CN1046559A - 制备胰高血糖素的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种生产胰高血糖素的新方法。该方法包括制备由下式代表的融合蛋白质:
X-GLu-GLucagon (I)
其中X是有70-170个氨基酸的先导顺序,GLu是谷氨酸残基,且GLucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序,以及
用能够在谷氨酸残基的羧基端特异地水解肽键的酶处理该融合蛋白质,从而裂解该融合蛋白质。
Description
本发明涉及制备胰高血糖素融合蛋白质、然后用酶处理并回收以生产胰高血糖素的有效方法,还涉及该生产方法中使用的编码胰高血糖素的DNA顺序,含有该DNA顺序的表达载体,以及携带该表达载体的转化体。
胰高血糖素(glucagon)是一种由胰岛A细胞分泌的肽激素,与胰岛B细胞分泌的胰岛素一起对碳水化合物代谢起着重要作用。胰高血糖素还是一种已知的高血糖-糖原分解因子(HGF);胰岛素可增进葡萄糖代谢并降低血葡萄糖水平,胰高血糖素则可使葡萄糖释入血中从而提高血糖水平。由于这些性质,故可使用胰高血糖素来试验生长激素的分泌、诊断胰岛瘤、进行糖元积聚试验、紧急治疗低血糖、在消化道的射线照相和内窥镜检查中作预处理及其他临床应用。
胰高血糖素的氨基酸顺序是已知的;其分子是由29个氨基酸组成的单股肽链,氨基末端是组氨酸;羧基末端是苏氨酸(见图11)。人、猪和牛胰高血糖素的氨基酸顺序是一样的,因此工业上可由牛或猪胰腺中分离并提纯胰高血糖素。市场上可以买到以这种方法生产的胰高血糖素产品。再者,James W.White和Grady F.Saunders(Nucleic Acids Research 14,4719-4730,1986)已经阐明了编码胰高血糖素的人DNA顺序(见图11)。自此,人们已将注意力转向尝试用DNA重组技术经济地大量生产胰高血糖素。
然而,如上所述,胰高血糖素是含29个氨基酸残基的短链肽,故分子量很低。当用DNA重组技术由宿主细胞分泌这种低分子量蛋白质时,它们将会被存在于宿主细胞内的蛋白水解酶降解。因此,如果使这种低分子量蛋白质与其他蛋白质结合成更为稳定的、有适当大小的融合蛋白质来表达,将是很有利的。这样,然后即可以用化学或酶方法处理这些融合蛋白质,分离出目的蛋白质。例如,日本专利公开63-284196号中介绍了一种以化学法处理融合蛋白然后回收目的蛋白质的方法。但化学处理常常伴有不利的付反应。另外,日本专利公开62-246600号描述了一种酶法处理融合蛋白以分离目的蛋白质的方法,其中是用谷氨酸特异性蛋白酶处理含表皮生长因子(EGF)的融合蛋白质,进而回收EGF这一目的产物。但已知EGF含有四个谷氨酸残基,因而使用这种酶难以回收到完整的EGF,而且收率很低。迄今为止,还没有一个经酶处理由融合蛋白中分离胰高血糖素的有效方法。
本发明生产胰高血糖素的方法,克服了现有技术中的上述缺陷及其他许多缺点和不足,该方法包括:
制备通式(Ⅰ)所示的融合蛋白:
X-Glu+Glucagon (Ⅰ)
其中X是70-170个氨基酸的先导顺序,Glu是谷氨酸残基,Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序,以及
用能够在谷氨酸残基的羧基末端特异地水解肽键的酶处理所说的融合蛋白,以裂解该融合蛋白。
在一优选方案中,用包括下列步骤的方法回收胰高血糖素:
(a).用适当的变性剂或表面活性剂溶解所说的融合蛋白质;
(b).降低所说变性剂或表面活性剂的浓度;
(c).向步骤(b)得到的混合物中加入酶,从而得到一种含有因融合蛋白部分分解而产生可溶性中间产物的反应混合物,
(d).将所说的反应混合物除盐,得到含有所说的中间产物和酶,但不含有所说的变性剂和表面活性剂的部分,
(e).借助含在所说部分中的酶使反应继续进行,以释放出胰高血糖素,以及
(f).分离释放的胰高血糖素。
本发明的表达载体具有编码上述融合蛋白的DNA顺序,并可在大肠杆菌宿主细胞中有效地表达所说的融合蛋白质。
本发明的转化体是向大肠杆菌细胞内导入上述表达载体而得到的。
本发明编码胰高血糖素的DNA顺序可用下式表示:
5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA
TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG
TGGCTGATGAACACC-3′(Ⅲ)
本发明的纯化胰高血糖素,纯度达99%或更高,所说的纯度是用高效液相层析法测定的。
因此,本发明可达到下述目的:
(1)提供一种生产胰高血糖素的方法,其中制备了含胰高血糖素的融合蛋白质,并以高效率用酶处理以回收胰高血糖素;
(2)提供一种按上述方法使用小量酶,生产与天然产物相同之胰高血糖素的方法;
(3)提供一个具有编码上述融合蛋白质之DNA顺序,并可使所说DNA顺序能在大肠杆菌中有效表达的表达载体,以及在其中导入了所说表达载体的转化体;
(4)提供一个编码胰高血糖素的DNA顺序,该DNA顺序是由能以高频率出现于大肠杆菌中的密码子组成的;以及
(5)提供纯度达99%或更高的纯化的胰高血糖素。
可借助下列附图进一步了解本发明的目的及其优点,从而进一步理解本发明。
图1显示了编码人胰高血糖素的DNA顺序。
图2a是构建质粒pGAl的流程图,该质粒用于构建本发明的表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon。
图2c是构建本发明之表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon的流程图。
图3显示表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon中含有的胰高血糖素DNA编码碱基顺序及该DNA上游和下游侧的相邻区域。
图4a是构建质粒Trp pAT △Cys huIFN γ的流程图,该质粒被用于构建本发明的表达载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon。
图4b是构建本发明之表达载体Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon的流程图。
图5是构建本发明之表达载体Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon的流程图。
图6是构建本发明之表达载体Trp pAT huIFNα80A2/glucagon的流程图。
图7a是用PCR方法合成含编码人IFNα80A2碱基顺序之DNA片段的流程图。
图7b显示在构建本发明的表达载体Trp pAT △CysⅡhuIFN γ/glucagon中,用PCR方法扩增编码胰高血糖素之基因顺序及其上游和下游DNA片段的流程图。
图7c是构建本发明之表达载体Trp pAT CysⅡhuIFN γ/glucagon的流程图。
图8显示人IFN80A2的DNA顺序和相应氨基酸顺序。
图9a和9b显示对按本发明的DNA重组技术得到的胰高血糖素所作反相HPLC和离子交换HPLC分析的结果。
图10a和10b显示对按本发明方法以DNA重组技术得到的胰高血糖素进行反相HPLC分析的结果。
图10c显示对市售天然胰高血糖素进行反相HPLC分析的结果。
图11显示人胰高血糖素的氨基酸顺序和编码所说胰高血糖素的人DNA顺序。
在用本发明的方法制备融合蛋白质X-Glu-Glucagon时,可选择表现有高表达水平的氨基酸顺序作为以X代表的先导顺序。所选择的先导顺序X应是当将编码X的碱基顺序导入大肠杆菌(一种适用的宿主)以诱导表达时,所说融合蛋白质占总蛋白产生量的20%或更高,且所说的融合蛋白质在宿主细胞中形成颗粒(即包涵体)。X的适当分子量为10-20千道尔顿(相当于70-170个氨基酸)。对X的适当的特异性选择包括干扰素γ、△Cys-干扰素γ、干扰素α80A2、干扰素β、干扰素δ、白细胞间素1β、牛生长激素、β-半乳糖苷酶、人白细胞介素8、大肠杆菌丙酮酸激酶Ⅰ、氨基糖苷酶3′-磷酸转移酶(APH)和含有这些多肽之氨基末端的各顺序等。含有干扰素γ、△Cys-干扰素γ和干扰素α80A2氨基末端之90-140氨基酸片段的顺序是特别适用的。构建含有多肽DNA编码顺序的表达载体(其中上述多肽顺序通过谷氨酸残基与胰高血糖素相连接),并用该表达载体转化大肠杆菌,从而可高效率地表达呈稳定融合蛋白质颗粒形式的所说多肽。
下文将按着生产方法的次序描述本发明生产胰高血糖素的方法。可按着“Molecular Cloning”(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1982)中所述程序完成用于本方法中的DNA重组技术。
编码胰高血糖素之DNA顺序的设计和化学合成
人、猪和牛胰高血糖素的氨基酸顺序是相同的,并可用下式代表:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr
Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln
Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr (Ⅱ)
James W.White和Grady F.Saunders(上述文献)已阐明了编码人胰高血糖素的DNA顺序。图11中显示了人胰高血糖素的氨基酸顺序和编码所说胰高血糖素的人DNA顺序。虽然可将该DNA顺序用于本发明,但最好是优先使用那些其中的密码子能以高效率用于大肠杆菌的DNA顺序。因此,本发明人在设计和合成的DNA顺序中尽可能地包含了以高频率用于大肠杆菌内的密码子。该 DNA顺序示于图1中。
编码胰高血糖素的DNA顺序相对较短,故可用化学合成方法制得。例如,可用自动核酸合成仪首先合成图1所示的15个片段(Fr.1-15),然后用层析法如高效液相层析法(HPLC)纯化这些片段,用激酶处理各片段,再用DNA连接酶以常规方法连接这些片段,即制成该合成的DNA。然后可用苯酚提取、乙醇沉淀、琼脂糖凝胶电泳等常规方法分离经上述连接反应得到的DNA。可按已述方法(Nucl.Acids Res.,8,253-264,1980)由琼脂糖凝胶中洗脱回收这些DNA片段。
然后可使用这些编码胰高血糖素的DNA顺序构建重组质粒(即表达载体)。
表达载体的构建
可按下述方法构建本发明的表达载体即:(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon,(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon,(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon (d)Trp pAT huIFN α80A2/glucagon和(e)Trp pAT △CysⅡhuIFN γ/glucagon。
(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon的构建
如图2c所示,本发明的表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon是使用下列三个组分构建的:
(1)含有编码胰高血糖素前半部分氨基酸顺序之碱基顺序的19bp片段;
(2)含有编码胰高血糖素后半部分氨基酸顺序之碱基顺序的片段;及
(3)Trp pAT huIFN γ/Kallikrein载体。DNA片段(1)的结构如下式所示:
1 2 3 4
GluHisSerGlnGly (Thr)
GCGAACACTCTCAGGGTAC
ACGTCGCTTGTGAGAGTCC
PstI KpnI (Ⅳ)
该片段由编码包括组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)及苏氨酸(Thr)之一部分在内的胰高血糖素N末端氨基酸的DNA顺序组成,其连接到接有谷氨酸(Glu)密码子GAA的5′末端上。另外,该片段在5′端有一个PstⅠ裂解位点,在3′端有一个KpnⅠ裂解位点。可经化学方法合成,然后再使构成片段的两单股19碱基寡核苷酸退火而得到该片段。
片段(2)是以图2a所示方式,用限制性酶裂解由ptac12(Amman等,Gene 25∶167,1983)(作为原型)构建的克隆载体pGAl而得到的。具体地说,可按下述方法由ptac 12构建pGAl。首先,将如下式所示的合成接头(Ⅴ)插入ptac 12的PvuⅡ裂解位点中:
然后用PvuⅡ和HindⅢ裂解如此得到的质粒(即ptac12/SLl;其在PvuⅡ裂解位点下游有一个HindⅢ裂解位点),并插入如图1所示的约100bp合成基因。然后如图2c所示,用HindⅢ裂解以这种方法得到的质粒pGAl,用Klenow片段将其末端切成平头,再用KpnⅠ切割如此得到的DNA片段,从而产生出一个90bp的KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。
可按下述方法制得Trp pAT huIFN γ/Kallikrein载体(3)。如图2b所示,首先用SalⅠ和BAP处理与人干扰素γ融合的PSTⅠ的表达质粒(即Trp pAT huIFN γ/PSTⅠ,J.Biochem.,102∶607-612,1987),并回收所得两个片段中的较大片段(即SalⅠ-SalⅠ片段)。另外用SalⅠ和XbaⅠ消化Trp pAT huIFN γ质粒,从而得到SalⅠ-XbaⅠ片段。进而合成下示的寡核苷酸衔接子Ⅵ(其含有编码人血浆激肽释放酶之识别位点(Phe-Arg)的DNA顺序)。
然后用T4 DNA连接酶连接上述SalⅠ-SalⅠ片段、SalⅠ-XbaⅠ片段及合成的寡核苷酸衔接子Ⅵ,得到质粒载体Trp pAT huIFN γ/Kallikrein。该载体具有一个处于色氨酸启动子控制下的、编码人干扰素γ上至135位丝氨酸残基之片段的顺序,然后是如图2b下部分所示处于下游区域的顺序。
用Xba Ⅰ、Klenow片段和Pst Ⅰ处理上述Trp pAT huIFN γ/Kallikrein载体(3),并使用T4 DNA连接酶,按常规方法将所得片段中较大者连接到上述片段(1)和(2)上,从而得到表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon(图2c)。图3显示了该表达载体中与编码胰高血糖素DNA之5′和3′端相邻的碱基顺序。
(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon的构建
如图4b所示,可用下列3个组分构建本发明的表达载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon:
(1)含有编码△Cys huIFN γ N末端氨基酸顺序(前半部)之碱基顺序的片段;
(2)含有编码△Cys huIFN γ C末端氨基酸顺序(后半部)和编码胰高血糖素之碱基顺序的片段;以及
(3)Trp pAT载体。
如图4b所示,DNA片段(1)得自由Trp pAT huIFN γ作为原型(Kiso to Rinsho,Vol.20∶4029-4034,1986,Japan)构建的huIFNγ表达质粒Trp pAT △Cys huIFN γ(见图4a)。可按下述方法由Trp pAT huIFN γ构建Trp pAT △Cys huIFN γ。首先,用ClaⅠ、AvaⅡ和SphⅠ消化Trp pAT huIFN γ,从而得到ClaⅠ和SphⅠ片段和AvaⅡ-SphⅠ片段。接下来合成下列寡核苷酸(Ⅶ):
MetGln(Asp)
5′-CGATACTATGCAG -3′
3′-TATGATACGTCCTG -5′
Cla I Ava Ⅱ (Ⅶ)
该合成的寡核苷酸衔接子(Ⅶ)编码△Cys huIFN γ的前部分,其由△Cys huIFN γ氨基末端的谷氨酰胺(Gln)和天冬氨酸(Asp)开始。合成所示的两条长度分别为13和14碱基的单股寡核苷酸,然后使之退火即得到寡核苷酸(Ⅶ)。
用T4 DNA连接酶连接上述ClaⅠ-SphⅠ片段、AvaⅡ-SphⅠ片段和合成的衔接子(Ⅶ)以构建质粒载体Trp pAT △Cys huIFN γ。然后用限制酶ClaⅠ和AsuⅡ消化该Trp pAT △Cys huIFN γ载体,从而得到一个275bp片段。该ClaⅠ-AsuⅡ片段编码由第4位谷氨酰胺残基开始上至相当于碱基顺序中AsuⅡ裂解位点的部分人干扰素γ。
DNA片段(2)是用AsuⅡ和SphⅠ切割上述表达载体Trp pAT huIFN γ/glucagon(图2c)所得到之片段中的较小片段。该AsuⅡ-SphⅠ片段包含编码人干扰素γ之后半部分氨基酸顺序的碱基顺序(其由相当于编码人干扰素γ之碱基顺序内AsuⅡ裂解位点处开始),向下游还包含一个编码胰高血糖素氨基酸顺序的碱基顺序。
DNA片段(3)是用ClaⅠ和SphⅠ切割上述表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon所得片段中的较大片段(图4b)。该ClaⅠ-SphⅠ片段含有色氨酸启动子的碱基顺序。
使用T4 DNA连接酶,以常规方法连接上述ClaⅠ-AsuⅡ片段(1)、AsuⅡ-SphⅠ片段(2)和ClaⅠ-SphⅠ片段(3),得到表达载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon(图4b)。
该载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon具有一个编码处于色氨酸启动子控制下的、由第4位Gln残基至第135位Ser残基的人干扰素γ片段的顺序,然后在下游区域中接有图4b下部分所示的顺序。该表达载体中,与编码胰高血糖素DNA的5′和3′端相邻的碱基顺序是与Trp pAT短huIFN γ/glucagon中的顺序(如图3所示)相同的。
(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon的构建
如图5所示,本发明的表达载体Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon是由(b)中所述的表达载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon(图4b)构建的。
具体地说,用下述程序制得Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon。首先,用限制酶AsuⅡ和PstⅠ切割载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon,用Klenow片段将末端切成平头。然后用T4 DNA连接酶以常规方法连接如此得到的较大片段(AsuⅡ/Klenow-PstⅠ/Klenow片段),从而得到载体Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon。
该载体Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon具有一个处于色氨酸启动子控制下的、编码部分人干扰素γ,即从第4位谷氨酰胺残基至第95位苯丙氨酸残基(Phe)的基因顺序且在下游侧,即编码甘氨酸和谷氨酸残基的顺序之后,还含有一个编码胰高血糖素之氨基酸顺序的碱基顺序。在该表达载体中,与编码胰高血糖素之DNA的5′末端相邻的碱基顺序示于图5的右下方。
(d)Trp pAT huIFN α80A2/glucagon的构建
如图6所示,本发明的表达载体Trp pAT huIFN α80A2/glucagon是使用下列三个组分构建的:
(1)含有编码huIFN α80A2之碱基顺序的片段;
(2)含有编码胰高血糖素之碱基顺序的片段;及
(3)Trp pAT载体。
如图7a所示,可用Trp pBR huIFN α80A2(日本专利公开61-56199号)作模板,以聚合酶链反应(PCR)方法(Saiki等,Science 239∶487,1988)制得DNA片段(1)。为此目的,首先以化学方法合成两条单股寡核苷酸链,即分别以下式代表的20核苷酸有意义引物(Ⅷ)和25核苷酸反意义引物(Ⅸ)。
有意义引物:
5′-AGTTAACTAGTACGCAAGTT-3′(Ⅷ)
反意义引物
5′-CAACCCTGCAGGCACAAGGGCTGTA-3′(Ⅸ)
如图7a所示,有意义引物(Ⅷ)相当于色氨酸启动子的前部分,而反意义引物(Ⅸ)则相当于huIFNα80A2的前部分。可使用这些引物,通过用Taq聚合酶扩增该片段而得到含有huIFNα80A2编码顺序的DNA片段。用ClaⅠ和PstⅠ切割该DNA顺序,得到ClaⅠ-PstⅠ片段。该ClaⅠ-PstⅠ片段含有上至第140位丙氨酸残基处之编码人IFNα80A2的基因顺序。
DNA片段(2)是如图6所示,用PstⅠ和BamHⅠ裂解上述表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon(图2c)得到的较小片段。该PstⅠ-BamHⅠ片段具有一个编码半胱氨酸、丝氨酸和谷氨酸的碱基顺序,及一个编码胰高血糖素的DNA顺序。
DNA片段(3)是如图6所示,用ClaⅠ和BamHⅠ裂解上述表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon(图2c)所得到的较大片段。该ClaⅠ-BamHⅠ片段含有色氨酸启动子的碱基顺序。
使用T4 DNA连接酶以常规方法连接上述ClaⅠ-PstⅠ片段(1)、Pst-BamHⅠ片段(2)和ClaⅠ-BamHⅠ片段(3),得到表达载体Trp pAT huIFNα80A2/glucagon(图6)。该载体Trp pAT huIFNα80A2/glucagon具有处于色氨酸启动子控制下的、编码上至第140位丙氨酸残基(Ala)之部分人IFNα80A2的基因顺序,该顺序下游侧与图6右下方指出的顺序相邻。huIFNα80A2的完整顺序如图8中所示。
(e)Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon的构建
如图7c中所示,本发明的表达载体Trp pAT △CysⅡhuIFN γ/glucagon是由上文(b)中所述的表达载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon衍生得到的,即所说的载体是以PCR方法(文献出处同上),使用含有失配的寡核苷酸,将只构成该质粒之一个PstⅠ裂解位点的碱基顺序CTGCAG转化成CTCGAG而得到的。具体地说,即用T4 DNA连接酶连接编 码胰高血糖素及其相邻顺序的DNA片段(1)和Trp pAT △Cys huIFN γ载体的较大片段(2)(两者参见下文所述),以得到Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon。
首先,化学合成两条单股寡核苷酸链,即由下式所示的21核苷酸有意义引物(Ⅹ)和21核苷酸反意义引物(Ⅺ):
有意义引物:
5′-CCGTTTCGCTCGAGCGAACAC-3′(Ⅹ)
反意义引物:
5′-AGCTCTAGAGCTTTTATTAGG-3′(Ⅺ)
如图7b所示,有意义引物(Ⅹ)相当于huIFNγ和胰高血糖素之连接处的顺序,而反意义引物(Ⅺ)则相当于由胰高血糖素的羧基末端区开始并包括其下游区部分的顺序。
可按下述方法制得编码胰高血糖素及相邻顺序的DNA片段(1)。使用上述两引物,以Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon作模板,用上述PCR方法扩增编码胰高血糖素及邻近顺序的DNA片段。因为有意义引物(Ⅹ)含有误配碱基对,所以已扩增之DNA片段的碱基顺序至少部分地不同于模板载体。这样,就使存在于编码干扰素γ与胰高血糖素连接区之碱基顺序中的PstⅠ裂解位点(CTGCAG)转化为已扩增之DNA顺序中的XhoⅠ裂解位点(CTCGAG)。结果,半胱氨酸密码子TGC变为编码丝氨酸残基的TCG。用XhoⅠ切割已扩增的DNA片段,并用Klenow片段将末端切成平头。然后用XbaⅠ切割该片段,由此得到DNA片段(1)。
如图7c所示,Trp pAT △Cys huIFN γ载体的较大片段(2)是用PstⅠ切割载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon,再用Klenow片段处理得到的。然后用XbaⅠ切割该顺序,其中所得到的较大片段就是所需的片段(2)。
使用T4DNA连接酶以常规方法连接上述XhoⅠ/Klenow-XbaⅠ片段(1)和PstⅠ/Klenow-XbaⅠ片段(2)即得到表达载体Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon。
该表达载体Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon具有一个处于色氨酸启动子控制下的、编码从第4位谷氨酰胺残基到第135位丝氨酸残基之人干扰素γ片段的基因顺序,该顺序则通过图7c右下方所示的顺序与其下游侧相接。
宿主细胞的转化及表达
按照“Molecular Cloning”(文献出处同上)中所述的方法,将上述表达质粒即(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon、(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon,(d)Trp pAT huIFN α80A2/glucagon和(e)Trp pAT △CysⅡ huIFNγ/glucagon导入适当宿主细胞中。根据四环素抗性选择转化体。经导入上述表达质粒(a)、(b)、(c)和(e)所得到的转化体可产生包含人胰高血糖素和人干扰素γ或其类似物的融合蛋白质。经导入上述表达质粒(d)而得到的转化体可产生包含人胰高血糖素及IFN α80A2的融合蛋白质。适用的宿主微生物包括大肠杆菌K12菌株C600、JM103、AG-1等。其中特别适用的是菌株K12 C600,使用该菌株可特别有效地产生含有人胰高血糖素的融合蛋白质。
将上述表达载体Trp pAT huIFNγ/glucagon导入大肠杆菌K12菌株C600中所得到的转化体被定名为Trp pAT huIFNγ融合的glucagon/C600,并已于1989年1月20日按照布达佩斯条约寄存于Fermentation Research Institute Agency for Industrial Science and Technology,1-3,Higashi 1 chome,Tsukuba-Shi,Ibaraki-Ken,Japan,保藏登记号为FERM BP-2250。
培养本发明的转化体并收集细胞后,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和抗胰高血糖素多克隆抗体进行Western印迹分析,进一步证实在宿主细胞中成功地表达了呈融合蛋白质形式的人胰高血糖素。即SDS-PAGE显示了分别相当于含人干扰素γ和干扰素α之融合蛋白质的约21千道尔顿和约14千道尔顿带。经Western印迹分析进一步证实了这些未修饰之融合蛋白质与抗胰高血糖素多克隆抗体的免疫学反应。用本发明方法,当分别用上述表达载体(a)、(b)、(c)、(d)和(e)转化宿主细胞时,每升转化体的培养混合物中约产生3.06g、2.43g、3.64g、0.24g和2.45g融合蛋白质。
溶解并用V8蛋白酶水解融合蛋白质,分离并纯化胰高糖血素
因为宿主细胞内融合蛋白质是以颗粒蛋白质的形式积聚的,所以为了从上述融合蛋白质(X-Glu-Glucagon)中回收胰高血糖素,须首先回收并溶解该颗粒蛋白质。
为此,可首先以常规方法离心培养混合物以收集细胞,然后破碎细胞并离心得到细胞团块。再加入变性剂或表面活性剂以溶解这些细胞团块。可用于此目的的变性剂包括胍(盐酸胍)、尿素等。可先将这种变性剂以足够量加入缓冲溶液中,然后用以溶解细胞团块。可使用胍或尿素的饱和溶液,但优选的浓度范围为6-8M。吐温80(商品名)是用于这一目的的适用表面活性剂,且其适宜浓度为0.05-0.2%(重量)。考虑到继后的酶处理过程,缓冲溶液的pH最好是在该过程中所用酶的最适pH范围内。例如,当使用由金黄色葡萄球菌中得到的蛋白酶V8(Sigma Chemical Co.,No.P-8400)时,pH值应为7.8,并且应使用pH值在7.8左右,且具有强缓冲能力的缓冲液,如碳酸氢铵缓冲液。如酶处理过程中使用的酶含有杂质如中性酶时,则可向所说的缓冲溶液内加入EDTA等酶抑制剂,以抑制所说杂质的活性。
以这种方法制得的含已溶解材料的混合物中含有足够高浓度的变性剂或表面活性剂,从而可阻止继后酶处理中所用酶的作用。在这种情况下,一般应该用适当稀释剂如没有变性剂或表面活性剂的上述缓冲溶液稀释该混合物。稀释程度应使蛋白质保持溶解状态,并能使下述酶处理过程中所用的酶发挥足够的效力。例如,当使用胍或尿素作变性剂时,应将混合物稀释到其中所说变性剂的浓度达到4M或更低,且最好为大约2M或更低。但应注意的是,含有已溶解材料的混合物中蛋白质浓度应为1-5mg/ml,且最好为2-3mg/ml。
然后经酶处理使胰高血糖素与蛋白质X分离开。该靶胰高血糖素是以部分变性形式存在的,并通过一个间插的谷氨酸残基与蛋白质X融合。因为胰高血糖素本身不含谷氨酸残基,所以可用能够在谷氨酸残基之羧基末端特异地切断肽键的酶处理,由完整形式的融合蛋白质中释放出胰高血糖素。适用于这一目的的酶包括由金黄色葡萄球菌中得到的蛋白酶V8(Sigma Chemical Co.,No.P-8400),但这并不是唯一的选择,原则上,能在谷氨酸残基之羧基端特异地切断肽键的任何酶都可以用于这一目的。例如,可优先选用由金黄色葡萄球菌ATCC No.12600得到的蛋白酶V8。酶的用量一般为上述稀释的细胞制剂中蛋白质总量的1/50至1/1000(W/W),最好是约1/500(W/W)。以这种方法向上述稀释的细胞制剂内加入这种酶得到反应混合物,可伴随缓慢搅拌于室温至40℃下反应30分钟至7小时。反应时间可根据所加酶的量而定。例如,当所加酶量为大约1/500(W/W)时,反应时间可为大约4小时。
可加入酸如盐酸、醋酸,使pH降至大约3,以终止酶促反应。如此得到的酶促反应混合物含有终产物胰高血糖素,以及分子量低于X-Glu-Glucagon融合蛋白质的中间产物。这些中间产物可能是因裂解蛋白质X内谷氨酸残基而产生的。即使除去混合物中含有的变性剂和表面活性剂,这些中间产物也仍是可溶的。下列因素可能影响到这些中间产物的产生:
(ⅰ)上述反应混合物中含有的酶可因变性剂和表面活性剂的短暂变性作用而显著降低了酶促活性,
(ⅱ)因裂解蛋白质X内谷氨酸残基所产生的低分子量分解产物抑制了酶促作用,
(ⅲ)因蛋白质较高级结构中的折迭或其他改变,而使得融合蛋白质中靶谷氨酸残基处的靶裂解位点对酶促作用降低了敏感性。
可以通过进一步处理和裂解这些中间产物来提高胰高血糖素的产率。为此而采取的一个有效方法是由酶促反应混合物中除去变性剂和表面活性剂,以及裂解蛋白质X内谷氨酸残基所形成的低分子量分解 产物。可用凝胶过滤、透析等除盐方法有效地除去这些物质,其中凝胶过滤是最为适用的方法。凝胶过滤最好在这样的条件下完成,即当除去变性剂或表面活性剂及低分子量分解产物的同时,也可在同一洗脱部分中洗脱酶和中间产物。收集凝胶过滤得到的含中间产物及酶的部分,将其pH调到酶的最适pH值,使酶变性并作用于已溶解的中间产物。然后于如上所述的同样条件下进行酶促反应,从而释放出胰高血糖素。
可联合使用几种常规技术,如凝胶过滤层析、亲和层析、离子交换层析、疏水凝胶层析等层析法或离心分离法,以纯化按这种方式由融合蛋白质中裂解下来的胰高血糖素。
上述回收胰高血糖素的方法只需要较少量的酶裂解谷氨酸残基,因此是比较经济的。
使用本发明的方法,当分别用上述表达载体(a)、(b)和(e)转化宿主时,在每升含转化体的培养基中约分别产生150mg160mg和170mg纯化的胰高血糖素。当使用携带表达载体(c)或(d)的转化体时,也可以同样方式由被表达的融合蛋白质中制得纯化的胰高血糖素。检测以上述方法制得的纯化胰高血糖素的纯度、氨基酸组成、氨基酸顺序及生物学活性,结果表明该物质确实是人胰高血糖素,它不含杂质,并且其氨基酸组成和生物学活性与天然胰高血糖素完全相同。因此,按上述方法制得的胰高血糖素可以以与常规胰高血糖素制剂完全相同的方式用于各种目的,如检测生长激素分泌、诊断胰岛瘤、糖元积聚试验、低血糖的紧急治疗、对消化道进行放射图象和内窥镜检查时的预处理及其他临床应用。
本发明不只限于生产融合蛋白质形式之人胰高血糖素的方法。本发明还包括表达所说融合蛋白质的载体、经导入这些载体所得到的转化体,以及某些编码胰高血糖素的特定DNA顺序。
因此,本发明提供了一种只使用少量酶,通过简单、有效且低成本的加工程序由X-Glu-glucagon形式的融合蛋白质中分离得到与天然胰高血糖素完全相同之胰高血糖素产品的方法。利用重组DNA技术产生的这种胰高血糖素能够以低成本大批量生产。此外,因为这种类型产品的氨基酸顺序与天然人胰高血糖素的氨基酸顺序完全相同,所以临床使用时不会发生变态反应,并可以与临床上常用的常规产品一样用于各种目的。
实施例
下文所述的基因重组实验是按照“Molecular Cloning”(Cold Spring Harbor Laboratory,1982)中指出的方法完成的。使用的酶均购自Takara Shuzo Co.,Ltd.。
(A)编码胰高血糖素之DNA顺序的设计和化学合成
原则上,可使用大肠杆菌有高利用频率的密码子设计编码人胰高血糖素之氨基酸顺序的DNA顺序。如此设计的DNA顺序,可编码图1中所示从起始组氨酸残基到第29位苏氨酸残基的氨基酸顺序。
用自动核酸合成仪化学合成图1中所示的15个短链片段。然后使这些片段退火,从而得到图1中所示有双键结构的DNA顺序。该DNA顺序在5′端有一个编码蛋氨酸的ATG密码子及AluⅠ酶切位点,且在3′端有两个TAA终止密码子和一个HindⅢ酶切位点。
(B)表达载体的构建
按下述方法构建5个能在大肠杆菌中表达人胰高血糖素的质粒载体,即(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon,(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon,(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon,(d)Trp pAT huIFN α80A2/glucagon和(e)Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon。
(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon的构建
经连接下文(1)-(3)中所述的三个DNA片段而构建该表达载体。图2a-2c中图解显示了该表达载体的构建程序。
(1)按下述方法制备含编码胰高血糖素前半部分氨基酸顺序之碱基顺序的19 bp PstⅠ-KpnⅠ片段。该碱基顺序的设计是在编码胰高血糖素前半部分氨基酸(包括组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和苏氨酸密码子的一部分)之DNA顺序的5′端加上谷氨酸密码子GAA和PstⅠ酶切位点,并在3′端提供一个KpnⅠ酶切位点。该碱基顺序已示于上文式(Ⅳ)中。然后化学合成用以形成该碱基顺序的两个19mer寡核苷酸并使之退火,从而得到含有胰高血糖素前半部分氨基酸编码顺序、在上游侧含PstⅠ酶切位点且在下游侧含KpnⅠ酶切位点的19bp片段。
(2)按下述方法制备质粒pGAl的KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。如图2a所示,使用质粒ptac12(文献同上)作原型,依下述程序构建克隆载体pGAl。首先,将上文式(Ⅴ)所示的15bp合成接头插入ptac12的PvuⅡ酶切位点中,从而构建成在PvuⅡ酶切位点下游有一HindⅢ酶切点的质粒(ptac12/SL1)。然后用PvuⅡ和HindⅢ切割该质粒ptac12/SL1,并插入前述(A)中得到的约100bp之合成基因(即图1中所示的DNA顺序)中,从而得到定名为pGAl的质粒。
另外,如图2c所示,用HindⅢ消化质粒pGAl并用Klenow片段处理,使其被切断的末端成为平头。然后用KpnⅠ消化已切割的质粒,并回收如此得到的较短片段,即90bp KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段。如图1所示,该KpnⅠ-HindⅢ/Klenow片段编码胰高血糖素的后半部分氨基酸顺序,即从上述胰高血糖素氨基酸编码顺序中间位置的KpnⅠ酶切位点开始的顺序。
(3)以下述方法制备质粒载体Trp pAT huIFN γ/Kallikrein的XbaⅠ-PstⅠ片段。如图2b所示,于37℃下用SalⅠ将由人干扰素γ和PSTⅠ形成之融合蛋白质的表达质粒(Trp pAT huIFN γ/PSTⅠ,J.Biochem.,102∶607-612,1987)消化1小时,然后用BAP将其产物37℃下处理2小时,并分离较大片段(SalⅠ-SalⅠ片段)。在另一操作中,用SalⅠ和XbaⅠ消化质粒Trp pAT huIFNγ并回收较小的XbaⅠ-SalⅠ片段。然后使用T4 DNA连接酶,用上文式(Ⅵ)所示的合成寡核苷酸接头(含有编码人血浆激肽释放酶之识别位点(Phe-Arg)的DNA顺序)连接上述SalⅠ-SalⅠ片段和上述XbaⅠ-SalⅠ片段。
将以该方式制得的质粒载体定名为Trp pAT huIFN γ/Kallikrein。该载体Trp pAT huIFN γ/Kallikrein含有处于色氨酸启动子控制下的上至第135位丝氨酸残基之部分人干扰素γ的基因编码顺序,其下游侧则是图2b下部分所示的顺序。如图2c所示用XbaⅠ切割载体Trp pAT huIFN γ/Kallikrein后,再用Klenow片段将切割的末端修成平头。接下来用PstⅠ切割该片段并回收所得的较大DNA片段(XbaⅠ-PstⅠ片段,3.6Kbp)。
如图2c中所示,用T4DNA连接酶连接上述DNA片段(1)-(3)(已分别按Nucleic Acids Res.,8∶253-264,1980中所述方法,经琼脂糖凝胶电泳分离),从而得到定名为Trp pAT huIFN γ/glucagon的表达载体。然后按照Proc.Natl.Acad Sci.USA 74∶5464-5467,1977中所述方法检查已插入该表达质粒中之DNA片段的碱基顺序,从而证实所说的DNA片段确实正确地编码了人胰高血糖素的全部29氨基酸顺序。
(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon的构建
该表达载体是经连接下文(1)-(3)中所述的三个DNA片段而得到的。图4a和4b中图解显示了该表达载体的构建。
(1)按下述方式制备人干扰素γ表达质粒Trp pAT △Cys huIFN γ的ClaⅠ-AsuⅡ片段。所说的人干扰素γ表达质粒Trp pAT △Cys huIFN γ是用Trp pAT huIFN γ(上述文献)作原型构建的(参见图4a)。首先,用ClaⅠ、AvaⅡ和SphⅠ消化Trp pAT huIFN γ,从而得到一个ClaⅠ-SphⅠ片段和一个AvaⅡ-SphⅠ片段。另外,进一步合成上述合成的寡核苷酸衔接子(Ⅶ)。然后用T4DNA连接酶连接该ClaⅠ-SphⅠ片段、AvaⅡ-SphⅠ片段和合成的衔接子(Ⅶ)。将如此制得的质粒定名为Trp pAT △Cys huIFN γ。
其后,如图4b右侧所示,于37℃下用ClaⅠ和AsuⅡ消化该质粒Trp pAT △Cys huIFN γ(1小时),并由产物中分离275bp片段(ClaⅠ-AsuⅡ片段)。
(2)于37℃下用AsuⅡ和SphⅠ消化Trp pAT huIFN γ/glucagon(1小时),然后分离较小片段,以制备上文(a)中所述的表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon的AsuⅡ-SphⅠ片段。
(3)此外,于37℃下用ClaⅠ和SphⅠ消化Trp pAT huIFN γ/glucagon(1小时)并分离较大片段,以制得上文(a)中所述表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon的ClaⅠ-SphⅠ片段。
按图4b中所示,使用T4DNA连接酶连接上述DNA片段(1)-(3)(各片段均已按Nucleic Acids Res.8∶253-264,1980所述,以琼脂糖凝胶电泳法分离出来),从而得到定名为Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon的表达载体。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5464-5467,1977中所述方法检查已插入该表达质粒Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon中之DNA片段的碱基顺序,从而证实所说的DNA片段确实正确地编码了人胰高血糖素的全部29氨基酸顺序。
(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon的构建
按下述方法构建表达载体。图5中显示了该表达载体的构建程序。
于37℃下用AsuⅡ和PstⅠ将上文(b)中所述的表达质粒Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon消化1小时,并用Klenow片段将切断的末端修成平头。再用T4DNA连接酶重新连接所得的较大片段(AsuⅡ/Klenow-PstⅠ/Klenow片段),如此便得到称为Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon的表达载体。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5464-5467,1977中所示方法检查已导入该表达质粒Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon中之DNA片段的碱基顺序,从而证实所说的DNA片段确实已正确地编码了人胰高血糖素的全部29氨基酸顺序。
(d)Trp pAT huIFNα80A2/glucagon的构建
连接下文(1)-(3)中所述的三个DNA片段以构建该表达载体。图6中图解显示了该表达载体的构建程序。
(1)按下述方法构建含编码huIFN α80A2之碱基顺序的ClaⅠ-PstⅠ片段。首先,合成两条单股寡核苷酸,即相当于人IFN α80A2表达质粒Trp pBR huIFN 80A2(文献同上)之Trp启动子后半部分的20核苷酸有意义引物(上述式(Ⅷ))和编码huIFN α80A2之后半部分的25核苷酸反意义引物(上述式(Ⅸ))。使用这些引物和Taq聚合酶,按照RCR方法(见上述文献)进行扩增以得到含有编码huIFN α80A2之碱基顺序的DNA片段。于37℃下用ClaⅠ和PstⅠ将该扩增的片段消化1小时,并分离所得到的ClaⅠ和PstⅠ片段。
(2)于37℃下用PstⅠ和BamHⅠ消化上文(a)中所述 的表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon(1小时)并分离较小的片段,制得含编码胰高血糖素之碱基顺序的PstⅠ-BamHI片段(图6)。
(3)同样,于37℃下用ClaⅠ和BamHI将上文(a)中得到的表达质粒Trp pAT huIFN γ/glucagon消化1小时,并分离较大片段,制得质粒载体Trp pAT huIFN γ/glucagon的ClaⅠ-BamHI片段(图6)。
如图6所示,按照Nucleic Acids Res.8∶253-264,1980中所说的方法,使用T4 DNA连接酶连接已用琼脂糖凝胶电泳法分离的上述DNA片段(1)-(3)。从而得到定名为Trp pAT huIFNα80A2/glucagon的表达载体。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5464-5467,1977中所述方法检查已导入该表达质粒Trp pAT huIFNα80A2/glucagon中之DNA片段的碱基顺序,从而证实所说的DNA片段确实已正确地编码了人胰高血糖素的整个29氨基酸顺序。
(e)Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon的构建
该表达载体是由上述(b)中制得的质粒Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon衍生的。图7c中图解显示了所说的表达载体的构建。
首先,合成一个21核苷酸有意义引物(上述式(Ⅹ))和一个21核苷酸反意义引物(上述式(Ⅺ))。使用这些引物和Taq聚合酶,以Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon作模板, 依据PCR方法扩增约130碱基对的DNA片段。37℃下用XhoⅠ将该扩增的DNA片段消化1小时,用Klenow片段处理,然后再于37℃下用XbaⅠ消化1小时,由此得到约110碱基对的DNA片段(1)。
然后于37℃下用PstⅠ将所说的载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon消化1小时,用Klenow片段处理,再于37℃下用XbaⅠ消化1小时并回收较大片段(2),从而由载体Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon制得DNA片段(2)。
用T4 DNA连接酶连接上述DNA片段即构建成表达载体Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon。然后按照Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5464-5467,1977中所述方法检查已导入该表达载体之DNA片段的碱基顺序,从而证实所说的DNA片段确实已正确地编码了人胰高血糖素的整个29氨基酸顺序。
(C)宿主细胞的转化和基因表达
使用大肠杆菌K12菌株C600(F-、thi-1、thr-1、leuB6、lacY1、tonA21、supE44)作为宿主细胞,用上述方法构建的质粒即(a)Trp pAT huIFN γ/glucagon,(b)Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon,(c)Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon,(d)Trp pAT huIFNα80A2/glucagon和(e)Trp pAT △CysⅡ huIFN γ/glucagon进行转化。因为这些表达质粒已向转化体内导入了所有必需的四环素抗性,故可将细胞在含有四环素的培养基(含有15μg/ml四环素的LB平皿培养基)上37℃培养过夜并选择已形成集落的细胞。然后,将这些集落于37℃下在改良的M9培养基中继续培养24小时,经离心收集细胞并悬浮于适于进行SDS凝胶分析的缓冲溶液(0.1M Tris-HCl,1%SDS、20%蔗糖和1%β-巯基乙醇,pH6.8)中,对该悬液进行SDS-PAGE分离,通过用考马斯亮兰R染色并使用抗胰高血糖素多克隆抗体进行Western印迹分析以检查含胰高血糖素之融合蛋白质的产生。结果表明用上述表达质粒(a)、(b)、(d)和(e)转化的宿主中产生了分子量约21千道尔顿的颗粒蛋白质,而用上述表达质粒(c)转化的宿主则产生了约14千道尔顿的蛋白质;此外,所说的蛋白质未经进一步修饰即可与抗胰高血糖素抗体反应。因此,这些结果进一步证实了所有转化体均产生了含所需胰高血糖素的融合蛋白质。
(D)融合蛋白质的溶解,用V8蛋白酶水解;胰高血糖素的分离和纯化
宿主细胞用上述表达载体(a)、(b)、(c)、(d)和(e)转化后,在改良的M9培养基中37℃培养24小时,离心收集细胞并悬浮于缓冲溶液A(8g/l氯化钠、0.2g/l氯化钾、2.9g/lNa2HPO4·12H2O,0.2g/1KH2PO4,5mM EDTA,18mM β-巯基乙醇和10mM苯脒,pH6.65)中。经搅拌后,离心该细胞悬液并洗涤所得细胞。将细胞重新悬浮于上述缓冲液A中,然后加入溶菌酶使其终浓度达到每克细胞含2mg(净重),并使混合物于35℃下反应1小时。接着超声处理并离心该反应混合物,以回收呈沉淀团块形式的颗粒部分。最后分别按照下文(D-1)和(D-2)中所述的一步骤或两步骤酶促 反应方法由这些颗粒部分中分离出胰高血糖素。
(D-1)以一步骤酶促反应法分离
将由上述表达载体(a)转化的宿主细胞中得到的颗粒部分悬浮于缓冲溶液A(含有6M盐酸胍)中,所说缓冲溶液的量为细胞培养物初始体积的1/6。彻底搅拌并进行超声处理后,将混合物于室温下放置2小时以使之溶解。然后离心除去尚未溶解的部分,并将上清液对含有2M的盐酸胍的缓冲溶液B(50mM碳酸氢铵、5mM EDTA,pH7.8)透析过夜。将透析液与等量缓冲溶液B混合,使盐酸胍浓度达到1M,并将所得样品称为(a)。对样品(a)的SDS-PAGE分析表明,每升培养液中约产生1g(50μmol)人干扰素γ。根据该混合物中所存在的蛋白质总量的比例,以1/10(W/W)比例向样品(a)中加入得自金黄色葡萄球菌并能特异地切割谷氨酸基之肽键的蛋白酶V8(Sigma Chemical Co.No.P-8400),使该混合物于37℃下反应1小时。因为所需的胰高血糖素是通过谷氨酸残基与干扰素γ融合的,而且在胰高血糖素中没有谷氨酸残基,所以该蛋白酶V8处理可以以完整和未改变的形式分离到整个胰高血糖素分子。然而,以这种方法得到的样品(b)中还含有因胰高血糖素与人干扰素γ分解而产生的各种长度的肽的混合物。为了除去这些有不同长度的肽类杂质,可离心样品(b),除去沉淀物,并使用C柱(4.6mm i.d.×250mm),对上清液进行反相HPLC分离。初始洗脱液是混合的32%乙腈-0.1%三氟乙酸溶剂,洗脱是随着渐渐增加乙腈的浓度进行的,即从洗脱开始后5分钟内每分钟增加0.5%,直到浓度达到42%为止。
结果如图9a中所示。于相同条件下用HPLC法分析胰高血糖素标准品,并在相当于滞留时间19.7分钟的位置进行检测。此后,收集在相当于图9a中约20分钟的位置洗脱的部分,并用离子交换HPLC法纯化该部分。将含有胰高血糖素的洗脱部分引入装有阳离子交换树脂DEAE-5PW的柱(7.5mm i.d.×75mm)中,所说的树脂是已用含有20%乙腈的10mM Tris-HCl(pH8.5)(缓冲溶液C)缓冲的。用缓冲溶液C洗5分钟后,于0-0.1M氯化钠的线性浓度梯度下(即当流速为1.0ml/分钟时,氯化钠浓度于30分钟内由0增加到0.1M)用缓冲溶液C洗脱所需材料。结果示于图9b中。基于胰高血糖素标准品的洗脱位置,进一步证实该分析物的基本成分(滞留时间19.3分钟,样品(b))是胰高血糖素。然后按下述方法分析样品(b)的氨基酸组成及氨基酸顺序。这些分析的结果分别示于表1和2中。
氨基酸组成分析
分析物用HPLC法(Aquapore RP-300柱,Brownlee)除盐并于110℃下用4M甲磺酸(含有0.2%3-(2-氨乙基)吲哚)水解24小时。然后用Hitachi 835型氨基酸分析仪检测该水解产物的氨基酸组成。
氨基酸顺序分析
经HPLC(Aquapore RP-300柱,Brownlee)脱盐后,用Applied Biosystems 477A型蛋白质顺序分析仪检测该分析物的氨基酸顺序。
上述纯化方法中,由1g(约50mol)融合蛋白质约纯化得到33mg(约10mol)胰高血糖素,即由每升培养液约得到33mg纯胰高血糖素。但该方法中需要使用大量酶裂解谷氨酸残基 的肽键。
表1 氨基酸组成
氨基酸数目
氨基酸 测定值 计算值
Asp 4.0 4
Thr 2.7 3
Ser 3.6 4
Glu 3.0 3
Gly 1.2 1
Ala 1.1 1
Val 1.0 1
Met 1.0 1
Leu 2.2 2
Tyr 2.0 2
Phe 2.0 2
Lys 1.2 1
His 1.0 1
Arg 1.9 2
Trp 1.1 1
总计 29
表2 氨基酸顺序分析
降解步骤 氨基酸残基 回收率(%)
1 His 9.6
2 Ser 77.9
3 Gln 27.5
4 Gly 29.6
5 Thr 52.2
6 Phe 28.2
7 Thr 47.4
8 Ser 58.6
9 Asp 19.6
10 Tyr 16.1
11 Ser 42.5
12 Lys 8.7
13 Tyr 14.0
14 Leu 12.0
15 Asp 11.3
16 Ser 25.4
17 Arg 9.9
18 Arg 7.8
19 Ala 7.7
20 Gln 7.9
21 Asp 6.3
22 Phe 3.2
23 Val 2.9
24 Gln 6.6
25 Trp 1.0
26 Leu 1.8
27 Met 1.0
28 Asn 2.9
29 Thr 0.8
(D-2)以两步骤酶促反应法分离
按下述方法由用上述表达载体(a)、(b)、(c)、(d)和(e)转化的大肠杆菌所产生的颗粒部分中制备胰高血糖素。首先,将1g离心沉淀的颗粒部分溶解在35ml缓冲溶液1(8M盐酸胍、50mM碳酸氢铵、5mM EDTA和10mM DTT,pH7.8)中。然后加入不含盐酸胍的缓冲溶液2(50mM碳酸氢铵、5mM EDTA和10mM DTT,pH7.8),将溶液中盐酸胍的浓度调到2M,使蛋白浓度达到2-3mg/ml(用Proteinassay试剂盒(BioRad Co.)检测)。然后向该溶液内加入等于该混合物中蛋白质量1/500(W/W)的金黄色葡萄球菌蛋白酶V8(Sigma Chemical Co.No.P-8400),并在缓慢搅拌下于25℃进行反应。4小时后,加入盐酸将溶液的pH调到3.0以终止反应。在终止酶促反应期间或其后取样,使用Vydac Protein C4柱(0.46mm内径×15.0cm)进行反相HPLC以检测反应产物。初始洗脱剂是混合的25%乙腈-0.1%三氟乙酸溶剂,洗脱过程中丙腈的浓度呈线性增加,于洗脱开始后25分钟内达到35%。分析结果表明,融合蛋白质及小量胰高血糖素的部分分解产物是随着反应的进行逐渐产生的。
因此,酶促反应之后应离心除去反应混合物中的不溶性材料,并使用Sephadex G-15柱(5cm内径×30cm,容量590ml)。使用的洗脱剂为含有5mM EDTA的50mM乙酸缓冲溶液(pH3.3),洗脱后回收含有中间产物和蛋白酶V8的高分子量部分。用氢氧化铵将该部分调至pH7.8,并在缓慢搅拌下于25℃再次进行反应。从而使反应混合物中的蛋白酶V8复性并作用于中间产物,约5小时内胰高血糖素即由所说的中间产物中释放出来。向该反应混合物中加入尿素使其终浓度达6M,然后用乙酸调pH至5.0,并使混合物终体积达到约200ml。使用预先用缓冲液3(用乙酸调至pH5.0的6M尿素溶液)平衡过的Sephadex柱(2.0cm内径×20.0cm,容量63ml,高流速型)对该混合物进行离子交换层析。连续用120ml缓冲溶液3和120ml含有0.05M氯化钠的缓冲溶液洗柱,除去未吸附的部分。然后于线性氯化钠浓度梯度即缓冲溶液3中氯化钠浓度由0.05M增加至0.15M的条件下(使用相当于柱容量15倍的洗脱剂)进行洗脱,并用约含有0.1M氯化钠的缓冲液洗脱胰高血糖素。使用预先已用50mM乙酸平衡过的Sephadex G-15柱(5cm内径×30cm,容量590ml),以凝胶过滤层析法使胰高血糖素部分(约70ml)脱盐。此时胰高血糖素的纯度为大约97-98%,因此尚须用HPLC法进一步纯化。
将按上述凝胶过滤法制得的含胰高血糖素部分导入用25.0%乙腈-0.1%三氟乙酸平衡过的Vydac Protein C4柱(2.2cm内径×25cm,10-15μm填充孔径300
)中,借助乙腈线性浓度梯度〔即乙腈浓度于120分钟内由25%增加到30%(流速4ml/分钟)〕分离和纯化胰高血糖素。此后胰高血糖素约洗脱90分钟。对于分别用载体(a)、(b)和(e)转化的大肠杆菌来说,以这种方法制得的离心沉淀的颗粒部分,每克分别约产生16.3mg、21.9mg和23.1mg纯胰高血糖素,而每克融合蛋白质的相应产率分别为49.0mg、65.8mg和69.4mg。如以表达载体(c)和(d)进行转化时,也可用相似方法得到纯化的胰高血糖素。
使用下述方法分析由用表达载体(a)转化的大肠杆菌产生的纯化之胰高血糖素的(ⅰ)纯度,(ⅱ)氨基酸组成,(ⅲ)氨基酸顺序及(ⅳ)生物学活性。
(ⅰ)纯度
使用Vydac Protein C4柱(0.46cm内径×15.0cm)以反相层析法检测纯度。使用的初始洗脱剂是混合的25%乙腈-0.1%三氟乙酸溶剂,借助由开始洗脱的25分钟内乙腈浓度增加到35%这一线性浓度梯度进行洗脱。如此得到的HPLC洗脱曲线如图10a所示,图10c则显示市售天然胰高血糖素(Sigma Chemical Co)的相应洗脱曲线。从图10a中可以看出,这种纯化的胰高血糖素的洗脱曲线只展示单一峰,故其中不含有杂质(即纯度为100%)。此外,这种纯化的胰高血糖素的洗脱滞留时间23.016分与图10c中所示天然胰高血糖素的洗脱滞留时间相同,即23.088分钟,此证明这种胰高血糖素确实与天然胰高血糖素完全相同。图10b中显示了按上述方法制得的另一胰高血糖素样品的HPLC洗脱图形。这种纯化胰高血糖素的洗脱滞留时间是20.404分钟,其纯度为99.3%。分析用表达载体(b)-(e)转化之转化体所产生的纯化胰高血糖素制剂,基本上都得到同样的结果。
(ⅱ)氨基酸组成
分析氨基酸组成之前,先于110℃下用含有0.2%3-(2-氨乙基)吲哚的4M甲磺酸将分析物水解24小时,然后用Hitachi835型氨基酸分析仪测定样品的氨基酸组成。结果(如表3所示)表明,用表达载体(a)转化的大肠杆菌产生之纯化胰高血糖素的氨基酸组成比例与理论值完全相同。分析用表达载体(b)-(e)转化之转化体所产生的纯化胰高血糖素制剂,基本上都得到同样的结果。
(ⅲ)氨基酸顺序分析
使用Applied Biosystems 477A型蛋白质顺序仪检测用表达载体(a)转化的宿主细胞产生之纯化胰高血糖素的氨基酸顺序。这一分析结果(如表4所示)表明,用表达载体(a)转化的大肠杆菌所产生之纯化胰高血糖素的氨基酸顺序与天然胰高血糖素完全相同。分析用表达载体(b)-(e)转化之转化体所产生的纯化胰高血糖制剂,基本上都得到了同样的结果。
表3 氨基酸组成
氨基酸数目
氨基酸 测定值 计算值
Asp 4.0 4
Thr 2.8 3
Ser 3.7 4
Glu 3.1 3
Pro 0.0 0
Gly 1.0 1
Ala 1.0 1
Cys/2 0.0 0
Val 0.9 1
Met 1.0 1
Ile 0.0 0
Leu 2.1 2
Tyr 2.0 2
Phe 2.0 2
Lys 1.1 1
His 1.0 1
Trp 1.1 1
Arg 2.0 2
总计 29
表4 氨基酸顺序分析
降解步骤 氨基酸残基 测定的氨基酸量(pmol)
1 His 1333
2 Ser 885
3 Gln 1412
4 Gly 1597
5 Thr 1146
6 Phe 2473
7 Thr 550
8 Ser 333
9 Asp 975
10 Tyr 1162
11 Ser 357
12 Lys 658
13 Tyr 804
14 Leu 1023
15 Asp 701
16 Ser 213
17 Arg 529
18 Arg 551
19 Ala 779
20 Gln 639
21 Asp 523
22 Phe 464
23 Val 537
24 Gln 178
25 Trp 109
26 Leu 356
27 Met 277
28 Asn 278
29 Thr 31
上样量=3856pmol
(ⅳ)生物学活性
使用大鼠肝细胞膜部分进行受体分析,使用游离的大鼠肝细胞进行cAMP反应分析,并研究由灌注的肝标本释放的葡萄糖量,以这些作为生物学活性的指标。结果表明,在所有分析中,由用表达载体(a)-(e)转化的大肠杆菌产生的纯化胰高血糖素具有与天然胰高血糖素同样的活性,故再次证明这些产物是与天然胰高血糖素完全相同的。
应明确的是,对本领域技术人员来说,在不超出本发明范围和精神的前提下,对本发明所作的各种其他改动都将是显而易见和容易做到的。因此,本发明待批权利要求的范围不仅限于本说明书中描述的具体内容,这些权利要求应包括有新颖性的所有特征以及被本领域内技术人员视为等同物的所有特征。
Claims (11)
1、一种制备胰高血糖素的方法,其包括
制备下式所示的融合蛋白质
X-Glu-Glucagon (Ⅰ)
其中X是70-170个氨基酸的先导顺序,Glu是谷氨酸残基,Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序,以及
用可特异地水解谷氨酸残基羧基端肽键的酶处理所说的融合蛋白质,以裂解所说的融合蛋白质。
2、根据权利要求1的方法,其中所说的顺序X含有干扰素γ、△Cys干扰素γ,或干扰素α80A2之氨基末端顺序的一部分。
3、根据权利要求1的方法,其中所说的胰高血糖素氨基酸顺序如下式所示:
His Ser Gln Gly Thy Phe Thr Ser Asp Tyr
Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln
Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
(Ⅱ)
4、根据权利要求1的方法,其中所说的融合蛋白质是通过培养将表达式Ⅰ所示融合蛋白质的表达载体导入大肠杆菌所得到的转化体而制备的。
5、根据权利要求1的方法,其中所说的胰高血糖素是经下述程序回收的,包括
(a)用适当的变性剂或表面活性剂溶解所说的融合蛋白质,
(b)降低所说变性剂或表面活性剂的浓度,
(c)向步骤(b)中制得的混合物中加入酶,从而得到含有因所说融合蛋白质部分分解而产生之可溶性中间产物的反应混合物,
(d)将所说的反应混合物脱盐,以得到含有所说中间产物和所说的酶,且不含有所说变性剂与表面活性剂的部分,
(e)借助所说部分中含有的酶使反应继续进行,以释放出胰高血糖素,以及
(f)回收释放的胰高血糖素。
6、根据权利要求1的方法,其中所说的酶是得自金黄色葡萄球菌的蛋白酶V8。
7、编码胰高血糖素的DNA顺序,该顺序如下式所示:
5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA
TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG
TGGCTGATGAACACC-3′ (Ⅲ)
8、含有编码下式所示融合蛋白质之DNA顺序的表达载体:
X-Glu-Glucagon (Ⅰ)
其中X是70-170个氨基酸的先导顺序,Glu是谷氨酸残基,且Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序。
9、根据权利要求8的表达载体,其选自于Trp pAT huIFN γ/glucagon、Trp pAT △Cys huIFN γ/glucagon、Trp pAT △Cys短huIFN γ/glucagon、Trp pAT huIFNα80A2/glucagon及Trp pAT△CysⅡ huIFN γ/glucagon。
10、通过向大肠杆菌内导入权利要求8或9的表达载体而得到的转化体。
11、一种纯度为99%或99%以上的纯化的胰高血糖素,所说的纯度是用高效液相层析法测定的。
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