CN100999730B - 利用转基因植物生产蝎抗神经兴奋肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种利用转基因植物生产东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)的方法。该方法是将蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因克隆进植物表达载体，将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中，获得转化植物的工程菌，再用该工程菌转化目的植株，经筛选得到能表达蝎抗神经兴奋肽基因的植物细胞株，并再生出完整的转基因植株，转基因植株获得了一个新性状，在细胞中生产蝎抗神经兴奋肽(ANEP)。用植物作为生物反应器生产蝎抗神经兴奋肽(ANEP)具有操作简便、成本低、不污染环境、易大量生产等优点，生产的蝎抗神经兴奋肽(ANEP)可作为临床治疗癫痫药物，开发前景良好。

Description

利用转基因植物生产蝎抗神经兴奋肽的方法

技术领域：

本发明涉及植物基因工程技术领域，主要是利用植物生物技术，通过植物表达系统进行蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因表达载体的构建和转化，获得生产蝎抗神经兴奋肽(ANEP)的转基因植株，从而达到利用转基因植物作为生物反应器生产蝎抗神经兴奋肽(ANEP)的目的。

背景技术：

植物生物反应器是国际生物工程药物研究的前沿领域。国内外关于以转基因植物为表达系统的基因操作技术已较成熟，成功表达了疫苗、抗体、糖类、蛋白质、脂肪等生物大分子。世界范围内通过转基因植物表达的多肽药物和蛋白有百种以上，比如干扰素、红细胞生成素、上皮生长因子、生长激素、胰岛素等重要的医药蛋白。转基因植物与微生物和转基因动物相比培养条件简单，且易于成活，能够再生植株，有利于遗传操作，并且可减少以菌体作表达载体时的后续发酵过程，大大降低生产成本，适于大规模生产，且具有重组蛋白正确装配表达系统，另外无动物病毒污染的危害。植物生物反应器打破了传统的医药生产模式，开创了生物医药工程学和植物基因工程学交叉的新领域，具有良好的产业化前景。

自宋代以来全蝎就是历代中医用来治疗惊厥、小儿惊风、癫痫的首选天然药物，88年首次报道了东亚钳蝎中具有的药用活性成分-蝎抗神经兴奋肽(ANEP)。药理学研究表明该肽不仅具有抗癫痫作用，同时又具有抗惊厥、抗小儿惊风等作用。多重药理作用使其具有较高的治疗指数。癫痫是一种严重危害人们身心健康的常见临床综合症，年发病率为0.05％，年死亡率为12/10万。目前，对于癫痫的治疗仍以药物控制为主，但治疗效果并不令人满意，且有较严重的临床毒副作用。市场上也缺乏长期防止和控制这类疾病的药物，主要原因是，利用蝎毒作为研究材料的来源，受到资源限制、原料昂贵、分离纯化繁琐而且收率较低等因素制约。目前，利用基因工程技术，通过大肠杆菌对东亚钳蝎抗神经兴奋肽进行表达，在一定程度上解决活性肽来源等诸多问题，但表达产物多以无活性的包涵体形式存在。包涵体给表达产物的纯化带来方便和快捷，但是包涵体的体外变、复性极为复杂，成本较高，制约其工业化生产进程。而植物具有完善的真核细胞表达系统，不仅能生产出正确加工和折叠的目标蛋白。并可直接食用，避免下游繁琐的分离、纯化过程，极大降低抗神经兴奋肽生产成本。为工业化生产抗神经兴奋肽扫清关键性难题。通过转基因技术，用植物作为生物反应器大量生产廉价的、安全的口服蝎抗神经兴奋活性肽具有巨大的经济效益和社会效益。

我国是癫痫疾病的高发国家，因此，开拓研发临床用于癫痫、惊厥、小儿惊风及这类脑神经过度兴奋性疾病的治疗以及改善患者生活质量的多肽类药物具有极其重要的意义。药理学研究表明，抗神经兴奋肽(ANEP)，在几种不同机理致惊厥、致癫痫动物模型及整体、离体实验动物模型中，均具较好的抗惊厥、抗癫痫作用。一般药理及急性毒性试验结果也表明，该肽极有可能成为用于临床的一个脑神经兴奋疾病防治药物。本发明采用植物反应器的原理，以农杆菌Ti质粒为载体，将外源东亚蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因转入烟草、番茄植物基因组中，使转基因植物稳定表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因。

现有技术表明，目前对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)的研究主要集中在生物学功能方面，尚没有利用转基因植物作为生物反应器生产东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)的技术文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用转基因植物生产蝎抗神经兴奋肽的方法，具体的说就是利用转基因烟草和番茄植株表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：它包括：1)将蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因构建到植物表达载体；(2)获得含有蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因的植物转化的工程菌PBI-ANEP/LBA4404；(3)转入植物细胞，并再生出完整的转基因植株；(4)在转基因植物细胞中表达蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因。

东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因克隆进植物表达载体PBI121，将该植物表达载体转化到根癌农杆菌中，再用该转化后的根癌农杆菌转化目的植物，经筛选得到能表达蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因的植物细胞株，再由细胞株培养为转基因植物。通过PCR、RT-PCR和wes tern blot鉴定，东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因在转基因植物中得到表达。

其中ANEP I氨基酸序列为：MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；ANEP II氨基酸序列为：MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；ANEPIII氨基酸序列为：MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK。

本发明包含三种东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)序列全序。

本发明构建了表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)重组植物表达载体PBI-ANEP I、PBI-ANEP II、PBI-ANEPIII。

本发明提供了一种含有东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因的用于植物遗传转化的工程菌PBI-ANEP I/LBA4404、PBI-ANEPII/LBA4404、PBI-ANEPIII/LBA4404。

本发明用工程菌PBI-ANEP I/LBA4404、PBI-ANEP II/LBA4404、PBI-ANEPIII/LBA4404转化番茄，得到含ANEP I、ANEP II、ANEPIII基因的番茄愈伤组织，再由愈伤组织培育出含ANEP I、ANEP II、ANEPIII基因的番茄。

本发明用工程菌PBI-ANEP I/LBA4404、PBI-ANEP II/LBA4404、PBI-ANEPIII/LBA4404转化烟草，得到含ANEP I、ANEP II、ANEPIII基因的烟草愈伤组织，再由愈伤组织培育出含ANEP I、ANEP II、ANEPIII基因的烟草。

通过根癌农杆菌转化生产蝎抗神经兴奋肽的植物包括烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、玉米、小麦、水稻等。

本发明提供了鉴定重组蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)基因的转基因植株方法，包括通过PCR检测、RT-PCR检测和Western blot杂交检测。转基因烟草和番茄可以稳定表达东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因，应用含有与东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)基因的T i载体已经成功地转化烟草和番茄，说明该方法和Ti载体具有很好的可行性和实用性。利用转基因植物生产的东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III(ANEP I、II、III)能够作为癫痫、惊厥、小儿惊风及这类脑神经过度兴奋性疾病临床治疗药物。

附图说明：

图1为东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)重组植物表达载体PBI-ANEP构建图。

图2为工程菌pBI-ANEP/LBA4404的ANEP基因PCR扩增电泳图。

图3为再生植株ANEP基因PCR扩增片段电泳图。

图4为再生植株ANEP基因RT-PCR鉴定分析图。

图5为再生植株ANEP基因Westernblot分析结果图。

图2中M：Marker DL2000；1：pNJU-ANEP的ANEP基因PCR产物；2：LBA4404PCR产物；3：pBI-ANEP I/LBA4404PCR产物；4：pBI-ANEP II/LBA4404PCR产物；5：pBI-ANEPIII/LBA4404PCR产物。

图3中M：Marker DL2000；1：pNJU-ANEP的ANEP基因PCR产物；2：非转基因植株ANEP I基因PCR产物；3：再生植株ANEP I基因PCR产物；4：再生植株ANEP II基因PCR产物；5：非转基因植株ANEP II基因PCR产物；6：再生植株ANEPIII基因PCR产物；7：非转基因植株ANEPIII基因PCR产物

图4中M：Marker DL2000；1：pNJU-ANEP质粒ANEP基因RT-PCR产物；2：非转基因植株ANEP基因RT-PCR产物；3：再生植株ANEP I基因RT-PCR产物；4：再生植株ANEP II基因RT-PCR产物；5：再生植株ANEPIII基因RT-PCR产物。

图5中1：转基因植株ANEP I蛋白免疫杂交条带；2：标准ANEP I蛋白免疫杂交条带；3：非转基因植株ANEP I蛋白免疫杂交条带；4：转基因植株ANEP II蛋白免疫杂交条带；5：非转基因植株ANEP II蛋白免疫杂交条带；6：标准ANEP II蛋白免疫杂交条带；7：非转基因植株ANEP III蛋白免疫杂交条带；8：标准ANEP III蛋白免疫杂交条带；9：转基因植株ANEPIII蛋白免疫杂交条带。

具体实施方式

实施例1：东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III基因植物表达载体的构建1.PCR扩增东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III基因

根据东亚钳蝎抗神经兴奋肽ANEP基因序列，设计PCR扩增引物：Sens eprimer：5’-t gctctagaaacatggcagatggatatataagaggaag-3’(Xba I)Ant-sense primer：5’-cgagctcttactttttgccaccgc-3’(Sac I)

以质粒pNJU-ANEP I、pNJU-ANEP II、pNJU-ANEP III为模板，PCR扩增ANEPI、ANEP II、ANEPIII基因全序列。加入了增强表达效率的Kozak序列。ANEPI、ANEP I、ANEPIII基因的PCR扩增条件为：94℃预变性1min，94℃20s，42℃30s，72℃40s，25个循环，72℃延伸10mi n。

2.连接产物转化及鉴定

ANEP I、ANEP II、ANEPIII基因PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段，对PCR回收产物以及表达载体PBI 121质粒进行Sac I与XbaI双酶切，37℃酶切2h，1％琼脂糖凝胶电泳，回收约250bp ANEP I、ANEPII、ANEPIII基因片段和约12kb的中间载体PBI 121的线性片断，定量按3∶1的比例插入片段ANEP I或ANEP II或ANEPIII和载体pBI 121线形片段混合进行连接反应，16℃孵育过夜，连接产物转化大肠杆菌，挑取重组菌株，提取菌株质粒PCR鉴定，结果扩增得到大小约为250bp的目的条带，提取质粒酶切鉴定，所切片段大小与理论大小也相符合。采用测序引物(Senseprimer：5’-acgcacaatcccactatccttcg-3’；Anti-sense primer：5’-tgaattcccgatctagtaac-3’)测序鉴定，测序结果与三种ANEP的序列完全一致，证实获得了用于农杆菌介导转化植物的表达载体pBI-ANEP I、pBI-ANEP II、pBI-ANEPIII。

实施例2：工程菌pBI-ANEP/LBA4404的制备

1.三亲交配法转化农杆菌：

受体农杆菌LBA4404(含Ti质粒)以1∶100接种于含有50mg/L链霉素的LB液体培养基，28℃250rpm培养48h。大肠杆菌HB101(含穿梭质粒pRK2013)以1∶100接种于LB液体培养基，28℃250rpm培养22h。大肠杆菌DH5α(含重组质粒pBI-ANEP)以1∶100接种于含50mg/L Kan的LB液体培养基中，37℃250rpm培养10h左右。将以上三种菌液分别吸取至EP管中，3500rpm离心5min，收集菌体，弃上清，用LB液体培养基清洗2次，离心，弃上清。另取干净EP管，混合三种菌液(1∶1∶1v/v)，用枪头不断抽打，以使其混合均匀。涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和链霉素(50mg/L)的双抗性LB平板。28℃静置暗培养24h后，挑取转化菌落，进行菌落PCR验证。结果扩增得到大小约为250bp的目的条带，提取质粒酶切鉴定，所切片段大小与理论大小也相符合。

2.采用改进冻融法将pBI-ANEP I、pBI-ANEP II、pBI-ANEP III导入农杆菌LBA4404

农杆菌LBA4404(含Ti质粒)以1∶100接种于含50mg/L链霉素LB液体培养基，28℃培养24h，将培养得到的饱和期LBA4404再次接种到LB液体培养基中，28℃培养6h得到对数期LBA4404。将菌液转移到10ml离心管中，5000rpm  4℃离心5min，弃上清。每个离心管中加入1ml 20mmol/LCaCl₂，混合均匀后转移到EP管中，加入2μlpBI-ANEP I或pBI-ANEP II或pBI-ANEPIII质粒，冰浴。液氮中冷冻10s，立即转入37℃水浴90s，冰浴2min。加入1ml LB液体培养基，28℃100rpm温和振荡培养3h。3500rpm离心5min，弃上清，吸取剩余菌液，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和链霉素(50mg/L)的双抗性LB平板上。28℃静置暗培养24h后，挑取转化菌落，进行菌落PCR验证。结果扩增得到大小约为250bp的目的条带，提取质粒酶切鉴定，所切片段大小与理论大小也相符合。

实施例3：根癌农杆菌介导烟草转化

挑取工程菌pBI-ANEP I、pBI-ANEP II、pBI-ANEPIII/LBA4404单菌落，接种于含Kan 50mg/L和Str 50mg/L的LB液体培养基中，28℃200rpm培养过夜。然后1∶100接种于含相同抗生素的3ml LB中培养到OD₆₀₀＝0.6～0.8，4℃5000rpm离心5min，收集沉淀，用不含激素的MS的液体培养基洗涤两次后，用液体MS制成稀释10倍菌悬液。

将烟草无菌叶片置于预培养培养基MS0中预培养2天，切去叶片边缘和主要叶脉，将叶片剪成直径为0.5×0.5cm²的叶块，将其浸入准备好的农杆菌悬液中侵染20min，取出叶片，置于铺有无菌滤纸的分化培养基MS1，25℃，暗培养2天，将共培养后的烟草叶盘片转入选择分化培养基MS 3，25℃培养，每隔2周转接，待芽长到2cm左右时，切下转移到选择生根培养基MS4中进行生根培养，室内28℃，每日3000Lx光强光照16h，生根后，植株生长加快，成为完整植株，在组培室去掉滤菌膜培养1周后，转入已灭菌的土壤中，温室培养，4～8周生长稳定后，即可移至温室花盆中培养。其中：

表1.烟草培养基一览表(单位：mg/L)

实施例4：根癌农杆菌介导番茄转化

将无菌番茄叶片置于预培养培养基MS 0中预培养2天，取活化的工程菌菌液，4℃5000rpm离心5min，收集沉淀，用不含激素的MS的液体培养基洗涤两次后，用液体MS制成稀释10倍菌悬液，取无菌番茄叶片切去叶片边缘和主要叶脉，剪成直径为0.5×0.5cm²的叶块，将其浸入准备好的农杆菌悬液中侵染20min，取出叶片，置于铺有无菌滤纸的分化培养基MS1，25℃，暗培养2天，将共培养后的番茄叶盘片转入选择分化培养基MS3，25℃培养，每隔2周转接，待芽长到2cm左右时，切下转移到选择生根培养基MS4中进行生根培养，25℃，光照强度1000～1500Lx，湿度50％的无菌组培室中进行培养，很快就会生根。之后植株生长加快，成为完整植株，在组培室去掉滤菌膜培养1周后，转入已灭菌的土壤中，温室培养，4～8周生长稳定后，即可移至温室花盆中培养。其中：

表2.番茄培养基一览表(单位：mg/L)

实施例5：转基因植物的分子检测

1.PCR检测

利用卡那霉素选择压力对转化细胞作早期筛选。取Kan抗性芽叶片约0.5g置于冰冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末。将粉末转入1.5ml离心管中，立即加入2倍体积的65℃预热的2％CTAB提取缓冲液，混合均匀，置于65℃的水浴中45min不时轻轻颠倒混匀。加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，5000rpm离心5mi n取上清，重复操作一次。加入2倍体积的预冷95％乙醇，-20℃沉淀3h。4℃12000rpm离心10min去上清，用20μl TE溶解，以提取的植物总DNA为模板，用ANEP上下游引物进行PCR检测，PCR检测条件为94℃预变性1mi n；94℃20s，42℃30s，72℃40s，25个循环；72℃延伸10min。从转基因烟草和番茄DNA中扩增出大小约为250bp的目的条带。

2.RT-PCR鉴定

Trizol法提取植物总RNA。取100mg植物叶片(去除主脉)，置于液氮中研磨成灰白色粉末，趁液氮尚未挥发干净时，转入1.5ml EP管中。加入1ml Trizol试剂，用枪头反复吸取剪切DNA，成为均匀的混悬液。加入200μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈振荡混匀30s，12000rpm，离心7min。上清液转移到EP管中，加入等体积的异丙醇，室温下放置10min。12000rpm，离心7min，小心移去上清液。用70％乙醇洗涤两次，每次700μl，12000rpm离心5min。尽可能彻底吸走上清液，防止RNA沉淀丢失，室温下干燥5min。沉淀用20μl DEPC处理水溶解，取提取的总RNA进行纯度测定，并进行电泳观察。

以1μg总RNA为模版，进行逆转录cDNA第一条链的合成，反应条件为：将总RNA和引物(ANEP上或下游引物或Oligo(dT)₁₈)在70℃混合培育5min，立刻转至冰上放置。添加Reaction buffer、dNTP、Ri bonucleaseInhibitor后，混合并于37℃培育5min。随后添加M-MuLV ReverseTranscriptase，混匀反应体系，在42℃反应45min，70℃10min终止反应。取合成得到的cDNA进行PCR扩增反应，反应体系与PCR验证中循环参数相同。

3.Western blot检测

采用改良丙酮沉降法提取植物蛋白样品。取100mg植物材料，用蛋白提取缓冲液研碎植物材料并完全转移至1.5ml离心管中，加入3倍体积的植物蛋白提取缓冲液。将研碎样品摇匀，并在4℃条件下放置1h充分溶解蛋白。放置后的样品摇匀，12000rpm离心20min。离心后将上清液转移至另一离心管中，按1∶2.5(v/v)加入-20℃预冷的丙酮，摇匀，-20℃放置1h以沉降蛋白。

12000rpm离心20min，弃上清液，沉淀在-20℃条件下放置20min，使丙酮完全挥发。加入上样缓冲液溶解沉淀，缓冲液用量按照每克植物材料(鲜重)添加300μl。沉淀充分溶解后，在4℃条件下12000rpm离心5mi n，取上清液进行Western blot检测。

植物蛋白样品加入2×SDS loading buffer在100℃沸水中变性处理3～5min，离心去沉淀后，用于Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5％分离胶80V，5％积层胶120V)。SDS-PAGE分离后，用电泳转移仪将蛋白转移至预处理的PVDF膜上，恒压94V，转移30min。取出PVDF，用蒸馏水漂洗5min，将膜置于封闭缓冲液(TBST+5％BSA)中，室温轻摇2.5h，取出，用TBST漂洗3次，每次5min。1∶100加入一抗，4℃过夜反应。次日取出，用TBST漂洗3次，每次5min。1∶1000加入二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG)，室温轻摇2h。取出，用TBST漂洗3次，每次5min。加入显色液BCIP/NBT，不断摇动，直到显出颜色条带，用蒸馏水漂洗中止染色。

Claims (1)

1.一种利用转基因植物生产蝎抗神经兴奋肽的方法，其特征在于：它包括：

1)将蝎抗神经兴奋肽基因构建到植物表达载体；(2)获得含有蝎抗神经兴奋肽基因的植物转化的工程菌PBI-ANEP/LBA4404；(3)转入植物细胞，并再生出完整的转基因植株；(4)在转基因植物细胞中表达蝎抗神经兴奋肽基因；所述的蝎抗神经兴奋肽为东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III，其氨基酸序列分别为：MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECKGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKVSCLWGNDGCNKECRAYGASYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；MKLSLLLVISASMLIDGLVNADGYIRGSNGCKISCLWGNEGCNKECIGFGAYYGYCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSESNTCGGKK；并通过如下方法构建：

东亚钳蝎抗神经兴奋肽I、II、III基因植物表达载体是按如下方法构建的：1)在蝎抗神经兴奋肽基因的5′端添加Xba I限制性核酸内切酶位点，在3′端添加Sac I限制性核酸内切酶位点；

2)根据东亚钳蝎抗神经兴奋肽基因序列及设计的酶切位点，设计PCR扩增引物：

Sense primer：5’-tgctctagaaacatggcagatggatatataagaggaag-3’

Ant-sense primer：5’-cgagctcttactttttgccaccgc-3’；

3)以pNJU-ANEP I、pNJU-ANEP II、pNJU-ANEPIII为模板，扩增蝎抗神经兴奋肽基因全序列，将扩增的蝎抗神经兴奋肽基因酶切后连到植物表达载体PBI121上；

并利用转基因烟草和番茄植株表达三种蝎抗神经兴奋肽基因。

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