CN113388009A - 一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用。所述标签蛋白为如下A1)或A2)或A3)所示的蛋白质：A1)氨基酸序列为SEQID NO.2的蛋白质；A2)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.2同一性在70％或以上，且与A1)具有相同功能的蛋白质；A3)由A1)和/或A2)进行串联重复、拼接、融合或截短而生成的且与A1)具有相同功能的蛋白质。所述标签蛋白通用性广、助溶性强、分子量适中，可以提高蛋白异源表达的溶解性及活性。

Description

一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用

技术领域

本申请涉及一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用，属于生物技术领域。

背景技术

原核表达是最便利、最经济快速获得大量活性蛋白的方法，然而其应用也有很多限制。比如缺少修饰、需要去除内毒素、外源蛋白易降解、表达中很多蛋白不能很好的折叠从而严重聚集或者产生包涵体等，其中包涵体或可溶性差是最为棘手的问题。包涵体的产生一般是因为蛋白表达过程中没有很好的折叠、疏水区暴露从而引起大量聚集产生沉淀，表达出的目标蛋白为无活性的不溶性颗粒。最近也有研究表明在大量聚集后有β淀粉样蛋白结构从聚集中产生，并导致决定性的包涵体。

为了解决包涵体问题人们已经采取了许多办法，如降低表达速度、加入额外的分子伴侣共表达、添加信号肽分泌表达、包涵体变复性、开发助溶标签与目标蛋白融合表达等，目前常用的标签蛋白有GST、Trx、Sumo、MBP、NusA等。然而，上面介绍的几种目前主流的标签在助溶效果上很不相同，且都各有其他方面的优缺点，还有一些蛋白使用主流助溶标签都无明显效果。因此急需开发新的助溶标签，这种新的助溶标签不仅具有显著的助溶效果而且具有较高的普适性、分子量还不能太大以免影响目标蛋白产量。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种标签蛋白，所述标签蛋白通用性广、助溶性强、分子量适中，可以提高蛋白异源表达的溶解性及活性。

一种标签蛋白，所述标签蛋白为如下A1)或A2)或A3)所示的蛋白质：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；

A2)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.2同一性在70％或以上，且与A1)具有相同功能的蛋白质；

A3)由A1)和/或A2)进行拼接而生成的且与A1)具有相同功能的蛋白质。

上述标签蛋白中，所述同一性在70％或以上可为同一性在70％、73％、75％、78％、80％、81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％或99％以上，或同一性为100％。

可选地，所述标签蛋白具有在蛋白异源表达中提高目标蛋白溶解性和/或活性的功能。

根据本申请的另一个方面，提供一种DNA分子，所述DNA分子编码上述任一项所述的标签蛋白。

可选地，所述DNA分子为如下a1)或a2)或a3)或4)所示的DNA分子；

a1)编码区包括SEQ ID NO.4的DNA分子；

a2)核苷酸序列是SEQ ID NO.4的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有70％或以上同一性，且编码权上述任一项所述标签蛋白的DNA分子；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述任一项所述标签蛋白的DNA分子。

在上述DNA分子中，所述具有70％或以上同一性可为具有至少70％、73％、75％、78％、80％、81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

所述严格条件是在2×SSC(柠檬酸钠缓冲液)，0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

根据本申请的另一个方面，提供一种重组载体，所述重组载体含上述任一项所述的DNA分子。

可选地，所述重组载体为利用上述任一项所述的DNA分子改造的PET质粒。

根据本申请的另一个方面，提供B1)或B2)在蛋白异源表达中提高目标蛋白溶解性和/或活性的应用；

所述B1)为上述任一项所述的标签蛋白、上述任一项所述的DNA分子、上述任一项所述的重组载体；

所述B2)为标签蛋白’，所述标签蛋白’的氨基酸序列与上述任一项所述的标签蛋白的氨基酸序列互为反向；

或所述B2)为DNA分子’，所述DNA分子’编码标签蛋白’；

或所述B2)为重组载体’，所述重组载体’含有DNA分子’。

可选地，所述标签蛋白’为如下A1’)或A2’)或A3’)所示的蛋白质：

A1’)氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；

A2’)氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基得到的，与SEQ ID NO.1同一性在70％或以上，且与A1’)具有相同功能的蛋白质；

A3’)由A1)、A2)、A1’)、A2’)中的至少一种进行拼接而生成的且与A1)或A1’)具有相同功能的蛋白质；

所述DNA分子’为如下a1’)或a2’)或a3’)或a4’)所示的DNA分子；

a1’)编码区包括SEQ ID NO.3的DNA分子；

a2’)核苷酸序列是SEQ ID NO.3的DNA分子；

a3’)与a1’)或a2’)限定的核苷酸序列具有70％或以上同一性，且编码标签蛋白’的DNA分子；

a4’)在严格条件下与a1’)或a2’)限定的核苷酸序列杂交，且编码标签蛋白’的DNA分子。

上述标签蛋白’中，所述同一性在70％或以上可为同一性在70％、73％、75％、78％、80％、81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％或99％以上，或同一性为100％。

在上述DNA分子’中，所述具有70％或以上同一性可为具有至少70％、73％、75％、78％、80％、81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

可选地，所述重组载体’为利用DNA分子’改造的PET质粒。

可选地，所述蛋白异源表达所利用的表达系统选自无细胞表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统中的任一种。

可选地，所述目标蛋白选自Chrono(115-306)、Notch2NL(1-210)、Nclu、NbALFA、CUA63106、BdNEDP1中的任一种。

可选地，所述标签蛋白’具有在蛋白异源表达中提高目标蛋白溶解性和/或活性的功能。

作为一个实施方案，本申请提供一种与目标蛋白一起融合表达的新的助溶蛋白标签AXX、XXA及它们的衍生蛋白，本发明公开的标签蛋白分子量不太大并具有显著的助溶效果和较高的普适性。

作为一个实施方案，本申请开发一种通用性广、助溶性强、分子量适中的新型标签蛋白，以提高蛋白异源表达的溶解性及活性。具体采用如下的技术方案：

本申请提供了可以提高目标蛋白可溶性及活性的标签蛋白，标签蛋白可以是如下的蛋白:

(a)序列为SEQ ID NO.1的蛋白，命名为AXX。

(b)序列为SEQ ID NO.2的蛋白，命名为XXA。

(c)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2经过若干个氨基酸缺失、插入、取代、截短等操作衍生的和AXX或XXA同源度在百分之70以上，并且也具有显著促进融合蛋白和目标蛋白溶解性及活性的标签蛋白。

(d)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或它们的衍生蛋白经过串联重复或间隔重复产生的标签蛋白。

将可以表达出本发明所涉及标签蛋白的基因序列，克隆进蛋白表达载体的多克隆位点中，将所需或感兴趣的目标蛋白基因序列克隆进同一个多克隆位点中，将标签蛋白和目标蛋白进行融合表达。

待表达结束后，采用合适的条件和方法对融合蛋白进行纯化，纯化后可选的对融合蛋白进行酶切，以选择去除标签蛋白或不去除标签蛋白。

作为一个实施方案，本申请提供了一种能表达出AXX标签蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO.3，提供了一种能表达出XXA标签蛋白的基因，其序列为SEQ ID NO.4。易于理解，由于密码子的简并性还有其他基因序列能表达出本专利公开的标签蛋白，故其他可表达本专利公开的标签蛋白的基因序列也在本专利的保护范围之内。

作为一个实施方案，本申请提供了2种改造过的PET系列质粒，其多克隆位点分别已经插入了SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，分别称为PET-AXX和PET-XXA。其中PET-XXA中还插入了8还插入了标签、Flag标签、HRV-3C蛋白酶切位点。PET-AXX和PET-XXA中都预留了目标蛋白基因插入的位点，PET-XXA多克隆位点的概览如附图1所示。易于理解，所提供的质粒只是为了提供标签蛋白的使用方法，其他含有本发明所公开标签蛋白基因的表达质粒也在本发明的保护之内。

本申请优选地提供了PET-XXA表达载体，并在大肠杆菌中进行目的蛋白的融合表达，所述的目的蛋白并无限制。值得注意的是本申请选择大肠杆菌进行融合蛋白表达只是为了更直观明显的展示标签蛋白的优异性能，利用其他蛋白表达系统并使用本申请标签蛋白进行融合蛋白表达也在本申请保护范围之内。其他表达系统是指包括而不限于以下的表达系统：无细胞表达系统、其他原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等。

本发明实施例中采用如下的目标蛋白进行助溶标签蛋白AXX和XXA的效果展示:

Chrono(115-306):来源于Homo sapiens；

Notch2NL(1-210):来源于Homo sapiens；

Nclu:来源于Homo sapiens；

NbALFA:ALFA标签的一种驼源纳米抗体；

CUA63106:来源于Escherichia coli；

BdNEDP1:来源于Brachypodium distachyon(二穗短柄草)。

以上这些目标蛋白大肠杆菌表达时均为难溶的包涵体，其中对照组实验中的Chrono(115-306)带GST标签融合表达、Notch2NL(1-210)带Trx标签融合表达、Nclu带NusA标签融合表达、NbALFA带Sumo标签融合表达、CUA63106带MBP标签融合表达、BdNEDP1带His标签表达。对照组表达的蛋白均为包涵体，全部位于沉淀中或绝大部分位于沉淀中。

本申请公开的基因SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，全基因合成自无锡青兰生物公司。

同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本申请中英文/缩写说明如下：

Chrono(115-306):Chrono蛋白的第115至第306氨基酸片段

Homo sapiens：智人

Notch2NL(1-210):Notch2NL蛋白的第1至第210氨基酸片段

Nclu:Clu蛋白的核定位形式

NbALFA:ALFA标签的一种纳米抗体(nanobody)

CUA63106:此蛋白对应的NCBI官方ACCESSION号码

Escherichia coli；大肠杆菌

BdNEDP1:来源于二穗短柄草的酶NEDP1

Brachypodium distachyon：二穗短柄草；

IPTG：表达诱导剂，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

Binding Buffer：结合缓冲液

Wash Buffer：洗杂缓冲液

Elution Buffer：目的蛋白洗脱缓冲液

SDS-PAGE电泳：十二烷基磺酸钠变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本申请所提供的标签蛋白及其应用，具有普适性、通用性广、助溶性强、分子量适中，且可显著性的提高蛋白表达的溶解性与活性。

(2)本申请所提供的标签蛋白及其应用，可短时大量的获得可溶性目标蛋白，可以选择性的切除标签蛋白并且标签去除后，目标蛋白依然可溶并具有活性。

(3)本申请所提供的标签蛋白及其应用，具有简单的融合蛋白克隆构建方法、传统的表达纯化方法、良好的表达系统可移植性等特点，都意味着本申请公开的标签蛋白在科学研究、工业生产、医药开发中将有深远影响和光明前景。

(4)本申请所提供的标签蛋白及其应用，解决了包涵体蛋白的原核可溶表达，避免了更高成本的真核表达和繁琐、低重复性的包涵体变复性操作。

(5)本申请所提供的标签蛋白及其应用，极大地提升了蛋白重组表达的可溶性、广泛性和简便性，预计将在基础科学研究、工业生产和医药开发中发挥重要作用。

附图说明

图1是pET-XXA载体多克隆位点的概图。

图2是XXA标签对包涵体Chrono(115-306)的助溶效果。

图3是XXA标签对包涵体Notch2NL(1-210)的助溶效果。

图4为XXA标签对包涵体nClu的助溶效果。

图5为XXA标签对包涵体NbALFA的助溶效果。

图6为XXA标签对包涵体CUA63106的助溶效果。

图7为XXA标签对包涵体BdNEDP1的助溶效果。

图8为Chrono(115-306)-XXA融合蛋白的酶切，酶切去除标签后Chrono(115-306)依然为可溶上清。

图9为由包涵体转为上清的BdNEDP1的活性实验展示。

图10为AXX标签对Chrono(115-306)、Notch2NL(1-210)及nClu的助溶效果。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。

其中，pET系列载体购自Novagen，pCold系列载体购自TaKaRa，pGEX系列载体购自GE Healthcare。

本申请采用双酶切法进行克隆构建，所涉及的限制性内切酶为BamH1、Ecor1、Xho1、Hind3，涉及的限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq酶及Pfu酶均购自TaKaRa公司。

本申请采用BL21(DE3)菌株表达蛋白、采用XL1blue菌株进行克隆构建、采用pGex6p1、pET32b、pET50b、pET28sumo、pColdMBP、pColdⅠ等载体进行对照表达实验。测序工作由福州铂尚公司完成，感受态细胞均为本实验室同一批次制作，制作方法参见中科院福建物质结构研究所赵剑锋博士学位论文《高尔基体堆叠蛋白GRASP55-Golgin45复合物结构及其相互作用的研究》。

除蛋白CUA63106为25度表达12h外，其余目标蛋白均优选的在16度表达24h，对照组中带有其他标签的融合蛋白表达纯化条件与相应的实验组融合蛋白表达纯化条件保持一致(实验组指带有本发明公开标签的融合蛋白)。培养基均使用LB培养基，诱导剂IPTG浓度为0.3mM。蛋白纯化中Binding Buffer的组成为：50mMTris-HCl PH8.0，300mMKCl，5％甘油；Wash Buffer的组成为：50mMTris-HCl PH8.0，300mMKCl，5％甘油，60mM咪唑；ElutionBuffer的组成为：50mMTris-HCl PH8.0，300mMKCl，5％甘油，500mM咪唑。破碎均在冰水混合物上完成，纯化均在6℃冷室完成，蛋白酶切均在4℃冰箱完成。HRV-3C蛋白酶、TEV蛋白酶、BdNEDP1的底物bdNEDD1均为本实验室自制，制作方法为将bdNEDD1蛋白的C端底物区域序列插入到无关蛋白的N端，融合表达并采用镍柱纯化；

HRV3C蛋白酶(prescission酶)采用pET49b载体表达并用GST柱纯化，且其还带有His标签；TEV蛋白酶制作方法参照prescission酶。除特殊注明外，其他试剂均购自生工公司。

AXX标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

XXA标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码DNA序列如SEQ ID NO.4所示；

Chrono(115-306)目标蛋白来源于Homo sapiens，氨基酸序列和编码DNA序列可通过Accession number在NCBI数据库的protein分项中查询，Chrono蛋白氨基酸序列的Accession number为：Q8N365。(115-306)是指Chrono蛋白的第115至第306氨基酸片段。

Notch2NL(1-210)目标蛋白来源于Homo sapiens；Notch2NL蛋白氨基酸序列的Accession number为：Q7Z3S9。(1-210)是指表达第1位至第210位氨基酸的蛋白区域，文中其他地方表述及意涵类似。

Nclu目标蛋白来源于Homo sapiens；氨基酸序列的Accession number为：P10909

NbALFA目标蛋白为带ALFA标签的一种驼源纳米抗体；相关信息可参考文献：

H,Kilisch M,Martínez-Carranza M,et al.The ALFA-tag is a highlyversatile tool for nanobody-based bioscience applications[J].Naturecommunications,2019,10(1):1-12.

CUA63106目标蛋白来源于Escherichia coli；氨基酸序列的Accession number为：CUA63106

BdNEDP1目标蛋白来源于Brachypodium distachyon(二穗短柄草)，氨基酸序列的Accession number为：XP_024311124。

PET-AXX和PET-XXA为分别插入SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的PET质粒，用于目标蛋白-XXA或目标蛋白-AXX的融合表达。

PET-AXX重组载体的构建：方法同下述PET-XXA重组载体的构建。

PET-XXA重组载体的构建：利用普通T7启动子的pET载体，在BamH1和Ecor1酶切位点之间插入带有Flag标签、8×His标签、prescission酶切位点的XXA基因片段，最终得到的PET-XXA重组载体多克隆位点的概图如图1所示。带有Flag标签、8×His标签、prescission酶切位点的XXA基因片段使用2次PCR反应获得。第一次PCR时上游引物额外加入Flag标签基因序列，下游引物额外加入Flag标签基因序列；第二次PCR时上游引物额外加入8×His标签基因序列，下游引物额外加入prescission酶切位点基因序列。

Chrono(115-306)-pGex6p1重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将Chrono(115-306)克隆到pGEX6p1载体上；

Chrono(115-306)-pXXA重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将Chrono(115-306)克隆到pXXA载体上；

Notch2NL(1-210)-pET32b重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将Notch2NL(1-210)克隆到pET32b载体上；

Notch2NL(1-210)-pXXA重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将Notch2NL(1-210)克隆到pXXA载体上；

nClu-pET50b重组表达载体的构建：采用Kpn1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将nClu克隆到pET50b载体上；

nClu-pXXA重组表达载体的构建：采用Hind3和Xho1酶切位点，利用双酶切法将nClu克隆到pXXA载体上；

NbALFA-pET28sumo重组表达载体的构建：采用Sal1和Xho1酶切位点用双酶切法将NbALFA克隆到pET28sumo载体上；

XXA-NbALFA-pET28sumo重组表达载体的构建：采用BamH1和Sal1酶切位点用双酶切法将XXA基因克隆到构建好的NbALFA-pET28sumo载体上；

CUA63106-pColdMBP重组表达载体的构建：采用Sac1和Xho1酶切位点用双酶切法将CUA63106克隆到pColdMBP载体上；

CUA63106-pXXA重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将CUA63106克隆到pXXA载体上；

BdNEDP1-pColdⅠ重组表达载体的构建：采用Bamh1和Ecor1酶切位点用双酶切法将BdNEDP1克隆到pColdⅠ载体上；

BdNEDP1-pXXA重组表达载体的构建：采用Ecor1和Xho1酶切位点，利用双酶切法将BdNEDP1克隆到pXXA载体上；

双酶切法操作按照TaKaRa公司提供的说明书进行。

实施例1:

将构建好的Chrono(115-306)-pGex6p1载体和Chrono(115-306)-pXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养。分别挑单克隆接入10ml小瓶LB培养基中，37℃培养至OD＝0.8时冰上冷却至温度低于16℃，加入终浓度0.3mM的IPTG在16℃下诱导表达24h。收菌(分别收集诱导前和诱导后的菌体)后加入Binding buffer，超声破碎，诱导后的菌体破碎产物进行12000rpm离心3min以分离破碎后的沉淀和上清。分别收集诱前(诱导前破碎样品)、诱后(诱导后破碎样品)、沉淀(诱导后破碎产物的沉淀样品)、上清(诱导后破碎产物的上清液样品)样品，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后结果如附图2。由附图2结果可知，在同样的条件下由Chrono(115-306)-pGex6p1载体表达出的Chrono(115-306)-GST融合蛋白是包涵体，全部位于沉淀之中。而由Chrono(115-306)-pXXA表达出的Chrono(115-306)-XXA融合蛋白大部分位于上清之中，可以看出XXA标签助溶效果优于GST标签。

实施例2:

将构建好的Notch2NL(1-210)-pET32b载体和Notch2NL(1-210)-pXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养，后续实验操作、条件等同实施例1，此处不再赘述，结果如附图3。由附图3结果可知，在同样的条件下由Notch2NL(1-210)-pET32b载体表达出的Notch2NL(1-210)-Trx融合蛋白全部位于沉淀中是包涵体，而由Notch2NL(1-210)-pXXA载体表达出的Notch2NL(1-210)-XXA融合蛋白大部分位于上清中。可以看出XXA标签助溶效果优于Trx标签。

实施例3:

将构建好的nClu-pET50b载体和nClu-pXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养，后续实验操作、条件等同实施例1。结果如附图4。由附图4结果可知，在同样的条件下由nClu-pET50b载体表达出的nClu-NusA融合蛋白全部位于沉淀中是包涵体，而由nClu-pXXA载体表达出的nClu-XXA融合蛋白大部分位于上清中。可以看出XXA标签助溶效果优于NusA标签。

实施例4:

先将NbALFA连接在pET28sumo载体上，构建NbALFA-pET28sumo质粒。再将XXA连接在NbALFA-pET28sumo载体上，XXA位于sumo上游，构建XXA-NbALFA-pET28sumo载体。

将构建好的NbALFA-pET28sumo载体和XXA-NbALFA-pET28sumo载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养，后续实验操作、条件等同实施例1。结果如附图5，由附图5结果可知，在同样的条件下由NbALFA-pET28sumo载体表达出NbALFA-sumo融合蛋白全部位于沉淀中是包涵体，而由XXA-NbALFA-pET28sumo载体表达出的NbALFA-XXA-sumo融合蛋白大部分位于上清中。可以看出XXA标签助溶效果优于sumo标签。

实施例5:

将构建好的CUA63106-pColdMBP载体和CUA63106-pXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养。分别挑单克隆接入10ml小瓶LB培养基中，37℃培养至OD＝0.8时冰上冷却至温度低于16℃，加入终浓度0.3mM的IPTG在25℃下诱导表达12h。收菌后加入Binding buffer，超声破碎，12000rpm离心3min以分离破碎后的沉淀和上清。分别收集诱前、诱后、沉淀、上清样品，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后结果如附图6。由附图6结果可知，在同样的条件下由CUA63106-pColdMBP载体表达出的CUA63106-MBP融合蛋白是包涵体全部位于沉淀之中，而由CUA63106-pXXA载体表达出的CUA63106-XXA融合蛋白大部分位于上清之中，可以看出XXA标签助溶效果优于MBP标签，并且在高温表达的条件下依然具有优异的助溶性。

实施例6:

将构建好的BdNEDP1-pColdⅠ载体和BdNEDP1-pXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养，后续实验操作、条件等同实施例1，结果如附图7。由附图7结果可知，在同样的条件下由BdNEDP1-pColdⅠ载体表达出的BdNEDP1-His融合蛋白全部位于沉淀中是包涵体，而由BdNEDP1-pXXA载体表达出的BdNEDP1-XXA融合蛋白大部分位于上清中。可以看出XXA标签具有极佳的助溶效果。

实施例7:

将构建好的Chrono(115-306)-PXXA载体转化入BL21(DE3)感受态中，涂板37℃过夜培养。分别挑单克隆接入10ml小瓶LB培养基中，37℃过夜培养，将过夜培养的10mlLB培养基接入500ml大瓶LB培养基中，37℃培养至OD＝0.8时，制冰机内冷却至温度低于16℃，加入IPTG至终浓度0.3mM，16℃诱导24h后收菌、加入Binding buffer、冰上高压破碎、16000rpm离心30min去除沉淀、将上清与准备好的镍柱填料冷室结合2h、Wash buffer洗杂、Elutionbuffer洗脱目标蛋白。收集诱前、诱后、沉淀、上清、Ft(穿出液，即上清结合完镍柱后的液体)、wash(洗杂液)、Elu(目标蛋白洗脱液)样品采用SDS-PAGE，结果如附图8。由结果的Elu样品可知，变为可溶的Chrono(115-306)-XXA融合蛋白可被成功纯化。纯化的Chrono(115-306)-XXA融合蛋白采用HRV3C酶进行酶切，由结果可知融合蛋白可以被成功酶切，并且去除XXA标签后Chrono(115-306)仍然稳定存在于上清之中。

实施例8:

BdNEDP1是一种蛋白酶，并且单独表达时为包涵体，与XXA融合表达时为可溶上清(见实施例6)。为了验证由包涵体变为上清后是否具有活性。进行BdNEDP1-XXA融合蛋白的纯化，具体纯化过程参考实施例7不再赘述，并得到了较纯的融合蛋白。采用蛋白酶酶切，切掉XXA标签，标签去除后BdNEDP1依然稳定的存在于上清之中，采用镍柱去除标签后得到了较纯的BdNEDP1，并进行活性实验。采用不同量的BdNEDP1在不同温度下对提前准备好的底物进行酶切，以底物减少的量来评判BdNEDP1的活性，由结果可知由包涵体转为上清的BdNEDP1具有良好的活性，见附图9，其中，M为marker的电泳图，1泳道为对照，酶量为0umol；2泳道酶量为10umol；3泳道酶量为1umol；4泳道酶量为100nmol；5泳道酶量为10nmol；6泳道酶量为1nmol；左侧1-6泳道为4℃下酶切，右侧1-6泳道为25℃下酶切；底物bdNEDP1均为100umol，反应时间均为1h；时间到后，所有样品加入5×SDS loading buffer以终止酶切反应。

实施例9:

为了验证蛋白AXX的助溶效果，采用Chrono(115-306)、Notch2NL(1-210)、nClu来进行实验，实验组表达载体采用pET-AXX，其他实验细节参照实施例1、实施例2、实施例3进行。结果表明AXX标签也具有优秀的助溶效果，见附图10，其中，第1泳道为marker的电泳图，第2～5泳道依次为Chrono(115-306)-AXX表达过程中的诱前、诱后、沉淀、上清样品的电泳图；第6～9泳道依次为Notch2NL(1-210)-AXX表达过程中的诱前、诱后、沉淀、上清样品的电泳图，第10～13泳道依次为nClu-AXX表达过程中的诱前、诱后、沉淀、上清样品的电泳图。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 中国科学院福建物质结构研究所

<120> 一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用

<130> DD210190I

<141> 2021-05-18

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> PRT

<213> Chlorella sorokiniana

<400> 1

Met Gln Asp Glu Ser Leu Ala Asp Lys Ala Lys Ser Ala Ile Glu Thr

1 5 10 15

Ala Lys His Ala Val Ser Asp Ala Ala Gln Lys Val Lys Glu Thr Val

20 25 30

Thr Gly Ala Ala Ala Asp Val Gln Glu Thr Ala Arg Asp Val Thr Gln

35 40 45

Asp Gln Arg Gln Asn Leu Gly Tyr Ala Glu Gln Lys Ala Ala Asp Thr

50 55 60

Leu Gly Asp Val Lys Ala Ala Ala Gln Glu Ala Tyr Glu Ser Ala Lys

65 70 75 80

Gln Arg Ala Ser Glu Ala Ala Glu Gly Ala Lys Ser Thr Ala Ser Glu

85 90 95

Leu Gly Gly Ser Ala Glu Arg Ala Val Arg Asp Ala Ala Gly Gly Ala

100 105 110

Glu Gly Ala Gly Arg Asp Ala Gln Gly Ala Ala Arg Glu Gly Leu Lys

115 120 125

Gly Ala Glu Gly Ala Gly Ala Thr Asp Glu Ala Arg Arg His Ala Glu

130 135 140

Asp Val Ala Asp Thr Ala Lys Glu Lys Tyr Ser Glu Leu Lys Gly Asp

145 150 155 160

Ala Lys Glu Gly Leu Gly Arg Ala Gln Ala Lys Gly Glu Asp Leu Ala

165 170 175

Gly Asp Ala Ser Lys Ala Ala Gln Asp Ala Ala Asp Arg Leu Lys Pro

180 185 190

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Lys Leu Arg Asp Ala Ala Asp Gln Ala Ala Lys Ser Ala Asp Gly

1 5 10 15

Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ala Gln Ala Arg Gly Leu Gly Glu Lys Ala

20 25 30

Asp Gly Lys Leu Glu Ser Tyr Lys Glu Lys Ala Thr Asp Ala Val Asp

35 40 45

Glu Ala His Arg Arg Ala Glu Asp Thr Ala Gly Ala Gly Glu Ala Gly

50 55 60

Lys Leu Gly Glu Arg Ala Ala Gly Gln Ala Asp Arg Gly Ala Gly Glu

65 70 75 80

Ala Gly Gly Ala Ala Asp Arg Val Ala Arg Glu Ala Ser Gly Gly Leu

85 90 95

Glu Ser Ala Thr Ser Lys Ala Gly Glu Ala Ala Glu Ser Ala Arg Gln

100 105 110

Lys Ala Ser Glu Tyr Ala Glu Gln Ala Ala Ala Lys Val Asp Gly Leu

115 120 125

Thr Asp Ala Ala Lys Gln Glu Ala Tyr Gly Leu Asn Gln Arg Gln Asp

130 135 140

Gln Thr Val Asp Arg Ala Thr Glu Gln Val Asp Ala Ala Ala Gly Thr

145 150 155 160

Val Thr Glu Lys Val Lys Gln Ala Ala Asp Ser Val Ala His Lys Ala

165 170 175

Thr Glu Ile Ala Ser Lys Ala Lys Asp Ala Leu Ser Glu Asp Gln Met

180 185 190

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaggacg aatctctggc tgacaaagct aaatctgcta tcgaaaccgc taaacacgct 60

gtttctgacg ctgctcagaa agttaaagaa accgttaccg gtgctgctgc tgacgttcag 120

gaaaccgctc gtgacgttac ccaggaccag cgtcagaacc tgggttacgc tgaacagaaa 180

gctgctgaca ccctgggtga cgttaaagct gctgctcagg aagcttacga atctgctaaa 240

cagcgtgctt ctgaagctgc tgaaggtgct aaatctaccg cttctgaact gggtggttct 300

gctgaacgtg ctgttcgtga cgctgctggt ggtgctgaag gtgctggtcg tgacgctcag 360

ggtgctgctc gtgaaggtct gaaaggtgct gaaggtgctg gtgctaccga cgaagctcgt 420

cgtcacgctg aagacgttgc tgacaccgct aaagaaaaat actctgaact gaaaggtgac 480

gctaaagaag gtctgggtcg tgctcaggct aaaggtgaag acctggctgg tgacgcttct 540

aaagctgctc aggacgctgc tgaccgtctg aaaccg 576

<210> 4

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgaaactgc gtgatgcggc ggatcaagcg gcaaaaagcg cggatggtgc gctggatgaa 60

ggtaaagcgc aagcgcgtgg cttaggtgaa aaagcggatg gcaaactgga aagctataag 120

gaaaaagcga ccgatgcggt ggatgaagca catcgccgtg cagaagatac tgcgggtgca 180

ggtgaagcag gtaaattggg cgaacgtgca gcaggtcaag cggatcgtgg tgcgggtgaa 240

gcgggtggtg cggcagatcg tgttgcacgt gaagcgagcg gtggtttaga aagcgcgacc 300

agcaaagcag gtgaagcggc agaaagtgcg cgtcaaaaag cgagcgaata tgcggaacag 360

gcggcggcaa aagttgatgg cctgaccgat gcggcaaaac aggaagcgta tggcctgaat 420

cagcgccaag atcagaccgt tgatcgtgcg accgaacaag ttgatgcggc ggcgggtacc 480

gttaccgaaa aagtgaaaca ggcggcggat agcgttgcac ataaagcgac cgaaattgcg 540

agcaaagcga aagatgcgct gagcgaagat cagatg 576

Claims (10)

1.一种标签蛋白，其特征在于，所述标签蛋白为如下A1)或A2)或A3)所示的蛋白质：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；

A2)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.2同一性在70％或以上，且与A1)具有相同功能的蛋白质；

A3)由A1)和/或A2)进行拼接而生成的且与A1)具有相同功能的蛋白质。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的标签蛋白。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为如下a1)或a2)或a3)或4)所示的DNA分子；

a1)编码区包括SEQ ID NO.4的DNA分子；

a2)核苷酸序列是SEQ ID NO.4的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有70％或以上同一性，且编码权利要求1所述标签蛋白的DNA分子；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述标签蛋白的DNA分子。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为利用权利要求2或3所述的DNA分子改造的PET质粒。

6.B1)或B2)在蛋白异源表达中提高目标蛋白溶解性和/或活性的应用；

所述B1)为权利要求1所述的标签蛋白、权利要求2或3所述的DNA分子、权利要求4或5所述的重组载体；

所述B2)为标签蛋白’，所述标签蛋白’的氨基酸序列与权利要求1所述的标签蛋白的氨基酸序列互为反向；

或所述B2)为DNA分子’，所述DNA分子’编码标签蛋白’；

或所述B2)为重组载体’，所述重组载体’含有DNA分子’。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述标签蛋白’为如下A1’)或A2’)或A3’)所示的蛋白质：

A1’)氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；

A2’)氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基得到的，与SEQ ID NO.1同一性在70％或以上，且与A1’)具有相同功能的蛋白质；

A3’)由A1)、A2)、A1’)、A2’)中的至少一种进行拼接而生成的且与A1)或A1’)具有相同功能的蛋白质；

所述DNA分子’为如下a1’)或a2’)或a3’)或a4’)所示的DNA分子；

a1’)编码区包括SEQ ID NO.3的DNA分子；

a2’)核苷酸序列是SEQ ID NO.3的DNA分子；

a3’)与a1’)或a2’)限定的核苷酸序列具有70％或以上同一性，且编码标签蛋白’的DNA分子；

a4’)在严格条件下与a1’)或a2’)限定的核苷酸序列杂交，且编码标签蛋白’的DNA分子。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组载体’为利用DNA分子’改造的PET质粒。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白异源表达所利用的表达系统选自无细胞表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统中的任一种。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目标蛋白选自Chrono(115-306)、Notch2NL(1-210)、Nclu、NbALFA、CUA63106、BdNEDP1中的任一种。

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