar el tratamiento (o diagnosis) de una o más enfermedades o trastornos referidos en el presente documento que implica(n) TNFa, incluyendo uno o más de los siguientes:
Enfermedades infecciosas, tal como el virus sincitial respiratorio (VSR; en inglés, RSV), VIH (en inglés, HIV), ántrax, candidiasis, infecciones por estafilococos, hepatitis C.
Enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, linfoma no de Hodgkin de linfocitos B, Esclerosis múltiple, LES (en inglés, SLE), espondilitis anquilosante, lupus, artritis psoriásica, eritematoso.
Trastornos inflamatorios tales como artritis reumatoide (AR), artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante (enfermedad de Bechterew), enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), psoriasis severa, uveítis crónica, sarcoidosis, granulomatosis de Wegener y otras enfermedades con inflamación como característica central.
Trastornos de la sangre, tales como sepsis, choque séptico, hemoglobinuria paroxística nocturna y síndrome urémico hemolítico.
Cáncer, tal como el cáncer de páncreas, linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, tratamiento de cáncer de mama metastásico con sobreexpresión de HER2, leucemia mieloide aguda, cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma), cáncer de pulmón microcítico, cáncer de tiroides, melanoma maligno, tumores sólidos, cáncer de mama, cáncer de mama en fase temprana positivo para HER2, cánceres CPNM (en inglés, NSCLC) no escamosos de primera línea, LMA (en inglés, a Ml ), tricoleucemia, neuroblastoma, cáncer renal, cáncer de cerebro, mieloma, mieloma múltiple, metástasis ósea, CPCP (en inglés, SCLC), cáncer de cabeza/cuello, pancreático de primera línea, CPCP, CPNM, cáncer de cabeza y cuello, tumores hematológicos y sólidos, tumores sólidos avanzados, cáncer gastrointestinal, cánceres pancreáticos, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma no cutáneo de linfocitos T, LLC (en inglés, CLL), de ovario, de próstata, cánceres de células renales, tumores que expresan mesotelina, glioblastoma, metastásico pancreático, neoplasias malignas hematológicas, linfoma cutáneo anaplásico de células grandes MAb, LMA, síndromes mielodisplásicos.
Enfermedad cardiovascular, tal como el infarto agudo de miocardio, arteriosclerosis, derivación cardiopulmonar, angina.
Trastornos metabólicos tales como diabetes, tales como la diabetes mellitus tipo-I.
Trastornos digestivos, tales como enfermedad de Crohn, Enfermedad C. dilficile, colitis ulcerosa,
Trastornos oculares, tales como uveítis.
Trastornos genéticos tales como la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN; en inglés, PNH).
Trastornos neurológicos, tales como dolor de osteoartritis y enfermedad de Alzheimer.
Trastornos respiratorios, tales como enfermedades respiratorias, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC; en inglés, COPD), poliposis nasal, asma pediátrico.
Dermatopatías, tales como psoriasis, incluyendo la psoriasis en placa crónica moderada a severa.
Rechazo de trasplantes, tales como el rechazo agudo de trasplante de riñón, reversión del rechazo de trasplantes de corazón e hígado, prevención del rechazo de trasplante de riñón, profilaxis del rechazo agudo de trasplante de riñón, rechazo de trasplante de riñón.
Otros trastornos, tales como diagnosis de apendicitis, inflamación de riñón, osteoporosis posmenopáusica (trastornos de huesos), síndrome hipereosinófilo, esofagitis eosinofílica y alergia a los cacahuetes.
En una realización, se selecciona la enfermedad de uno o más de los grupos anteriores de enfermedades y trastornos específicos.
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VI. Terapia y monitorización terapéutica
Una vez se ha determinado el diagnóstico o el pronóstico de un sujeto que recibe terapia con fármacos anti-TNFa o se ha predicho la probabilidad de respuesta ante un fármaco anti-TNFa en un individuo diagnosticado con una enfermedad y trastorno en el que se ha implicado al TNFa en la fisiopatología, por ejemplo, pero sin limitarse a, shock, sepsis, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, AR, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra huésped, según los métodos descritos en el presente documento, la presente invención puede comprender adicionalmente recomendar un curso de la terapia basándose en el diagnóstico, pronóstico o predicción. Se puede administrar al individuo una cantidad eficaz terapéuticamente de un fármaco anti-TNFa útil para tratar uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno en el que se ha implicado al TNFa en la fisiopatología. En aplicaciones terapéuticas, el fármaco anti-TNFa puede administrarse solo o coadministrarse junto con uno o más fármacos anti-TNFa y/o uno o más fármacos que reducen los efectos asociados con el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, un agente inmunosupresor). Entre los ejemplos de fármacos anti-TNFa que se describen en el presente documento se incluyen, aunque no se limitan a, REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol), agentes biológicos, fármacos convencionales y combinaciones de los mismos. Como tal, la presente invención permite ventajosamente a un médico practicar "medicina personalizada" al guiar las decisiones sobre tratamientos y al guiar la selección de terapias y al optimizar los fármacos anti-TNFa de manera que se proporcione el fármaco correcto al paciente correcto en el momento adecuado.
Un fármaco anti-TNFa se puede administrar con un excipiente farmacéuticamente adecuado en caso necesario y se puede llevar a cabo a través de los tipos de administración aceptados. Por tanto, la administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, tópica, subcutánea, transcutánea, transdérmica, intramuscular, oral, bucal, sublingual, gingival, palatal, intra-articulación, parenteral, intra-arteriola, intradérmica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal o por inhalación. Por "coadministrar" se entiende que se administra un fármaco anti-TNFa al mismo tiempo, justo antes de o justo después de la administración de un segundo fármaco (por ejemplo, otro fármaco anti-TNFa, un fármaco útil para reducir los efectos secundarios del fármaco anti-TNFa, etc.).
Se puede administrar una cantidad eficaz de un fármaco anti-TNFa repetidamente, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más veces o se pueden administrar las dosis mediante infusión continua. Las dosis pueden tomar la forma de sólidos, semisólidos, polvo liofilizado o formas de administración líquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, pastillas, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles, espumas o similares, preferentemente en formas de administración unitarias adecuadas para la administración sencilla de dosificaciones precisas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "forma de administración unitaria" incluye unidades físicamente discretas adecuadas como administraciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un fármaco anti-TNFa, calculada para producir las respuestas deseadas, tolerancia y/o efectos terapéuticos, conjuntamente con un excipiente farmacéutico adecuado (por ejemplo, una ampolla). Además, se pueden prepara formas de administración más concentradas, a partir de las que se pueden producir formas de administración unitarias más diluidas. Las formas de administración más concentradas contendrán así considerablemente más de, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces la cantidad del fármaco anti-TNFa.
Los métodos para preparar dichas formas de administración se conocen expertos en la materia (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania (1990)). Las formas de administración incluyen normalmente un vehículo o excipiente farmacéutico convencional y pueden incluir adicionalmente otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la permeabilidad de los tejidos, solubilizantes y similares. Los excipientes adecuados se pueden adaptar a la forma de administración en particular y la ruta de administración mediante métodos bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, más arriba).
Entre los ejemplos de materiales adecuados se incluyen, aunque no se limitan a, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato cálcico, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, suero salino, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y ácidos poliacrílicos tales como los carbopolos, por ejemplo, Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981, etc. Las formas de administración pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes; agentes de suspensión; agentes conservantes, tales como metil-, etil- y propilhidroxibenzoatos (es decir, los parabenos); agentes ajustadores de pH, tal como ácidos y bases inorgánicos y orgánicos; agentes edulcorantes; y agentes aromatizantes. Las formas de administración pueden comprender también perlas de polímeros biodegradables, dextrano y complejos de inclusión de ciclodextrina.
Para la administración oral, la dosis eficaz terapéuticamente puede ser en forma de comprimidos, cápsulas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, pulverizaciones, pastillas para chupar, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Entre los excipientes adecuados para la administración oral se incluyen los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
En algunas realizaciones, la dosis eficaz terapéuticamente toma la forma de una píldora, comprimido o cápsula y así, la forma de administración pueden contener, junto con un fármaco anti-TNFa, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico y similares; un disgregante tal como celulosa o derivados de la misma; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y un aglutinante tal como un almidón, goma arábiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y sus derivados. Un fármaco anti-TNFa puede formularse también en un supositorio dispuesto, por ejemplo, en un vehículo de polietilenglicol (PEG).
Las formas de administración líquidas se pueden preparar disolviendo o dispersando un fármaco anti-TNFa y opcionalmente, uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables en un vehículo, tal como, por ejemplo, suero salino acuoso (por ejemplo, cloruro sódico al 0,9 % p/v), dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solución o suspensión, por ejemplo, para administración oral, tópica o intravenosa. Un fármaco anti-TNFa puede formularse también en un enema de retención.
Para la administración tópica, la dosis eficaz terapéuticamente puede ser en forma de emulsiones, lociones, geles, espumas, cremas, gelatinas, soluciones, suspensiones, pomada y parches transdérmicos. Para la administración por inhalación, se puede administrar un fármaco anti-TNFa como un polvo seco o en forma líquida a través de un nebulizador. Para la administración parenteral, la dosis eficaz terapéuticamente puede ser en forma de soluciones estériles inyectables y polvos estériles envasados. Preferentemente, las soluciones inyectables se formulan a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5.
La dosis eficaz terapéuticamente se puede proporcionar también en una forma liofilizada. Tales formas de administración pueden incluir un tampón, por ejemplo, bicarbonato, para reconstituir antes de administrar o el tampón se puede incluir en la forma de administración liofilizada para reconstituir con, por ejemplo, agua. La forma de administración liofilizada puede comprender adicionalmente un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La forma de dosificación liofilizada se puede proporcionar en una jeringa, opcionalmente envasada junto con el tampón para reconstituir, de manera que la forma de administración reconstituida se puede administrar inmediatamente a un individuo.
En el uso terapéutico para tratar enfermedades y trastornos en los que se ha implicado TNFa en la fisiopatología, se puede administrar un fármaco anti-TNFa en la posología inicial de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg diariamente. Se puede utilizar una dosis diaria en un intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Las posologías, sin embargo, puede variar dependiendo de las necesidades del individuo, la gravedad de la enfermedad, trastorno o síntomas y del fármaco anti-TNFa a emplear. Por ejemplo, las posologías se pueden determinar empíricamente considerando el tipo y la gravedad de la enfermedad, trastorno y/o síntomas según los métodos descritos en el presente documento. La posología administrada a un individuo, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para afectar a una respuesta terapéutica beneficiosa en el individuo a lo largo del tiempo. El tamaño de la dosis se puede determinar también mediante la existencia, naturaleza y extensión de cualquiera de los efectos secundarios que acompañan a la administración a un individuo de un fármaco anti-TNFa en particular. La determinación de la dosificación adecuada para una situación en particular se encuentra dentro de los conocimientos del profesional sanitario. Normalmente, se inicia el tratamiento con posologías más pequeñas por debajo de la dosis óptima del fármaco anti-TNFa. Seguidamente, la posología aumenta en incrementos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo dependiendo de las circunstancias. Por conveniencia, la posología diaria total se puede dividir y administrar en porciones durante el día, si se desea.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fármaco anti-TNFa" incluye todas las formas farmacéuticamente aceptables de un fármaco que es útil para tratar uno o más síntomas asociados con las enfermedades o trastornos en los que se ha implicado al TNF-a en la fisiopatología. Por ejemplo, los fármacos anti-TNFa pueden ser una mezcla racémica o isomérica, un complejo sólido unido a una resina de intercambio iónico o similares. Además, los fármacos anti-TNFa pueden estar en forma solvatada. La expresión tiene por objeto también incluir todas las sales farmacéuticamente aceptables, derivados y análogos de los fármacos anti-TNFa que se han descrito, así como combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de unos fármacos anti-TNFa incluyen, sin limitación, el tartrato, succinato, tartarato, bitartarato, diclorhidrato, salicilato, hemisuccinato, citrato, maleato, clorhidrato, carbamato, sulfato, nitrato y formas de sal de benzoato de los mismos, así como combinaciones de los mismos y similares. Cualquier forma de unos fármacos anti-TNFa es adecuada para utilizar en los métodos de la presente invención, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de unos fármacos anti-TNFa, una base libre de unos fármacos anti-TNFa o una mezcla de las mismas. Entre los ejemplos de fármacos anti-TNFa adecuados se incluyen, aunque no se limitan a, agentes biológicos, fármacos convencionales y combinaciones de los mismos.
Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-citocinas y quimiocinas tales como anticuerpos de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Los ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-TNFa incluyen: anticuerpos monoclonales quiméricos tales como infliximab (Remicade®) (Centocor, Inc.; Horsham, Pensilvania), que es un anticuerpo monoclonal quimérico de IgG1 anti-TNFa; anticuerpos monoclonales humanizados tales como CDP571 y el CDP870 PEGilado; anticuerpos monoclonales totalmente humanos tales como adalimumab (Humira®) (Abbott Laboratories; Abbott Park, Illinois); proteínas de fusión p75 tales como etanercept (Enbrel®) (Amgen; Thousand Oaks, California; Wyeth Pharmaceuticals Inc.; Collegeville, Pensilvania), moléculas pequeñas (por ejemplo, inhibidores de quinasa PAM (en inglés, MAP)); y combinaciones de los mismos. Véase, Ghosh, Novartis Found Symp., 263: 193-205 (2004).
Otros agentes biológicos incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-adhesión celular tales como natalizumab (Tysabri®) (Elan Pharmaceuticals, Inc.; Dublín, Irlanda; Biogen Idec; Cambridge, Massachusetts), que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra la molécula de adhesión celular a4-integrina y MLN-02 (Millennium Pharmaceuticals; Cambridge, Massachusetts), que es un anticuerpo monoclonal humanizado de IgG1 anti-a4p7-integrina; agentes anti-linfocito T; anticuerpos anti-CD3 tales como visilizumab (Nuvion®) (PDL BioPharma; Incline Village, Nevada), que es un anticuerpo monoclonal humanizado de IgG2M3 anti-CD3; anticuerpos anti-CD4 tales como priliximab (cM-T412) (Centocor, Inc.; Horsham, Pensilvania), que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD4; anticuerpos de receptor alfa anti-IL-2 (CD25) tales como daclizumab Zenapax®) (PDL BioPharma; Incline Village, Nevada; Roche; Nutley, Nueva Jersey), que es un anticuerpo monoclonal humanizado de IgG1 anti-CD25 y basiliximab (Simulect®) (Novartis; Basilea, Suiza), que es un anticuerpo monoclonal quimérico de IgG1 anti-CD25; y combinaciones de los mismos.
Se puede monitorizar también un individuo a intervalos periódicos de tiempo para calcular la eficacia de un cierto régimen terapéutico una vez se ha obtenido la información de diagnóstico, pronóstico y/o predicción de la muestra del individuo. Por ejemplo, el nivel de presencia o concentración de un anticuerpo terapéutico y/o un autoanticuerpo dirigido al anticuerpo terapéutico puede cambiar según el efecto terapéutico del tratamiento con el anticuerpo terapéutico. En ciertas realizaciones, se puede monitorizar el paciente para calcular la respuesta y entender los efectos de ciertos fármacos o tratamientos en un enfoque individualizado. Adicionalmente, los pacientes pueden no responder a un fármaco, pero los niveles de anticuerpos pueden cambiar, sugiriendo que estos pacientes pertenecen a una población especial (no sensible) que se puede identificar a través de sus niveles de anticuerpos. A estos pacientes se les puede interrumpir su terapia actual y prescribírseles tratamientos alternativos.
Se puede monitorizar también un individuo a intervalos periódicos de tiempo para calcular las concentraciones o niveles de anticuerpos diferentes. Son importantes los niveles de anticuerpos en puntos temporales diferentes, así como la tasa de cambio de los niveles de anticuerpos a lo largo del tiempo. En ciertos casos, la tasa de incremento de uno o más anticuerpos (por ejemplo, autoanticuerpos contra anticuerpos anti-TNFa) en un individuo sobre una cantidad umbral indica que el individuo tiene un riesgo notablemente mayor de desarrollar complicaciones o de riesgo de efectos secundarios. La información obtenida de ensayos en serie en forma de velocidad de un indicador (es decir, el cambio en niveles de anticuerpos a lo largo de un periodo de tiempo) puede estar asociada con la gravedad de la enfermedad, el riesgo de complicaciones de la enfermedad y/o el riesgo de efectos secundarios.
Los métodos de la presente invención también se establecen para identificar no respondedores o respondedores escasos primarios, por ejemplo, para el tratamiento con un anticuerpo monoclonal terapéutico. Estos no respondedores o respondedores escasos primarios pueden, por ejemplo, ser pacientes que resulta que tienen una respuesta de inmunoglobulina innata o desarrollada previamente hacia el agente terapéutico. Cuando el agente terapéutico es un anticuerpo de diagnóstico, la identificación de no respondedores o respondedores escasos primarios puede asegurar la selección de un agente terapéutico adecuado para cada paciente individual.
El método según la invención puede, por ejemplo, utilizarse para identificar pacientes con fallo de respuesta secundaria. Los fallos de respuesta secundaria pueden ser asintomáticos, es decir, los únicos síntomas son que el tratamiento se ha vuelto menos eficaz o incluso no eficaz. En ciertos casos, los métodos de la presente invención son útiles para identificar el desarrollo del fallo de respuesta secundaria antes de que el paciente o de que el profesional sanitario médico haya percibido que el tratamiento es menos eficaz. Se puede aplicar una posología más elevada del tratamiento para asegurarse de que se alcanza la concentración correcta in vivo o se puede seleccionar un tratamiento alternativo o una combinación de los mismos. Cuando el agente terapéutico es un agente de diagnóstico, el desarrollo de un fallo de respuesta secundaria puede ser particularmente catastrófico. Se utilizan anticuerpos monoclonales marcados radiactivamente de forma rutinaria en la monitorización de enfermedades tales como cánceres y algunas enfermedades infecciosas, en las que es importante determinar el tamaño y/o la localización de la enfermedad/agente, por ejemplo, en la identificación de la presencia y/o localización de cualquier metástasis secundaria. Cuando el desarrollo del fallo de respuesta (primaria o secundaria) sucede de forma inadvertida, el paciente puede recibir el 'todo bien', es decir, un resultado falso negativo, que puede provocar el cese del tratamiento y a la posterior reaparición de la enfermedad, a menudo en un estado más desarrollado y posiblemente incurable.
Una categoría adicional de fallo de respuesta es el desarrollo de fallo de respuesta (por ejemplo, secundaria) asociada con efectos secundarios adversos. El desarrollo de una respuesta inmunitaria al hospedador en un sujeto puede acompañarse de efectos perjudiciales o desagradables. Estos pueden estar causados por el desarrollo de anticuerpos que reconocen los agentes terapéuticos humanos o humanizados pero que no distinguen entre otras inmunoglobulinas del hospedador. Los métodos de la presente invención son por tanto adecuados para identificar sujetos que tienen una respuesta inmunitaria innata o desarrollada previamente ante el agente terapéutico y quién puede, por ejemplo, ser vulnerable a efectos secundarios adversos asociados con el fallo de respuesta.
Los métodos de la presente invención son adecuados para la selección y gestión de regímenes de tratamiento que implican la administración de agentes terapéuticos monoclonales a pacientes. Por consiguiente, los métodos para determinar la concentración o biodisponibilidad de un anticuerpo terapéutico como se describe en el presente documento se pueden incorporar en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno. Monitorizando el estado inmunológico de un paciente utilizando los métodos de la presente invención durante el curso del tratamiento terapéutico, se puede adaptar la selección y/o administración del agente terapéutico para asegurar el máximo beneficio terapéutico al paciente, mientras se asegura el uso eficaz del coste de agentes terapéuticos costosos. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para determinar si un paciente requiere una pauta posológica modificada del agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo terapéutico) o una terapia farmacológica alternativa.
Los métodos de la presente invención pueden implicar adicionalmente un cálculo periódico de la concentración de suero o de la biodisponibilidad del agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo terapéutico) en el paciente.
Los métodos de la presente invención también establecen si un sujeto ha desarrollado una respuesta inmunitaria a un agente terapéutico tal como un anticuerpo terapéutico.
Los métodos de la presente invención también establecen un método para determinar si la falta de respuesta al tratamiento en un paciente se debe a la formación de inmunoglobulinas derivadas del paciente contra un anticuerpo terapéutico tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa.
La presente invención también establece un método para seleccionar el tratamiento farmacológico adecuado para un paciente que sufre una enfermedad que es tratable con un anticuerpo terapéutico.
La presente invención también establece un método de pronóstico para la determinación de la probabilidad de si un paciente desarrollará un fallo de respuesta secundaria ante un anticuerpo terapéutico.
VII. Ejemplos
La invención se describirá con más detalle por medio de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos que pueden cambiarse o modificarse para producir los mismos resultados esencialmente.
Ejemplo 1. Nuevo ensayo de cambio de movilidad para medir niveles de agentes biológicos anti-TNFa.
Este ejemplo ilustra un nuevo ensayo homogéneo para medir la concentración de fármaco anti-TNFa en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño para detectar la unión del fármaco anti-TNFa a TNFa marcado fluorescentemente. El ensayo es ventajoso porque obvia la necesidad de las etapas de lavado, utiliza fluoróforos que permiten la detección en el espectro visible y/o fluorescente, los cuales disminuyen los problemas de interferencia de fondo y del suero, incrementan la capacidad para detectar fármacos anti-TNFa en pacientes con una valoración baja debido a su elevada sensibilidad de detección de marca de fluorescencia y tiene lugar como una reacción en fase líquida, reduciendo por tanto la posibilidad de cualquier cambio en el epítopo por la unión a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.
En una realización ejemplar, el TNFa se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647), en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el espectro fluorescente. El TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir al fármaco anti-TNFa presente en el suero que se una. El TNFa marcado se puede también incubar con cantidades conocidas del fármaco anti-TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa al TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNFa presente en la muestra de suero a continuación se puede comparar con la curva estándar y los controles.
La figura 1 muestra un ejemplo del ensayo de la presente invención en la que se utiliza HPLC de exclusión por tamaño para detectar la unión entre TNFa-Alexa647 y HUMIRA™ (adalimumab). Como se muestra en la figura 1, la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647 provocó un desplazamiento del pico de TNFa-Alexa647 hacia la izquierda.
La figura 2 muestra las curvas de respuesta a la dosis de la unión de HUMIRA™ a TNFa-Alexa647. En particular, La figura 2A muestra que HUMIRA™ incrementó el cambio de TNFa-Alexa647 de forma dependiente de la dosis en el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño. La figura 2B muestra que la presencia de suero humano al 1 % no tuvo un efecto significativo sobre el cambio de TNFa-Alexa647 en el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño. La figura 2C muestra que la presencia de suero agrupado positivo para AR no tuvo un efecto significativo sobre el cambio de TNFa-Alexa647 en el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño.
Como tal, este ejemplo demuestra la utilidad de la presente invención en la monitorización de pacientes que reciben un fármaco anti-TNFa tal como HUMIRA™: (1) para guiar en la determinación de la posología farmacológica adecuada; (2) para evaluar farmacocinéticas de fármacos, por ejemplo, para determinar si el fármaco se elimina del cuerpo demasiado rápido; y (3) para guiar las decisiones del tratamiento, por ejemplo, si cambiar del fármaco anti-TNFa actual a un inhibidor de TNFa diferente o a otro tipo de terapia.
Ejemplo 2. Nuevo ensayo de cambio de movilidad para medir niveles de HACA y HAHA.
Este ejemplo ilustra un nuevo ensayo homogéneo para medir las concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño para detectar la unión de estos autoanticuerpos a un fármaco anti-TNFa marcado fluorescentemente. El ensayo es ventajoso porque obvia la necesidad de las etapas de lavado que eliminan HACA y HAHA de baja afinidad, utiliza fluoróforos que permiten la detección en el espectro visible y/o fluorescente, los cuales disminuyen los problemas de interferencia de fondo y del suero, incrementan la capacidad para detectar HACA y HAHA en pacientes con una valoración baja debido a su elevada sensibilidad de detección de marca de fluorescencia y tiene lugar como una reacción en fase líquida, reduciendo por tanto la posibilidad de cualquier cambio en el epítopo por la unión a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.
La utilidad clínica de medir autoanticuerpos (por ejemplo, HACA, HAHA, etc.) que se generan contra inhibidores de TNFa se ilustra por el hecho de que se detectaron HACA en el 53 %, 21 % y 7 % de los pacientes de artritis reumatoide tratados con 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg de infliximab. Cuando se combinó el infliximab con metotrexato, la incidencia de anticuerpos fue inferior al 15 %, 7 % y 0 %, lo que indica que la terapia inmunosupresora concomitante es eficaz para disminuir las respuestas anti-fármaco, pero también indica que una dosis elevada de fármaco anti-TNFa puede provocar tolerancia. En la enfermedad de Crohn, se ha informado de una incidencia mucho mayor; tras la quinta infusión, el 61 % de los pacientes tenían HACA. La respuesta clínica se acortó cuando había HACA presentes. Véase, Rutgeerts, N. Engl. J. Med., 348: 601-608 (2003). Un estudio retrospectivo de los niveles de infliximab y HACA medidos a lo largo de un periodo de 3 años, de 2005 a 2008, en 155 pacientes demostró que se detectaron HACA en el 22,6 % (N = 35) de los pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino. Véase, Afif et al., "Clinical Utility of Measuring Infliximab and Human Anti-Chimeric Antibody Levels in Patients with Inflammatory Bowel Disease" ("Utilidad clínica de medir niveles de infliximab y de anticuerpos antiquiméricos humanos en pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino"); artículo presentado en la semana de la enfermedad digestiva (en inglés, Digestive Disease Week); 30 de mayo-3 de junio, 2009; Chicago, Illinois. Los autores concluyeron que el tratamiento de cambio basado solo en síntomas clínicos puede provocar una gestión inadecuada.
El ensayo de cambio de movilidad homogéneo es ventajoso respecto a los métodos actuales tales como el ensayo de puente mostrado en la figura 3 para medir concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) en una muestra de paciente, porque el método inventivo es capaz de medir la concentración de autoanticuerpos tales como HACA sin unión no específica e interferencia de fase sólida de la placa de ELISA, sin interferencia del fármaco anti-TNFa (por ejemplo, con el ensayo de puente, las mediciones de HACA se deben tomar en niveles valle del fármaco anti-TNFa) y sin ninguna dependencia sobre la multivalencia del anticuerpo (por ejemplo, los anticuerpos IgG4 no se detectan utilizando el ensayo de puente porque los anticuerpos IgG4 son biespecíficos y no se pueden enlazar al mismo antígeno). Como tal, la presente invención tiene al menos las siguientes ventajas sobre los métodos actuales: evita la unión de antígenos a superficies sólidas (se evita la desnaturalización); elimina el efecto de IgG4; supera los problemas de valle del anticuerpo terapéutico; detecta anticuerpos con afinidades débiles; eliminan las uniones no específicas de IgG irrelevantes; e incrementa la sensibilidad y la especificidad de la detección.
En una realización ejemplar, el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, REMICADE™) se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647), en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el espectro fluorescente. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que se unan HACA y HAHA presentes en el suero. El fármaco anti-TNFa marcado se puede incubar también con cantidades conocidas de un anticuerpo anti-IgG en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión de los anticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el fármaco marcado solo. La concentración de HACA y HAHA presentes en la muestra de suero se puede comparar a continuación con la curva estándar y los controles. La figura 4 ilustra una descripción ejemplar de los ensayos de detección de autoanticuerpos de la presente invención para medir las concentraciones de HACA/HAHA generadas contra REMICADE™. En ciertos casos, los niveles de HACA/HAHA elevados indican que la terapia actual con REMICADE™ debe cambiarse a otro fármaco anti-TNFa, tal como HUMIRA™.
El principio de este ensayo se basa en el cambio de movilidad del complejo REMICADE™ marcado con Alexa647 unido a anticuerpo frente al REMICADE™ marcado con Alexa647 libre en la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC-ET) debido al incremento en peso molecular del complejo.
La cromatografía en este ejemplo se realizó en un sistema de HPLC Agilent-1200, utilizando una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de pesos moleculares de 5.000 -700.000 y una fase móvil de PBS IX, pH 7,4, a un caudal de 0,5 ml/min con detección de UV a 650 nm. Frente al sistema de HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 hay una precolumna analítica que es una Bio-Sep de 75x7,8 mm SEC-3000. Se cargó un volumen de muestra de 100 pl en la columna para cada análisis.
El complejo REMICADE™ marcado con Alexa647 unido a anticuerpo se forma por incubación de una cantidad conocida del anticuerpo y del REMICADE™ marcado con Alexa647 en el PBS IX, pH 7,3, tampón de elución a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis con HPLC-ET.
La figura 5 muestra un análisis de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG humana a REMICADE™-Alexa647 detectado utilizando el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño de la presente invención. La unión anticuerpo anti-IgG a REMICADE™-Alexa647 provocó un desplazamiento del pico de REMICADE™-Alexa647 hacia la izquierda. La figura 6 muestra un segundo análisis de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG humana a REMICADE™-Alexa647 detectado utilizando el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño de la presente invención. Las mayores cantidades del anticuerpo anti-IgG humana dieron como resultado el incremento de la formación de complejos anti-IgG/REMICADE™-Alexa647 de forma dependiente de la dosis, como indicó el desplazamiento del pico de REMICADE™-Alexa647 hacia la izquierda. La figura 7 muestra curvas de respuesta a la dosis de la unión de anticuerpo anti-IgG a REMICADE™-Alexa647.
La figura 8 muestra la formación del inmunocomplejo REMICADE™-Alexa647 en suero humano normal y en suero positivo para HACA detectado utilizando el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño de la presente invención con 100 pl de muestra inyectada. Como se muestra en la figura 8, la unión de HACA presente en muestras de pacientes a REMICADE™-Alexa647 provocó un desplazamiento del pico de REMICADE™-Alexa647 hacia la izquierda. Como tal, el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño de la invención es ventajoso particularmente porque mide HACA en presencia de REMICADE™, se puede utilizar mientras el paciente está en terapia, mide la unión de HACA tanto la débil como la fuerte, es un ensayo de cambio de movilidad de mezcla y lectura y se puede ampliar a otros enfoques que utilizan REMICADE™ marcado para equilibrar con HACA y REMICADE™.
La figura 9 proporciona un sumario de las mediciones de HACA a partir de 20 muestras de suero de pacientes que se realizaron utilizando el ensayo de puente o el ensayo de cambio de movilidad de la presente invención. Este estudio comparativo demuestra que los métodos presentes han incrementado la sensibilidad respecto a métodos actuales, porque 3 muestras que fueron negativas para HACA medidas utilizando el ensayo de puente, resultaron en realidad positivas para HACA cuando se midieron utilizando el ensayo de cambio de movilidad de la presente invención (véase, los pacientes n°. SK07070305, SK07070595 y SK07110035).
Como tal, este ejemplo demuestra la utilidad de la presente invención en la monitorización de pacientes que reciben un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, REMICADE™) para detectar la presencia o nivel de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA y/o HAHA) contra el fármaco, porque dichas respuestas inmunitarias se pueden asociar con reacciones de hipersensibilidad y cambios dramáticos en las farmacocinéticas y la biodistribución del fármaco anti-TNFa que impiden el tratamiento adicional con el fármaco.
En conclusión, los ejemplos 1 y 2 demuestran que los anticuerpos TNFa y anti-TNFa pueden marcarse con Alexa647
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Ejemplo 3. Medición de niveles de anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA) de Infliximab (IFX) en suero de paciente utilizando un nuevo ensayo de cambio de movilidad.
RESUMEN
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biodisponibilidad del fármaco y la farmacocinética en pacientes individuales pueden contribuir al fallo del tratamiento. La inmunogenicidad de los fármacos, que provoca el desarrollo de HACA/HAHA en pacientes, podría dar como resultado una gama de reacciones adversas, desde una respuesta alérgica leve a un choque anafiláctico. Estos problemas ahora se reconocen por muchos investigadores, agencias controladoras de fármacos, compañías de seguros médicos y fabricantes de fármacos. Asimismo, muchos pacientes con fallo de respuesta secundaria a un fármaco anti-TNFa se benefician del cambio a otros fármacos anti-TNFa, lo que sugiere que juegan un papel los anticuerpos neutralizantes dirigidos específicamente contra la proteína utilizada para el tratamiento (Radstake et al., Ann. Rheum. Dis., 68(11):1739-45 (2009)). Se garantiza por tanto la monitorización de pacientes para los niveles de fármacos y de HACA/HAHA de modo que la administración se puede adaptar al paciente individual y se pueden proporcionar las terapias prolongadas eficaz y económicamente con poco o ningún riesgo para los pacientes (Bendtzen et al., Scand. J. Gastroenterol., 44(7):774-81 (2009)).
Se han utilizado varios inmunoensayos ligados a enzimas para calcular los niveles en circulación de fármacos y de HACA/HAHA. La figura 10 proporciona un sumario de los ensayos actuales disponibles para la medición de HACA en comparación con el ensayo nuevo de HACA de la presente invención. Una de las limitaciones de las metodologías actuales es que los niveles de anticuerpos son difíciles de medir cuando hay una cantidad medible de fármaco en circulación. En contraste con los métodos en fase sólida actuales para detectar HACA en los que las mediciones solo se pueden realizar al menos 8 semanas tras una dosis de IFX, el ensayo nuevo de la presente invención es un ensayo de HPLC de exclusión por tamaño (ET) en fase líquida sin marcaje radioactivo que es capaz de medir los niveles de HACA e IFX en suero de pacientes mientras son tratados con IFX.
A continuación, se dan los fundamentos para medir las concentraciones de suero de fármacos biológicos anti-TNFa y anticuerpos contra fármacos biológicos de TNFa en pacientes: (1) para estudios de PC (en inglés, PK) en ensayos clínicos; (2) durante los ensayos clínicos la FDA puede requerir la monitorización de una respuesta inmunitaria de un paciente al fármaco biológico; (3) para monitorizar la respuesta inmunitaria de un paciente al fármaco biológico a través de la medición de HACA o HAHA para guiar la posología del fármaco para cada paciente; y (4) para utilizar como una guía para cambiar a un fármaco biológico diferente cuando el fármaco inicial falla.
MÉTODOS
Análisis de HPLC-ET de los niveles de Infliximab (IFX) en suero de pacientes. Se marcó TNFa humano recombinante con un fluoróforo ("Fl" tal como, por ejemplo, Alexa Fluor® 488) según las instrucciones del fabricante. Se incubó el TNFa marcado con cantidades diferentes de IFX o suero de pacientes durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 pl de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó un detector de fluorescencia (en inglés, FLD) para monitorizar el inmunocomplejo TNFa-Fl libre y el TNFa-Fl unido basándose en sus tiempos de retención. Se calcularon los niveles de IFX de suero a partir de la curva estándar.
Análisis de HPLC-ET de los niveles de HACA en suero de pacientes. Se marcó IFX purificado con FI. Se incubó el IFX marcado con diluciones diferentes de suero agrupado positivo para HACA o suero de pacientes diluido durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 pl de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó un detector de fluorescencia (en inglés, FLD) para monitorizar el inmunocomplejo IFX-Fl libre y el IFX-Fl unido basándose en sus tiempos de retención. La proporción de IFX-FI unido y libre se utilizó para determinar el nivel de HACA.
Procedimiento de ensayo de cambio de movilidad para medir HACA en suero. El principio de este ensayo se basa en el cambio de movilidad del complejo Infliximab (IFX) marcado con FI unido a HACA frente al IFX marcado con FI libre en la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC-ET) debido al incremento en peso molecular del complejo. La cromatografía se realizó en un sistema de HPLC Agilent-1200, utilizando una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de pesos moleculares de 5.000-700.000 y una fase móvil de PBS 1X, pH 7,3, a un caudal de 0,5 ml/min con detección de FLD. Frente al sistema de HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 hay una precolumna analítica que es una Bio-Sep de 75x7,8 mm SEC-3000. Se cargó un volumen de muestra de 100 pl en la columna para cada análisis. El complejo IFX marcado con FI unido a HACA se forma mediante la incubación de suero de paciente tratado con IFX e IFX marcado con FI en el PBS 1X, pH 7,3, tampón de elución a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis con HPLC-ET.
RESULTADOS
La figura 11 muestra la separación del complejo IFX-FI unido a HACA del IFX-FI libre debido al cambio de movilidad del complejo de elevado peso molecular. Como se observa en los paneles c y d, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 21,8 min a 15,5-19,0 min. Cuanto más HACA está presente en la mezcla de reacción, menos permanece el IFX-FI libre en el cromatograma y más inmunocomplejo se forma. La figura 12 muestra las curvas de respuesta a la dosis del cambio del pico fluorescente provocado por la adición de HACA. Utilizando muestra positiva para HACA, los presentes inventores pudieron detectar el cambio del pico con diluciones 1:1000 del suero.
La figura 13 muestra la separación del complejo TNFa-Fl unido a IFX del TNFa-Fl libre debido al cambio de movilidad del complejo de elevado peso molecular.
Como se observa en los paneles c y d, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 24 min a 13­ 19,5 min. Cuanto más IFX está presente en la mezcla de reacción, menos permanece el TNFa-FI libre en el cromatograma y más inmunocomplejo se forma. La figura 14 muestra las curvas de respuesta a la dosis del cambio del pico fluorescente de TNFa-Fl provocado por la adición de IFX. Basándose en el IFX añadido, el límite de detección es de 10 ng/ml de IFX en el suero.
El nuevo ensayo de cambio de movilidad de la presente invención se validó sometiendo a prueba las muestras de suero de pacientes positivos y negativos en HACA medidos mediante el ensayo de puente (Tabla 2). Utilizando este ensayo, los presentes inventores han analizado las muestras de suero de 50 pacientes sanos y de 117 pacientes de EII tratados con IFX. Todas las muestras de 50 pacientes sanos tienen un nivel de IFX por debajo del límite de detección, mientras que 65 de las muestras de pacientes tienen un promedio de concentración de IFX de 11,0 ug/ml. La tabla 3 muestra los niveles de HACA en el suero de pacientes control sanos y de pacientes de EII tratados con IFX medidos mediante el ensayo de puente y el ensayo de cambio de movilidad. El ensayo de puente detectó menos pacientes positivos para HACA que el ensayo de cambio de movilidad y más falsos negativos, así como más falsos positivos.
Tabla 2. Correlación de niveles de HACA relativos en suero de pacientes de positivos y negativos firmes entre n n n HPL -ET.
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Tabla 3. Análisis de muestras de pacientes sobre niveles de suero de HACA con ensayo de puente (Valor de corte _______ 1,69 ug/ml) y ensayo de cambio de HPLC (Valor de corte 0,19, proporción de IFX unido y libre).________
Sujetos (n) Positivos en HACA Ensayo de puente
Ensayo de puente Ensayo de HPLC Falso negativo so positivo
Control sano
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50 N/D N/D
Paciente tratado 117 9 (IFX elevado) 9 con IFX
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Los resultados falsos negativos son provocados por el suero de pacientes que contiene niveles de IFX elevados que interfieren con el ensayo de puente en la determinación de HACA, mientras que el ensayo de HPLC-ET no se ve afectado. Los resultados falsos positivos son provocados por el suero de pacientes que contiene niveles de sustancias de interferencia no específicas que pueden interferir con el ensayo de puente.____________________
La figura 15 muestra la relación del nivel de HACA y la concentración de IFX en pacientes de EII durante el curso del tratamiento de IFX. Se pudo detectar HACA ya desde V10 (30 semanas) y siguió incrementándose en algunos pacientes durante el tratamiento de IFX. La figura 16 muestra que se pudo detectar HACA en presencia de IFX utilizando el ensayo de la presente invención. Se asoció un mayor nivel de HACA en el suero con un menor nivel de IFX que podía detectarse (por ejemplo, redujo la biodisponibilidad). Como tal, la detección temprana de HACA durante el tratamiento con IFX puede guiar al médico y/o al paciente para cambiar a otros fármacos anti-TNF o incrementar la dosis de IFX.
CONCLUSIÓN
Los fármacos biológicos Anti-TNFa pueden marcarse fácilmente con un fluoróforo ("Fl") y el formato de ensayo de cambio de movilidad utilizado para medir HACA/HAHA es un ensayo homogéneo sin el revestimiento de antígenos sobre una superficie sólida y las etapas de lavados múltiples e incubación, como un ELISA típico. La incubación de IFX marcado con FI con suero positivo en HACA da como resultado la formación de un complejo inmunitario que eluye hacia una posición diferente en comparación con IFX marcado con FI libre en HPLC-ET y por tanto se puede cuantificar la cantidad de HACA. La presencia de otros componentes de suero tuvo poco efecto sobre el ensayo de cambio de movilidad. El formato de ensayo de cambio de movilidad, a diferencia de ELISA, no se ve afectado por uniones no específicas de IgG irrelevantes y detecta el isotipo IgG4. Las muestras de pacientes sanos no causan cambio de movilidad del IFX marcado con FI y se encontró que el 28,2 % de los pacientes tratados con IFX tuvieron HACA mediante el ensayo de la presente invención. Como tal, el formato de ensayo descrito en el presente documento es muy sensible y puede aplicarse para detectar todos los fármacos biológicos (por ejemplo, REMICADE™, HUMIRA, Enbrel y Cimzia), así como sus anticuerpos (por ejemplo, anti-REMICADE™, anti-HUlVIIRA, anti-Enbrel y anti-Cimzia) en suero de pacientes. Especialmente, dado que se puede detectar HACA en presencia de IFX utilizando el ensayo de cambio de movilidad de la invención, la detección temprana de HACA durante el tratamiento con IFX puede guiar al médico y/o al paciente para cambiar a otros fármacos anti-TNF o incrementar la dosis posterior de IFX.
Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de HPLC-ET en fase líquida sin marcaje radioactivo para medir los niveles de HACA e IFX en muestras de suero obtenidas de pacientes tratados con IFX. El nuevo ensayo tiene elevada sensibilidad, exactitud y precisión y los resultados son altamente reproducibles, lo que hace a este ensayo adecuado para someter a prueba de forma rutinaria un número grande de muestras de suero humanas. El nuevo formato de ensayo, a diferencia de ELISA, elimina el revestimiento de antígenos a superficies sólidas y no se ve afectado por uniones no específicas de IgG irrelevantes. Estas ventajas del formato de ensayo descritas en el presente documento reducen los resultados falsos negativos y falsos positivos de la prueba. Ventajosamente, el formato de ensayo de la presente invención es muy sensible y puede utilizarse para detectar todos los fármacos biológicos así como otros anticuerpos presentes en el suero mientras el paciente está en terapia.
Ejemplo 4. Diferenciación entre anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA) neutralizantes y no neutralizantes en suero de pacientes utilizando ensayos de cambio de movilidad nuevos.
Este ejemplo ilustra ensayos homogéneos nuevos para medir concentraciones de autoanticuerpos (por ejemplo, HACA) en una muestra de paciente (por ejemplo, suero) y para determinar si dichos autoanticuerpos son autoanticuerpos neutralizantes o no neutralizantes utilizando cromatografía de exclusión por tamaño para detectar la unión de dichos autoanticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado fluorescentemente en presencia de TNFa marcado fluorescentemente. Estos ensayos son ventajosos porque obvian la necesidad de las etapas de lavado que eliminar HACA de baja afinidad, utilizan fluoróforos distintos que permiten la detección en el espectro visible y/o en el fluorescente que disminuyen los problemas de interferencia del fondo y del suero, incrementan la capacidad para detectar HACA neutralizante o no neutralizante en pacientes con una valoración baja debido a la elevada sensibilidad de detección de marca fluorescente y tiene lugar como una reacción en fase líquida, reduciendo por tanto la posibilidad de cualquier cambio en el epítopo por la unión a una superficie sólida tal como una placa de ELISA.
En una realización ejemplar, se marca un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, REMICADE™) con un fluoróforo "F1" (véase, por ejemplo, la figura 17A), en l que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible o en el fluorescente. De manera similar, se marca TNFa con un fluoróforo "F2" (véase, por ejemplo, la figura 17A), en el que se puede detectar el fluoróforo tanto en el espectro visible como en el fluorescente y en el que "F1" y "F2" son fluoróforos diferentes. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida y se añade el TNFa marcado a la reacción para permitir la formación de complejos (es decir, inmunocomplejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado, TNFa marcado y/o HACA presente en el suero. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión tanto del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) y el TNFa marcado al fármaco anti-TNFa marcado da como resultado un desplazamiento del pico hacia la izquierda (por ejemplo, "Inmunocomplejo 1" en la figura 17A) en comparación con un complejo binario entre el autoanticuerpo y el fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, "Inmunocomplejo 2" en la figure 17A), el fármaco marcado solo o el TNFa marcado solo. La presencia de este complejo de autoanticuerpo ternario (por ejemplo, HACA), TNFa marcado y fármaco anti-TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es una forma no neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), de manera que el autoanticuerpo no interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa. En una realización particular, como se muestra en la Figura 17A, si está presente en el suero HACA no neutralizante, se observará un cambio tanto para F1-REMICADE™ como para F2-TNFa, dando como resultado un incremento en el pido tanto del Inmunocomplejo 1 como en del Inmunocomplejo 2 y una disminución en los picos de F1-REMICADE™ libre y de F2-TNFa libre. Sin embargo, la presencia del complejo binario entre el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) y el fármaco anti-TNFa marcado (por ejemplo, "Inmunocomplejo 2" en la figura 17B) en ausencia del complejo ternario de autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), TNFa marcado y fármaco anti-TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es una forma neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), de manera que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa. En una realización particular, como se muestra en la Figura 17B, si está presente en el suero HACA neutralizante, se observará un cambio para F1-REMICADE™, dando como resultado un incremento en el pico del Inmunocomplejo 2, un descenso en el pico de F1-REMICADE™ libre y ningún cambio en el pico de F2-TNFa libre. En ciertos casos, la presencia de HACA neutralizante indica que la terapia actual con REMICADE™ debe cambiarse a otro fármaco anti-TNFa, tal como HUMIRA™.
En una realización alternativa, el fármaco anti-TNFa marcado se incuba primero con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir la formación de complejos (es decir, inmunocomplejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado y HACA presente en el suero. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una primera columna de exclusión por tamaño. La unión de los autoanticuerpos (por ejemplo, HACA) al fármaco anti-TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico (por ejemplo, "Inmunocomplejo 2" en la figura 18) en comparación con el fármaco marcado solo. El TNFa marcado se añade a continuación a la reacción para determinar si es capaz de desplazar (por ejemplo, de competir con) el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) para unirse al fármaco anti-TNFa marcado, para permitir por tanto la formación de complejos (es decir, inmunocomplejos) entre el fármaco anti-TNFa marcado y el TNFa marcado. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una segunda columna de exclusión por tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa marcado al TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico (por ejemplo, "Inmunocomplejo 3" en la figura 18) en comparación con el TNFa marcado solo. La ruptura de la unión entre el autoanticuerpo (por ejemplo, HACA) y el fármaco TNFa marcado mediante la adición de TNFa marcado indica que el autoanticuerpo presente en la muestra de suero es una forma neutralizante del autoanticuerpo (por ejemplo, HACA), de manera que el autoanticuerpo interfiere con la unión entre el fármaco anti-TNFa y el TNFa. En ciertos casos, la presencia de HACA neutralizante indica que la terapia actual con REMICADE™ debe cambiarse a otro fármaco anti-TNFa, tal como HUMIRA™. Ejemplo 5. Análisis de anticuerpos antifármaco humanos (AAF) para Adalimumab en suero de pacientes utilizando un ensayo de cambio de movilidad homogéneo nuevo.
Antecedentes y objetivo: Los anticuerpos monoclonales contra TNF-a tales como infliximab (IFX), adalimumab (HUMIRA™) y certolizumab se han mostrado eficaces en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) y de otros trastornos inflamatorios. Los anticuerpos antifármaco (AAF) pueden reducir la eficacia de los fármacos y/o inducir efectos adversos. Sin embargo, se han encontrado AAF no solo en pacientes tratados con el anticuerpo quimérico infliximab, sino también en pacientes tratados con el anticuerpo humanizado adalimumab. La monitorización de los niveles de AAF y de fármacos en pacientes individuales puede ayudar a optimizar el tratamiento y la posología del paciente. Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de cambio de movilidad homogéneo en fase líquida sin marcaje radioactivo para medir con exactitud tanto HACA (anticuerpo antiquimérico humano) como IFX en el suero de pacientes. Este método de ensayo supera una limitación importante de los ensayos en fase sólida actuales para detectar HACA, a saber, la incapacidad para detectar HACA con exactitud en presencia de IFX en circulación. En el presente estudio, los presentes inventores han evaluado un nuevo método para medir los niveles de AAF de suero y de fármacos en pacientes tratados con el fármaco de anticuerpo humanizado, adalimumab.
Métodos: El ensayo de cambio de movilidad estuvo basado en el cambio en el tiempo de retención de un antígeno libre frente al inmunocomplejo antígeno-anticuerpo en la separación de exclusión por tamaño. Se mezclaron adalimumab o TNF-a marcado con fluoróforo y control interno con muestras de suero para medir el cambio de movilidad del adalimumab y TNF-a libre en presencia de AAF o de fármaco. Los cambios en la proporción del adalimumab o TNF-a libre respecto al control interno son indicadores de la formación de inmunocomplejos. Se determinaron las concentraciones de AAF o adalimumab con curvas estándar generadas mediante la incubación con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-IgG humana o adalimumab purificado. Utilizando el ensayo de cambio de movilidad, los presentes inventores midieron los niveles de adalimumab y AAF en sueros recogidos de pacientes de EII tratados con adalimumab que habían dejado de responder.
Resultados: Se generaron curvas de respuesta a la dosis con anticuerpo anti-IgG humana para la medición del cambio de movilidad de adalimumab marcado. El límite de detección del ensayo fue de 1 ng de anti-IgG humana. Se sometieron a prueba cincuenta controles sanos para AAF y todas las muestras tuvieron niveles de AAF por debajo del límite de detección (es decir, sin cambio del adalimumab marcado libre). Se demostró también la detección de AAF en presencia de adalimumab añadido exógenamente. Para medir la concentración de fármaco en pacientes tratados con adalimumab, los presentes inventores generaron una curva estándar con diferentes cantidades de adalimumab sobre el cambio de movilidad de TNF-a marcado y el límite de detección de adalimumab fue de 10 ng.
Conclusiones: El ensayo de cambio de movilidad homogéneo en fase líquida sin marcaje radioactivo de la presente invención se ha aplicado para medir niveles de AAF y adalimumab en muestras de suero de pacientes tratados con adalimumab. El ensayo resultó ser reproducible con elevada sensibilidad y exactitud y puede utilizarse para evaluar niveles de AAF en muestras de suero de pacientes tratado con adalimumab.
Ejemplo 6. Análisis de anticuerpos antifármaco (AAF) para Adalimumab en suero de pacientes utilizando un ensayo de cambio de movilidad exclusivo nuevo.
RESUMEN
Antecedentes: Los fármacos anti-TNF-a tales como infliximab (IFX) y adalimumab (ADL) han mostrado ser eficaces en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino (EII). Sin embargo, la incorporación de AAF en los pacientes tratados puede reducir la eficacia de los fármacos y/o inducir efectos adversos. De hecho, se han encontrado AAF no solo en pacientes tratados con IFX, sino también en pacientes tratados con ADL. La monitorización de los niveles de AAF y de fármacos en pacientes individuales puede ayudar a optimizar el tratamiento y la posología del paciente. Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de cambio de movilidad para medir con exactitud tanto HACA (anticuerpo antiquimérico humano) como IFX en el suero de pacientes tratados con IFX. Este de ensayo supera la limitación importante de los ensayos en fase sólida actuales para detectar HACA, a saber, la incapacidad para detectar HACA con exactitud en presencia de IFX en circulación. En el presente estudio, los presentes inventores han evaluado un nuevo método para medir los niveles de AAF de suero y de fármacos en pacientes tratados con el fármaco de anticuerpo totalmente humano, ADL.
Métodos: El ensayo de cambio de movilidad estuvo basado en el cambio en el tiempo de retención del inmunocomplejo antígeno-anticuerpo frente al antígeno libre en la cromatografía de exclusión por tamaño. Se mezclaron ADL o TNF-a marcado con fluoróforo y control interno con muestras de suero para medir el cambio de movilidad del ADL y TNF-a marcado en presencia de AAF o de fármaco. Los cambios en la proporción del ADL o TNF-a libre respecto al control interno son indicadores de la formación de inmunocomplejos. Se determinaron las concentraciones de suero de AAF o ADL con curvas estándar generadas mediante la incubación con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-IgG humana o ADL purificado. Utilizando este ensayo, los presentes inventores midieron los niveles de ADL y AAF en sueros recogidos de pacientes de EII tratados con ADL.
Resultados: Se generaron curvas de respuesta a la dosis con anticuerpo anti-IgG humana para la medición del cambio de movilidad de ADL marcado. El límite de detección del ensayo fue de 10 ng de anti-IgG humana. Se sometieron a prueba 100 controles sanos para AAF y todas las muestras tuvieron niveles de AAF por debajo del límite de detección (es decir, sin cambio del ADL marcado libre). Se demostró la detección de AAF en cinco de las 114 muestras de pacientes de EII tratados con ADL. Para medir la concentración de fármaco en pacientes tratados con ADL, los presentes inventores generaron una curva estándar con diferentes cantidades de ADL sobre el cambio de movilidad de TNF-a marcado con límite de detección de 10 ng.
Conclusiones: Los presentes inventores han aplicado su ensayo de cambio de movilidad homogéneo en fase líquida sin marcaje radioactivo exclusivo nuevo para medir niveles de AAF y ADL en suero de pacientes tratados con ADL. Los ensayos son reproducibles con elevada sensibilidad y exactitud y son útiles para evaluar niveles de AAF en muestras de suero de pacientes tratados con ADL.
INTRODUCCIÓN
Se ha visto que los anti-factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) biológicos tales como infliximab (IFX), etanorcept, adalimumab (ADL) y certolizumab pegol reducen la actividad de la enfermedad en diversas enfermedades autoinmunitarias, incluyendo la enfermedad de Crohn (EC) y la artritis reumatoide (AR). Sin embargo, algunos pacientes no responden a la terapia anti-TNF-a, mientras que otros necesitan una posología más alta o más frecuente debido a la falta de respuesta suficiente o al desarrollo de reacciones a la infusión.
La inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos que causa el desarrollo de anticuerpos en pacientes contra los fármacos puede contribuir al fallo de los tratamientos y a las reacciones a la infusión. Los anticuerpos quiméricos como IFX tienen un elevado potencial para inducir la generación de anticuerpos en comparación con anticuerpos totalmente humanizados tales como a Dl . La prevalencia de anticuerpos contra IFX (HACA) en pacientes de AR varía del 12 % al 44 % y parece ser inversamente proporcional al nivel de IFX en suero de pacientes y a la respuesta terapéutica. Mientras el ADL totalmente humanizado se supone que es menos inmunógeno que los anticuerpos murinos o quiméricos, varios estudios han informado de la formación de anticuerpos humanos antihumanizados (HAHA) y mostraron la prevalencia de generación de anticuerpos del 1 % al 87 % en pacientes de AR y EC (Aikawa et al., Immunogenicity of Anti-TNF-alpha agents in autoimmune diseases. Clin. Rev. Allergy Immunol., 38(2-3):82-9 (2010)).
Muchos pacientes con fallo de respuesta secundaria hacia un fármaco anti-TNF-a se pueden beneficiar del cambio a otro fármaco anti-TNF-a o de incrementar la posología y/o la frecuencia de la posología. La monitorización de pacientes para los niveles de fármaco y anticuerpo antifármaco (AAF) está garantizada por tanto de modo que la administración de fármacos se puede adaptar al paciente individual. Este enfoque permite el ajuste de la dosis cuando esté justificado o el cese de la medicación cuando estén presentes niveles de AAF. (Bendtzen et al., Individual medicine in inflammatory bowel disease: monitoring bioavailability, pharmacokinetics and immunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. Scand. J. Gastroenterol., 44(7):774-81 (2009); Afif et al., Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol., 105(5): 1133-9 (2010)).
Se han desarrollado diversos ensayos para medir HACA y HAHA. Una de las limitaciones de las metodologías actuales es que los niveles de AAF no pueden medirse de forma fiable cuando hay un nivel elevado de fármacos en la circulación.
Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de cambio de movilidad en fase líquida sin marcaje radioactivo exclusivo para medir niveles de AAF y ADL en suero de pacientes tratados con ADL que no se ve afectado por la presencia del fármaco en el suero.
MÉTODOS
Se incubó ADL marcado con fluoróforo (FI) con suero de paciente para formar el inmunocomplejo. Se incluyó un péptido pequeño marcado con FI como un control interno en cada reacción. Se utilizaron diferentes cantidades de anti-IgG humana para generar una curva estándar para determinar el nivel de AAF del suero. Se separó el ADL marcado con FI libre del complejo unido a anticuerpo basándose en su peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se utilizó la proporción de ADL marcado con FI libre respecto al control interno de cada muestra para extrapolar la concentración de HAHA a partir de la curva estándar. Se utilizó una metodología similar para medir niveles de ADL en muestras de suero de pacientes con TNF-a marcado con FI.
RESULTADOS
La figura 19 muestra la separación del complejo FI-ADL unido a anti-IgG humana del FI-ADL libre debido al cambio de movilidad del complejo de elevado peso molecular. Como se observa en los paneles c a h, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 10,1 min a 7,3-9,5 min. Cuanto más anti-IgG humana se añade en la mezcla de reacción, menos permanece el ADL libre en el cromatograma y más inmunocomplejo se forma (h a c). El tiempo de retención para el control interno es de 13,5 min.
La figura 20 muestra la curva de respuesta a la dosis del cambio del pico fluorescente provocado por la adición de anti-IgG humana. El incremento de la concentración de anti-IgG humana reduce la proporción de ADL libre respecto al control interno debido a la formación del inmunocomplejo. La sensibilidad del ensayo es de 10ng/ml de anti-IgG humana. El control interno "Fl-BioCyt" corresponde a una Alexa Fluor® 488-biocitina (BioCyt) que combina el fluoróforo verde fluorescente Alexa Fluor® 488 con biotina y una amina primaria reparable con aldehido (aldehydefixable primary amine) (lisina) (Invitrogen Corp.; Carlsbad, California).
La figura 21 muestra la separación del complejo TNF-a-Fl unido a ADL del TNF-a-Fl libre debido al cambio de movilidad del complejo de elevado peso molecular. Como se observa en los paneles c y j, el tiempo de retención del pico fluorescente se desplazó de 11,9 min a 6,5-10,5 min. Cuanto más ADL se añade en la mezcla de reacción, menos permanece el pico de TNFa-FI libre en el cromatograma y más inmunocomplejo se forma.
La figura 22 muestra las curvas de respuesta a la dosis del cambio del pico de TNFa-Fl provocado por la adición de ADL. Basándose en el ADL añadido, el límite de detección es de 10 ng/ml de ADL en el suero.
La tabla 4 muestra que las muestras de suero de 100 sujetos sanos y de 114 pacientes de EII tratados con ADL se analizaron para los niveles de AAF y ADL utilizando el ensayo de cambio de movilidad de la presente invención. Todas las muestras de los 100 sujetos sanos tuvieron niveles de AAF por debajo del límite de detección (sin cambio del Fl-ADL libre), mientras que 5 de las 114 muestras de pacientes tuvieron una concentración de AAF de 0,012 a >20 |jg/ml. El promedio de niveles de ADL en muestras de 100 sujetos sanos fue de 0,76±1,0 jg/ml (intervalo de 0 a 9,4 jg/ml). El promedio de los niveles de ADL en 114 muestras de suero de pacientes tratados con ADL fue de 10,8±17,8 jg/ml (intervalo 0 - 139 jg/ml). Cuatro de cinco de las muestras positivas para AAF tuvieron niveles de ADL indetectables.
T l 4. Niv l r i n AAF ADL m i m i n l n m i m vili
Figure imgf000042_0001
La tabla 5 proporciona un análisis adicional de las muestras de suero de 100 pacientes sanos y de 114 paciente de EII tratados con ADL. En particular, 4 de las 42 muestras de pacientes con 0-4 jg/ml de ADL tuvieron una concentración promedio de AAF de 0,012 a >20 jg/ml. Cuatro de cuatro de las muestras positivas para AAF tuvieron niveles de ADL indetectables. Para la detección de AAF, los 114 pacientes de EII tratados con ADL se dividieron en dos categorías, 0-4 jg/ml de ADL y >4 jg/ml de ADL. Los pacientes con más de 4 jg/ml de ADL pueden ser sometidos a una mayor cantidad de ADL-Fl para afrontar la competición de ADL en circulación con ADL-Fl.
T l . Niv l r i n AAF ADL m i m i n l n ' m i m vili
Figure imgf000042_0002
CONCLUSIONES
El formato de ensayo de cambio de movilidad utilizado para medir HACA/IFX es un ensayo homogéneo sin el revestimiento de antígenos sobre una superficie sólida y las etapas de lavados múltiples e incubación, como un ELISA típico. Este ensayo se puede aplicar para medir AAF y fármacos anti-TNF. La sensibilidad del ensayo (intervalo en |jg/ml) es más elevada para la medida con suero de paciente tanto de AAF como de ADL en comparación con los métodos ELISA (intervalo en mg/ml). Las muestras de pacientes sanos no provocan cambio de movilidad del ADL marcado con FI y se encontró mediante este ensayo que el 4,3 % de los pacientes tratados con ADL tuvieron AAF. En particular, se encontró que el 9,52 % de los pacientes con 0,4 jg/ml de ADL tuvieron AAF en este ensayo. Se realizará una evaluación adicional de muestras normales y muestras de pacientes con mayores concentraciones de ADL-FI. Aunque las muestras de suero de controles sanos causaron un cambio de movilidad del TNF-a marcado con FI, que podría haberse debido a la presencia de receptor libre soluble de TNF-a, el promedio de ADL en pacientes tratados con ADL fue mucho más elevada (10,8 frente a 0,76 mg/ml). La detección precoz de AAF y el seguimiento del nivel del fármaco ADL mientras el paciente está recibiendo tratamiento de a Dl permitirá al médico optimizar la posología de ADL o cambiar a otro fármaco anti-TNF-a cuando sea adecuado y de este modo, optimizar la gestión integral de la enfermedad del paciente.
Ejemplo 7: Determinación de los niveles de concentración de REMICADE™ y de anticuerpos antifármaco humanos.
Este ejemplo describe un método para determinar los niveles de fármacos Anti-TNFa, por ejemplo REMICADE™ (infliximab), en una muestra de suero, así como determinar los niveles de un anticuerpo antifármaco humano, por ejemplo un anticuerpo humano antiquimérico (HACA) a REMICADE™ (infliximab).
Etapa 1: Determinación del nivel de concentración de REMICADE™ (infliximab) en una muestra.
En una realización ejemplar, el TNFa se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647), en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el espectro fluorescente. El TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir al fármaco anti-TNFa presente en el suero que se una. El TNFa marcado se puede también incubar con cantidades conocidas del fármaco anti-TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa al TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNFa presente en la muestra de suero a continuación se puede comparar con la curva estándar y los controles.
Análisis de HPLC-ET de los niveles de REMICADE™ (infliximab) en suero de pacientes. Se marcó TNFa humano recombinante con un fluoróforo, Alexa Fluor® 488, según las instrucciones del fabricante. Se incubó el TNFa marcado con cantidades diferentes de REMICADE™ o suero de pacientes durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 j l de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó un detector de marca de fluorescencia para monitorizar el TNFa marcado libre y el inmunocomplejo TNFa marcado unido basándose en sus tiempos de retención. Los niveles de REMICADE™ se calcularon a partir de la curva estándar.
Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo:
Ecuación I: TNFa marcado REMICADE™ ^ (TNFa marcadô REMICADE™)complejo
Ecuación II: [REMICADE™]sin TNFa marcado presente [(TNFa marcado^REMICADE™)complejo]
Ecuación III: [REMICADE™] = [(TNFa marcado^REMICADE™)complejo]/[TNFa marcado] x [TNFa marcado]
En la Etapa 1, se pone en contacto una cantidad conocida de TNFa marcado con una muestra de suero que contiene REMICADE™. El TNFa marcado y el REMICADE™ forman un complejo, (TNFa rnarcado^REMICADE™)complejo, Véase la ecuación I. Debido a que casi todo el REMICADE™ formará un complejo con el TNFa marcado, la concentración de REMICADE™ presente antes de la introducción del TNFa marcado es igual a la concentración medida del TNFa rnarcado^REMICADE™complejo, Véase la ecuación II. El nivel de concentración de REMICADE™ se calcula multiplicando la proporción de [(TNFa rnarcado^REMICADE™)complejo]/[TNFa marcado] por [TNFa marcado], Véase la ecuación III. La proporción, [(TNFa rnarcado^REMICADE™)complejo]/[TNFa marcado], se obtiene integrando el área bajo la curva para el pico (TNFa rnarcado^REMICADE™)complejo, a partir de un gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir del HPLC de exclusión por tamaño y dividiendo este número por la integración resultante del área bajo la curva para el pico de TNFa marcado a partir del gráfico. La [TNFa marcado] es conocida a priori.
Etapa 2: Determinación del nivel de anticuerpo antiquimérico humano, HACA.
En una realización ejemplar, un fármaco anti-TNFa, por ejemplo, REMICADE™, se marca con un fluoróforo, por ejemplo, Alexa647, en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el fluorescente. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que se una cualquier HACA presente en el suero. El fármaco anti-TNFa marcado se puede incubar también con cantidades conocidas de un anticuerpo anti-IgG o suero agrupado de pacientes positivos en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión de los anticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el fármaco marcado solo. La concentración de HACA presente en la muestra de suero se puede comparar a continuación con la curva estándar y los controles.
Análisis de HPLC-ET de los niveles de HACA en suero de pacientes. Se marcó REMICADE™ purificado con un fluoróforo. Se incubó el REMICADE™ marcado con diluciones diferentes de suero agrupado positivo para HACA o suero de pacientes diluido durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 pl de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó un detector de marca de fluorescencia para monitorizar el REMICADE™ marcado libre y el inmunocomplejo REMICADE™ marcado unido basándose en sus tiempos de retención. La proporción de REMICADE™ marcado unido y libre se utilizó para determinar el nivel de HACA como se describe a continuación.
Procedimiento de ensayo de cambio de movilidad para medir HACA en suero. El principio de este ensayo se basa en el cambio de movilidad del complejo de un anticuerpo antifármaco, por ejemplo, HACA, con REMICADE™ marcado con Alexa647 respecto a REMICADE™ marcado con Alexa647 libre, en la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC-ET) debido al incremento en peso molecular del complejo. La cromatografía se realizó en un sistema de HPLC Agilent-1200, utilizando una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de pesos moleculares de 5.000-700.000 y una fase móvil de PBS 1X, pH 7,3, a un caudal de 0,5 - 1,0 ml/min con detección de marca de fluorescencia, por ejemplo, detección de UV a 650 nm. Frente al sistema de HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 hay una precolumna analítica que es una Bio-Sep de 75x7,8 mm SEC-3000. Se cargó un volumen de muestra de 100 pl en la columna para cada análisis. El complejo de HACA y el complejo de REMICADE™ marcado se forma mediante la incubación de suero de paciente tratado con REMICADE™ y REMICADE™ marcado en el PBS 1X, pH 7,3, tampón de elución a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis con HPLC-ET.
Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo:
Ecuación IV: REMICADE™ REMICADE™ marcado HACA ^ (REMICADE™^HACA)complejo + (REMICADE™ rnarcado^HACA)complejo
Ecuación V: [REMICADE™]/[REMICADE™^ HAC Acomplejo] = [REMICADE™ marcado]/[REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo]
Ecuación VI: [HACA] = [REMICAD E™^ HACA]complejo + [REMICADE™ rnarcadô HACA]complejo
Ecuación VII: [REMICADE™^HACAcomplejo] = [REMICADE™] x [REMICADE™ marcado^HACAcomplejo]/[REMICADE™ marcado]
Ecuación VIII: [REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo] = [REMICADE™ marcado] x [REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo]/[REMICADE™ marcado]
Ecuación IX: [REMICADE™]cantidad eficaz = [REMICADE™] -[HACA]
Determinación de los niveles de concentración de anticuerpos anti-TNFa humanos, por ejemplo, HACA. Se añadió una concentración conocida de REMICADE™ marcado a una muestra de suero. HACA forma un complejo con REMICADE™ o REMICADE™ marcado, Véase la ecuación IV. La [REMICADE™] se determinó en la Etapa 1, anteriormente. Integrando el área bajo la curva para el REMICADE™ marcado^HACAcomplejo y dividiendo este número por la integración resultante del área bajo la curva para el REMICADE™ marcado libre, se obtiene la proporción de [REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo] respecto a [REMICADE™ marcado]. La proporción de [REMICADE™] respecto a [REMICADE™^HACAcomplejo] es igual a la proporción de [REMICADE™ marcado] respecto a [REMICADE™ rnarcado^HACA)complejo], Véase la ecuación V. Debido a que HACA equilibra y forma un complejo tanto con REMICADE™ como con REMICADE™ marcado, la cantidad total de HACA es igual a la suma de la cantidad de REMICADE™^HACAcomplejo y la cantidad de REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo, Véase la ecuación VI. Debido a que la proporción de [REMICADE™] respecto a [REMICADE™ •HACAcomplejo] es igual a la proporción de [REMICa De ™ marcado] respecto a [REMIcAd E™ rnarcado^HACAcomplejo], tanto la [ReMICADE™-HACA]complejo como la [REMICADE™ marcado-HACAcomplejo] se determinan multiplicando la proporción de [REMICAd E™ rnarcado^HACAcomplejo)]/ [REMICADE™ marcado] por, respectivamente, la cantidad de concentración de REMICADE™, determinada en la Etapa 1 y la cantidad de concentración de REMICADE™ marcado, conocida a priori, Véanse las ecuaciones VII y VIII. Por tanto, la cantidad total de HACA es igual a la suma de (1) el [REMICADE™], de la etapa 1, multiplicado por [REMICADE™ rnarcado^HACA)complejo]/[REMICADE™ marcado] y (2) el [REMICADE™ marcado], conocida a priori, multiplicado por [REMiCa DE™ rnarcado^HACA)complejo]/ [REMICADE™ marcado].
Determinación de los niveles de concentración eficaces de REMICADE™. Debido a que HACA forma complejo con REMICADE™, la cantidad eficaz de REMICADE™ disponible en una muestra de suero es la cantidad de REMICADE™, medida en la etapa 1, menos la cantidad de HACA, medida en la etapa 2, Véase la ecuación IX.
Cálculo ejemplar. En el paciente JAG en V10, se determinó que la [REMICADE™] fue de 7,5 |jg/ml, Véase la figura 16c. Este resultado se obtuvo siguiendo la etapa 1 y utilizando las ecuaciones I-III.7,5 jg/ml es igual a 30 ng/ 4 jl. Dado que se utilizaron 4 j l de muestra en la medición en la etapa 2, estaban presentes un total de 30,0 ng de REMICADE™ en la muestra analizada. La proporción de [REMlCADE™ marcado^HACA]complejo/[REMICADE™ marcado] para el paciente JAG en V10 fue de 0,25, Véase la figura 16b. La [REMICADE™ marcado] introducida en la muestra fue 37.5 ng/ 100 jl. Dado que se utilizaron 100 j l de REMICADE™ marcado en la medición en la etapa 2, estaban presentes un total de 37,5 ng de REMICADE™ marcado en la muestra analizada. Utilizando la ecuación VII, la cantidad total de REMICADE™^HACAcomplejo fue de 30 ng multiplicados por 0,25, lo que es igual a 7,5 ng de REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo. Utilizando la ecuación V iII, la cantidad total de REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo fue de 37,5 ng multiplicados por 0,25, lo que es igual a 9,4 ng REMICADE™ rnarcado^HACAcomplejo Utilizando la ecuación VI, la cantidad total de HACA es igual a la suma de 9,4 ng y 7,5 ng, lo que es igual a 16,9 ng de HACA. Los 16,9 ng de HACA estaban presentes en 4 j l de muestra. La [HACA] fue de 16.9 ng/4 jl, lo que es igual a 4,23 jg/ml. Utilizando la ecuación IX, la cantidad eficaz de REMICADE™ es igual a 7,5 jg/ml de REMICADE™, determinada en la etapa 1, menos 4,23 jg/ml de HACA, determinada en la etapa 2. En este cálculo ejemplar, la [REMICADE™] eficaz fue igual a 3,27 jg/ml.
Ejemplo 8: Determinación de los niveles de concentración de HUMIRA™ y de anticuerpos antifármaco humanos.
El presente ejemplo describe un método para determinar los niveles de HUMIRA™ en una muestra de suero así como para determinar los niveles de anticuerpos humanos antihumanos (HAHA).
Etapa 1: Determinación del nivel de concentración de HUMIRA™ en una muestra.
En una realización ejemplar, el TNFa se marca con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa647), en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el espectro fluorescente. El TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir al fármaco anti-TNFa presente en el suero que se una. El TNFa marcado se puede también incubar con cantidades conocidas del fármaco anti-TNFa en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión del fármaco anti-TNFa al TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el TNFa marcado solo. La concentración del fármaco anti-TNFa presente en la muestra de suero a continuación se puede comparar con la curva estándar y los controles.
Análisis de HPLC-ET de los niveles de HUMIRA™ en suero de pacientes. Se marcó TNFa humano recombinante con un fluoróforo, Alexa Fluor® 488, según las instrucciones del fabricante. Se incubó el TNFa marcado con cantidades diferentes de HUMIRA™ o suero de pacientes durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 j l de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó un detector de marca de fluorescencia para monitorizar el TNFa marcado libre y el inmunocomplejo TNFa marcado unido basándose en sus tiempos de retención. Los niveles de HUMIRA™ se calcularon a partir de la curva estándar.
Las siguientes ecuaciones son relevantes para este ensayo:
Ecuación X: TNFa marcado HUMIRA™ ^ (TNFa marcado^HUMIRA™)complejo
Ecuación XI: [HUMIRA™] = [(TNFa marcado^HUMIRA)complejo]
Ecuación XII: [HUMIRA™] = [(TNFa marcado^HUMIRA™)complejo]/[TNFa marcado] x [TNFa marcado]
En la Etapa 1, se pone en contacto una cantidad conocida de TNFa marcado con una muestra de suero que contiene Hu MIRA™. El TNFa marcado y el HUMIRA™ forman un complejo, (TNFa rnarcado^HUMIRA™)complejo, Véase la ecuación X. Debido a que casi todo el HUMIRA™ formará un complejo con el TNFa marcado, la [HUMIRA™] presente antes de la introducción del TNFa marcado es igual a la concentración medida del [(TNFa rnarcado^HUMIRA™)complejo], Véase la ecuación XI. La [HUMIRA™] se calcula multiplicando la proporción de [(TNFa rnarcadô HUMIRA™)complejo]/[TNFa marcado] por [TNFa marcado], Véase la ecuación XII. Integrando el área bajo la curva para el TNFa marcado y área bajo la curva para el (TNFa rnarcado^HUMIRA™)complejo y dividiendo la integración resultante para (TNFa rnarcado^HUMIRA™)complejo por la integración resultante del TNFa marcado, se obtiene la proporción de [(TNFa rnarcado^HUMIRA™)complejo] respecto a [TNFa marcado]. La [TNFa marcado] es conocida a priori.
Etapa 2: Determinación del nivel de anticuerpo antihumano humano, por ejemplo, HAHA. En una realización ejemplar, un fármaco anti-TNFa, por ejemplo, HUMIRA™, se marca con un fluoróforo, por ejemplo, Alexa647, en el que se puede detectar el fluoróforo en el espectro visible y/o en el fluorescente. El fármaco anti-TNFa marcado se incuba con suero humano en una reacción en fase líquida para permitir que se una cualquier HAHA presente en el suero. El fármaco anti-TNFa marcado se puede incubar también con cantidades conocidas de un anticuerpo anti-IgG o suero agrupado de pacientes positivos en una reacción en fase líquida para crear una curva estándar. Tras la incubación, se cargan las muestras directamente en una columna de exclusión por tamaño. La unión de los anticuerpos al fármaco anti-TNFa marcado da como resultado un desplazamiento hacia la izquierda del pico en comparación con el fármaco marcado solo. La concentración de HAHA presente en la muestra de suero se puede comparar a continuación con la curva estándar y los controles.
Análisis de HPLC-ET de los niveles de HAHA en suero de pacientes. Se marcó HUMIRA™ purificado con un fluoróforo. Se incubó HUMIRA™ marcado con diluciones diferentes de suero agrupado positivo para HAHA o suero de pacientes diluido durante una hora a temperatura ambiente. Se analizaron muestras de 100 pl de volumen mediante cromatografía de exclusión por tamaño en un sistema HPLC. Se utilizó detección de marca de fluorescencia para monitorizar el HUMIRA™ marcado libre y el inmunocomplejo HUMIRA™ marcado unido basándose en sus tiempos de retención. La proporción de HUMIRA™ marcado unido y libre se utilizó para determinar el nivel de HAHA como se describe a continuación.
Procedimiento de ensayo de cambio de movilidad para medir HAHA en suero. El principio de este ensayo se basa en el cambio de movilidad del anticuerpo, por ejemplo, HAHA, complejo HUMIRa ™ marcado con Alexa647 unido frente al HUMIRA™ marcado con Alexa647 libre en la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC-ET) debido al incremento en peso molecular del complejo. La cromatografía se realizó en un sistema de HPLC Agilent-1200, utilizando una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 (Phenomenex) con un intervalo de fraccionamiento de pesos moleculares de 5.000-700.000 y una fase móvil de PBS 1X, pH 7,3, a un caudal de 0,5-1,0 ml/min con detección de marca de fluorescencia, por ejemplo, detección de UV a 650 nm. Frente al sistema de HPLC Agilent-1200 con una columna Bio-Sep de 300x7,8 mm SEC-3000 hay una precolumna analítica que es una Bio-Sep de 75x7,8 mm SEC-3000. Se cargó un volumen de muestra de 100 pl en la columna para cada análisis. Se cargó un volumen de muestra de 100 pl en la columna para cada análisis. El complejo de HUMIRA™ marcado unido a HAHA se forma mediante la incubación de suero de paciente tratado con HUMIRA y HUMIRA™ marcado en el PBS 1X, pH 7,3, tampón de elución a temperatura ambiente durante 1 hora antes del análisis con HPLC-ET.
Ecuación XIII: HUMIRA™ HUMIRA™ marcado+ HAHA ^ (HUMIRA™^HAHA)complejo + (HUMIRA™ rnarcado^HAHA)complejo
Ecuación XIV: [HUMIR A™]/[HUMIRA™^ H AHAcomplejo] = [HUMIRA™ marcado]/[HUMIRA marcado^HAHAcomplejo]
Ecuación XV: [HAHA] = [HUMIRA™^HAHA complejo] [HUMIRA™ marcado^HAHAc o m p j
Ecuación XVI: [HUMIRA™• HAHAcomplejo] = [HUMIRA™] x [HUMIRA™ marcadô HAHAcomplejo]/[HUMIRA™ marcado]
Ecuación XVII: [HUMIRA™ marcado^HAHAcomplejo] = [HUMIRA™ marcado] x [HUMIRA™ rnarcadô HAHAcomplejo]/[HUMIRA™ marcado]
Ecuación XVIII: [HUMIRA™]cantidad eficaz = [HUMIRA™] -[HAHA]
Cálculo para la etapa 2: Se añadió una concentración conocida de HUMIRA™ marcado a una muestra de suero. HAHA forma un complejo con HUMIRA™ o HUMIRA™ marcado, Véase la ecuación XIII. La [HUMIRA™] se determinó en la Etapa 1, como se ha descrito anteriormente. Integrando el área bajo la curva para el HUMIRA™ marcado • HAHAcomplejo y el área bajo la curva para el HUMIRA™ marcado y dividiendo la integración resultante para el HUMIRA™ marcado • HAHAcomplejo por la integración resultante del HUMIRA™ marcado, se obtiene la proporción de la [HUMIRA™ rnarcado^HAHAcomplejo] respecto a [HUMIRA™ marcado]. La proporción de la [HUMIRA™] respecto a la [HUMIRA™^HAHAcomplejo] es igual a la proporción de la [HUMIRa ™ marcado] respecto a la [HUMIRA™ rnarcado^HAHAcomplejo], Véase la ecuación XIV. Debido a que HAHA equilibra y forma un complejo tanto con HUMIRA como con HUMIRA™ marcado, la cantidad total de HAHA es igual a la suma de la cantidad de HUMIRA™^HAHAcomplejo y la cantidad de HUMIRA™ rnarcado^HAHAcomplejo, Véase la ecuación XV. Debido a que la proporción de [Hu MirA™] respecto a [HUMIRA™ •HACAcomplejo] es igual a la proporción de [HUMIRA marcado] respecto a [Hu MiRA™ rnarcado^HACAcomplejo], la concentración tanto de la [HUMIRA™- HAHAcomplejo] y la [HUMIRA™ marcado-HAHAcomplejo] se determinan multiplicando la proporción de la [HUMIRA rnarcadô HAHAcomplejo]/ [HUMIRA marcado] por la [h Um IRA™], determinada en la etapa 1 y la [HUMIrA™ marcado], conocida a priori, respectivamente, Véanse las ecuaciones XVI y XVII. Debido a que HAHA forma complejo con HUMIRA™, la cantidad eficaz de HUMIRA™ disponible en una muestra de suero es la cantidad de HUMIRA, medida en la etapa 1, menos la cantidad de HAHA, medida en la etapa 2, Véase la ecuación XVIII.
Cálculo ejemplar. En el paciente SL03246013, véase la figura 25, se determinó que la [HUMIRA™] fue de 16.9 pg/ml, véase la figura 25. Este resultado se obtuvo siguiendo la etapa 1 y utilizando las ecuaciones X-XII.
16.9 pg/ml es igual a 67,6 ng/ 4 pl. Dado que se utilizaron 4 pl de muestra en la medición en la etapa 2, estaban presentes un total de 67,6 ng de HUMIRA™ en la muestra analizada. La proporción de [HUMIRA™ marcado^HAHA]compiejo/[HUMIRA™ marcado] para el paciente SL03246013 fue 0,055, véase la figura 25. La [HUMIRA™ marcado] introducida en la muestra fue 37.5 ng/ 100 pl. Dado que se utilizaron 100 pl de HUMIRA™ marcado en la medición en la etapa 2, estaban presentes un total de 37,5 ng de HUMIRA™ marcado en la muestra analizada. Utilizando la ecuación XVI, la cantidad total de HUMIRA™ marcado^HACAcomplejo fue de 67,6 ng multiplicados por 0,055, lo que es igual a 3,71 ng de HUMIRA™ marcado^HACAcomplejo. Utilizando la ecuación XVII, la cantidad total de HUMIRA™ marcado^HACAcomplejo fue de 37,5 ng multiplicados por 0,055, lo que es igual a 2,06 ng de HUMIRA™ marcado^HACAcomplejo. Utilizando la ecuación XV, la cantidad total de HAHA es igual a la suma de 3,71 ng y 2,06 ng, lo que es igual a 5,77 ng de HAHA. Los 5,77 ng de HAHA estaban presentes en 4 pl de muestra. La [HAHA] fue de 5.77 ng/4 pl, lo que es igual a 1,44 pg/ml. Utilizando la ecuación XVIII, la cantidad eficaz de Hu MiRA™ es igual a 16,99 pg/ml de HUMIRA™, determinada en la etapa 1, menos 1,44 pg/ml de HAHA, determinada en la etapa 2. En este cálculo ejemplar, la [HUMIRA™] eficaz fue igual a 15,46 pg/ml.
Ejemplo 9: Determinación de la cantidad de un complejo de HACA o HAHA con REMICADE™, REMICADE™ marcado, HUMIRA o HUMIRA marcado.
Este ejemplo describe un método para determinar la cantidad de un complejo de HACA o HAHA con REMICADE™, REMICADE™ marcado, HUMIRA o HUMIRA™ marcado con referencia a un estándar interno.
Utilizando un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, se pueden identificar artefactos del suero y variaciones de un experimento a otro y analizarse de forma adecuada. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 pg por 100 pl analizados.
Se incubó HUMIRA™ marcado con fluoróforo (FI) con suero de paciente para formar el inmunocomplejo. Se incluyó un péptido pequeño marcado con FI, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, como un control interno en cada reacción. En un caso, se utilizaron diferentes cantidades de anti-IgG humana para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA del suero. En otro caso, se utilizó suero agrupado de paciente positivo valorado que se había calibrado con HAHA purificado para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA de suero. En todavía otro caso, se utilizó el método descrito en el ejemplo 7 para generar una curva estándar para determinar los niveles de HAHA del suero. Se separó el HUMIRA marcado del complejo unido a anticuerpo basándose en su peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se utilizó la proporción de HUMIRA marcado respecto al control interno de cada muestra para extrapolar la concentración de HAHA a partir de la curva estándar. Se utilizó una metodología similar para medir niveles de HUMIRA en muestras de suero de pacientes con TNF-a marcado. La proporción inicial de fármaco marcado, es decir, REMICADE™ marcado o HUMIRA marcado, respecto al control interno es igual a 100. Como se muestra en las figuras 23 y 24, cuando la proporción de fármaco marcado respecto al control interno cae por debajo de 95, se infiere que el fármaco marcado forma complejo con un compuesto de unión antifármaco, por ejemplo, HACA, HAHA. La proporción de la [fármaco marcado] respecto a [control interno] se obtiene mediante la integración de las áreas bajo la curva para el fármaco marcado y para el control interno y dividiendo a continuación la integración resultante para el fármaco marcado por la integración resultante para el control interno.
Ejemplo 10: Determinación de la proporción de fármacos anti-TNFa en forma de complejo respecto a fármacos anti-TNFa no en forma de complejo.
La proporción entre el fármaco anti-TNFa en forma de complejo respecto al fármaco anti-TNFa no en forma de complejo se obtiene integrando las áreas bajo la curva tanto para el fármaco anti-TNFa en complejo como para el fármaco anti-TNFa no en complejo y a continuación, dividiendo la integración resultante para el fármaco anti-TNFa en complejo por la integración resultante para el fármaco anti-TNFa no en complejo.
En una realización, el fármaco anti-TNFa no en forma de complejo es REMICADE™ que tiene niveles entre aproximadamente 0 ng y 100 ng en una muestra. La cantidad de REMICADE™ marcado es aproximadamente 37,5 ng.
Utilizando un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, se pueden identificar artefactos del suero y variaciones de un experimento a otro y analizarse de forma adecuada. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 pg por 100 pl analizados.
La proporción del fármaco anti-TNFa marcado, por ejemplo, REMICADE™ o HUMIRA™, respecto al control interno marcado se obtiene integrando las áreas bajo la curva tanto para el fármaco anti-TNFa marcado como para el control interno marcado y dividiendo a continuación la integración resultante para el fármaco anti-TNFa marcado por la integración resultante para el control interno marcado.
La proporción de [(fármaco anti-TNFa marcado^autoanticuerpo)complejo]/[control interno] se obtiene integrando el área bajo la curva para el pico de (fármaco anti-TNFa marcado^Autoanticuerpo)complej0 a partir de un gráfico de intensidad de señal en función del tiempo de elución a partir de la HPLC de exclusión por tamaño y dividiendo este número por la integración resultante del área bajo la curva para el pico del control interno a partir del gráfico. En algunas realizaciones, el fármaco anti-TNFa marcado es REMICADE™ marcado. En algunas otras realizaciones, el fármaco anti-TNFa marcado es HUMIRA™ marcado.
Ejemplo 11: Determinación de la proporción de TNFa marcado libre y en forma de complejo.
Este ejemplo describe un método para determinar la cantidad de un complejo de TNFa marcado con REMICADE™ o HUMIRA™ con referencia a un estándar interno.
Utilizando un control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, se pueden identificar artefactos del suero y variaciones de un experimento a otro y analizarse de forma adecuada. La cantidad de control interno, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 ng por 100 pl analizados.
En una realización, el TNFa marcado no en forma de complejo tiene niveles entre aproximadamente 50 ng y 150 ng en una muestra. En ciertos casos, la cantidad de TNFa marcado es aproximadamente 100,0 ng.
Se incubó TNFa marcado con fluoróforo (FI) con suero de paciente para formar el inmunocomplejo. Se incluyó un péptido pequeño marcado con FI, por ejemplo, Biocitina-Alexa 488, como un control interno en cada reacción. Se creó una curva estándar aumentando en concentraciones conocidas del fármaco anti-TNFa y extrapolando a continuación a partir de la curva para determinar la concentración en unidades de pg/ml.
La proporción inicial de TNFa marcado respecto al control interno es igual a 100. Cuando la proporción de TNFa marcado respecto al control interno cae por debajo de 95, se infiere que el TNFa marcado forma complejo con un fármaco anti-TNFa, por ejemplo, Remicade™, Humira™. La proporción de la [TNFa marcado] respecto a [control interno] se obtiene mediante la integración de las áreas bajo la curva para el TNFa marcado y para el control interno y dividiendo a continuación la integración resultante para el TNFa marcado por la integración resultante para el control interno.
Ejemplo 12: Optimización de la terapia de fármaco anti-TNFa mediante la medición de los niveles de fármaco anti-TNFa y/o de anticuerpo antifármaco (AAF).
Este ejemplo describe métodos para optimizar la terapia de fármaco anti-TNFa, reduciendo la toxicidad asociada con la terapia de fármaco anti-TNF-a y/o monitorizando la eficacia del tratamiento terapéutico con un fármaco anti-TNF-a mediante la medición de la cantidad (por ejemplo, nivel de concentración) de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, nivel de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre) y/o de anticuerpo antifármaco (AAF) (por ejemplo, nivel de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa) en una muestra de un sujeto que recibe terapia de fármaco anti-TNFa. Por consiguiente, los métodos proporcionados en el presente ejemplo proporcionan información útil para guiar decisiones de tratamiento, por ejemplo, determinando cuándo o cómo ajustar o modificar (por ejemplo, incrementar o disminuir) la dosis posterior de un fármaco anti-TNFa, mediante la determinación de cuándo o cómo combinar un fármaco anti-TNFa (por ejemplo, a una dosis incrementada, disminuida o a la misma) con uno o más agentes inmunosupresores tales como el metotrexato (MTX) o la azatioprina y/o mediante la determinación de cuándo o cómo modificar el curso de terapia actual (por ejemplo, cambiar a un fármaco anti-TNFa diferente).
Con fines ilustrativos solamente, los siguientes supuestos proporcionan una demostración de cómo los métodos de la presente invención permiten ventajosamente optimizar la terapia y minimizar la toxicidad (por ejemplo, efectos secundarios) o reducirla basándose en el nivel de fármaco anti-TNFa (por ejemplo, el nivel de anticuerpo terapéutico anti-TNFa libre) y/o AAF (por ejemplo, nivel de autoanticuerpo contra el fármaco anti-TNFa) en una muestra de un sujeto que recibe terapia de fármaco anti-TNFa. Los niveles del fármaco anti-TNFa y de AAF se pueden medir con los ensayos nuevos descritos en el presente documento.
Supuesto n° 1: Nivel elevado de fármaco anti-TNFa con nivel bajo de anticuerpo antifármaco (AAF).
Niveles de fármaco = 10-50 ng/10 pl; Niveles de AAF = 0,1-2 ng/10 pl. Entre las muestras de pacientes que tienen este perfil se incluyen las muestras de los pacientes BAB y JAA en la visita 10 ("V10"). Véase, la figura 16b.
Los pacientes que reciben terapia de fármaco anti-TNFa y que tienen este perfil particular se deberían tratar con fármacos inmunosupresores como azatioprina (AZA) junto con el fármaco anti-TNFa (por ejemplo, infliximab).
Supuesto # 2: Nivel medio de fármaco anti-TNFa con nivel bajo de AAF.
Niveles de fármaco = 5-20 ng/10 pl; Niveles de AAF = 0,1-2 ng/10 pl. Entre las muestras de pacientes que tienen este perfil se incluyen las muestras de los pacientes DGO, JAG y JJH en V10. Véase, la figura 16b.
Los pacientes que reciben terapia de fármaco anti-TNFa y que tienen este perfil particular se deberían tratar con fármacos inmunosupresores como azatioprina (AZA) junto con una dosis más elevada del fármaco anti-TNFa (por ejemplo, infliximab). Un experto en la materia sabrá que las dosis más elevadas o más bajas a las que puede ajustarse el curso de la terapia actual se pueden ajustar de manera que se optimiza la terapia del fármaco, por

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la presencia o el nivel de un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, en la que el fármaco anti-TNFa es un anticuerpo para TNFa, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto un TNFa marcado con una muestra biológica que tiene un fármaco anti-TNFa para formar un complejo marcado con el fármaco anti-TNFa;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del TNFa marcado y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del TNFa marcado libre; (c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de fármaco anti-TNFa basándose en la proporción calculada en la etapa (c).
2. El método de la reivindicación 1, en el que el TNFa marcado es un TNFa marcado con fluoróforo.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que se eluye primero el complejo marcado, seguido por el TNFa marcado libre.
4. Un método para determinar la presencia o el nivel de un autoanticuerpo contra un fármaco anti-TNFa en una muestra biológica, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto un fármaco TNFa marcado con la muestra biológica para formar un complejo marcado con el autoanticuerpo;
(b) someter el complejo marcado a cromatografía de exclusión por tamaño para separar el complejo marcado del fármaco de TNFa marcado libre y para detectar una cantidad del complejo marcado y una cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre;
(c) calcular una proporción de la cantidad del complejo marcado y la cantidad del fármaco anti-TNFa marcado libre detectado en la etapa (b); y
(d) determinar la presencia o nivel de autoanticuerpo basándose en la proporción calculada en la etapa (c).
5. El método de la reivindicación 4, en el que el autoanticuerpo es un componente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo humano antirratón (HAMA), un anticuerpo humano antiquimérico (HACA), un anticuerpo humano antihumanizado (HAHA) y combinaciones de los mismos.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que el fármaco anti-TNFa marcado es un fármaco anti-TNFa marcado con fluoróforo.
7. El método de la reivindicación 2 o 6, en el que el fluoróforo es un colorante Alexa Fluor®.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que se eluye primero el complejo marcado, seguido por el fármaco anti-TNFa marcado libre.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica es suero.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el fármaco anti-TNFa es un componente seleccionado del grupo que consiste en REMICADE™ (infliximab), ENBREL™ (etanercept), HUMIRA™ (adalimumab), CIMZIA® (certolizumab pegol) y combinaciones de los mismos.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cromatografía por exclusión de tamaño es la cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (HPLC-ET).
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la muestra se obtiene de un sujeto que recibe terapia con el fármaco anti-TNFa.
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