KR20220063800A - 항tnf-알파 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트 - Google Patents

항tnf-알파 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 항TNF-α 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트로서, 다공성 멤브레인; 다공성 멤브레인의 상류 단부에 배치되고, 시료를 흡수하여 상기 다공성 멤브레인에 제공하는 시료 패드; 상기 다공성 멤브레인 상에서 상기 시료 패드로부터 이격되어 형성된 테스트 라인; 상기 다공성 멤브레인의 하류 단부에 배치되고, 시료 패드로부터 제공된 시료를 흡수하는 흡수 패드; 및 상기 테스트 라인에서 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질이 검출되고, 상기 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질은, 항TNF-α 약물과 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 포함하는 복합체인 신속 검출 키트를 제공한다. 본 발명은, 항TNF-α 약물을 신속하게 검출할 수 있고, 샘플 내 항TNF-α 약물의 농도를 정확하게 측정하기 위한 키트를 제공함으로써, TNF-α 관련된 질환에 대한 최적화된 치료법을 환자에게 제공할 수 있다.

Description

항TNF-알파 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트{A RAPID DETECTION KIT FOR MONITORING ANTI-TNF ALPHA DRUG}
본 발명은 신속 검출 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈액 등 샘플 내의 항TNF-α(tumor necrosis factor-α; 종양 괴사 인자) 약물의 존재 또는 수준을 검출 및 측정하기 위한 신속 검출 키트에 관한 것이다.
염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD) 또는 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 치료를 위해, 염증성 장질환 또는 류머티스 관절염을 유발하는 염증 매개 물질인 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor α, TNF-α)에 대한 항체로서, 에타너셉트(Enbrel PFS), 인플릭시맙(Remicade), 아달리무맙(Humira), 골리무맙(Simponi PFS) 등이 개발되었다.
그러나, 이러한 항TNF-α 약물은 매우 비싸고, 결핵 등의 감염을 유발할 수 있으며, 약 1/3의 환자에서는 항TNF-α 약물에 의한 치료 효과를 보이지 못하며, 치료 효과가 있는 환자에게 치료를 계속하더라도 치료 효과가 감소한다고 알려져 있다.
치료 효과의 주요 감소 원인으로는, 혈중 항TNF-α 약물의 농도 감소, 혈중 항TNF-α 약물에 대한 인간 항체 형성 등이 알려져 있으며, 치료 효과를 높이기 위해서는, 치료적 약물 모니터링(therapeutic drug monitoring, TDM)을 통해, 혈중 항TNF-α 약물의 농도를 측정하여, 적절한 피드백을 환자에게 제공해야 한다.
특히, 항TNF-α 약물 중 인플릭시맙의 혈중 존재 및 그 농도의 검사 방법으로서, 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)이 널리 이용되고 있다. 그러나, 이 방법은 96well의 플레이트에서 정확한 부피의 다양한 시약을 특정시간 동안 반응시켜 주는 복잡한 과정이 필요하다. 또한, 대형병원의 연구실에서 고가의 장비를 활용하거나 전문인력이 검사를 수행해야 하고, 검사 시간이 오래 걸리는 문제점 등으로 인해, 검사 결과가 실제 치료까지 반영되기까지 2주일 이상 시간이 소요된다. 따라서 환자는 검사 및 치료를 위해 최소 2회 이상 병원을 방문해야 하는 불편함과, 검사와 치료 사이의 시간 차이로 인한 정확한 치료 방법을 제공받지 못하는 문제점이 있다.
따라서, 적절한 치료를 위해, 치료적 약물 모니터링을 신속하게 할 수 있는 현장 검사(point-of-care test, POCT)가 필요하다. 인플릭시맙의 현장 검사 방법으로는, 전세계적으로 2개 제품(Quantum Blue® Infliximab, RIDA®QUICK IFX Monitoring)에 국한되어 있으며, 전혈 가능 제품은 전무하다. 또한 이 제품들은 혈중 농도를 측정하기까지 시료와 검사 시약을 반응시키는 추가 시험진행이 필요하여 현장검사법으로서 유용성이 제한적이다.
공개특허공보 10-2014-0008397호 등록특허공보 제10-1761541호
본 발명은, 항TNF-α 약물을 신속하게 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, TNF 간섭을 최소화하여, 샘플 내 항TNF-α 약물의 농도를 정확하게 측정할 수 있는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 항TNF-α 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트로서, 다공성 멤브레인; 다공성 멤브레인의 상류 단부에 배치되고, 시료를 흡수하여 상기 다공성 멤브레인에 제공하는 시료 패드; 상기 다공성 멤브레인 상에서 상기 시료 패드로부터 이격되어 형성된 테스트 라인; 상기 다공성 멤브레인의 하류 단부에 배치되고, 시료 패드로부터 제공된 시료를 흡수하는 흡수 패드; 및 상기 테스트 라인에서 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질이 검출되고, 상기 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질은, 항TNF-α 약물과 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 포함하는 복합체인 신속 검출 키트를 제공한다.
상기 테스트 라인에는 링커 또는 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체가 고정될 수 있다.
상기 링커는 스트렙트아비딘, 아비딘, 비오틴, 히스티딘 작용기를 포함하는 단백질 및 항 히스티딘 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 1종 이상일 수 있다.
상기 신속 검출 키트는 테스트 라인 또는 컨트롤 라인에서 발생하는 형광을 검출할 수 있는 형광 검출부를 추가로 포함할 수 있다.
상기 시료는 항TNF-α 약물 및 형광 모이어티가 표지된 항-인간 IgG 항체로 이루어진 항체-약물 복합체를 포함할 수 있다.
상기 시료는 항TNF-α 약물 및 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체로 이루어진 항체-약물 복합체를 포함할 수 있다.
상기 시료는 항TNF-α 약물, 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체 및 상기 트레이서 항체로 이루어진 항체-약물-항체 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명은, 항TNF-α 약물을 신속하게 검출할 수 있고, 샘플 내 항TNF-α 약물의 농도를 TNF-α의 간섭 없이 정확하게 측정하기 위한 키트를 제공함으로써, TNF-α 관련된 질환에 대한 최적화된 치료법을 환자에게 제공할 수 있다.
도 1의 (a)는 약물과 약물이 작용하는 타겟이 결합하는 것을 나타내는 모식도이며, 도 2의 (b)는 항 이디오타입 항체가 약물이 작용하는 타겟이 약물에 결합하는 부위와 다른 부위에 결합하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 2의 (a)는 시료 패드, 테스트라인, 컨트롤 라인 및 흡수 패드를 포함하는 다공성 멤브레인을 나타내며, 도 2의 (b)는 다공성 멤브레인을 덮고 있는 플라스틱 하우징의 일예를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 신속 검출 키트의 사용법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 세가지 구현예를 나타낸 모식도이다.
도 5의 (a)는 테스트 라인 및 컨트롤 라인에서 신호를 검출하는 것을 나타낸 모식도이며, 도 5의 (b)는 약물 농도가 증가할수록 테스트 라인에서 검출되는 신호의 세기가 증가하는 것을 나타낸 모식도이다.
본 발명의 약물 신속 검출 키트는 샘플 내 항TNF-α 약물의 존재 및 그 농도를 측정하기 위해, 측방 유동 분석법(lateral flow assays, LFA)을 이용한다. 약물 신속 검출 키트는 다공성 멤브레인, 시료 패드, 테스트 라인, 컨트롤 라인, 흡수 패드를 포함하고, 추가로 형광 검출부를 포함한다.
항TNF-α 약물은 TNF-α 활성을 억제 또는 방해하는 작용제로서, 예를 들면, 에타너셉트(Enbrel PFS), 인플릭시맙(Remicade), 아달리무맙(Humira), 골리무맙(Simponi PFS)일 수 있다.
샘플은 혈액, 혈구, 림프액, 타액, 소변, 땀, 간질 또는 세포내 체액, 또는 이로부터 추출된 물질 등을 들 수 있고, 혈액은 소정의 처리(예를 들면 응고 방지)가 이루어진 혈액, 혈장, 혹은 혈청 등이 이에 해당될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 샘플은 조작하거나 조작하지 않은 상태로 사용될 수 있다.
검출 버퍼는 테스트 디텍터 항체, 컨트롤 디텍터, 혹은 트레이서 항체를 포함하는 버퍼로서, 샘플과 혼합하여 시료를 형성한다.
테스트 디텍터 항체는 형광 모이어티(fluorescent moiety)가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체 또는 형광 모이어티가 표지된 항-인간 IgG(anti-human IgG) 항체이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 항-이디오타입 항체는 약물이 작용하는 타겟의 결합 사이트(binding site)가 아닌 그 외 부분에 결합하는 항체를 의미한다. 항-이디오타입 항체를 사용함으로써, 항TNF-α 약물의 TNF-α에 대한 결합 여부와 무관하게, 시료 내 항TNF-α 약물의 농도를 정확하게 측정할 수 있다.
상기 형광 모이어티는 특정 주파수의 광(예컨대, UV 광)을 흡수하여 형광 시그널을 발생시키는 형광 분자 또는 이의 유도체를 의미한다. 예를 들면, 상기 형광 모이어티는 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 405, 알렉사 430, 알렉사 488, 알렉사 555, 알렉사 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPYTRX, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, 캐스캐이드 블루(cascade blue), Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 댄실 클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로 벤조-2-옥사-1,3-디아졸), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루 (Pacific Blue), 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛(cresyl fast violet), 크레실 바이올렛, 브릴리안트 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 4-아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐 플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트(rare earth metal cryptate), 트리-비피리딜디 아민 유로품, 유로퓸 크립테이트 화합물 또는 킬레이트, 디아민, 디시아닌, 라 졸라 블루 다이(La Jolla blue dye), 알로피코시아닌, 알로코시아닌 B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, R-피코에리트린, C-피코시아닌, 피코에리트린 R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메 틸로다민 이소티올), 테트라메틸로다민, 텍사스 레드(Texas Red), CdS/ZnS Quantum dot, CdSe Quantum dot, CdSe/ZnS Quantum dot, CdSSe/ZnS Quantum dot, CdTe/CdSe/ZnS Quantum dot, CdS Quantum dot, ZnCdSe/ZnS Quantum dot, CdTe Quantum dot, Eu 및 Tb일 수 있다.
컨트롤 디텍터는 형광 모이어티가 표지된 chiken IgY, anti-chiken IgY, KLH, anti-KLH, rabbit IgG, anti-rabbit IgG, goat IgG, anti-goat IgG일 수 있다. 컨트롤 디텍터에 포함되는 형광 모이어티는 테스트 디텍터 항체에 포함되는 형광 모이어티와 동일할 수도, 상이할 수도 있다.
트레이서 항체는 링커가 결합되어 있는 항-이디오타입 항체이다. 링커는 예를 들면 비오틴, 스트렙트아비딘 아비딘, 비오틴, 히스티딘 작용기를 포함하는 단백질 및 항 히스티딘 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
다공성 멤브레인은 모세관 운동 또는 측방 유동을 제공할 수 있는 멤브레인으로서, 니트로 셀룰로오스, 폴리 에스테르 또는 셀룰로오스와 같은 니트로 셀룰로오스 혼합물(blends), 다공성 종이, 레이온(rayon), 유리 섬유, 아크릴로니트릴 공중합체, 나일론 등을 포함한다.
시료 패드는 다공성 멤브레인의 상류 단부에 배치되고, 샘플과 검출 버퍼가 혼합된 시료를 흡수하여, 다공성 멤브레인을 따라 흐르도록 한다.
테스트 라인은 다공성 멤브레인 상에서 시료 패드로부터 이격되어 형성되어 있다. 테스트 라인에는 테스트 캡처로서 링커 또는 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체가 고정되어 있다. 테스트 라인에서, 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질을 검출한다. 타겟 물질은 항체-약물 복합체 또는 항체-약물-항체 복합체이다. 보다 구체적으로, 타겟 물질은 항-이디오타입 항체-항TNF-α 약물 복합체, 항-인간 IgG 항체-항TNF-α 약물 복합체 또는 항-이디오타입 항체-항TNF-α 약물-트레이서 항체 복합체일 수 있다.
컨트롤 라인은 다공성 멤브레인 상에서 시료 패드로부터 이격되어 형성되어 있다. 컨트롤 라인에는 컨트롤 캡처로서 chiken IgY, anti-chiken IgY, KLH, anti-KLH, rabbit IgG, anti-rabbit IgG, goat IgG, anti-goat IgG등이 고정되어 있어, 시료에 존재하는 컨트롤 디텍터를 검출한다.
흡수 패드는 다공성 멤브레인의 하류 단부에 배치되고, 시료 패드로부터 제공된 시료를 흡수한다.
형광 검출부는, 형광 모이어티에서 발생하는 형광을 검출할 수 있는 수단으로서, 예를 들면, 테스트라인 및 컨트롤라인의 형광 모이어티에 별도의 경로로 여기광을 조사하여 형광 모이어티를 여기시키고 방출광(형광)을 검출하여 형광 신호강도를 측정할 수 있는 광검출기기이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1-1. 제1 구현예
제1 구현예는, 테스트 라인에 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체가 고정되어 있고, 검출 버퍼에는 테스트 디텍터 항체로서 형광 모이어티가 표지된 항-인간 IgG 항체가 포함되어 있다. 샘플 내 항TNF-α 약물과 형광 모이어티가 표지된 항-인간 IgG 항체가 반응하여 항체-약물 복합체가 형성되고, 상기 항체-약물 복합체는 다공성 멤브레인을 따라 유동되면서 테스트 라인에 고정되어 있는 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체와 반응하여 결합된다. 제1 구현예의 모식도를 도 4의 type1에 나타낸다.
1-2. 제2 구현예
제2 구현예는, 테스트 라인에 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체가 고정되어 있고, 검출 버퍼에는 테스트 디텍터 항체로서 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체가 포함되어 있다. 샘플 내 항TNF-α 약물과 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체가 반응하여 항체-약물 복합체가 형성되고, 상기 항체-약물 복합체는 다공성 멤브레인을 따라 유동되면서 테스트 라인에 고정되어 있는 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체와 반응하여 결합된다. 제2 구현예의 모식도를 도 4의 type2에 나타낸다.
1-3. 제3 구현예
제3 구현예는, 테스트 라인에 스트렙트아비딘이 고정되어 있고, 검출 버퍼에는 테스트 디텍터 항체로서 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체 및 트레이서 항체로서 비오틴이 결합되어 있는 항-이디오타입 항체가 포함되어 있다. 샘플 내 항TNF-α 약물이 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체 및 상기 트레이서 항체와 반응하여 항체-약물-항체 복합체가 형성되고, 상기 항체-약물-항체 복합체는 다공성 멤브레인을 따라 유동되면서 테스트 라인에 고정되어 있는 스트렙트아비딘과 반응하여 결합된다. 제3 구현예의 모식도를 도 4의 type3에 나타낸다.
2. 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체의 선택
본 발명에서 항-이디오타입 항체의 선택 과정은 다음과 같다.
먼저, 인플릭시맙에 결합하는 총 16종의 단클론 anti-IFX(안티-인플릭시맙) 항체를 개발하였다. 또한, 이들 항체의 인플릭시맙에 대한 결합부위 확인을 위해 competitive ELISA가 수행되었다.
결합 부위 확인을 위한 competitive ELISA 원리는 TNF-α와 결합한 인플릭시맙에 대한 anti-IFX의 반응성을 평가하는 것이다. 먼저, 96 well plate 각 well에 0.5 ug/mL 인플릭시맙을 적하하고, 4°C에서 12시간 방치한다. 인플릭시맙이 고정된 96 well plate를 0.1% PBST(Phosphate-buffered saline with Tween 20)로 washing하고 일정농도의 BSA(bovine serum albumin) (in 0.1% PBST) 용액을 적하하여 반응시킨다. Blocking이 끝난 96 well plate를 0.1% PBST로 washing하고 1ug/mL TNFα를 반응시킨다. 이때, 96 well plate바닥에 고정된 IFX와 TNFα가 반응한다. 반응이 끝난 96 well plate를 0.1% PBST로 washing하고 1 ug/mL의 16종 단클론 anti-IFX 항체 용액을 각각 반응한다. 단클론 anti-IFX 항체와 IFX의 반응이 끝나면 96 well plate를 0.1% PBST로 washing하고 발색을 위해 HRP(horseradish peroxidase)가 표지된 2차 항체를 반응시킨다. 반응이 끝나면 96 well plate를 0.1% PBST로 washing하고 TMB(tetramethylbenzidine)를 이용해 발색하고, stop solution으로 발색 종료 후 흡광도를 측정한다.
항체 결합 부위 확인을 위한 16종의 단클론 anti-IFX 항체의 결과는 아래 표 1에 나타낸다.
Figure pat00001
각 단클론 항체 결합 부위 확인 결과, 총 16종 클론 중 4종의 클론(5E36, 4C18, 10D2, 8G73)은 IFX와 TNF결합시 IFX에 대한 반응성이 20 % 이상 감소하는 결과를 나타내었다. 이는 TNF와 일부 또는 전체 결합 사이트를 공유하기 때문에, TNF와 간섭에 의해 그 반응성이 감소하는 것으로 추정된다. 따라서, 나머지 12종을 IFX와 TNF의 결합 사이트를 공유하지 않는 항-이디오타입 항체로 판단하였다.
이후 이들 12종의 항-이디오타입 항체 중에서 IFX 반응성 평가 및 항체쌍 선별 과정을 통해 최종 항-이디오타입 항체를 선별하였다.
3-1. 형광 모이어티가 표지된 항-이디오타입 항체 제조
형광 모이어티(fluorescent moiety)가 표지된 항-이디오타입 항체를 제조한다. 준비된 항-이디오타입 항체에 적당량의 NaHCO3를 녹이고, 적당량의 형광 모이어티-NHS(N-hydroxysuccinimide) ester(예를 들면, alexa-NHS ester)를 첨가하여 반응시킨다. 반응이 완료된 용액은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 형광 모이어티가 표지된 항-이디오타입 항체만 분리한다.
3-2. 트레이서 항체 제조
링커가 결합되어 있는 항-이디오타입 항체인 트레이서 항체를 제조한다. 항-이디오타입 항체에 적당량의 NaHCO3를 녹이고, 적당량의 biotin-NHS를 첨가하여 반응시킨다. 반응이 완료된 용액은 원심분리기를 이용하여 biotin-TNFα복합체만 분리한다.
4. 약물 신속 검출 키트의 제조
본 발명의 약물 신속 검출 키트는 다공성 멤브레인, 시료 패드, 테스트 라인, 컨트롤 라인, 흡수 패드 및 형광 검출부를 포함한다. 다공성 멤브레인에 컨트롤 캡처와 테스트 캡처를 일정 농도로 분사하고 건조시켜 컨트롤 라인 및 테스트 라인을 다공성 멤브레인 상에 형성시킨다. 상기 컨트롤 캡처는 chiken IgY 또는 KLH이고, 상기 테스트 캡처는 항-이디오타입 항체 또는 링커이다. 적절한 시료 패드를 다공성 멤브레인의 상류 단부에 배치시키고, 적절한 흡수 패드를 다공성 멤브레인의 하류 단부에 배치시킨다. 이후, 플라스틱 하우징에 시료 패드 및 흡수 패드가 형성된 다공성 멤브레인을 넣어 조립한다. 본 발명의 검출 키트를 도 2에 나타낸다(형광 검출부는 도시하지 않음).
5. 항TNF-α 약물 신속 검출 키트 사용 방법
본 발명의 신속 검출 키트의 사용방법은 도 3에 나타낸 바와 같이, 3단계로 구성된다.
1단계는 샘플 희석 단계이다. 샘플은 손가락 등에서 채혈된 항TNF-α 약물을포함하는 모세혈, 혈청, 혈장 및 전혈을 사용할 수 있다. Sample collector를 이용해 샘플 10 ul를 채취하고 희석액과 혼합하여 교반한다.
2단계는 시료 제조 단계이다. 1단계에서 제조된 샘플 희석액을 검출 버퍼에 첨가한다. 이때, 검출 버퍼에는 테스트 디텍터 항체, 컨트롤 디텍터, 또는 트레이서 항체 등이 포함되어 있어, 시료 내에는 항체-약물 복합체 또는 항체-약물-항체 복합체, 즉 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질이 형성된다.
3단계는 형성된 복합체를 다공성 멤브레인에 고정하는 단계이다. 2단계에서제조된 시료를 플라스틱 하우징 시료 투입구에 투입시킨다. 시료는 다공성 멤브레인을 따라 흐르게 되고, 컨트롤 디텍터는 컨트롤 라인에서 고정되며, 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질은 테스트 라인에서 고정된다. 보다 구체적으로, 항체-약물 복합체의 약물은 테스트 라인에 고정되어 있는 항-이디오타입 항체와 결합되기 때문에, 타겟 물질이 테스트 라인에서 고정된다. 또는, 항체-약물-항체 복합체의 링커는 테스트 라인에 고정되어 있는 링커와 결합되기 때문에, 타겟 물질이 테스트 라인에서 고정된다. 테스트 라인에서 타겟 물질이 고정되는 구현예를 도 4에 나타낸다.
6-1. 형광 신호 처리 및 결과 분석
일정 incubation 시간을 거쳐 다공성 멤브레인에 타겟 물질 및 컨트롤 디텍터의 고정화 반응이 끝난 후, 도 5의 a에 나타낸 바와 같이, 테스트 라인 및 컨트롤 라인의 형광 신호를 형광 검출부(도시하지 않음)에 의해 스캔한다. 도 5의 b에 나타낸 바와 같이, 시료 내 약물의 농도가 증가할 수록, 테스트 라인에 고정된 타겟 물질의 양이 증가하므로, 형광 신호도 증가한다. 반면 control line의 경우, 시료 내 약물의 농도와 무관하게 일정한 형광신호를 나타낸다.
약물의 농도는 표준시료의 형광신호를 기반으로 미지 시료의 농도를 산출하는 방식으로 계산된다. 검사 시 검정 시료를 동시에 시험하는 통상의 ELISA 시험법과 차별된 방법이며, 검증하고자 하는 시료 시험을 위한 시약 외에 부가적인 시료의 소모가 없어 자원을 절감할 수 있고, 경제적이다.
6-2. 신속 검출 키트를 이용한 항-TNFα 약물의 정량 분석
항-TNFα 약물 모니터를 위한 신속 검출 키트의 정량 분석 결과는 다음 과정을 통해 도출된다.
먼저, Infliximab 국제 표준 물질 등을 이용해 설정한 농도로 희석한 5-6개의 표준시료 또는 표준물질(calibrator)을 준비한다. 약물 모니터의 가장 주요한 목적은 주사하는 약물이 효능을 가지면서도 부작용이 없는 최대 농도(Therapeutic range)와 다음 주사 시기 전에 유지되어야 하는 최소 농도(trough level) 범위 내에 유지되도록 하는 것이다. 따라서, 표준물질의 농도 설정은 trough level 보다 낮은 농도, trough level, therapeutic range에 근거하여 저 중 고 전 영역을 포함하도록 설정한다. 본 실시예에서는 0, 0.5, 2, 20, 50 ug/mL 농도의 IFX 표준물질을 제작하였다.
다음으로, 전술한 5. 항TNF-α 약물 신속 검출 키트 사용 방법에 따라 제작한 시료를 신속 검출 키트로 농도를 평가한다. 시료내 약물의 농도가 증가하면, 테스트 라인의 형광 신호가 증가하는 반면, 컨트롤 라인의 경우, 약물 농도에 영향을 받지 않으므로 농도에 상관없이 일정한 형광신호를 나타낸다. 형광 검출부에 의해 측정한 테스트 라인 및 컨트롤 라인의 형광 신호 ratio를 계산하여 검량곡선(calibration curve)을 작성한다.
작성된 검량곡선은 미지의 시료의 농도를 결정하는데 사용하며, 구체적으로 미지의 시료로부터 얻은 형광 신호 ratio 결과값을 검량곡선에 대입하여 미지 시료의 농도를 계산한다.
7. 신속 검출 키트의 TNF-α의 간섭 배제 성능
본 발명의 신속 검출 키트는 TNF-α의 간섭을 배제하기 위해 항-이디오타입 항체를 사용하고 있고, 실험을 통해 적절한 항-이디오타입 항체를 선별하였다. 이에, 최종적으로 제조된 신속 검출 키트의 TNF-α의 간섭 배제 성능을 확인하였다.
염증성 장 질환(IBD) 환자의 경우, 건강한 사람보다 매우 높은 수준의 TNF-α가 혈액 내 존재하며, 그 수준은 수~수십 pg/mL 정도인 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명의 신속 검출 키트의 TNF-α 간섭 배제 성능 평가를 위해, ng/mL 수준 이상의 TNF-α 존재 시 TNF-α의 간섭 여부를 판단하는 실험을 진행하였다.
4가지 농도(0.5, 2, 10, 25 ug/mL)의 IFX(인플릭시맙) 용액을 제조하고, 각 용액에 0, 1, 10, 100 ng/mL의 TNF-α 용액을 첨가하여 평가 시료를 준비하였다. 이때 첨가한 TNF-α 용액의 부피는 전체 평가 시료 부피의 10% 미만으로 첨가되었다. 실험 결과는 TNF-α가 존재하지 않는 시료(TNF-α 0 ng/mL)의 IFX 검출 결과값을 기준으로 하여, 평가 시료 내 TNF-α 농도에 따른 IFX 검출 결과값의 변화(recovery)를 분석한 결과를 아래 표 2에 나타낸다.
Figure pat00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신속 검출 키트는 시료 내 TNF-α에 의한 간섭이 거의 없는 것으로 나타났다. 다만, TNF가 매우 고농도(100 ng/mL)로 존재하고, IFX 농도가 통상적인 trough level이나 그 이하(0.5~2 ug/mL) 수준인 일부 경우에 한해 간섭 현상이 나타나는 것으로 확인되었다. 반면, TNF가 매우 고농도(100 ng/mL)로 존재하더라도, IFX 10 ug/mL 이상의 고농도에서는 간섭 현상이 완화되는 것으로 확인되었다.

Claims (7)

  1. 항TNF-α 약물 모니터링을 위한 신속 검출 키트로서,
    다공성 멤브레인;
    다공성 멤브레인의 상류 단부에 배치되고, 시료를 흡수하여 상기 다공성 멤브레인에 제공하는 시료 패드;
    상기 다공성 멤브레인 상에서 상기 시료 패드로부터 이격되어 형성된 테스트 라인;
    상기 다공성 멤브레인의 하류 단부에 배치되고, 시료 패드로부터 제공된 시료를 흡수하는 흡수 패드; 및
    상기 테스트 라인에서 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질이 검출되고,
    상기 항TNF-α 약물을 포함하는 타겟 물질은, 항TNF-α 약물과 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체를 포함하는 복합체인 신속 검출 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 테스트 라인에는 링커 또는 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체가 고정되어 있는 신속 검출 키트.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 링커는 스트렙트아비딘, 아비딘, 비오틴, 히스티딘 작용기를 포함하는 단백질 및 항 히스티딘 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 1종 이상인 신속 검출 키트.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 신속 검출 키트는 테스트 라인 또는 컨트롤 라인에서 발생하는 형광을 검출할 수 있는 형광 검출부를 추가로 포함하고 있는 신속 검출 키트.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 항TNF-α 약물 및 형광 모이어티가 표지된 항-인간 IgG 항체로 이루어진 항체-약물 복합체를 포함하는 신속 검출 키트.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 항TNF-α 약물 및 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체로 이루어진 항체-약물 복합체를 포함하는 신속 검출 키트.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 항TNF-α 약물, 형광 모이어티가 표지된 항TNF-α 약물에 대한 항-이디오타입 항체 및 상기 트레이서 항체로 이루어진 항체-약물-항체 복합체를 포함하는 신속 검출 키트.
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