CN113234704A - 一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶。本发明通过优化原核表达提高了蛋白的产量；通过SUMO3的突变改造，提高了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的复性率和均一性。同时，本发明也简化了纯化步骤，降低了生产成本，适合重组粘质沙雷氏菌核酸酶的大规模工业生产。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域；更具体地，涉及一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法。
背景技术
核酸酶是可以切割核酸核苷酸亚单位之间磷酸二酯键的酶。在遗传机制的很多方面发挥着重要作用，包括参与避免突变(DNA修复、复制和重组)、清除生长和代谢过程中产生的多余核苷酸和磷酸盐、防御外来的核酸分子、细胞程序性死亡和感染；在食品工业中核酸酶可用于生产核酸增味剂，如单磷酸鸟苷、单磷酸肌苷等；在医药工业中核酸酶用于生产其它核苷酸、疫苗和基因治疗产品。
核酸酶按底物特异性可分为两类：糖类特异性核酸酶(脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)和降解DNA、RNA的糖类非特异性核酸酶。在所有非特异性核酸酶中，来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶能水解各种形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环形)，生成5’-磷酸单核苷酸和5’-磷酸寡核苷酸终产物，对核酸的序列没有严格要求，没有蛋白酶活性。该核酸内切酶的应用较多，可以有效去除重组蛋白中的核酸污染；去除病毒疫苗和基因治疗病毒载体生产中的核酸污染，使其符合FDA指南中核酸含量的要求；可以用于实时定量PCR测定重组病毒滴度；降低由核酸导致细菌或细胞裂解液的高粘度使其易于过滤，有保护蛋白纯化柱的功效；防止细胞成团；提高包涵体蛋白复性率；在二维凝胶电泳中提高蛋白质分离效率和双向电泳的分辨率等。
来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸酶由266个氨基酸组成，与其它革兰氏阴性菌不同，1-21氨基酸组成的信号肽帮助核酸酶分泌到培养基中，其它革兰氏阴性菌的蛋白质被分泌到质膜空间而不是周围的培养基，在分泌过程中信号肽(1-21氨基酸)被切除；具有水解核酸酶活性的22-266氨基酸部分被分泌到培养基中，分子量约为26.7kDa。研究发现在粘质沙雷氏菌中将核酸酶分泌到培养基中信号肽(1-21氨基酸)是必须存在的，但是在大肠杆菌中表达重组粘质沙雷氏菌核酸酶即使没有信号肽(1-21氨基酸)，重组粘质沙雷氏菌核酸酶也可以被分泌到培养基中。
现有的方法中，虽然重组粘质沙雷氏菌核酸酶在大肠杆菌中分泌表达，但是依旧约有50％的重组粘质沙雷氏菌核酸酶无法被分泌到培养基中(详见发明专利US5173418A)，使其产量严重受限，且留在胞内的重组粘质沙雷氏菌核酸酶具有水解大肠杆菌基因组的能力，损伤大肠杆菌基因组，进一步限制了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的产量，因此重组粘质沙雷氏菌核酸酶的产量较低，即使采用高密度细菌发酵的方法，也仍需处理几十至几百升的培养基上清，增加重组粘质沙雷氏菌核酸酶的生产时间和成本。此外，例如US5173418A的方案，其构建质粒不带有纯化标签，无法采用快速、高效的亲和层析纯化方法，只能采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和排阻层析等多步骤纯化方法，致使纯化步骤繁琐、生产耗时长。现有的其他一些表达方法中，虽然通过在重组蛋白的N端和C端引入标签提高纯化效率，但是无法完全切除标签，重组生产获得的粘质沙雷氏菌核酸酶与天然沙雷氏菌的核酸酶氨基酸序列存在差异。
综上所述，现有制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶发明专利存在蛋白产量低、蛋白不均一、纯化步骤繁琐、生产耗时长和生产成本高等问题亟待解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法。
在本发明的第一方面，提供一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser。
在一个优选例中，融合表达时，所述的突变型SUMO3标签位于N端，所述粘质沙雷氏菌核酸酶位于C端。
在另一优选例中，所述的突变型SUMO3标签的N端，还包括His标签。
在另一优选例中，所述突变型SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的粘质沙雷氏菌核酸酶的氨基酸序列(突变前)如SEQ IDNO:2所示。
在另一优选例中，在原核细胞或真核细胞中表达；较佳地，所述的原核细胞包括(但不限于)：大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
在另一优选例中，以大肠杆菌进行表达，诱导温度37±2℃，0.5±0.2mM IPTG，诱导表达12±4小时。
在另一优选例中，以大肠杆菌进行表达，获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤；较佳地，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述粘质沙雷氏菌核酸酶；更佳地，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)。
在另一优选例中，所述清洗液包括：10-50mM(如15、20、25、30、40、45mM)三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.1-1M NaCl(如0.2、0.3、0.5、0.7、0.8M)，0.1-1％(如0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％)Triton X-100。
在另一优选例中，所述溶解液包括：6-8M(如6.5、7、7.5M)尿素，5-50mM(如10、15、20、25、30、40、45mM)二硫苏糖醇(DTT)。
在另一优选例中，所述复性液包括：0.2-2M(如0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8M)L-精氨酸，10-200mM(如15、20、30、50、80、100、120、150、180mM)三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，1-10mM(如2、3、5、6、8mM)还原型谷胱甘肽(GSH)或半胱氨酸(Cysteine)，1-10mM(如2、3、5、6、8mM)氧化型谷胱甘肽(GSSG)或胱氨酸(Cystine)，1-20％(v/v)(如2％、3％、5％、7％、10％、12％、15％、18％(v/v))甘油，10-50mM(如15、20、25、30、40、45mM)氯化镁。
在另一优选例中，所述包涵体蛋白复性后，上样至亲和层析柱，柱上切除位于粘质沙雷氏菌核酸酶N端前的区段(SUMO3标签或His-SUMO3)，收集含有粘质沙雷氏菌核酸酶的流穿液，纯化得到的有活性的粘质沙雷氏菌核酸酶。
在本发明的另一方面，提供一种突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser；较佳地，所述突变型SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的另一方面，提供一种表达构建体，其中包含所述的突变型SUMO3标签的编码核酸。
在另一优选例中，所述表达构建体中还包含与所述突变型SUMO3标签操作性连接的粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸。
在另一优选例中，表达构建体中，所述的突变型SUMO3标签位于N端，所述粘质沙雷氏菌核酸酶位于C端。
在另一优选例中，表达构建体中，所述的突变型SUMO3标签的N端，还包括His标签。
在另一优选例中，所述的表达构建体(构建物)是表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含所述的表达构建体。
在一个优选例中，该宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的原核细胞包括(但不限于)：大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。
在另一优选例中，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的突变型SUMO3标签、所述的表达构建体或所述的宿主细胞的应用，用于制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶，提高其复性率。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明重组粘质沙雷氏菌核酸酶制备方法的总体流程图。
图2、本发明C47S突变改造的SUMO3标签蛋白与来自于粘质沙雷氏菌的核酸内切酶氨基酸序列连接方式示意图。
图3、SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的包涵体蛋白复性率高于His标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶。
图4、pET28a-SUMO3-S-Nuclease质粒采用最佳效果组合：大肠杆菌BL21(DE3)菌株，37℃，0.5mM IPTG诱导表达12小时，高表达C47S突变改造SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白。
图5、SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)切除改造SUMO3标签，镍亲和层析树脂柱上酶切得到不含标签的重组粘质沙雷氏菌核酸酶的SDS-PAGE胶电泳图。
图6、最终纯化得到重组粘质沙雷氏菌核酸酶的酶活检测图。
具体实施方式
本发明人经过深入研究和实验工作，揭示了一种新型的制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法。所述方法包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3(Smallubiquitin-related modifier 3)标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶。
术语
如本文所用，除非另外说明，所述的“SUMO3的突变体”、“突变型SUMO3”可互换使用，是指对应于如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的SUMO3，发生以下位置的突变后所构成的蛋白：第47位由Cys突变为Ser。
如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
如本文所用，“提高复性率”是指与改造前的技术方案相比，优化表达策略后，粘质沙雷氏菌核酸酶的包涵体蛋白复性率发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，复性率提高的粘质沙雷氏菌核酸酶的复性率提高2％以上、3％以上、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上等。
如本文所用，所述的“构建物”或“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可一定程度上控制核酸序列表达的核苷酸序列。典范的调控元件例如但不限于包括增强子、内核糖体进入位点(IRES)、复制起点、多腺苷酸化信号、启动子、转录终止序列或上游调节区，所述调控元件有助于核酸的复制、转录、转录后修饰等。
如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，如本文所用，所述的“外源”或“异源”来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或不同来源的核酸/蛋白质与其宿主之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是“外源”的。又例如，特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源”的。
如本文所用，所述的“外源蛋白”是指感兴趣的、需要利用宿主细胞进行重组表达的蛋白。
如本文所用，如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为折叠因子，或目标蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
SUMO3突变体及包含其的构建体等
本发明的SUMO3突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。
本发明人发现，将SUMO3第47位Cys突变为Ser后，可以显著地提高重组粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白的复性率。同时，这种突变并不会影响SUMO3本身在纯化过程中被SUMO蛋白水解酶(SENP2)切除的性能，有利于纯化的进行。
本发明还包括所述SUMO3突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SUMO3突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个(如1、2、3、5或10个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1、2、3、5或10个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。但所述的SUMO3突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在本发明所特别指出的突变，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第47位为Ser。
在本发明中，术语“SUMO3突变体”还包括与所述的SUMO3突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白需要满足的条件是：必然存在本发明所特别指出的突变，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，第47位为Ser。
本发明还提供了编码本发明SUMO3突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。该多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明中，SUMO3突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SUMO3突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。在所述表达载体中，SUMO3突变体编码序列的3’端，可以设置多克隆位点(如至少一个酶切位点)，从而外源的可与该SUMO3突变体融合表达的蛋白(如粘质沙雷氏菌核酸酶)的核酸序列可被引入到所述表达载体中。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，所述的宿主细胞优选地是原核细胞，如细菌细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞，优选地为BL21(DE3)菌株。
粘质沙雷氏菌核酸酶的重组表达
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser。
本发明中，所述的粘质沙雷氏菌核酸酶可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。本发明还包括所述粘质沙雷氏菌核酸酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，粘质沙雷氏菌核酸酶的“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与SEQ ID NO:2所示序列的酶或其含有信号肽的全长蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是(i)有一个或多个(如1、2、3、5、10或20个)保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个(如1、2、3、5、10或20个)氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。所述粘质沙雷氏菌核酸酶还包括与所述的SEQ ID NO:2或其含有信号肽的全长蛋白的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。
本发明还包括编码本发明粘质沙雷氏菌核酸酶或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
作为本发明的优选方式，采用原核宿主细胞进行所述粘质沙雷氏菌核酸酶的重组表达，优选以大肠杆菌作为宿主细胞。在进行表达时，将SUMO3突变体的核苷酸序列与所述粘质沙雷氏菌核酸酶的核苷酸序列融合表达、获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤；较佳地，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述粘质沙雷氏菌核酸酶；更佳地，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)。
所述的突变型SUMO标签可以作为重组蛋白表达的融合标签，其与粘质沙雷氏菌核酸酶融合表达后，可被完整地切除以获得不带有多余氨基酸的重组粘质沙雷氏菌核酸酶。利用SUMO蛋白水解酶(优选地如SUMO特异性蛋白酶2(SENP2))能识别该突变型SUMO3标签蛋白序列，并把该突变型SUMO3从融合蛋白上切割下来，得到不带有多余氨基酸的重组粘质沙雷氏菌核酸酶。作为本发明的优选方式，运用His-突变型SUMO3标签融合所述粘质沙雷氏菌核酸酶(His-SUMO3-S-Nuclease)，更佳地所述His-突变型SUMO3标签的氨基酸序列如SEQID NO:8中第1～102位所示。
作为一种优选的实施方案，采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达所述His-SUMO3-S-Nuclease。
粘质沙雷氏菌核酸酶氨基酸序列可以包括信号肽序列或不包括信号肽序列，也可以包括部分的信号肽序列。也即，根据粘质沙雷氏菌核酸酶全长(含信号肽)序列来计，包括第22位天冬氨酸到最后一位氨基酸的野生型全长形式，或者第22位到最后一位氨基酸之前的任意截短形式，以及全长和截短形式对应的任意氨基酸突变形式。
本发明提供了一种产量高、纯度高、易操作、生产周期短、成本低的适合大规模工业生产重组粘质沙雷氏菌核酸酶的制备方法。作为一种优选的实施方式，本发明的方法包括如下步骤：重组粘质沙雷氏菌核酸酶表达载体的克隆构建：全基因合成C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶碱基片段，引入到pET28a载体；过表达C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶形成包涵体蛋白。
进一步地，还包括对C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白进行清洗、溶解。优选地，清洗液组分包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100；优选地，溶解液组分为：6-8M尿素，5-50mM二硫苏糖醇(DTT)。
进一步地，还包括对C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白进行复性。优选地，复性液组分包括：0.2-2M L-精氨酸(L-Arginine)，10-200mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽(GSH)或半胱氨酸(Cysteine)，1-10mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或胱氨酸(Cystine)，1-20％甘油，10-50mM氯化镁。
进一步地，还包括重组粘质沙雷氏菌核酸酶的纯化：C47S突变改造的SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白充分复性后，经镍亲和层析树脂纯化得到正确折叠的重组蛋白，经过SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)柱上酶切过夜后，收集的流穿液即为最终纯化得到的重组粘质沙雷氏菌核酸酶，其氨基酸序列与天然沙雷氏菌的核酸内切酶相同，不带有任何多余氨基酸。
作为一种优选方案，采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达C47S突变改造的SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白。
作为一种优选方案，加入终浓度为0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶表达。
作为一种优选方案，37℃诱导表达C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶，促进包涵体蛋白的生成。
作为一种优选方案，C47S突变改造的SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶表达时间为12小时，提高包涵体蛋白的表达量。
作为一种优选方案，清洗液组分为：50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.15MNaCl，0.1％Triton X-100。
作为一种优选方案，溶解液组分为：8M尿素，10mM二硫苏糖醇(DTT)。
作为一种优选方案，所述复性液的组分为：1M L-精氨酸(L-Arginine)，100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，5mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，15％甘油，50mM氯化镁。
作为一种优选方案，C47S突变改造的SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白复性温度为室温，表达时间为6小时左右。
本发明使用的C47S突变改造SUMO3标签(简称SUMO3-S)基于UniProt中HumanSmall ubiquitin-related modifier 3氨基酸序列稍作改变(UniProtKB:P55854)，本发明使用的核酸酶氨基酸序列来自粘质沙雷氏菌的核酸酶氨基酸序列(UniProtKB:P13717)。
作为本发明的更为具体的实施方式，所述重组粘质沙雷氏菌核酸酶的制备方法包括：将克隆完成的pET28a-SUMO3-S-Nuclease质粒热激转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取单克隆至LB培养基中37℃培养细菌，待OD600达到0.6-1.0时加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，12小时后收集并破碎菌体，提取His-SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白，包涵体蛋白经过清洗、溶解后滴加到复性液中进行包涵体重组蛋白的重折叠，室温静置4-12小时后经镍亲和层析树脂纯化出正确折叠的重组蛋白，经过SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)柱上酶切过夜后，收集的流穿液即为最终纯化得到具有活性的重组粘质沙雷氏菌核酸酶。
基于本发明的优化的技术方案，本发明也提供了一种用于重组表达外源蛋白如粘质沙雷氏菌核酸酶的试剂盒，其中包括本发明所述的突变型SUMO3标签、所述的表达构建体或所述的宿主细胞。
所述试剂盒中还可包括用于重组表达和/或纯化的其他试剂，包括但不限于：SUMO蛋白水解酶，较佳地为SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)；清洗液；溶解液或复性液。
为了便于本领域技术人员的操作，所述的试剂盒中还可包括说明操作方法的使用说明书。
与现有的表达技术相比，本发明的技术方案的优异效果在于：(1)以包涵体的形式表达重组粘质沙雷氏菌核酸酶，屏蔽蛋白酶的水解以保持重组蛋白序列的完整，降低重组粘质沙雷氏菌核酸酶对大肠杆菌细胞的毒性，提高重组蛋白的均一性和表达量；(2)包涵体蛋白表达量高，处理样品体积小至几升，无需处理几十至几百升的培养基上清，操作方便；(3)C47S突变改造的SUMO3标签显著提高了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的复性效率，提高重组粘质沙雷氏菌核酸酶的产量；(4)可通过镍亲和层析树脂柱上酶切的方式，得到高纯度的重组粘质沙雷氏菌核酸酶，简化纯化工艺，使之适合大规模工业生产；(5)可利用SENP2酶切除融合标签，可实现生产的重组粘质沙雷氏菌核酸酶与天然沙雷氏菌的核酸酶氨基酸序列完全相同，不带有多余氨基酸。
综上所述，本发明通过包涵体表达的优化设计，提高了蛋白的产量；通过SUMO3的优化设计，提高了重组粘质沙雷氏菌核酸酶的复性率和均一性。本发明利用常规的原核表达宿主进行表达，简化了纯化步骤，降低了生产成本，适合重组粘质沙雷氏菌核酸酶的大规模工业生产。本发明解决了现有制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法中存在的蛋白产量低、蛋白不均一、纯化步骤繁琐、生产耗时长和生产成本高等问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、野生型粘质沙雷氏菌核酸酶融合His-SUMO3标签克隆的构建
为了优化粘质沙雷氏菌核酸酶的表达，本发明人试验了多种表达方案，包括将其与His标签连接、与His-SUMO3标签连接等，进行融合和表达。
SUMO3融合标签氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
野生型粘质沙雷氏菌核酸酶氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2；不含其第1～21位的信号肽序列)：
本发明人将SUMO3标签蛋白的第92位(SEQ ID NO:1中第102位)甘氨酸后连接粘质沙雷氏菌核酸酶的第22位天冬氨酸(未含第1-21的信号肽，也即SEQ ID NO:2的第1位)，并在N端添加His标签(6XHis)，获得His-SUMO3-Nuclease，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：
SEQ ID NO:3中，第1～2位“MG”作为翻译起始氨基酸，GS用于连接His-tag与SUMO3-tag，增加各组分的灵活性。6XHis位于第3～8位；SUMO3位于第11～102位，之后为粘质沙雷氏菌核酸酶序列。
His-SUMO3-Nuclease的碱基序列如下(SEQ ID NO:4)：
ATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCCCTGCAGGAGGAGAAGCCCAAGGAGGGTGTGAAGACAGAGAATGACCACATCAACCTGAAGGTGGCCGGGCAGGACGGCTCCGTGGTGCAGTTCAAGATCAAGAGGCACACGCCGCTGAGCAAGCTGATGAAGGCCTACTGCGAGAGGCAGGGCTTGTCAATGAGGCAGATCAGATTCAGGTTCGACGGGCAGCCAATCAATGAAACTGACACTCCAGCACAGCTGGAGATGGAGGACGAGGACACCATCGACGTGTTCCAGCAGCAGACGGGCGGAGATACCCTGGAAAGCATTGATAATTGCGCAGTGGGCTGTCCGACCGGTGGTAGCAGCAATGTGAGCATTGTGCGCCATGCATATACCCTGAATAATAATAGCACCACCAAATTTGCCAATTGGGTTGCCTATCATATTACCAAAGATACCCCGGCCAGTGGCAAAACCCGCAATTGGAAAACCGATCCGGCACTGAATCCGGCCGATACCCTGGCACCGGCCGATTATACCGGCGCCAATGCCGCCCTGAAAGTTGATCGTGGTCATCAGGCACCGCTGGCCAGTCTGGCCGGTGTGAGCGATTGGGAAAGTCTGAATTATCTGAGCAATATTACCCCGCAGAAAAGCGATCTGAATCAGGGCGCATGGGCCCGCCTGGAAGATCAGGAACGCAAACTGATTGATCGTGCCGATATTAGCAGTGTTTATACCGTGACCGGTCCGCTGTATGAACGTGATATGGGCAAACTGCCGGGCACCCAGAAAGCCCATACCATTCCGAGCGCATATTGGAAAGTTATTTTTATTAACAACAGCCCGGCAGTGAATCATTATGCAGCCTTTCTGTTTGATCAGAATACCCCGAAAGGTGCCGATTTTTGTCAGTTTCGCGTTACCGTGGATGAAATTGAAAAACGCACCGGTCTGATTATTTGGGCCGGCCTGCCGGATGATGTTCAGGCCAGCCTGAAAAGTAAACCGGGTGTTCTGCCGGAACTGATGGGCTGTAAAAATTAA
同时，本发明人也在His标签后直接连接粘质沙雷氏菌核酸酶的第22位天冬氨酸(未含第1-21的信号肽)，获得His-Nuclease(SEQ ID NO:5)：
His-Nuclease碱基序列(SEQ ID NO:6)：
ATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCCGATACCCTGGAAAGCATTGATAATTGCGCAGTGGGCTGTCCGACCGGTGGTAGCAGCAATGTGAGCATTGTGCGCCATGCATATACCCTGAATAATAATAGCACCACCAAATTTGCCAATTGGGTTGCCTATCATATTACCAAAGATACCCCGGCCAGTGGCAAAACCCGCAATTGGAAAACCGATCCGGCACTGAATCCGGCCGATACCCTGGCACCGGCCGATTATACCGGCGCCAATGCCGCCCTGAAAGTTGATCGTGGTCATCAGGCACCGCTGGCCAGTCTGGCCGGTGTGAGCGATTGGGAAAGTCTGAATTATCTGAGCAATATTACCCCGCAGAAAAGCGATCTGAATCAGGGCGCATGGGCCCGCCTGGAAGATCAGGAACGCAAACTGATTGATCGTGCCGATATTAGCAGTGTTTATACCGTGACCGGTCCGCTGTATGAACGTGATATGGGCAAACTGCCGGGCACCCAGAAAGCCCATACCATTCCGAGCGCATATTGGAAAGTTATTTTTATTAACAACAGCCCGGCAGTGAATCATTATGCAGCCTTTCTGTTTGATCAGAATACCCCGAAAGGTGCCGATTTTTGTCAGTTTCGCGTTACCGTGGATGAAATTGAAAAACGCACCGGTCTGATTATTTGGGCCGGCCTGCCGGATGATGTTCAGGCCAGCCTGAAAAGTAAACCGGGTGTTCTGCCGGAACTGATGGGCTGTAAAAATTAA
人工全基因合成方式获得上述各个融合的碱基序列，经T4 DNA连接酶插入到pET28a载体中，常规方法转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
表达方法：在LB培养基中按照1:100的比例接种过夜培养的细菌种子，220rpm，37℃培养，待OD600达到0.6-1.0时加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，继续培养12小时表达包涵体蛋白，破碎细菌提取包涵体，包涵体经过清洗液(50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.15MNaCl，0.1％Triton-X 100)洗涤后，包涵体被溶解液(8M尿素，10mM DTT)溶解后滴加到不断搅拌的复性液(1M L-精氨酸，100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.0，5mM还原型谷胱甘肽(GSH)或者半胱氨酸(Cysteine)，5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)或者胱氨酸(Cystine)，15％甘油，50mM氯化镁)中复性，室温静置4-12小时蛋白充分复性后，经过SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)柱上酶切过夜后，收集的流穿液即为最终纯化得到的重组粘质沙雷氏菌核酸酶，其氨基酸序列与天然沙雷氏菌的核酸内切酶相同，不带有任何多余氨基酸。
表达纯化的示意图如图1所示。
蛋白复性率的测定方法：取37μg鲱鱼精DNA(herring sperm DNA)，加入1ug重组粘质沙雷氏菌核酸酶，每1分钟检测A260吸光值并记录，共30个循环，计算其斜率后，带入标准品粘质沙雷氏菌核酸酶制作的标准曲线，即可换算出具有活性的重组粘质沙雷氏菌核酸酶质量，其除以加入的重组粘质沙雷氏菌核酸酶总量，其比值即为重组粘质沙雷氏菌核酸酶蛋白复性率。
同时表达His标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶(His-Nuclease)、SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶(His-SUMO3-Nuclease)，获得包涵体蛋白，取相同质量的包涵体蛋白分别用相同溶解液、复性液进行重组蛋白的重折叠，SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的蛋白复性率高于His标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶约3倍(图3)。
因此可见，利用His-SUMO3表达标签来进行粘质沙雷氏菌核酸酶的重组表达，效果出乎意料。
同时，由于实现了包涵体表达，屏蔽了粘质沙雷氏菌核酸酶作为蛋白酶水解宿主细胞中的基因组的情况，降低了重组粘质沙雷氏菌核酸酶对大肠杆菌细胞的毒性。
实施例2、重组粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体复性的优化
根据实施例1，选择His-SUMO3表达标签来进行粘质沙雷氏菌核酸酶的重组表达。为了进一步提高其复性率以及表达效率，本发明人进一步进行优化。
本发明人首先研究了粘质沙雷氏菌核酸酶的蛋白序列，包括分析其三级结构，以期找到提高其性能的突变点。经过多位点的分析改造以及实验验证，实验结果中没有发现能够有效提高包涵体复性率的位点。
之后，本发明人尝试进行His-SUMO3表达标签的改造，对His-SUMO3中多个位点进行了研究分析和实验验证。结果发现，SUMO3序列中第47位的Cys突变为Ser(C47S)，可以显著地提高粘质沙雷氏菌核酸酶的表达效率，其复性率有显著提高。
突变后的SUMO序列如下(SEQ ID NO:7)：
C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶(His-SUMO3-S-Nuclease)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:8)：
其中，SUMO序列的第47位的Cys突变为Ser，即SUMO3-S(1-92aa)；第103位至第347位为粘质沙雷氏菌核酸酶，即Nuclease(22-266aa)。
C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的碱基序列(SEQ ID NO:9)：
atgggtcatcaccatcatcatcacgggtccctgcaggaggagaagcccaaggagggtgtgaagacagagaatgaccacatcaacctgaaggtggccgggcaggacggctccgtggtgcagttcaagatcaagaggcacacgccgctgagcaagctgatgaaggcctactcagagaggcagggcttgtcaatgaggcagatcagattcaggttcgacgggcagccaatcaatgaaactgacactccagcacagctggagatggaggacgaggacaccatcgacgtgttccagcagcagacgggcggagataccctggaaagcattgataattgcgcagtgggctgtccgaccggtggtagcagcaatgtgagcattgtgcgccatgcatataccctgaataataatagcaccaccaaatttgccaattgggttgcctatcatattaccaaagataccccggccagtggcaaaacccgcaattggaaaaccgatccggcactgaatccggccgataccctggcaccggccgattataccggcgccaatgccgccctgaaagttgatcgtggtcatcaggcaccgctggccagtctggccggtgtgagcgattgggaaagtctgaattatctgagcaatattaccccgcagaaaagcgatctgaatcagggcgcatgggcccgcctggaagatcaggaacgcaaactgattgatcgtgccgatattagcagtgtttatac cgtgaccggtccgctgtatgaacgtgatatgggcaaactgccgggcacccagaaagcccataccattccgagcgcatattggaaagttatttttattaacaacagcccggcagtgaatcattatgcagcctttctgtttgatcagaataccccgaaaggtgccgatttttgtcagtttcgcgttaccgtggatgaaattgaaaaacgcaccggtctgattatttgggccggcctgccggatgatgttcaggccagcctgaaaagtaaaccgggtgttctgccggaactgatgggctgtaaaaattaa
按照实施例1同样的方法，人工全基因合成方式获得上述各个融合的碱基序列，经T4 DNA连接酶插入到pET28a载体中，得到用于表达C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的pET28a-SUMO3-S-Nuclease质粒。
常规方法将上述质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株。按照实施例1同样的方法进行表达、变复性。以His-SUMO3-S-Nuclease表达的粘质沙雷氏菌核酸酶的包涵体蛋白复性率见表1。
表1
| 包涵体蛋白复性率 | |
| His-SUMO3-Nuclease | 30.2％ |
| His-SUMO3-S-Nuclease | 39.7％ |
根据表1，突变后粘质沙雷氏菌核酸酶的包涵体蛋白复性率发生显著地提高。申请人分析认为，改造后的SUMO3标签能在复性过程中帮助粘质沙雷氏菌核酸酶三维结构的正确折叠，提高重组粘质沙雷氏菌核酸酶的复性率，提高重组蛋白产量。
实施例3、不同菌株、诱导温度、IPTG浓度和诱导表达时间对C47S突变改造SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白表达量的影响
将pET28a-SUMO3-S-Nuclease质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，JM109(DE3)和OrigamiB(DE3)菌株中，在其它表达条件相同的情况下BL21(DE3)菌株获得的包涵体蛋白量最多。
在其它表达条件相同的情况下，采用25、30、32和37℃诱导重组蛋白表达，37℃获得的包涵体蛋白最多。
在其它表达条件相同的情况下，采用0.1、0.25、0.5和1mM IPTG诱导蛋白表达，0.5mM IPTG获得的包涵体蛋白量最多。
在其它表达条件相同的情况下，诱导表达时间为2、4、6、8、12、16和24小时，诱导表达12小时包涵体蛋白产量达到顶峰，更长的诱导表达时间包涵体产量也不会增多。
综上结果，最佳效果组合：BL21(DE3)菌株，诱导温度37℃，0.5mM IPTG，诱导12小时表达C47S突变改造SUMO3标签融合的粘质沙雷氏菌核酸酶包涵体蛋白(图4)。
实施例4、C47S突变改造SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的纯化方法
在包涵体蛋白复性后，将C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶的复性液经过平衡液(10mM Tris pH7.4,300mM NaCl)预平衡的镍亲和层析树脂(BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin)，之后向纯化柱中加入适量SUMO特异性蛋白酶2(SENP2)，于室温酶切过夜，切除改造的SUMO3标签，再次用平衡液(10mM Tris pH7.4,300mM NaCl)冲洗镍亲和层析树脂，该步骤的流穿液即为纯化完成的重组粘质沙雷氏菌核酸酶(图5)，其氨基酸序列与天然沙雷氏菌的核酸内切酶相同，不含有任何多余氨基酸。
C47S突变改造的SUMO3标签蛋白与来自于粘质沙雷氏菌的核酸内切酶氨基酸序列连接方式示意图如图2。
本发明最终纯化得到的重组粘质沙雷氏菌核酸酶酶活检测见图6。其能有效降解DNA(质粒DNA)，即使低至10-4U的酶用量下，降解效果仍然良好。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海碧云天生物技术有限公司
<120> 一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法
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<400> 1
Leu Gln Glu Glu Lys Pro Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His
1 5 10 15
Ile Asn Leu Lys Val Ala Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys
20 25 30
Ile Lys Arg His Thr Pro Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Cys Glu
35 40 45
Arg Gln Gly Leu Ser Met Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln
50 55 60
Pro Ile Asn Glu Thr Asp Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ile Asp Val Phe Gln Gln Gln Thr Gly Gly
85 90
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)
<400> 2
Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val Gly Cys Pro Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala Tyr Thr Leu Asn Asn
20 25 30
Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala Tyr His Ile Thr Lys
35 40 45
Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp Lys Thr Asp Pro Ala
50 55 60
Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala Pro Leu Ala Ser Leu
85 90 95
Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr Leu Ser Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp Ala Arg Leu Glu Asp
115 120 125
Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile Ser Ser Val Tyr Thr
130 135 140
Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly Lys Leu Pro Gly Thr
145 150 155 160
Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp Lys Val Ile Phe Ile
165 170 175
Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala Phe Leu Phe Asp Gln
180 185 190
Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe Arg Val Thr Val Asp
195 200 205
Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Asp
210 215 220
Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly Val Leu Pro Glu Leu
225 230 235 240
Met Gly Cys Lys Asn
245
<210> 3
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(347)
<223> His-SUMO3-Nuclease
<400> 3
Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Glu Glu Lys Pro
1 5 10 15
Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His Ile Asn Leu Lys Val Ala
20 25 30
Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys Ile Lys Arg His Thr Pro
35 40 45
Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Cys Glu Arg Gln Gly Leu Ser Met
50 55 60
Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln Pro Ile Asn Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu Asp Thr Ile Asp Val Phe
85 90 95
Gln Gln Gln Thr Gly Gly Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala
100 105 110
Val Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His
115 120 125
Ala Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val
130 135 140
Ala Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn
145 150 155 160
Trp Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala
165 170 175
Asp Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln
180 185 190
Ala Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn
195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala
210 215 220
Trp Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp
225 230 235 240
Ile Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met
245 250 255
Gly Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr
260 265 270
Trp Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala
275 280 285
Ala Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln
290 295 300
Phe Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile
305 310 315 320
Trp Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro
325 330 335
Gly Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn
340 345
<210> 4
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1044)
<223> His-SUMO3-Nuclease
<400> 4
atgggtcatc accatcatca tcacgggtcc ctgcaggagg agaagcccaa ggagggtgtg 60
aagacagaga atgaccacat caacctgaag gtggccgggc aggacggctc cgtggtgcag 120
ttcaagatca agaggcacac gccgctgagc aagctgatga aggcctactg cgagaggcag 180
ggcttgtcaa tgaggcagat cagattcagg ttcgacgggc agccaatcaa tgaaactgac 240
actccagcac agctggagat ggaggacgag gacaccatcg acgtgttcca gcagcagacg 300
ggcggagata ccctggaaag cattgataat tgcgcagtgg gctgtccgac cggtggtagc 360
agcaatgtga gcattgtgcg ccatgcatat accctgaata ataatagcac caccaaattt 420
gccaattggg ttgcctatca tattaccaaa gataccccgg ccagtggcaa aacccgcaat 480
tggaaaaccg atccggcact gaatccggcc gataccctgg caccggccga ttataccggc 540
gccaatgccg ccctgaaagt tgatcgtggt catcaggcac cgctggccag tctggccggt 600
gtgagcgatt gggaaagtct gaattatctg agcaatatta ccccgcagaa aagcgatctg 660
aatcagggcg catgggcccg cctggaagat caggaacgca aactgattga tcgtgccgat 720
attagcagtg tttataccgt gaccggtccg ctgtatgaac gtgatatggg caaactgccg 780
ggcacccaga aagcccatac cattccgagc gcatattgga aagttatttt tattaacaac 840
agcccggcag tgaatcatta tgcagccttt ctgtttgatc agaatacccc gaaaggtgcc 900
gatttttgtc agtttcgcgt taccgtggat gaaattgaaa aacgcaccgg tctgattatt 960
tgggccggcc tgccggatga tgttcaggcc agcctgaaaa gtaaaccggg tgttctgccg 1020
gaactgatgg gctgtaaaaa ttaa 1044
<210> 5
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(255)
<223> His-Nuclease
<400> 5
Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Thr Leu Glu Ser Ile
1 5 10 15
Asp Asn Cys Ala Val Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser
20 25 30
Ile Val Arg His Ala Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe
35 40 45
Ala Asn Trp Val Ala Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly
50 55 60
Lys Thr Arg Asn Trp Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr
65 70 75 80
Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp
85 90 95
Arg Gly His Gln Ala Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp
100 105 110
Glu Ser Leu Asn Tyr Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu
115 120 125
Asn Gln Gly Ala Trp Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile
130 135 140
Asp Arg Ala Asp Ile Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr
145 150 155 160
Glu Arg Asp Met Gly Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile
165 170 175
Pro Ser Ala Tyr Trp Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val
180 185 190
Asn His Tyr Ala Ala Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala
195 200 205
Asp Phe Cys Gln Phe Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr
210 215 220
Gly Leu Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu
225 230 235 240
Lys Ser Lys Pro Gly Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn
245 250 255
<210> 6
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(768)
<223> His-Nuclease
<400> 6
atgggtcatc accatcatca tcacgggtcc gataccctgg aaagcattga taattgcgca 60
gtgggctgtc cgaccggtgg tagcagcaat gtgagcattg tgcgccatgc atataccctg 120
aataataata gcaccaccaa atttgccaat tgggttgcct atcatattac caaagatacc 180
ccggccagtg gcaaaacccg caattggaaa accgatccgg cactgaatcc ggccgatacc 240
ctggcaccgg ccgattatac cggcgccaat gccgccctga aagttgatcg tggtcatcag 300
gcaccgctgg ccagtctggc cggtgtgagc gattgggaaa gtctgaatta tctgagcaat 360
attaccccgc agaaaagcga tctgaatcag ggcgcatggg cccgcctgga agatcaggaa 420
cgcaaactga ttgatcgtgc cgatattagc agtgtttata ccgtgaccgg tccgctgtat 480
gaacgtgata tgggcaaact gccgggcacc cagaaagccc ataccattcc gagcgcatat 540
tggaaagtta tttttattaa caacagcccg gcagtgaatc attatgcagc ctttctgttt 600
gatcagaata ccccgaaagg tgccgatttt tgtcagtttc gcgttaccgt ggatgaaatt 660
gaaaaacgca ccggtctgat tatttgggcc ggcctgccgg atgatgttca ggccagcctg 720
aaaagtaaac cgggtgttct gccggaactg atgggctgta aaaattaa 768
<210> 7
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(92)
<223> 突变后的SUMO
<400> 7
Leu Gln Glu Glu Lys Pro Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His
1 5 10 15
Ile Asn Leu Lys Val Ala Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys
20 25 30
Ile Lys Arg His Thr Pro Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Ser Glu
35 40 45
Arg Gln Gly Leu Ser Met Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln
50 55 60
Pro Ile Asn Glu Thr Asp Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ile Asp Val Phe Gln Gln Gln Thr Gly Gly
85 90
<210> 8
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(347)
<223> His-SUMO3-S-Nuclease
<400> 8
Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Glu Glu Lys Pro
1 5 10 15
Lys Glu Gly Val Lys Thr Glu Asn Asp His Ile Asn Leu Lys Val Ala
20 25 30
Gly Gln Asp Gly Ser Val Val Gln Phe Lys Ile Lys Arg His Thr Pro
35 40 45
Leu Ser Lys Leu Met Lys Ala Tyr Ser Glu Arg Gln Gly Leu Ser Met
50 55 60
Arg Gln Ile Arg Phe Arg Phe Asp Gly Gln Pro Ile Asn Glu Thr Asp
65 70 75 80
Thr Pro Ala Gln Leu Glu Met Glu Asp Glu Asp Thr Ile Asp Val Phe
85 90 95
Gln Gln Gln Thr Gly Gly Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala
100 105 110
Val Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His
115 120 125
Ala Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val
130 135 140
Ala Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn
145 150 155 160
Trp Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala
165 170 175
Asp Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln
180 185 190
Ala Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn
195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala
210 215 220
Trp Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp
225 230 235 240
Ile Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met
245 250 255
Gly Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr
260 265 270
Trp Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala
275 280 285
Ala Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln
290 295 300
Phe Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile
305 310 315 320
Trp Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro
325 330 335
Gly Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn
340 345
<210> 9
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1044)
<223> C47S突变改造的SUMO3标签融合粘质沙雷氏菌核酸酶
<400> 9
atgggtcatc accatcatca tcacgggtcc ctgcaggagg agaagcccaa ggagggtgtg 60
aagacagaga atgaccacat caacctgaag gtggccgggc aggacggctc cgtggtgcag 120
ttcaagatca agaggcacac gccgctgagc aagctgatga aggcctactc agagaggcag 180
ggcttgtcaa tgaggcagat cagattcagg ttcgacgggc agccaatcaa tgaaactgac 240
actccagcac agctggagat ggaggacgag gacaccatcg acgtgttcca gcagcagacg 300
ggcggagata ccctggaaag cattgataat tgcgcagtgg gctgtccgac cggtggtagc 360
agcaatgtga gcattgtgcg ccatgcatat accctgaata ataatagcac caccaaattt 420
gccaattggg ttgcctatca tattaccaaa gataccccgg ccagtggcaa aacccgcaat 480
tggaaaaccg atccggcact gaatccggcc gataccctgg caccggccga ttataccggc 540
gccaatgccg ccctgaaagt tgatcgtggt catcaggcac cgctggccag tctggccggt 600
gtgagcgatt gggaaagtct gaattatctg agcaatatta ccccgcagaa aagcgatctg 660
aatcagggcg catgggcccg cctggaagat caggaacgca aactgattga tcgtgccgat 720
attagcagtg tttataccgt gaccggtccg ctgtatgaac gtgatatggg caaactgccg 780
ggcacccaga aagcccatac cattccgagc gcatattgga aagttatttt tattaacaac 840
agcccggcag tgaatcatta tgcagccttt ctgtttgatc agaatacccc gaaaggtgcc 900
gatttttgtc agtttcgcgt taccgtggat gaaattgaaa aacgcaccgg tctgattatt 960
tgggccggcc tgccggatga tgttcaggcc agcctgaaaa gtaaaccggg tgttctgccg 1020
gaactgatgg gctgtaaaaa ttaa 1044
Claims (12)
1.一种制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶的方法，包括：将粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸与突变型SUMO3标签的编码核酸进行融合表达，分离获得粘质沙雷氏菌核酸酶；其中，所述突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，融合表达时，所述的突变型SUMO3标签位于N端，所述粘质沙雷氏菌核酸酶位于C端；和/或
所述的突变型SUMO3标签的N端，还包括His标签；和/或
所述突变型SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
所述的粘质沙雷氏菌核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在原核细胞或真核细胞中表达；较佳地，所述的原核细胞包括：大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌进行表达，诱导温度37±2℃，0.5±0.2mMIPTG，诱导表达12±4小时。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌进行表达，获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤；较佳地，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述粘质沙雷氏菌核酸酶；更佳地，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述清洗液包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100；和/或
所述溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM二硫苏糖醇；和/或
所述复性液包括：0.2-2M L-精氨酸，10-200mM三羟甲基氨基甲烷pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽或半胱氨酸，1-10mM氧化型谷胱甘肽或胱氨酸，1-20％(v/v)甘油，10-50mM氯化镁。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述包涵体蛋白复性后，上样至亲和层析柱，柱上切除位于粘质沙雷氏菌核酸酶N端前的区段，收集含有粘质沙雷氏菌核酸酶的流穿液，纯化得到的有活性的粘质沙雷氏菌核酸酶。
8.一种突变型SUMO3标签，其第47位由Cys突变为Ser；较佳地，所述突变型SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
9.一种表达构建体，其中包含权利要求8所述的突变型SUMO3标签的编码核酸；较佳地，其中还包含与所述突变型SUMO3标签操作性连接的粘质沙雷氏菌核酸酶的编码核酸；更佳地，所述的突变型SUMO3标签位于N端，所述粘质沙雷氏菌核酸酶位于C端；和/或，所述的突变型SUMO3标签的N端，还包括His标签。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的表达构建体；较佳地，该宿主细胞为原核细胞或真核细胞；较佳地，所述的原核细胞包括：大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
11.权利要求8所述的突变型SUMO3标签、权利要求9所述的表达构建体或权利要求10所述的宿主细胞的应用，用于制备重组粘质沙雷氏菌核酸酶，提高其包涵体蛋白复性率。
12.一种用于重组表达外源蛋白的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求8所述的突变型SUMO3标签、权利要求9所述的表达构建体或权利要求10所述的宿主细胞；较佳地，其中还包括选自下组的试剂：
SUMO蛋白水解酶，较佳地为SUMO特异性蛋白酶2；
清洗液，较佳地其包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1％Triton X-100；和/或
溶解液，较佳地其包括：6-8M尿素，5-50mM二硫苏糖醇；和/或
复性液，较佳地其包括：0.2-2M L-精氨酸，10-200mM三羟甲基氨基甲烷pH8.0，1-10mM还原型谷胱甘肽或半胱氨酸，1-10mM氧化型谷胱甘肽或胱氨酸，1-20％(v/v)甘油，10-50mM氯化镁。
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|---|---|
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