CN105462991B - 疣粒野生稻bZIP1基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，公开了一种疣粒野生稻bZIP1基因，具体包含一个来源于疣粒野生稻的抗白叶枯病相关基因的分离克隆和功能鉴定，作物野生近缘种往往蕴含着抗病、抗逆、高产等性状。疣粒野生稻对水稻白叶枯病近乎免疫，由于其与栽培稻无法杂交，其中抗性基因尚未被有效鉴定。本发明克隆并坚定了疣粒野生稻中一基因(OmbZIP1)，该基因和栽培稻中的一bZIP型转录因子高度同源。对获得的转基因材料进行鉴定后发现，该基因的能影响水稻对白叶枯病的抗性，增强了水稻对部分白叶枯小种的抗病。

Description

疣粒野生稻bZIP1基因
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，涉及一种疣粒野生稻bZIP1基因，具体包含一个来源于疣粒野生稻的抗白叶枯病相关基因的分离克隆和功能分析，尤其涉及疣粒野生稻DNA序列和该DNA序列对水稻对白叶枯病抗性的影响。
背景技术
水稻是人类最重要的粮食作物之一，高产一直是水稻育种选择的重要农艺性状，也是农业生产追求的主要目标。然而，水稻的产量往往受到生物或者非生物逆境的影响。白叶枯病，由黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae,Xoo)引起，是一个严重的全球性水稻病害。水稻是亚洲许多国家的主要粮食，因此水稻白叶枯病对亚洲国家粮食生产的威胁尤为严重(Singh et al.2001；Century et al.1999)，该病害也一直是影响我国水稻高产、稳产的一个重要原因。据统计，在发病较重的年份和地区该病引起的水稻减产高达50％甚至绝收(章琦等,2007)。实践表明，使用抗病品种是防治白叶枯病最经济有效且环境影响小的技术措施。但是，由于白叶枯病生理小种变异频繁，新的抗性品种在种植几年后往往又会变为易感(Hulbert et al.2001)。例如，日本的抗病品种“朝风”，在种植后不久就遭遇当地毒性菌株的侵袭，另外在韩国、印度、菲律宾和我国南方部分稻区也发现有能侵染带Xa21抗病基因水稻的毒性菌株(Goel et al.,1998；Lee et al.,1999；曾列先等,2002；姬广海等,2003)。因此，挖掘利用新的抗病基因资源，拓展抗病基因资源；研究相关抗病机理，提升和延展抗病基因的功能，成为目前水稻抗病育种的重要研究内容。
由于自然选择的结果，野生稻对环境适应性要远高于栽培稻，对水稻各种病害具有较好的抗性(Brar and Khush 1997)。野生稻遗传资源在水稻育种工作已经起到了很多积极的作用。由于众多学者的不懈努力，多个来源于野生稻的白叶枯病抗性基因已被定位或克隆，包括来源于普通野生稻(Oriza rufipogon Griff.)的Xa23(Zhang et al.1996)，小粒野生稻(O.minuta)的Xa27(Amante-Bordeos et al.1992；Wu et al.2008)，药用野生稻O.officinalis的Xa29(Tan et al.2004)和普通野生稻的Xa30(Jin et al.2007)等。来源于长雄蕊野生稻(O.longistaminata)的Xa21基因(Song et al.1995)更是被广泛的应用于农业生产和基础科学研究。疣粒野生稻为GG组，和普通栽培稻的亲缘关系较远(Brar andKhush 1997)。研究表明，其对白叶枯病的抗性非常高(章琦,1994)。通过多年研究，我们确定了多个来源于疣粒野生稻的抗白叶枯病候选基因，并进行了转基因验证。结果显示，其中一基因能显著影响水稻对白叶枯病的抗性。
发明内容
本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种疣粒野生稻bZIP1基因。
本发明的第一个目的是提供疣粒野生稻中分离的OmbZIP1基因，本发明的第二个目的是提供了增强水稻对白叶枯菌抗性的新方法。这种方法包括将OmbZIP1基因与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体、转入水稻以提高水稻对白叶枯病抗性的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种疣粒野生稻bZIP1基因，其DNA序列是SEQ ID NO:1所示的DNA序列，或者基本上相当于SEQ ID NO:1的DNA序列。OmbZIP1总长1413bp(碱基对)。其中最前端ATG为起始符，根据三联体密码规则计算，最后三个字符TAA为终止符，可见是一个完整的基因。
疣粒野生稻bZIP1基因作为增强水稻对白叶枯病抗性中的应用。
所述的DNA序列与适合启动子连接，能够使水稻产生双链RNA。
本发明的有益效果为：本发明克隆并坚定了疣粒野生稻中一基因(OmbZIP1)，该基因和栽培稻中的一bZIP型转录因子高度同源。对获得的转基因材料进行鉴定后发现，该基因的能影响水稻对白叶枯病的抗性，增强了水稻对部分白叶枯小种的抗病。
附图说明
图1.是具有OmbZIP1基因遗传背景的T0代材料。采用Ubiquitin启动子驱动的OmbZIP1基因转入石首白毛。T0代转基因材料RT鉴定显示，OmbZIP1基因表达均较强。而OmbZIP1的转基因生长较矮小且育性下降；接种白叶枯菌后OmbZIP1转基因材料显示出较高的抗性。
图2.是具有OmbZIP1基因亚细胞定位。35s启动子表达sGFP::OmbZIP1融合蛋白主要定位于细胞核内；Ubiquitin启动子驱动的融合蛋白的也主要定位于细胞核内。
图3.是具有OmbZIP1自身互作。BiFC互作载体的结构示意图，nYFP::OmbZIP1融合蛋白和cYFP::OmbZIP1融合蛋均采用35s启动子驱动表达；共转化烟草的瞬时实验显示OmbZIP1蛋白具有很强的自身互作，互作位点位于细胞核中。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。
实施例1：
1.疣粒野生稻OmbZIP1基因的克隆
1.1.疣粒野生稻RNA制备
(1)试剂：
Solution I连接酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA片段回收试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶和cDNA第一链合成试剂盒购自NEB公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶购自TOYOBO公司；IPTG(Isopropyl-1thio-β-galactoside，异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷)；X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-硫代半乳糖苷)；卡那霉素(Kanamycin，Kan)；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)；链霉素(streptomycin，Str)；液氮；二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate DEPC)；无水乙醇；氯仿；异丙醇；Na2EDTA；冰醋酸；甘油；胰蛋白胨；酵母浸膏；NaCl；琼脂由上海英俊生物技术有限公司(Invitrogen)和生工生物工程(上海)有限公司进行引物合成。
(2)仪器：
超净工作台、手术刀、250ml三角形烧瓶、移液枪、恒温干燥箱、枪头、高压灭菌锅、研钵、制冰机、小勺、一次性塑料手套、恒温培养箱、电泳仪、接种针、离心管、酒精灯、PCR仪、台式低温离心机、超低温冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、水浴锅、小型电泳装置、超微量分光光度计、培养皿、恒温摇床、涡旋仪、高压灭菌锅等。
(3)相关软件及数据库：
引物设计采用Oligo 6Demo，序列分析比对采用Vector NTI Advance 10和DNASTAR-Lesergene V6，序列同源性分析在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov/)和RAP.DB(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)上进行。
1.2.材料、菌株与载体
植物材料为疣粒野生稻(Oryza meyeriana)。大肠杆菌菌株(Escheichia coli，DH5a)，农杆菌菌株(Agrobac terium tumefaciens，EHA105)和酵母菌株(Y2HGold)以及水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)菲律宾生理小种P10为本实验室保存。
1.3.总RNA的提取
疣粒野生稻生长条件为：温度28-32℃，湿度：60-80％，光照250micromol/m2.s白光，光周期为12h/d。
(1)按样品数量准备好RNase Free的2ml EP管，并放入高温烘烤过的震荡用玻璃珠；
(2)选取鲜嫩幼叶75mg，放入2ml EP管中(14天苗岭苗和2ml EP管等长叶片约25mg，故取等管长的叶片3段)，立即放入液氮冷冻；
(3)将震荡适配器用液氮预冷，再将取样用的2ml EP管放入配器，安装并锁紧适配器后，25HZ震荡1.5min；
(4)每管(75mg组织)加1mlTRIzol试剂(添加TRIzol时，要保证样品低温，切莫同时从液氮中取出多管样品，导致样品升温降解。每次从液氮保存罐中取出1～2管样品，加TRIzol后立即晃动，直至TRZol融化并和样品完全混匀)；
(5)匀浆后，室温(气温低时用25℃金属浴)放置5min；
(6)每管样品加氯仿0.2ml(按每mlTRIzol加0.2ml氯仿计)，手工振荡15秒；
(7)室温(气温低时用25℃金属浴)静置5分钟后，4℃，12000g，15min(此步骤离心后，要格外小心)；
(8)用200ul枪头缓缓吸取上清(一般为0.5ml)到一新的RNase Free的1.5mlEP管(离心后的EP管要尽量轻拿轻放，移液时绝对不要碰到中间的蛋白层，液面越接近蛋白层，移液速度越要慢，以免因液体流动激起中间的蛋白层，如无把握，可以少吸取一些上清)，
(9)可选步骤(建议操作)：加等体积的氯仿异戊醇(一般为0.5ml)，手工振荡15秒，静置5min后，4℃，12000g，10min离心，取上清无色水相(一般为0.5ml)到RNase Free1.5mlEP管(注意事项与前一步一样，离心后的EP管尽量轻拿轻放，移液时，不要碰到中间的蛋白层，移液速度要慢，以免激起中间的蛋白层，如无把握可以少吸取一些上清)；
(10)加等体积的异丙醇(一般为0.5ml)，颠倒数次混匀，室温(气温低时用金属浴)静置十分钟；
(11)4℃，,12000g，10min，离心。可见总RNA在官底的白色沉淀，弃去上清；
(12)吸干残留的异丙醇。调整移液器到200L刻度，用枪头吸取约180L 75％乙醇，再吸取约20ul空气，轻轻搅动的RNA粘在枪头上，以减少RNA损失；
(13)补充加入75％乙醇1ml，颠倒混匀数次后，4℃,7500g，5min，离心。
(14)重复上诉洗涤步骤；
(15)去上清，用200L枪头尽量吸干液体，真空干燥沉淀5～10分钟(用旋转蒸发仪时，不要开离心功能，30℃抽干约5分钟时，可见残留液体逐渐减少，RNA由白色变为透明，此时为最佳干燥效果。如果继续干燥则会由透明变白，导致RNA难溶，且导致OD260/280<1.6)；
(16)加DEPC水20～30L，溶解总RNA；
(17)测OD值跑电泳确认RNA质量，加入后继续步骤或-80℃冻存。
1.4.RNA的逆转录
(1)引物设计：
以提取的水稻总RNA为模板，参照invitrogenTMM-MLV逆转录酶说明书进行逆转录。在RNAase-Free的PCR管中加入以下成分。
将加入上诉混合物的PCR管置于65℃，5min后，迅速置于冰上5-10min。加入以下成分10xbuffer 2.5L，M-MLV逆转录酶1L，RNaseOUTTM核酸酶抑制剂0.5L，Nuclease-FreeWater 2.5L至最终体积为20L。混匀后在42℃放置1h，然后在90℃加热10min来终止反应。将逆转录产物放于-20℃，保存备用。
依据OsbZIP1基因的ORF序列用软件Oligo设计引物，用于PCR扩增。引物由生工公司合成。
(2)PCR扩增
以疣粒野生稻cDNA为模板，PCR扩增CDS序列。扩增体系参考KOD FX DNA聚合酶说明书，体系如下
扩增条件为98℃预变性2min；98℃ 10s，62℃ 30s，68℃ 1min，33个循环，68℃延伸7min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并将目的片段切割下来置于1.5ml离心管中。用Promiga试剂盒回收目的片段。
(3)T-A连接：
连接反应体系如下
连接产物置于16℃PCR仪器中孵育过夜后用于转化感受态细胞。
(4)转化大肠杆菌：
1)将冻存的感受态大肠杆菌DH5α在冰上溶化；
2)加入5μL连接产物，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置15min，42℃热激90sec，立即放置于冰上15min；
3)加入800μL无抗的SOC培养基，37℃ 220rpm轻摇温育1h，使细胞恢复并表达质粒编码的抗生素抗性；
4)加入25μL IPTG(20mg/ml)和25μL X-gal(20mg/ml)，混匀后用三角推棒均匀地铺在含有氨苄青霉素的固体LB培养基上，室温吹干多余液体，37℃倒置平板培养过夜(12-16h)。
(5)重组质粒的筛选与鉴定
从转化LB平板上挑取3-5个白色阳性克隆，分别接种于500μL的含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌约8h。用M13通用引物进行PCR扩增，检测挑取的克隆是否为阳性。测序及序列分析
将含有阳性重组质粒的菌液进行序列测定，测序由铂尚生物技术有限公司完成。为了保证结果的准确性，一般选取2到3个阳性克隆进行测序。测序结果用DANStar软件去除载体序列后，进行Blast分析。
分别以疣粒野生稻和野生型日本晴总cDNA为模板，以OmbZIP1_F/R为引物进行PCR扩增，OmbZIP1基因大小为1413bp。
2.OmbZIP1的亚细胞定位
利用Gateway LR重组技术将目的片段分别连入pGWB505/506载体，使目的基因与绿色荧光蛋白GFP的N端或C端进行融合，用水稻茎原生质体和烟草进行瞬时表达后，在Leica TCS SP2激光共聚焦显微镜下观察融合GFP蛋白的定位情况。
2.1.电击转化
(1)从-80℃低温冰箱取出感受态细胞，置于冰上，感受态细胞完全融化后加入1L质粒，混匀，冰上放置20min；
(2)将含有质粒的感受态细胞放于电击杯中，置于冰上预冷20～30min，赶走气泡，然后在2500V下电击；
(3)取出电击杯，迅速加入800uL YEP培养基中，轻轻混匀，吸出菌液于1.5ml离心管中，28℃，230rpm振荡培养2h；
(4)吸取100L菌液涂布于响应抗性的YEP平板上，28℃，倒置培养1～1.5d。
2.2.亚细胞定位的烟草瞬时转染
将构建好的载体质粒点击转化进入农杆菌EHA105中,挑单克隆接种于2ml含有对应抗性的YEP培养液中。28℃，225rpm培养24h。10000g离心15min收集菌体，用适量的转染液悬浮细胞至OD600＝1.0。室温静置3h左右。用医用注射器将菌液注射进入烟草叶片中。2-3d后用激光共聚焦显微镜观察基因的表达情况。共侵染然草72小时后，在莱卡(Leica TCSSP2)激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位情况。如图2示，基因在烟草细胞中主要分布于细胞核，具备转录因子的特征。
3.OmbZIP1的自身互作研究
063075-DEST和063076-DEST是包含EYFP标签的BiFC目的载体，为本实验室保存。通过连接反应，将回收产物OsRP1L1基因连入pX2E-T中，构建得到入门载体。入门载体与目的载体重组：
25℃孵育1h后加0.5μl的Proteinase K solution，37℃放置10min终止反应。
热击转化：
1)将上述LR反应产物加入到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，混匀后冰上静置15min，42℃热击90s，立即置于冰上5min；
2)加入800μl无抗SOC液体培养基，于37℃，225rpm培养1h。
3)集菌重悬后，涂布于含有50μg/ml Kan的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
从转化LB平板上挑取单克隆，接种于含有50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃，225rpm摇菌8h。利用TaKaRa公司的质粒抽提试剂盒提取上述质粒，并电击转化农杆菌感受态细胞EHA105后，挑取单克隆，摇菌，保菌备用。
3.1.互作载体的烟草瞬时表达
1)将上述农杆菌在50μg/ml Kan和50μg/ml Str抗性YEP培养基中28℃过夜振荡培养；
2)经4000r/min离心5min收集菌体；
3)用浸润液(含10mM MgCl2，10mM MES(pH 5.6)，200μM乙酰丁香酮[Ace])重悬细胞，调整菌液浓度至OD600为1.0；
4)将调好OD值的两种菌液等体积(1:1)混合，在温室下放置4小时以上，同时设好阴性和阳性对照；
5)用2ml注射器(无针头)，在烟草叶片背面缓慢将菌液渗透注射到组织间隙中；
6)将浸润好的烟草培养三天后，在莱卡(Leica TCS SP2)激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位情况。
4.农杆菌介导的水稻转化
4.1.OmbZIP1超表达载体的遗传转化
(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导
挑取成熟的日本晴种子脱壳，选择饱满光洁无菌斑的种子若干。放于50ml离心管中。用70％乙醇消毒1min后，将乙醇倒出，加入35％的次氯酸钠消毒30min后，倒出次氯酸钠。用无菌水清洗5次，最后一次放置30min。然后倒去无菌水将种子置于滤纸上晾干后，将种子转入诱导培养基中，每一皿放置9-10粒种子。28℃，光照培养3-4周。
(2)胚性愈伤的继代增殖
将自然分裂的胚性愈伤转移到新鲜的继代培养基上，28℃，光照培养10-14天即可用于农杆菌的侵染。
(3)农杆菌介导的侵染和抗性愈伤的选择
将含有目的片段的p1300SUR超表达载体电击转化进入农杆菌。将挑选出的愈伤组织浸没于重悬农杆菌的AAM培养液10min后，倒出菌液将愈伤组织置于无菌滤纸上晾干。之后将愈伤组织转入共培养培养基中20℃暗培养3天。用无菌水将愈伤组织清洗后晾干再移至选择培养基上，28℃光照培养3-4周。
(4)抗性愈伤的分化
挑选抗性愈伤至分化培养基中，28℃光照培养至分化成苗。
4.2.OmbZIP1超表达材料的DNA获取
水稻转基因苗总DNA的提取采用TPS法。超表达转基因材料使用引物ZJ-28(CGCCGATGGTTTCTACAAAG)/ZJ-29(ACACATGGGGATCAGCAATC)进行PCR鉴定，该引物位于超表达载体HPT基因片段上。本实验以未转化的石狩白毛作为阴性对照，载体为阳性对照。PCR条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃30s，35循环；72℃ 7min；16℃保存。
TPS法提取DNA：
1)取样(0.5×3cm2)，放入1.5ml离心管中；
2)加磁珠，放入破碎仪板中(镜像对称)，加液氮，使用破碎仪(Retsch，Haan，Germany)，18Hz/s，震荡90s，样品震为粉末；
3)加入600μl的TPS溶液，放入65℃水浴锅中，温育30min后，12,000rpm离心5min，取上清；
4)加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置15min，12,000rpm离心5min；
5)弃上清，加入800～1000μl 75％的酒精，12,000rpm离心1min，弃上清；
6)重复步骤5，晾干；
7)加入含RNase的无菌H2O，37℃反应30min，-20℃储存。
TPS溶液配方：100mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，1M KCl。
4.3.超表达材料的RT-PCR鉴定
提取超表达转基因材料总RNA，逆转录得到cDNA，进行半定量实验。首先，以OsActin基因作为内参，将cDNA模板浓度调整一致，再以OmbZIP1-F/R为引物进行半定量实验。PCR条件为：94℃ 10min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，28个循环，72℃ 7min。
采用SsoFast EvaGreen Supermix试剂盒进行qRT-PCR实验。qRT-PCR反应及分析使用LightCycler 480real-time PCR仪(Roche，Basel，Switzerland)进行。PCR体系为：2×real-time PCR mix 5μl，引物各0.2μl，模板DNA 1μl，H2O 3.6μl，总体积10μl。PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 20s，45个循环；qRT-PCR实验中，使用水稻看家基因OsActin的表达量作为衡量cDNA浓度的内参，数据分析采用2-△(△Ct)方法进行。ΔCt＝同一目的基因的Ct值-OsActin的Ct值，-Δ(ΔCt)＝不同样品间ΔCt值的差值。
4.4.超表达材料对白叶枯抗性分析
白叶枯病菌培养，使用协本哲培养基。配方如下：
调pH值至7.2-7.4，固体培养基另加12g琼脂，密封，高压灭菌，冷却后，液体培养基于4℃冰箱保存，固体培养基倒平板，备用。
取出冻存的水稻白叶枯病菌菌株P10，用接菌环将其接种于协本哲固体培养基上，28℃倒置培养2天。将活化后的白叶枯病菌接种于协本哲液体培养基中，28℃，225rpm培养约48h。
接菌前，用无菌水配置成含菌量约1×109cfu/ml(OD600≈1.0)的菌液后进行接种。采用人工剪叶法对分蘖期的水稻进行接种实验。分别在接种7天和14天后观察水稻叶片的发病情况，本实验中使用用野生型石狩白毛接种作为对照实验。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种疣粒野生稻bZIP1基因作为增强水稻对白叶枯病抗性中的应用，其DNA序列是SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
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