CN104263747A - 一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，提供一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法，该方法包括pSumo-Intein质粒载体的构建、人源SENP2催化域蛋白的制备、pSumo-目标DNA-Intein质粒载体构建、pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和复性纯化等步骤，得到目标蛋白。本发明将Sumo和Intein这两种标签整合到同一个表达质粒中，可以同时利用这两种标签的优势，在大肠杆菌中表达时最大程度地免受蛋白酶的降解。本发明可用于大规模低成本地实现实验室规模到工业生产规模蛋白质药物的纯化和复性，高通量蛋白质抗原表达，和已有蛋白质药物的长效化改造。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种长效蛋白质药物表达复性修饰的双标签载体及方法。
背景技术
自基因重组技术发明以来(Hannig,G.,and Makrides,S.C.(1998).Strategiesfor optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli.Trends Biotechnol.16,54–60.)，重组蛋白质多肽药物逐渐取代了传统来源的蛋白质药物，比如人重组胰岛素基本已经完全取代来自动物胰脏的胰岛素来治疗糖尿病(EP2374888A1,EP0437320A1)。目前重组蛋白质药物的市场已经在全球范围内达1400亿美元，而且随着抗体药以及其他蛋白类新药的发现，这个市场持续以高增长率维持相当长的一段时间。
重组蛋白质药物的生产也从早期在大肠杆菌宿主中表达，演化到现在可以在从原核到真核细胞，乃至人体细胞中表达，满足一系列不同蛋白质的表达需求。但大肠杆菌仍然是科研和工业市场上的首选，其显著特点是表达量高(50％总蛋白以上)，生长快(20-30分钟细胞分裂一次)，分子生物学操作简单，体系成熟。对于表达来自原核或者溶解度高的蛋白质多肽，大肠杆菌具有首选的技术优势。但是对于很多来自真核或者人源的蛋白质，在大肠杆菌中的高产量可溶性表达是个难题，很多蛋白质的表达都是以包涵体的形式存在。
包涵体是蛋白质在大肠杆菌中高速表达或者没有正确的翻译后修饰导致的蛋白质聚集体。虽然其中的蛋白质没有活性，但可以屏蔽的蛋白酶的水解而保存完整的序列。如果有合适的复性手段就可以完美的解决这个矛盾。
但包涵体蛋白质复性目前仍然被认为是世界性难题(Vallejo,L.F.,and Rinas,U.(2004).Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterialinclusion body proteins.Microbial Cell Factories 3,11.)。每一个蛋白质的复性方法都不尽相同，很难有通用的方法，而且一般主流复性手段如稀释复性的产率很低，后续纯化工艺难度大。根据目前蛋白质复性数据库的数据(http://refold.med.monash.edu.au/)，稀释复性的产率一般位于1％到20％之间，不同蛋白质复性的效率不一样且难以预测，这给重组人源蛋白质药物的大规模、低成本生产带来很大的困难。因此在过去几十年的蛋白质复性技术发展过程中，科学家们发明出多种复性方法，包括稀释法、透析法、柱上复性以及各种复性添加剂的开发(Coutard,B.,Danchin,E.G.J.,Oubelaid,R.,Canard,B.,andBignon,C.(2012).Single pH buffer refolding screen for protein from inclusionbodies.Protein Expression and Purification 82,352–359.
Vallejo,L.F.,and Rinas,U.(2004).Strategies for the recovery of active proteinsthrough refolding of bacterial inclusion body proteins.Microbial Cell Factories 3,11.
Vincentelli,R.,Canaan,S.,Campanacci,V.,Valencia,C.,Maurin,D.,Frassinetti,F.,Scappucini-Calvo,L.,Bourne,Y.,Cambillau,C.,and Bignon,C.(2004).High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.Protein Science13,2782–2792.)。单就复性成本来说，柱上复性成本最高，而且需要扎实的蛋白质纯化工艺知识。但从蛋白质折叠数据库的数据来看，柱上复性一般都可以给出更好的复性效率。
对于目前主流的蛋白质药物生产工艺还是直接纯化外源表达的蛋白质作为药物。但也有很多蛋白质药物经过化学修饰之后被发现在人体内的半衰期大大延长，可能原因有修饰屏蔽掉血液中內源蛋白酶的降解或者修饰之后分子量的增加降低了被肾小球过滤的速率。蛋白质的化学修饰也是复杂的工程问题(Roberts,M.J.,Bentley,M.D.,and Harris,J.M.(2002).Chemistry for peptide andprotein PEGylation.Advanced Drug Delivery Reviews 54,459–476.)。最早的修饰是通过自由氨基简单的耦联，这种修饰随机性大，无法获得均一的化学修饰。后来科学家又开始采用引入半胱氨酸到蛋白质序列中，这个未形成二硫键的半胱氨酸可以提供位点特异性修饰。不过额外的氨基酸引入不能对所有的蛋白质都有效，难以兼顾既不影响蛋白质药物自身的活性又可以方便地化学修饰。
SUMO标签从开始应用到蛋白质表达纯化之后，科学家们发现这种标签不但可以完全从目标蛋白上被特异的蛋白酶SENP剪切掉，而且还可以帮助目标蛋白质复性(Butt,T.R.,Edavettal,S.C.,Hall,J.P.,and Mattern,M.R.(2005).SUMOfusion technology for difficult-to-express proteins.Protein Expression andPurification 43,1–9.
Kong,B.,and Guo,G.L.(2011).Enhanced In Vitro Refolding of FibroblastGrowth Factor 15with the Assistance of SUMO Fusion Partner.PLoS ONE 6,e20307.)。另外Intein标签一直被用来作为蛋白质表达系统的优势是可以在无需酶催化的条件下与目标蛋白发生自剪切反应(Carvajal-Vallejos,P.,Pallisse,R.,Mootz,H.D.,and Schmidt,S.R.(2012).Unprecedented rates and efficienciesrevealed for new natural split inteins from metagenomic sources.J.Biol.Chem.
Xu,M.Q.,and Evans Jr,T.C.(2001).Intein-mediated ligation and cyclization ofexpressed proteins.Methods 24,257–277.)，而且不会留下任何Intein标签上的序列。其另外一个特性就是，如果Intein是位于目标蛋白的C端，自剪切之后可以在目标蛋白质末端引入一个thioester活性基团。这种活性基团可以特异性地与亲核攻击基团比如半胱氨酸侧链自由巯基(-SH)发生反应，这种反应被称为Native Chemical Ligation。也就是说这种化学反应可以在保持一般蛋白质活性的缓冲液中进行。反应程度接近100％而且特异性强。
因此，目前的科研和生产中需要将这两种标签整合到同一个表达质粒载体，再最终获得位点特异性修饰的目标蛋白质并将其纯化的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供种长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，该方法可用于大规模低成本地实现蛋白质药物的纯化和复性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种长效蛋白质药物表达复性修饰双标签质粒载体，所述双标签质粒载体的出发载体是IPTG诱导表达的质粒载体，所述双标签质粒载体包含有至少一个目标蛋白N端的Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)和目标蛋白C端的Intein的DNA序列；所述IPTG诱导表达的质粒载体优选为pTWIN1质粒载体，也可以为pGEX质粒载体。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种用于长效蛋白质药物表达复性修饰的蛋白，翻译得到所述蛋白的DNA序列中包括SEQ ID No.3。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，包括如下步骤：
pSumo-Intein质粒载体的构建步骤：将Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)连接入已酶切掉目标蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG诱导表达的质粒载体，得到pSumo-Intein质粒载体；
人源SENP2催化域蛋白的制备步骤：将SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)连接入pGEX4T1质粒载体，得到SENP2-pGEX4T1质粒载体；再将所述SENP2-pGEX4T1质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、收集纯化处理，得到人源SENP2催化域蛋白；
目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤：将目标DNA连接入所述pSumo-Intein质粒载体，得到pSumo-目标DNA-Intein质粒载体；
pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和复性纯化步骤：将所述pSumo-目标DNA-Intein质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、裂解和消化处理、孵育处理、复性处理、自剪切处理、酶切处理、洗脱处理，得到目标蛋白。
进一步地，所述目标DNA为proinsulin突变体的DNA序列(包括SEQ IDNo.4)或GLP1类似物exendin-4突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.5)。
进一步地，所述人源SENP2催化域蛋白的制备步骤中，
所述诱导表达处理为：挑取所述SENP2-pGEX4T1质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
所述收集纯化处理为：先进行裂解和消化处理：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再进行纯化处理：将所述消化液离心取上清，在该上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再离心，保留沉淀，再将该沉淀清洗、洗脱，得到洗脱上清液，即为所述人源SENP2催化域蛋白的溶液。
进一步地，所述pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和纯化复性步骤中，
所述诱导表达处理为：挑取pSumo-目标DNA-Intein质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
所述裂解和消化处理为：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；
所述孵育处理为：将所述消化液离心后取沉淀，向该沉淀中加入尿素和二硫苏糖醇，得到孵育液；
所述复性处理为：向所述孵育液中加入IMAC树脂，再加入含有尿素的复性缓冲液，清洗后得到复性树脂复合物；
所述自剪切处理为：向所述复性沉淀中加入含有2-巯基乙基磺酸钠的自剪切缓冲液，清洗后得到自剪切树脂复合物；
所述酶切处理为：向所述自剪切树脂复合物中加入含有所述人源SENP2催化域蛋白SENP2的酶切缓冲液，得到酶切树脂复合物；
所述洗脱处理为：将所述酶切树脂复合物清洗后，加入洗脱缓冲液，离心后取上清，得到目标蛋白的溶液。
进一步地，所述pSumo-Intein质粒载体的构建步骤中，所述Sumo3的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.6-15。
进一步地，所述人源SENP2催化域蛋白的制备步骤中，所述人源SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)，通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.26-43。
进一步地，所述目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤中，所述Proinsulin突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.4)，通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.16-21。
进一步地，根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤中，所述对GLP1类似物Exendin-4突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.5)，通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.22-25。
柱上复性纯化修饰一体化系统如图1所示。基于本发明方法的大规模蛋白质纯化工艺如图2所示。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
1、本发明将Sumo和Intein这两种标签整合到同一个表达质粒中，通过SapI酶切位点可以插入任意一段目标蛋白质的表达序列，使得Sumo标签和Intein标签分别位于目标蛋白质的N端和C端。这种设计不但可以同时利用这两种标签的优势，还可以在大肠杆菌中表达时最大程度地免受蛋白酶的降解。在这种表达质粒中表达的蛋白质如果是以包涵体的形式表达，可以在包涵体初步纯化之后再进行IMAC柱上复性和酶切。最终经过SENP剪切和Intein自剪切之后获得的目标蛋白一定是复性成功且可溶的，而且C端引入的thioester键可以通过与半胱氨酸修饰的脂肪酸或者聚乙二醇进行自然化学连接(Native ChemicalLigation)，从而最终获得位点特异性修饰的目标蛋白质。本发明相对于传统蛋白质表达纯化修饰工艺来说取得了巨大的工艺创新和简化，将常规至少三步蛋白质纯化过程简化成一步IMAC变性纯化，而且这一步IMAC还整合了柱上复性过程以及柱上酶切之后的Native Chemical Ligation。
2、本发明促进新型蛋白质表达平台的构建。创新的双标签设计可以允许外源蛋白质在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达，表达量超过总蛋白50％以上，5L的发酵初步研究表明可以达到5g/L的发酵量。如此高的发酵量可以满足糖尿病类蛋白质药物的大剂量需求。按照当前的工艺条件线性放大，5个1000L的发酵罐连续循环发酵就可以贡献1000kg/年的生产量，满足1000万病人一年的用药量。
3、本发明促进柱上复性工艺的整合。正是由于柱上复性技术的使用才能够进行大规模高产量的包涵体表达蛋白质药物。相比传统方法5％左右的复性比率，柱上复性可以实现70-90％的复性比率，经过复性缓冲液优化之后可能达100％的复性比率。单在这一步工艺就可以极大地降低纯化损失，提高效率。
4、本发明有利于位点特异性化学修饰技术。成品的蛋白质药物如果不经修饰，体内的半衰期之后几分钟到几小时，比如：治疗糖尿病的胰岛素半衰期是6个小时，GLP1是几分钟。经过化学修饰之后，一般是对其进行PEG修饰，可以成本延长它们的半衰期，比如已知GLP1经过修饰之后半衰期可以延长至7天，胰岛素预期也可以提高到2-3天。
5、本发明可用于大规模低成本地实现实验室规模到工业生产规模蛋白质药物的纯化和复性，高通量蛋白质抗原表达，和已有蛋白质药物的长效化改造。结合我们发明的蛋白质位点特异性聚乙二醇(PEG)修饰及高效蛋白质复性及纯化技术，我们可以实现低成本大规模生产长效蛋白质类药物，特别是针对治疗糖尿病的蛋白质多肽药物的生产。
附图说明
图1：柱上复性纯化修饰一体化系统示意图。
图2：基于本发明方法的大规模蛋白质纯化工艺示意图。
图3：实施例2中的SENP2-pGEX4T1质粒载体结构示意图。
图4：实施例1中的pSumo-Intein质粒结构示意图。
图5：实施例3中的表达proinsulin突变体或者GLP1类似物突变体的pSumo-proinsulin/GLP1-Intein质粒载体结构示意图。
图6：实施例4中的Proinsulin突变体蛋白的复性纯化结果。蛋白质在BL21RP菌株中以包涵体形式表达，条带1-6分别是未诱导的细菌裂解液，1mM IPTG诱导4小时的裂解液，不溶性组分(含包涵体)，可溶组分，IMAC穿透液，经过GST柱纯化的Proinsulin。
具体实施方式
本发明提供一种长效蛋白质药物表达复性修饰双标签质粒载体，其出发载体是pTWIN1质粒载体或者其他IPTG可诱导表达的质粒载体，包含有至少一个目标蛋白N端的Sumo的标签的DNA序列(SEQ ID No.2)和目标蛋白C端的Intein的DNA序列。
本发明提供翻译得到一种用于长效蛋白质药物表达复性修饰的蛋白的DNA序列中包括SEQ ID No.3。
本发明提供一种长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，包括如下步骤：
步骤一、pSumo-Intein质粒载体的构建：将Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)连接入已酶切掉目标蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG诱导表达的，得到pSumo-Intein质粒载体。
Sumo的标签的DNA序列(SEQ ID No.2)通过Assembly PCR反应合成，Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.6-15。
具体地说，本步骤通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)获得人Sumo3蛋白的序列(P55854)，再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到Sumo3的DNA序列(SEQ IDNo.1)。在此基础上取其7-276bp作为sumo3tag序列(SEQ ID No.2)。然后再通过基因合成这段序列，并将pTWIN1(NEB)中的目标蛋白N端Intein序列置换为Sumo3的标签的DNA序列，同时保留目标蛋白C端Intein序列；通过测序验证得到序列正确的pSumo-Intein质粒克隆。本步骤也可以采用pGEX质粒载体作为出发载体。
本步骤也可以将pTWIN1质粒载体的目标蛋白的C端Intein的DNA序列、Sumo3标签的DNA序列，分别接入其他任何IPTG可诱导表达的质粒载体，并分别位于目标蛋白的C端和N端，以得到pSumo-Intein质粒载体。
步骤二、人源SENP2催化域蛋白的制备：将SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)连接入pGEX4T1质粒载体，得到SENP2-pGEX4T1质粒载体；再将SENP2-pGEX4T1质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、收集纯化处理，得到人源SENP2催化域蛋白；
该人源SENP2催化域的DNA序列(SEQ ID No.3)，通过Assembly PCR反应合成，Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.26-43。
上述诱导表达处理为：挑取SENP2-pGEX4T1质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
上述收集纯化处理为：先进行裂解和消化处理：将上述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再进行纯化处理：将消化液离心取上清，在该上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再离心，保留沉淀，再将该沉淀清洗、洗脱，得到洗脱上清液，即为人源SENP2催化域蛋白的溶液。
具体地说，本步骤通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)获得人SENP2蛋白的序列(Q9P0U3)，再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到SENP2催化domain(362-589aa)的DNA序列(SEQ ID No.3)。将这段通过基因合成得到的序列克隆到GST表达系统pGEX4T1中，再采用电转化将SENP2催化domain在大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus-RP中表达，并用IPTG诱导之后采用GST亲和纯化。
步骤三、目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建：将目标DNA连接入pSumo-Intein质粒载体，得到pSumo-目标DNA-Intein质粒载体。
该目标DNA为proinsulin突变体的DNA序列(SEQ ID No.4)或GLP1类似物exendin-4突变体的DNA序列(SEQ ID No.5)。
Proinsulin突变体的DNA序列(SEQ ID No.4)，通过Assembly PCR反应合成，Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.16-21。
对GLP1类似物Exendin-4突变体的DNA序列(SEQ ID No.5)，通过Assembly PCR反应合成，Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ IDNO.22-25。
具体地说，本步骤中通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)获得人Proinsulin蛋白的序列(P01308)，然后得到原核表达突变体，包括A链和B链的序列，中间用KR作为linker序列分开；再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)的DNA序列(SEQ ID No.4)；再将这段通过基因合成得到的序列克隆到pSumo-Intein中。
对GLP1类似物Exendin4采用类似的方法克隆到pSumo-Intein质粒中通过Uniprot数据库获得GLP1蛋白的序列(P26349)，然后取其氨基酸序列48-86得到原核表达突变体。再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到其DNA序列(SEQ ID No.5)；再将这段通过基因合成得到的序列克隆到pSumo-Intein中。
步骤四、pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和复性纯化：将pSumo-目标DNA-Intein质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、裂解和消化处理、孵育处理、复性处理、自剪切处理、酶切处理、洗脱处理，得到目标蛋白。
上述诱导表达处理为：挑取pSumo-目标DNA-Intein质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
上述裂解和消化处理为：将诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；
上述孵育处理为：将消化液离心后取沉淀，向该沉淀中加入尿素和二硫苏糖醇，得到孵育液；
复性处理为：向孵育液中加入IMAC树脂，再加入含有尿素的复性缓冲液，清洗后得到复性树脂复合物；
上述自剪切处理为：向复性树脂复合物中加入含有2-巯基乙基磺酸钠的自剪切缓冲液，清洗后得到自剪切树脂复合物；
上述酶切处理为：向自剪切树脂复合物中加入含有人源SENP2催化域蛋白SENP2的酶切缓冲液，得到酶切树脂复合物；
上述洗脱处理为：将酶切树脂复合物清洗后，加入洗脱缓冲液，离心后取上清，得到目标蛋白的溶液。
具体地说，本步骤表达Proinsulin突变体/Exendin4突变体的pSumo-Intein质粒被电转化到BL21(DE3)CodonPlus-RP中，筛选到阳性克隆后摇瓶培养并采用IPTG诱导表达。变性溶解的包涵体在IMAC亲和柱上纯化，然后梯度降低变性剂的浓度以使得Proinsulin复性。之后采用2-mercaptoethanesμlfonic acid(MESNA)激活Intein自剪切，进一步清洗之后再用SENP2酶切，再将目标蛋白洗脱。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照试剂制造厂家所建议的条件。
实施例1：pSumo-Intein质粒载体的构建
(1)、通过Uniprot数据库获得人源化Sumo3蛋白的序列(P55854)，再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到Sumo3的DNA序列(SEQ ID No.1)。在此基础上取其7-276bp作为sumo3tag的序列(SEQ ID No.2)，同时该段序列还包含一点6×His标签的序列以便于后期进行IMAC亲和变性纯化。
(2)、接下来对优化过的DNA序列设计分段式引物(Gene Design，http://54.235.254.95/gd/)进行基因合成：
合成反应是通过Assembly PCR反应(Marchand,J.A.,and Peccoud,J.(2012).Building block synthesis using the polymerase chain assembly method.Methods Mol.Biol.852,3–10.)来完成的。该分段式引物的序列OPM和TPM如SEQ ID NO.6-15所示。所有设计的Overlap引物(即分段式引物)通过Sigma公司合成并溶解在水溶液中形成100μM的母液。按照Marchand等人的方法准备templateprimer mix(TPM)(SEQ ID NO.7-14)和outer primer mix(OPM)(SEQ ID NO.6,15)：TPM所有引物的浓度是300nM，OPM的所有引物浓度是3μM。首先进行第一轮PCR，反应液包括12.5μl HotStar Taq master mix 2×(含有：2.5μl10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl TPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；反应条件是95℃15分钟，55℃30秒，72℃1分钟；然后25个循环，每个循环为95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟；最后72℃3分钟。
将第一轮反应得到的PCR产物1：4稀释，然后取2μl与12.5μl HotStar Taqmaster mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl OPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水混合。之后进行第二轮PCR，其条件与第一轮条件相同。PCR产物与GelRed缓冲液混合，然后在1.5％的琼脂糖电泳中分离，并切胶纯化，纯化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up试剂盒。然后再进行TOPO cloning(Life Technologies公司)和测序鉴定，挑选序列正确的克隆，得到sumo-TOPO质粒载体。
(3)、用NdeI和NcoI(fermentas公司)与该sumo-TOPO质粒进行酶切反应，得到含Sumo3的标签的DNA片段，然后将该DNA片段再与经过同样两种酶消化的pTWIN1(NEB公司)进行连接反应，即将该DNA片段插入pTWIN1质粒载体的NdeI、NcoI酶切位点之间。该连接反应液包含1μl pTWIN1，3μl sumo片段，1μl 10×缓冲液，1μl T4DNA ligase，4μl水。室温连接20分钟后转化大肠杆菌XL1Blue。挑取阳性克隆并测序鉴定，得到pSumo-Intein质粒载体，大小为7003b；该pSumo-Intein质粒载体的结构如图4所示。
本步骤也可以采用pGEX质粒载体等其他IPTG诱导表达的质粒载体作为出发载体；还可以将pTWIN1质粒载体的目标蛋白的C端Intein的DNA序列、Sumo3标签的DNA序列，分别接入其他任何IPTG可诱导表达的质粒载体，并分别位于目标蛋白的C端和N端，以得到pSumo-Intein质粒载体。
实施例2：人源SENP2催化域蛋白的制备
(1)、通过Uniprot数据库获得人SENP2蛋白的序列(Q9P0U3)，再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到SENP2催化域(362-589aa)的DNA序列(SEQ ID No.3)；
(2)、接下来对优化过的DNA序列设计分段式引物(Gene Design，http://54.235.254.95/gd/)进行基因合成：
该分段式引物的序列OPM和TPM如SEQ ID NO.26-43所示。合成反应是通过Assembly PCR反应(Marchand,J.A.,and Peccoud,J.(2012).Building blocksynthesis using the polymerase chain assembly method.Methods Mol.Biol.852,3–10.)来完成的。所有设计的Overlap引物(即分段式引物)通过Sigma合成并溶解在水溶液中形成100uM的母液。按照Marchand等人的方法准备templateprimer mix(TPM)(SEQ ID NO.27-42)和outer primer mix(OPM)(SEQ IDNO.26，43)：TPM所有引物的浓度是300nM，OPM的所有引物浓度是3μM。首先进行第一轮PCR，反应液包括12.5μl HotStar Taq master mix 2×(含有：2.5μl10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl TPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；反应条件是95℃15分钟，55℃30秒，72℃1分钟；然后25个循环，每个循环为95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟；最后72℃3分钟。
将第一轮反应得到的PCR产物1：4稀释，然后取2μl与12.5μl HotStar Taqmaster mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl OPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水混合。之后进行第二轮PCR，其条件与第一轮条件相同。PCR产物与GelRed缓冲液混合，然后在1.5％的琼脂糖电泳中分离，并切胶纯化，纯化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up试剂盒；然后再进行TOPO cloning(Life Technologies公司)和测序鉴定，挑选序列正确的克隆，得到SENP2-TOPO质粒载体。
(3)、再将SENP2-TOPO质粒载体，再对之进行sub-cloning到GST表达系统pGEX4T1中：
采用BamHI和EcoRI从TOPO质粒中剪切得到含SENP2的DNA片段，然后再与经过同样酶消化的pGEX4T1载体连接，即将该含SENP2的DNA片段插入pGEX4T1载体的酶切位点BamHI和EcoRI之间，得到SENP2-pGEX4T1质粒载体，大小为5650bp。SENP2-pGEX4T1质粒载体的结构如图3所示。连接条件与参见实施例1。
(4)、先采用电转化将SENP2-pGEX4T1质粒载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus-RP中诱导表达：挑取SENP2-pGEX4T1质粒载体的阳性克隆在1L LB media中开始37℃，230rpm发酵，等到OD600达到1.0之后，加入1mM IPTG并在18℃，230rpm过夜诱导表达，得到诱导表达液；；
(5)、再收集纯化人源SENP2催化域蛋白：
a、裂解和消化处理：第二天，于4000rpm，30分钟离心取大肠杆菌细胞沉淀，用10ml裂解液(50mM tris pH 7.5,150mM NaCl,1％Triton X-100)充分悬浮，并加入溶菌酶(lysozyme)至0.5mg/ml降解细胞壁，冰上孵育30分钟；待溶液粘稠后放到-80℃冷冻20分钟，然后再室温化冰，如此再重复两次；最后加入全能核酸酶(Benzonase)(10U/ml)消化DNA，得到大肠杆菌细胞消化液；
b、纯化处理：然后再于14000rpm，30分钟离心大肠杆菌细胞消化液取上清；在上清中加入500μl谷胱甘肽珠(Glutathione Beads(GE Lifesciences公司))，4℃摇床孵育10分钟，离心去除上清；将沉淀用10ml冰上预冷的裂解液清洗三遍，最后加入350μl洗脱缓冲液(含有：100mM Tris pH 8，15mg/ml还原型谷胱甘肽(Glutathione))洗脱，收集上清，得到上述人源SENP2催化域蛋白的溶液；采用Pierce公司的protein assay 660nm试剂盒测量该溶液的蛋白浓度，约为0.3mg/ml。
实施例3：Proinsulin和GLP1类似物在pSumo-Intein系统中的质粒构建
(1)、pSumo-proinsulin-Intein质粒载体的构建
a、通过Uniprot数据库获得人Proinsulin蛋白的序列(P01308)，然后通过程序得到原核表达突变体，该突变体的序列是通过将Insulin的B链和A链的序列之间用KR作为linker序列分开，形成B链-KR-A链的结构；再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到其DNA序列(SEQ ID No.4)。
b、再对上述优化过的DNA序列设计分段式引物(Gene Design，http://54.235.254.95/gd/)进行基因合成：
合成反应是通过Assembly PCR(Marchand,J.A.,and Peccoud,J.(2012).Building block synthesis using the polymerase chain assembly method.Methods Mol.Biol.852,3–10.)来完成的。该分段式引物的序列OPM和TPM如SEQ ID NO.16-21。所有设计的Overlap引物通过Sigma合成并溶解在水溶液中形成100uM的母液。按照Marchand等人的方法准备template primer mix(TPM)(SEQ IDNO.17-20)和outer primer mix(OPM)(SEQ ID NO.16,21)：TPM所有引物的浓度是300nM，OPM的所有引物浓度是3μM。首先进行第一轮PCR，反应液包括12.5μl HotStar Taq master mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl TPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；反应条件是95℃15分钟，55℃30秒，72℃1分钟；然后25个循环，每个循环为95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟；最后72℃3分钟。
将第一轮反应得到的PCR产物1：4稀释，然后取2μl与12.5μl HotStar Taqmaster mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl OPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水混合。之后进行第二轮PCR，其条件与第一轮条件相同。PCR产物与GelRed缓冲液混合，然后在1.5％的琼脂糖电泳中分离，并切胶纯化。纯化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up试剂盒纯化。然后再进行TOPO cloning(Life Technologies公司)和测序鉴定，挑选序列正确的克隆，得到Proinsulin-TOPO质粒载体。
c、然后用SapI酶切Proinsulin-TOPO质粒载体，得到含有proinsulin突变体的DNA片段，再与同样经过SapI消化的实施例1得到的pSumo-Intein质粒载体连接，即将含有proinsulin突变体的DNA片段插入pSumo-Intein质粒载体的SapI位点之间；再转化，挑取阳性克隆并测序鉴定，得到pSumo-proinsulin-Intein质粒载体，大小为7120bp。
(2)、pSumo-GLP1-Intein质粒载体的构建
a、对GLP1类似物exendin-4(SEQ ID NO.5)采用类似的方法克隆到pSumo-Intein质粒中：通过Uniprot数据库获得GLP1蛋白的序列(P26349)，然后取其氨基酸序列48-86得到原核表达突变体；再利用蛋白质序列反翻译以及密码子优化服务(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到其DNA序列(SEQ IDNo.5)。
b、再对优化过的DNA序列设计分段式引物(Gene Design，http://54.235.254.95/gd/)进行基因合成：
合成反应是通过Assembly PCR(Marchand,J.A.,and Peccoud,J.(2012).Building block synthesis using the polymerase chain assembly method.Methods Mol.Biol.852,3–10.)来完成的。该分段式引物序列如SEQ ID NO.22-25。
所有设计的Overlap引物通过Sigma公司合成并溶解在水溶液中形成100μM的母液。按照Marchand等人的方法准备template primer mix(TPM)(SEQ ID NO.23-24)和outer primer mix(OPM)(SEQ ID NO.22，25)：TPM所有引物的浓℃是300nM，OPM的所有引物浓度是3μM。首先进行第一轮PCR，反应液包括12.5μl HotStar Taq master mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl TPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水。反应条件是95℃15分钟，55℃30秒，72℃1分钟；然后25个循环，每个循环为95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟；最后72℃3分钟。
将第一轮反应得到的PCR产物1：4稀释，然后取2μl与12.5μl HotStar Taqmaster mix 2×(含有：2.5μl 10xThermoPol缓冲液(NEB)，0.5μl dNTPs(10mM母液)，0.5μl HotStar Taq聚合酶(Qiagen)，9μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水),2.5μl OPM和10μl无核酸酶无蛋白酶的双蒸水混合。之后进行第二轮PCR，其条件与第一轮条件相同。PCR产物与GelRed缓冲液混合，然后在1.5％的琼脂糖电泳中分离，并切胶纯化。纯化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up试剂盒。然后再进行TOPO cloning(Life Technologies公司)和测序鉴定，挑选序列正确的克隆，得到GLP1-TOPO质粒载体。
c、然后用SapI酶切GLP1-TOPO质粒载体，得到含有GLP1突变体的DNA片段，再与同样经过SapI消化的实施例1得到的pSumo-Intein质粒载体连接，即将含有GLP1突变体的DNA片段插入pSumo-Intein质粒载体的SapI位点之间；再转化，挑取阳性克隆并测序鉴定，得到pSumo-GLP1-Intein质粒载体，大小为7078bp。
本实施例构建的2种质粒载体的结构如图5所示，。
实施例4：两种双标签表达载体在大肠杆菌中的原核表达和复性纯化
(1)、Proinsulin双标签表达载体在大肠杆菌中的原核表达和复性纯化
a、诱导表达处理：表达Proinsulin的pSumo-Intein质粒(即：实施例3得到的pSumo-proinsulin-Intein质粒载体)被电转化到BL21(DE3)CodonPlus-RP中，筛选到阳性克隆后摇瓶培养并采用IPTG诱导表达：挑取pSumo-proinsulin-Intein质粒载体的阳性克隆在1L LB media中开始37℃，230rpm发酵，等到OD600达到1.0之后，加入1mM IPTG并在37℃，230rpm诱导4小时，得到诱导表达液。
b、裂解和消化处理：然后于4000rpm，30分钟离心取大肠杆菌细胞沉淀，用10ml裂解缓冲液(50mM tris pH 7.5,150mM NaCl,1％Triton X-100)充分悬浮，并加入溶菌酶(lysozyme)至0.5mg/ml降解细胞壁，冰上孵育30分钟；待溶液粘稠后放到-80℃冷冻20分钟，然后再室温化冰，如此再重复两次；最后加入全能核酸酶(Benzonase)(10U/ml)消化DNA，得到大肠杆菌消化液。
c、孵育处理：于14000rpm，30分钟离心大肠杆菌消化液，分离可溶性组分(上清)和不溶性组分(沉淀)；将不溶性组分再以每6ml加入4.2g尿素(Urea)以获得最终浓度大约是6M Urea的溶液，然后再加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇(DTT)(母液1M DTT，100倍稀释)，于室温孵育8小时以获得孵育液，即为充分溶解的包涵体的溶液。
d、复性处理：将上述孵育液约20ml中加入1ml IMAC树脂(resin)(Qiagen公司)，室温结合10分钟，2000RPM，1分钟离心收集上清作为穿透组分；然后分别用10ml含有4M尿素(Urea)，2M Urea和0.5M Urea的复性缓冲液(还含有10mM tris pH 10.5,10mM glycine,1mM cysteine,10mM cystine)孵育树脂(即前次离心后的沉淀)各20分钟后于2000RPM，1分钟离心去除上清，得到复性树脂复合物。
e、自剪切处理：然后向复性树脂复合物中(即前次离心后的沉淀)加入1ml2-巯基乙基磺酸钠(MESNA)自剪切缓冲液(50mM MESNA，50mM tris pH 8，150mM NaCl)在4℃孵育24小时，然后再用20ml清洗缓冲液(50mM tris pH7.5,150mM NaCl)清洗两次各5分钟，并在每次清洗之后用2000RPM，1分钟离心去除上清。
f、酶切处理：然后向上述复性树脂复合物(即前次离心后的沉淀)加入1mlSENP2酶切缓冲液(30μg/ml SENP2，50mM tris pH 7.5，150mM NaCl)进行酶切(该SENP2是将实施例2得到的人源SENP2催化域蛋白稀释后得到)，酶切条件是室温4小时，得到酶切树脂复合物。
g、洗脱处理：然后用清洗缓冲液(50mM tris pH 7.5,150mM NaCl)将酶切树脂复合物清洗两次各5分钟，并在每次清洗之后用2000RPM，1分钟离心去除上清；最后，再向树脂中(即前次离心后的沉淀)加入800μl洗脱缓冲液(500mM咪唑(Imidazole),50mM tris pH 7.5,150mM NaCl)，再于2000RPM，1分钟离心，取上清，该上清为Proinsulin突变体蛋白的溶液；如此，Proinsulin突变体蛋白就被洗脱下来作为复性洗脱组分。
h、检测：为了检测诱导效率，诱导表达处理前后各取1ml菌液，离心取上清后加入100μl Laemmli上样缓冲液溶解所有蛋白质，分别作为未诱导和IPTG诱导裂解液；最后所有组分都在15％的SDS-PAGE电泳上分离之后，采用GelCode Blue Stain染色(Pierce公司)。结果如图6所示。通过比较IPTG诱导条带和未诱导条带(条带2和1相比)可以看出经过1mM IPTG诱导之后可以明显看出诱导表达的外源双标签融合蛋白(含proinsulin突变体)。经过诱导之后，融合蛋白的表达量占总蛋白含量的32.7％。通过比较条带3和4可以发现，绝大部分融合蛋白表达属于不可溶组分，作为包涵体形式表达。经过变性溶解IMAC亲和纯化之后，穿透组分中基本没有融合蛋白，表明IMAC亲和纯化结合效率很高，没有发生泄露。最终经过复性纯化酶切之后可以得到单一条带纯度的目标蛋白，经过Image J定量之后纯度有89.8％。如果通过调节Imidazole浓度梯度还可以进一步提高纯度。
(2)、Exendin4双标签表达载体在大肠杆菌中的原核表达和复性纯化
a、表达Exendin4的pSumo-Intein质粒(即：实施例3得到的pSumo-GLP1-Intein质粒载体)被电转化到BL21(DE3)CodonPlus-RP中，筛选到阳性克隆后摇瓶培养并采用IPTG诱导表达：挑取pSumo-GLP1-Intein质粒载体的阳性克隆在1L LB培养基中开始37℃，230rpm发酵，等到OD600达到1.0之后，加入1mM IPTG并在37℃，230rpm诱导4小时，得到诱导表达液。
b、裂解和消化处理：然后于4000rpm，30分钟离心取大肠杆菌细胞沉淀，用10ml裂解缓冲液(50mM tris pH 7.5,150mM NaCl,1％Triton X-100)充分悬浮，并加入溶菌酶(lysozyme)至0.5mg/ml降解细胞壁，冰上孵育30分钟；待溶液粘稠后放到-80℃冷冻20分钟，然后再室温化冰，如此再重复两次；最后加入全能核酸酶(Benzonase)(10U/ml)消化DNA，得到大肠杆菌消化液。
c、孵育处理：于14000rpm，30分钟离心大肠杆菌消化液，分离可溶性组分(上清)和不溶性组分(沉淀)；将不溶性组分再以每6ml加入4.2g尿素(Urea)以获得最终浓度大约是6M Urea的溶液，然后再加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇(DTT)(母液1M DTT，100倍稀释)，于室温孵育8小时以获得孵育液，即为充分溶解的包涵体的溶液。
d、复性处理：将上述孵育液约20ml中加入1ml IMAC树脂(resin)(Qiagen公司)，室温结合10分钟，2000RPM，1分钟离心收集上清作为穿透组分。然后分别用10ml含有4M尿素(Urea)，2M Urea和0.5M Urea的复性缓冲液(还含有10mM tris pH 10.5,10mM glycine,1mM cysteine,10mM cystine)孵育树脂(即前次离心后的沉淀)各20分钟后于2000RPM，1分钟离心去除上清，得到复性树脂复合物。
e、自剪切处理：然后向复性树脂复合物中(即前次离心后的沉淀)加入1ml2-巯基乙基磺酸钠(MESNA)自剪切缓冲液(50mM MESNA，50mM tris pH 8，150mM NaCl)在4℃孵育24小时，然后再用20ml清洗缓冲液(50mM tris pH7.5,150mM NaCl)清洗两次各5分钟，并在每次清洗之后用2000RPM，1分钟离心去除上清。
f、酶切处理：然后再向自剪切树脂复合物中(即前次离心后的沉淀)加入1ml SENP2酶切缓冲液(30μg/ml SENP2，50mM tris pH 7.5，150mM NaCl)进行酶切(该SENP2是将实施例2得到的人源SENP2催化域蛋白稀释后得到)，酶切条件是室温4小时，得到酶切树脂复合物。
g、洗脱处理：然后用清洗缓冲液(50mM tris pH 7.5,150mM NaCl)将酶切树脂复合物清洗两次各5分钟，并在每次清洗之后用2000RPM，1分钟离心去除上清；最后，再向树脂中(即前次离心后的沉淀)加入800μl洗脱缓冲液(500mM咪唑(Imidazole),50mM tris pH 7.5,150mM NaCl)，再于2000RPM，1分钟离心，取上清，该上清为Exendin-4突变体蛋白的溶液；就这样，Exendin-4突变体蛋白就被洗脱下来作为复性洗脱组分。
h、检测：为了检测诱导效率，诱导表达处理前后各取1ml菌液，离心取上清后加入100μl Laemmli上样缓冲液溶解所有蛋白质分别作为未诱导和IPTG诱导裂解液。最后所有组分都在15％的SDS-PAGE电泳上分离之后，采用GelCode Blue Stain染色(Pierce公司)，最后可以得到与上述pSumo-insulin-Intein质粒载体相似的结果。
Claims (10)
1.一种长效蛋白质药物表达复性修饰双标签质粒载体，其特征在于：所述双标签质粒载体的出发载体是IPTG诱导表达的质粒载体，所述双标签质粒载体包含有至少一个目标蛋白N端的Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ IDNo.2)和目标蛋白C端的Intein的DNA序列；优选地，所述IPTG诱导表达的质粒载体为pTWIN1质粒载体或pGEX质粒载体。
2.一种用于长效蛋白质药物表达复性修饰的蛋白，其特征在于：翻译得到所述蛋白的DNA序列中包括SEQ ID No.3。
3.一种长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
pSumo-Intein质粒载体的构建步骤：将Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)连接入已酶切掉目标蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG诱导表达的质粒载体，得到pSumo-Intein质粒载体；
人源SENP2催化域蛋白的制备步骤：将SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)连接入pGEX4T1质粒载体，得到SENP2-pGEX4T1质粒载体；再将所述SENP2-pGEX4T1质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、收集纯化处理，得到人源SENP2催化域蛋白；
目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤：将目标DNA连接入所述pSumo-Intein质粒载体，得到pSumo-目标DNA-Intein质粒载体；
pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和复性纯化步骤：将所述pSumo-目标DNA-Intein质粒载体转化入表达宿主菌进行诱导表达处理、裂解和消化处理、孵育处理、复性处理、自剪切处理、酶切处理、洗脱处理，得到目标蛋白。
4.根据权利要求3所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述目标DNA为proinsulin突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.4)或GLP1类似物exendin-4突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.5)。
5.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述人源SENP2催化域蛋白的制备步骤中，
所述诱导表达处理为：挑取所述SENP2-pGEX4T1质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
所述收集纯化处理为：先进行裂解和消化处理：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再进行纯化处理：将所述消化液离心取上清，在该上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再离心，保留沉淀，再将该沉淀清洗、洗脱，得到洗脱上清液，即为所述人源SENP2催化域蛋白的溶液。
6.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：pSumo-目标DNA-Intein质粒载体在表达宿主菌的表达和纯化复性步骤中，
所述诱导表达处理为：挑取pSumo-目标DNA-Intein质粒载体的阳性克隆在LB培养基中发酵，再加入IPTG诱导，得到诱导表达液；
所述裂解和消化处理为：将所述诱导表达液离心取沉淀，将该沉淀用裂解液悬浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；
所述孵育处理为：将所述消化液离心后取沉淀，向该沉淀中加入尿素和二硫苏糖醇，得到孵育液；
所述复性处理为：向所述孵育液中加入IMAC树脂，再加入含有尿素的复性缓冲液，清洗后得到复性树脂复合物；
所述自剪切处理为：向所述复性树脂复合物中加入含有2-巯基乙基磺酸钠的自剪切缓冲液，清洗后得到自剪切树脂复合物；
所述酶切处理为：向所述自剪切树脂复合物中加入含有所述人源SENP2催化域蛋白SENP2的酶切缓冲液，得到酶切树脂复合物；
所述洗脱处理为：将所述酶切树脂复合物清洗后，加入洗脱缓冲液，离心后取上清，得到目标蛋白的溶液。
7.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述pSumo-Intein质粒载体的构建步骤中，所述Sumo的标签的DNA序列(包括SEQ ID No.2)通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.6-15。
8.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述人源SENP2催化域蛋白的制备步骤中，所述人源SENP2催化域的DNA序列(包括SEQ ID No.3)，通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.26-43。
9.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤中，所述Proinsulin突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.4)，通过Assembly PCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ ID NO.16-21。
10.根据权利要求3或4所述长效蛋白质药物表达复性修饰的方法，其特征在于：所述目标DNA在pSumo-Intein系统中的质粒构建步骤中，所述对GLP1类似物Exendin-4突变体的DNA序列(包括SEQ ID No.5)，通过AssemblyPCR反应合成，所述Assembly PCR反应合成的Overlap引物序列为SEQ IDNO.22-25。
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