NO308667B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av fusjonsproteiner - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner. Oppfinnelsen omhandler også forskjellige oligonukleotid- og aminosyresekvenser som utgjør fusjonsproteinene fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

Proteiner, som i tillegg til det ønskede protein også har en uønsket bestanddel eller "ballast"-bestanddel i sluttpro-duktet benevnes fusjonsproteiner. Når proteiner fremstilles ved hjelp av genteknologi anvendes det mellomliggende trinn med et fusjonsprotein særlig hvis det ønskede protein ved direkte uttrykking spaltes relativt hurtig av vertsendogene proteaser som bevirker reduserte eller fullstendig util-strekkelige utbytter av det ønskede protein.

Størrelsen av ballastbestanddelen av fusjonsproteinet blir vanlig selektert på en slik måte at det oppnås et uoppløselig fusjonsprotein. Denne uoppløselighet tilveiebringer ikke bare den ønskede beskyttelse mot de vertsendogene proteaser, men tillater også lett separering fra de oppløselige celle-komponenter. Det er vanlig godtatt at andelen av det ønskede protein i fusjonsproteinet er forholdsvis liten, nemlig at cellen frembringer en forholdsvis stor mengde "ballast". Fremstillingen av fusjonsproteiner med en kort ballastbestanddel har vært forsøkt. F.eks. ble det fremstilt en genfusjon som koder for et fusjonsprotein fra de første 10 aminosyrer av p-galaktosidase og somatostatin. Det ble imidlertid iakttatt at denne korte aminosyrekjede ikke beskyttet fusjonsproteinet tilstrekkelig mot spaltning av de vertsendogene proteaser (US-A-4.366.246, spalte 15, avsnitt 2).

Fra EP-A-0 290 005 og 0 292 763 kjennes fusjonsproteiner hvis ballastbestanddel består av et IS-galaktosidasefragment med mer enn 250 aminosyrer. Disse fusjonsproteiner er uoppløse-lige, men de kan lett gjøres oppløselige med urea (EP-A-

0 290 005).

Selv om fusjonsproteiner er beskrevet på området er utvikling av fusjonsproteiner med ønskelige egenskaper slik som proteaseresistens en omstendelig prosedyre og resulterer ofte i fusjonsproteiner som har et antall uønskede egenskaper.

Det foreligger således et behov for en effektiv fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner med et antall til-trekkende egenskaper inkluderende proteaseresistens, riktig sammenfolding og effektiv spaltning av ballasten fra det ønskede protein.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner. Fusjonsproteiner fremstilt i samsvar med den foreliggende oppfinnelse inneholder et ønsket protein og en ballastbestanddel. Fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse involverer utvikling av et oligonukleotidbibliotek (blanding) som koder for ballastbestanddelene, det blandede oligonukleotid (bibliotek) innskytes i en vektor slik at oligonukleotidet er funksjonelt knyttet til en regulatorregion og til det strukturelle gen som koder for det nevnte ønskede protein, og vertscellene med den således oppnådde vektorpopulasjon transformeres. Trans-formanter selekteres så som uttrykker et fusjonsprotein med høyt utbytte.

Fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse omhandler videre et oligonukleotid som koder for en aminosyre eller for en gruppe av aminosyrer som tillater en lett spaltning av det ønskede protein fra den nevnte ballastbestanddel. Spaltningen kan være enzymatisk eller kjemisk.

Oppfinnelsen omhandler også et oligonukleotid som er konstruert slik at det fører til et uoppløselig fusjonsprotein som lett kan oppløseliggjøres. Fusjonsproteiner fremstilt i samsvar med oppfinnelsen tilfredsstiller således de krav som er etablert for proteaseresistens.

Oligonukleotider i oppfinnelsens sammenheng kan videre konstrueres slik at ballastbestanddelen ikke forstyrrer sammenfoldingen av det ønskede protein.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 og dens fortsettelse i fig. la og fig. lb viser konstruksjonen av plasmidpopulasjonen (genbank) pINT4x fra det kjente plasmid pH154/25<*>via plasmid pINT40. Andre konstruksjoner er ikke grafisk fremstilt pga at de lett fremgår fra figurene. Fig. 2 er et kart av plasmid pUHIO inneholdende det komplette

HMG CoA reduktasegen.

Fig. 3 og 3a viser konstruksjon av pIK4 som er et plasmid

inneholdende mini-proinsulingenet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner inneholdende et ønsket protein og en ballastbestanddel, som er kjennetegnet ved

(a) konstruksjon av et blandet oligonukleotid som koder for det nevnte ønskede protein og en ballastbestanddel, hvori det nevnte oligonukleotid inneholder en DNA-sekvens (kodetråden)

(DCD)X

hvori D er A, G eller T og x er 4 - 12,

og hvor det nevnte oligonukleotid ved sin 3<1->ende av kodetråden koder for en aminosyre eller for en gruppe av aminosyrer som tillater en lett avspaltning av det nevnte ønskede protein fra den nevnte ballastbestanddel, og hvor det nevnte oligonukleotid er konstruert slik at ballastbestanddelen ikke forstyrrer foldingen av det nevnte ønskede protein, (b) det blandede oligonukleotid innskytes i en vektor slik at det er funksjonelt knyttet til en regulatorregion og til det strukturelle gen som koder for det nevnte ønskede protein, (c) vertscellene transformeres med den således oppnådde

vektorpopulasjon, og

(d) fra transformantene selekteres en eller flere kloner som

uttrykker et fusjonsprotein i høyt utbytte.

Oligonukleotidet koder ved 3<1->enden for en aminosyre eller en gruppe av aminosyrer som tillater eller lett tillater en foretrukket enzymatisk spaltning av ballastbestanddelen fra det ønskede protein. I henhold til en utførelsesform konstrueres et oligonukleotid som tilveiebringer et uopp-løselig fusjonsprotein som lett kan gjøres oppløselig. Spesielt konstrueres et oligonukleotid som koder for en ballastbestanddel som ikke forstyrrer sammenfoldingen av det ønskede protein.

Av praktiske grunner vil konstruksjonen i oppfinnelsens sammenheng av oligonukleotid for ballastbestanddelen bevirke at denne er meget kort.

Det var overraskende å iaktta at selv når de har en ytterst kort ballastbestanddel tilfredsstiller fusjonsproteiner ikke bare de krav som er etablert for proteaseresistens, men blir også produsert med en høy uttrykningsgrad og om ønsket, hvis fusjonsproteinet er uoppløselig, kan dette lett gjøres løselig. I den oppløste eller oppløselige tilstand vil da den korte ballastbestanddel i oppfinnelsens sammenheng til-late en sterisk gunstig konformasjon av det ønskede protein slik at dette kan sammenfoldes riktig og lett separeres fra ballastbestanddelen.

Hvis det ønskede protein tildannes i en proform kan ballastbestanddelen sammensettes på en slik måte at dens spaltning kan foregå samtidig med transformasjonen av proproteinet til det modne protein. Ved f.eks insulinfremstilling kan ballastbestanddelen og C-kjeden fjernes samtidig og gir et derivat av det modne insulin som kan transformeres til insulin uten noen bireaksjoner som kunne medføre mye tap. Den korte ballastbestanddel i oppfinnelsens sammenheng er faktisk kortere enn de vanlige signalfrekvenser av proteiner og forstyrrer ikke sammenfoldingen av det ønskede protein. Den behøver derfor ikke å fjernes før det endelige prosess-trinn som gir det modne protein.

Oligonukleotidet som koder for ballastbestanddelen inneholder DNA-sekvensen (kodetråden) hvori D står for A, G eller T og x er 4 - 12, foretrukket 4 - 8 .

Spesielt er oligonukleotidet kjennetegnet ved DNA-sekvensen

(kodetråden)

hvori N i NNN-tripletten står for identiske eller forskjellige nukleotider, inkluderende stoppkodoner, z er 1 - 4 og y + z er 6 - 12, foretrukket 6-10, hvori y er minst 4. Det har vist seg fordelaktig for oligonukleotidet at det har DNA-sekvensen (kodetråden) særlig hvis det har DNA-sekvensen (kodetråden) eller fordelaktig

hvori W står for A eller T.

De ovennevnte DNA-modellsekvenser tilfredsstiller alle disse krav. Kodon DCD koder for aminosyrene serin, treonin og alanin og derfor for en forholdsvis hydrofil proteinkjede. Stoppkodoner ekskluderes og seleksjon av aminosyrene forblir innenfor en håndterbar ramme. Det følgende er en spesielt foretrukket utførelsesform av DNA-sekvensen for ballastbestanddelen, særlig hvis det ønskede protein er proinsulin: eller

hvori y' betyr 3 til 6, spesielt 4 til 6.

Det andre kodon, GCD, koder for alanin og kompletterer gjen-kj ennelsessekvensen for restriksjonsenzymet Ncol, med den betingelse at den forreste reguleringssekvens ender med CC. Den nest siste triplett koder for treonin og representerer sammen med kodonet CGT for arginin, gjenkjennelsessekvensen for restriksjonsenzymet Mlul. Følgelig kan dette oligonukleotid lett og utvetydig innlemmes i genkonstruksjoner. Gruppen (NNN)zkoder i 31 - stillingen for en aminosyre eller en gruppe av aminosyre som tillater enkel og foretrukket enzymatisk separering av ballastbestanddelen fra det ønskede etterfølgende protein. Det er greit å selektere nukleotidene i denne gruppe på en slik måte at de ved 3<1->enden koder spaltningssetet av et restriksjonsenzym som tillater sammen-knytting av det strukturelle gen for det ønskede protein. Det er også fordelaktig at ATG-utgangskodonet og om nødvendig den første DCD-triplett innlemmes i gjenkjennelsessekvensen av et restriksjonsenzym slik at genet for ballastbestanddelen i oppfinnelsens sammenheng lett kan innskytes i de vanlige vektorer.

Den øvre grense for z oppnås på den ene side fra det ønskede spaltningssete for (enzymatisk) spaltning av det oppnådde fusjonsprotein, dvs at den omfatter kodoner f.eks. for aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg i det tilfellet at spaltning skal gjennomføres med faktor Xa. Generelt er den øvre grense for summen av y og z 12, ettersom ballastbestanddelen selv-følgelig bør være så liten som mulig og fremfor alt ikke forstyrre sammenfoldingen av ønskede protein.

Av hensiktsmessighetsgrunner foretrekkes bakterier eller lave eukaryotiske celler som gjærceller som vertsorganismer i de genteknologiske prosesser, på betingelse av at høyere organ-ismer ikke kreves. I disse prosesser reguleres uttrykkingen av det hetereologiske gen ved hjelp av en homolog regulatorregion, dvs en region som er egen for verten eller forlikelig med vertscellen. Hvis et forpeptid uttrykkes forekommer det ofte at forsekvensen også er heterolog til vertscellen. I praksis resulterer denne manglende "sekvensharmoni" ofte i variable og ikke forutsigbare proteinutbytter. Ettersom ballastsekvensen i oppfinnelsens sammenheng er tilpasset sin omgivelse gir seleksjonsprosessen i oppfinnelsens sammenheng en DNA-konstruksjon som er kjennetegnet ved hjelp av denne "sekvensharmoni".

Begynnelsen og slutten av ballastbestanddelen er bestemt ved denne konstruksjon, metionin er ved begynnelsen og en aminosyre eller gruppe av aminosyrer som tillater den ønskede separering av ballastbestanddelen fra det ønskede protein er ved slutten. Hvis f.eks. det ønskede protein er proinsulin, selekteres fordelaktig som NNN en triplett som koder for arginin som det siste kodon ettersom dette tillater den spesielt gunstige samtidige avspaltning av ballastbestanddelen med fjernelse av C-kjeden. Selvfølgelig kan slutten av ballastbestanddelen også være en aminosyre eller en gruppe av aminosyrer som tillater en kjemisk spaltning, f.eks. metionin, slik at spaltning er mulig med cyanbromid eller cyan-klorid.

Den mellomliggende aminosyresekvens bør være så kort som mulig slik at sammenfoldingen av det ønskede protein ikke påvirkes. Denne kjede bør videre være forholdsvis hydrofil slik at oppløseliggjøring lettes med uoppløste fusjonsproteiner og fusjonsproteinet forblir oppløselig. Cysteinrester er uønsket ettersom disse kan forstyrre dannelsen av disul-fidbroene. Det DNA som koder for ballastbestanddelen synte-tiseres i form av et blandet oligonukleotid; det innlemmes i et passende uttrykkingsplasmid umiddelbart foran det strukturelle gen for det ønskede protein og E. coli transformeres med genbanken oppnådd på denne måte. Passende genstrukturer kan oppnås på denne måte ved hjelp av seleksjon av bakteriekloner som frembringer tilsvarende fusjonsproteiner.

Det ble tidligere nevnt at spaltningssetene for restriksjonsenzymene ved begynnelsen og slutten av nukleotidsekvensen som koder for ballastbestanddelen skal anses bare som eksempler. Gjenkjennelsessekvenser som omfatter startkodon ATG og hvori hvilke som helst nukleotider som følger kan inkludere kodonet for passende aminosyrer er som eksempel også tilsvarende for restriksjonsenzymene Afllll, Ndel, Nlalll, NspHI og Styl. Ettersom arginin med den foretrukne utførelsesform skal være ved slutten av ballastsekvensen og ettersom der er seks forskjellige kodoner for arginin, kan ytterligere passende restriksjonsenzymer også finnes her for bruk i stedet for Mlul, nemlig Nrul, Avrll, Afllll, Clal og Haell.

Det er imidlertid også fordelaktig å anvende en "polymerase kj ede reaksjon" (PCR) i henhold til Saiki, R.K. et al, Science 239:487-491, 1988, som kan gjøre det unødvendig med konstruksjon av spesifikke gjenkjennelsesseter for restriksjonsenzymer.

Det er tidligere antydet at begrensning til DNA-sekvensen (DCD)Xer av bekvemmelighetshensyn og at denne ikke utelukker andre kodoner som f.eks. kodoner for glysin, prolin, lysin, metionin eller asparagin.

Den mest effektive utførelsesform av denne DNA-sekvens oppnås ved seleksjon av gode produsenter av fusjonsproteinet, nemlig det fusjonsprotein som inneholder proinsulin. Dette gir den mest gunstige kombinasjon av reguleringssekvens, ballastsekvens og ønsket protein, og som et resultat derav unngås ugunstige kombinasjoner av promoter, ballastsekvens og struk-turelt gen og gode resultater oppnås med minimum omkostninger med henblikk på den ovennevnte "sekvensharmoni".

Det ble overraskende iakttatt at genene som optimaliseres for ballastbestanddelen i oppfinnelsens sammenheng ikke alltid inneholder de tripletter som foretrekkes av E. coli. Det ble funnet at for Thr forekommer faktisk kodonet ACA, som anvendes minst hyppig av E. coli, ofte i de selekterte sekvenser. Hvis f.eks. den følgende aminosyresekvens ble optimalisert i henhold til den foretrukne kodonbruk (p.c.u.) av E. coli (p.c.u.:Aota, S. et al, Nucleic Acids Research 16 (supplement): r315, r316, r391, r402 (1988)), ville det bli oppnådd en totalt forskjellig genstruktur enn den som ville bli oppnådd i samsvar med oppfinnelsen (jf tabell 1):

Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr

GCG ACC ACC AGC ACC GCG ACC ACC p.c.u.

GCA ACA ACA TCA ACA GCA ACT ACG oppfinnelsen

I tilfellet av fusjonsproteinene med en proinsulinbestanddel var det initiale startpunkt en ballastbestanddel med ti aminosyrer. DNA-sekvensen av den beste produsent tjente da som base for variasjoner i denne sekvens, hvoretter det ble bemerket at opptil tre aminosyrer kan fjernes uten et merk-bart tap i den relative uttrykningsgrad. Dette funn er ikke bare overraskende, ettersom det var uventet at et slikt kort ballastprotein ville være tilstrekkelig, men også meget fordelaktig ettersom selvfølgelig den relative andel av proinsulin i fusjonsproteinet øker ettersom ballastbestanddelen minsker.

Betydningen av ballastbestanddelen i proteinet fremgår av den følgende sammenligning: Humant proinsulin inneholder 86 aminosyrer. Hvis det for et fusjonsprotein i henhold til EP-A 0 290 005 forutsettes den nedre grense på 2 50 aminosyrer for ballastbestanddelen har fusjonsproteinet 33 6 aminosyrer, hvorav bare omtrent en fjerdedel forekommer i det ønskede protein. Som sammenligning har et fusjonsprotein fremstilt i samsvar med oppfinnelsen med bare 7 aminosyrer i ballastbestanddelen 93 aminosyrer, og proinsulinbestanddelen utgjør da 92,5 %. Hvis det ønskede protein har mange fler aminosyrer enn proinsulinet vil da forholdet mellom ballast og ønsket protein bli ennå mer gunstig.

Det er ved en rekke anledninger nevnt at som et ønsket protein representerer proinsulin bare en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen. Oppfinnelsen virker imidlertid også med mye større fusjonsproteiner for hvilke et fusjonsprotein med det aktive domene av human 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A-reduktase (HMG) nevnes som et eksempel. Dette protein inneholder 461 aminosyrer. Et gen som koder for det sistnevnte er kjent f.eks. fra EP-A 292 803.

Etter nå generelt å ha beskrevet oppfinnelsen vil denne lettere forstås ved henvisning til de etterfølgende eksempler som skal illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Konstruksjon av genbanken og seleksjon av en klon med høy uttrykking.

Hvis ikke annet er angitt fremstilles alle media i samsvar med Maniatis, T.; Fritsch, E.F. og Sambrook, J.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Laboratory (1982). TP-medium består av M9CA-medium, men med et glukose- og casaminosyre-innhold på 0,4 % hver. Hvis ikke annet er angitt inneholder alle media 50/zg/ml ampicillin. Bakterievekst under fermentering bestemmes ved måling av den optiske densitet av kulturene ved 600 nm (OD). Prosentvise data refererer til vekt hvis ingen andre data er angitt.

Utgangsmaterialet er plasmid pH154/25<*>(fig. 1) som er kjent fra EP-A 0 211 299 som det her vises til. Dette plasmid inneholder et fusjonsproteingen (D'-Proin) knyttet til en trp-promoter og et resistensgen som resistens mot det anti-biotiske ampicillin (Amp). Fusjonsproteingenet koder for et fusjonsprotein som inneholder et fragment av trpD-proteinet fra E. coli (D<1>) og ape-proinsulin (Proin). Genstrukturen av plasmidet resulterer i et polycistronisk mRNA som koder for både fusjonsproteinet og resistensgenproduktet. For å under-trykke dannelse av overskudd av resistensgenprodukt innføres initialt den (kommersielle) trp-transkipsjonsterminator-sekvens (trpTer) (2) mellom de to strukturelle gener. For å gjøre dette åpnes plasmidet ved hjelp av EcoRI og de utstående ender innfylles med Klenow-polymerase. Det resulterende DNA-fragment med butte ender sammenknyttes med terminatorsekvensen (2)

5'AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTT3' 3'TCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA5' (2)

som resulterer i plasmidet pINT12 (fig. 1 - (3)).

Utgangsplasmidet pH154/25<*>inneholder et spaltningssete for enzym Pvul i Amp-genet, så vel som et Hindlll-spaltningssete i karboksyterminalområdet av trpD-fragmentet. Begge spaltningsseter er derfor også inneholdt i pINT12. Ved å kutte plasmidet (fig. 1 - (3)) med Pvul og Hindlll, blir det delt opp i to fragmenter hvorfra den ene inneholdende proinsulingenet (fig. 1 - (4)) isoleres. Plasmid pGATTP (fig. la - (5) ) , som er strukturert på analog måte med (3), men som i stedet for D'-Proin-genet bærer et gamma-interferongen (Ifn) inneholdende restriksjonsspaltningssete Ncol og Hindlll, også kuttes med Pvul og Hindlll og fragmentet (fig. la - (6)) med promoterregionen isoleres. Ved ligering av dette fragment (6) med fragmentet (4) oppnådd fra (3) oppnås plasmidet pINT40 (fig. la - (7)). Det lille fragment med resten av gamma-interferongenet kuttes av fra det sistnevnte med Ncol ogMlul. Det store fragment (fig. lb - (8)) ligeres med det blandede oligonukleotid (9)

hvori D står for A, G eller T og H og betegner det komplementære nukleotid. Dette resulterer i plasmidpopulasjonen (genbank) pINT4x (fig. lb - (10)). Blandede oligonukleotider i oppfinnelsens sammenheng kan oppnås ved metoder som vil være vel kjent for de fagkyndige på området. Det blandede oligonukleotid (9) oppnås fra det syntetiske blandede oligonukleotid (9a)

som innfylles med Klenow-polymerase og kuttes med Mlul og Nco.

Stammen E. coli WS3110 transformeres med plasmidpopulasjonen (10) og bakteriene utplates på LB-agarskåler. Seks av de resulterende bakteriekloner testes med hensyn til deres evne til å fremstille et fusjonsprotein med en isulinbestanddel. For dette formål blir over-natten-kulturer av klonene fremstilt i LB-medium og 100 fil delprøver av kulturene blandes med 10,5 ml TP-medium og rystes ved 37°C. Ved OD600 = 1 innstilles kulturene til 20/ig/ml 3-fé-indolylakrylsyre (IAA) , en oppløsning av 40 mg glukose i 100 ml vann tilsettes og preparatet rystes i ytterligere tre timer ved 37°C. Deretter fjernes 6 OD ekvivalenter av kulturen, bakteriene inneholdt deri høstes ved sentrifuger ing og g j ensuspenderes i 300 testbuffer (37,5 mM tris med pH 8,5, 7 M urea, 1 % (vekt/- volum) SDS og 4 % (volum/volum) 2-merkaptoetanol) . Suspensjonen oppvarmes i fem minutter, behandles i to sekunder med ultralyd for å redusere viskositeten og delprøver derav blir deretter utsatt for SDS gelelektroforese. Med bakterier som fremstiller fusjonsprotein kan det forventes et proteinbånd med en molekylvekt på 10.350 D. Det er klart at en av disse kloner, pINT41 (tabell 1) frembringer et riktig protein i forholdsvis store mengder mens noen slik proteindannelse ikke sees med de øvrige kloner. Et immunblottingsforsøk med insulinspesifikke antistoffer bekrefter at det protein som kodes av pINT41 inneholder en insulinbestanddel.

Tabell 1 viser DNA- og aminosyresekvensen av ballastbestanddelen for et antall plasmidkonstruksjoner. Spesielt illu-strerer tabell 1 DNA- og aminosyresekvensen av ballastbestanddelen i pINT41 fusjonsproteinet.

EKSEMPEL 2

Seleksjon av ytterligere kloner.

For å detektere ytterligere passende kloner anvendes en metode i henhold til Helfman, D.M. et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:31-35, 1983). TP-agarskåler hvis medium inneholder ytterligere 40/im/ml IAA, anvendes for dette formål.15 minutter før anvendelse belegges agaroverflaten av platene med et 2 mm tykt TP agartopplag, et nitrocellulosefilter anbringes på det sistnevnte og nytransformerte celler anbringes på filteret. Kopier fremstilles av filterne som har frem-bragt bakteriekolonier etter inkubasjon ved 37°C og bakteriene fra det opprinnelige filter lyseres. For å fullføre dette eksponeres filterne for en kloroformatmosfære i en eksikator i 15 minutter, beveges deretter sakte i seks timer ved romtemperatur i immunbuffer (50 mM Tris med pH 7,5,

150 mm NaCl, 5 mM MgCl2og 3 % (vekt/volum) BSA) inneholdende ytterligere 1/xg/ml DNase I og 4 0 fig/ ml lysozym, og vaskes så to ganger i fem minutter i vaskebuffer (50 mM tris med pH 7,5 og 150 mM NaCl). Filtrene inkuberes så over natten ved 3°C i immunbuffer med insulinspesifikke antistoffer, vaskes fire

ganger i fem minutter med vaskebuffer, inkuberes i en time i immunbuffer med et protein A-pepperrotperoksydasekonjugat, vaskes på nytt fire ganger i fem minutter med vaskebuffer og kolonier som har bundet antistoffer visualiseres ved en fargereaksjon. Kloner pINT42 og pINT43, som også frembringer ganske store mengder fusjonsprotein, finnes på denne måte i 500 kolonier. DNA oppnådd ved sekvensering og aminosyresekvenser avledet derav er også gjengitt i tabell 1.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av plasmid pINT41d.

Mellom replikasjonsopprinnelsen og trp-promoteren inneholder plasmidet pINT41 en ikke-essensiell DNA-region som flankeres av spaltningsseter for enzym Nsp(7524)l. For å fjerne denne region fra plasmidet kuttes pINT41 med NSP(7524)1 og det største av de resulterende fragmenter isoleres og religeres.

Dette gir anledning til plasmid pINT41d hvis DNA-sekvens er gjengitt i tabell 2.

EKSEMPEL 4

Fermentering og behandling av pINT41d-fusjonsprotein

(i) Fermentering: En rystekultur i LB-medium fremstilt fra E. coli W3110 transformert med pINT41d. 15/il av denne kultur, som har en OD = 2 anbringes så i 15,7 1 TP-medium og suspensjonen fermenteres i 16 timer ved 37°C. Kulturen, som ved dette tidspunkt har en OD = 13, innstilles så til 20/zg/ml IAA og inntil slutten av fermenteringen, etter omtrent fem timer, pumpes konti-nuerlig en 50 % (vekt/volum) maltoseoppløsning inn med en hastighet på 100 ml/time. En OD = 17,5 oppnås ved denne prosess. Ved slutten høstes bakteriene ved sentrifugering.

(ii) Knusing av celler: Cellene gjensuspenderes i 400 ml/ desintegrasjonsbuffer (10 mM tris med pH 8,0 5 mM EDTA) og knuses i en presse av type French. Fusjonsproteinet inneholdende insulin konsentreres deretter i 30

minutter ved sentrifugering ved 23.500 g og vaskes med desintegrasjonsbuffer. Dette gir 134 g sediment (fuktig substans).

(iii) Sulfitolyse: 12,5 g sediment (fuktig substans) fra (ii) innrøres i 125 ml av en 8 M ureaoppløsning ved 35°C. Etter omrøring i 30 minutter innstilles oppløs-ningen til pH 9,5 med natriumhydroksydoppløsning og omsettes med 1 g natriumsulfitt. Etter ytterligere 30 minutters omrøring ved 35°C tilsettes 0,25 g natrium-tetrationat og blandingen omrøres på nytt i 30 minutter ved 35°C. (iv) DEAE-anionbytter-kromatografi: Hele porsjonen av (iii) fortynnes med 250 ml buffer A (50 mM glysin, pH 9,0) og anbringes på en kromatograferingskolonne som inneholder Fractogel TSK DEAE-650 (kolonnevolum 130 ml, kolonne-diameter 26 mm) ekvilibrert med buffer A. Etter vasking med buffer A elueres fusjonsprotein-S-sulfonatet med en saltgradient bestående av 250 ml av hver av buffer A og buffer B (50 mM glysin med pH 9,0, 3 M urea og 1 M NaCl) med en strømningshastighet på 3 ml/minutt. Fraksjonene inneholdende fusjonsprotein-S-sulfonat blir så kombinert. (v) Folding og enzymatisk spaltning: De kombinerte frak-sjoner fra (iv) fortynnes ved 4°C i et volumforhold på1+9 med foldende buffer (50 mM glysin, pH 10,7) og pr liter av den resulterende fortynning tilsettes 410 mg

askorbinsyre og 165 fil 2-merkaptoetanol ved 4°C under forsiktig omrøring. Etter korreksjon av pH-verdien til pH 10,5 fortsettes omrøring i ytterligere fire timer ved 4°C. Deretter tilsettes fast N-(2-hydroksyetyl)-piperazin-N'-2-etansulfonsyre (HEPES) til en sluttkons-entrasjon på 24 g pr porsjonsliter. Blandingen som nå har pH 8 behandles med trypsin ved 2 5°C. Under pro-sessen er enzymkonsentrasjonen i behandlingsblandingen 80/ig/1. Spaltningsforløpet følges analytisk ved hjelp

av RP-HPLC. Etter to timer kan behandlingen stanses ved tilsetning av 130/xg soyabønne trypsin-inhibitor. HPLC viser dannelse av 19,8 mg di-Arg-insulin fra en blanding i samsvar med (iii). Identiteten av spaltningsproduktet bekreftes ved proteinsekvensering og sammenlignende HPLC med referansesubstanser. di-Arg-insulinet kan renses

kromatografisk i samsvar med kjente metoder og omdannes til insulin med karboksypeptidase B.

EKSEMPEL 5

Konstruksjon av plasmid pINT60

Plasmid pINT60 resulterer i en insulinforløper, hvis ballastsekvens består av bare ni aminosyrer. For konstruksjon av dette plasmid kuttes plasmid pINT4 0 med Nco og Mlul og det resulterende vektorfragment isoleres. Oligonukleotidet Insul5

blir så syntetisert, innfylt med Klenow-polymerase og også kuttet med disse to enzymer. Det resulterende DNA-fragment ligeres så med vektorfragmentet til å gi plasmid pINT60.

Tabell 1 viser DNA og aminosyresekvensen av ballastbestanddelen i dette fusjonsprotein.

EKSEMPEL 6

Konstruksjon av plasmid pINT67d

Plasmid pINT67d er et derivat av pINT41d hvori kodonet av aminosyren i 9-stillingen av ballastsekvensen er deletert. Dette er grunnen til at det i likhet med pINT60 resulterer i en insulinforløper med en ballastsekvens av ni aminosyrer. En metode i samsvar med Ho, S.N. et al (Gene 77:51-59, 1989) anvendes for dets konstruksjon. For dette formål blir to separate PCR først gjennomført med plasmid pINT41d og de to oligonukleot idpar

Dette frembringer to fragmenter som er delvis komplementære til hverandre og som når de sammensmeltes med hverandre koder for en lignende insulinforløper som pINT41d hvori imidlertid aminosyren i 9-stillingen er fraværende. For komplettering kombineres de to fragmenter og underkastes for en ytterligere PCR sammen med oligonukleotidene TIR og Insull. Fra DNA-fragmentet oppnådd på denne måte frigis det strukturelle gen av insulinforløperen med Nco og Sali og renses. Plasmid pINT41d blir også kuttet med disse to enzymer, vektorfragmentet renses og ligeres deretter med det strukturelle genfragment fra PCR til å gi plasmid pINT67d.

Nukleotid- og aminosyresekvensene for ballastregionen er gjengitt i tabell 1.

EKSEMPEL 7

Konstruksjon av plasmid pINT68.

I likhet med plasmid pINT67d er plasmid pINT68d et avkortet derivat av plasmid pINT41d hvori kodonene av de to aminosyrer i 8-stillingen og 9-stillingen i ballastsekvensen er deletert. Dette resulterer derfor i en insulinforløper med en ballastsekvens på bare 8 aminosyrer. Prosedyren tidligere beskrevet i eksempel 6 anvendes for dets konstruksjon, men med de to oligonukleotidpar

TIR: 5'-CTG AAA TGA GCT GTT GAC-3'

og

Nukleotid- og aminosyresekvensene for ballastregionen er gjengitt i tabell 1.

EKSEMPEL 8

Konstruksjon av plasmid pINT69d

Plasmid pINT69d er også et avkortet derivat av plasmid pINT41d hvori imidlertid kodonene av de tre aminosyrer i stillinger 7, 8 og 9 av ballastsekvensen er blitt deletert. Dette resulterer derfor i en insulinforløper med en ballastsekvens på bare 7 aminosyrer. Prosedyren beskrevet i eksempel 6 anvendes også for dets konstruksjon, men med de to oligonukleotidpar.

Nukleotid- og aminosyresekvensene for ballastregionen er gjengitt i tabell 1.

EKSEMPEL 9

Konstruksjon av plasmid pINT72d

Plasmid pINT72d er et derivat av plasmidet pINT69d hvori hele C-peptidgenregionen, med unntagelse av det første kodon for aminosyren arginin, er deletert. Følgelig resulterer dette i et"mini-proinsulinderivat" med en argininrest i stedet for en C-kjede. Med plasmid pINT69d som utgangspunkt anvendes prosedyren beskrevet i eksempel 6 også for dets konstruksjon, men med de to oligonukleotidpar

TIR: 5'-CTG AAA TGA GCT GTT GAC-3'

EKSEMPEL 10

Konstruksjon av plasmidene pINT73d, pINT88d og pINT89d Plasmid pINT73d er et derivat av plasmid pINT69d (eksempel 8) hvori insulinforløpergenet er anordnet to ganger i rekke-følge. Plasmidet resulterer derfor i dannelse av et polycistronisk mRNA som kan fordoble utbyttet. For dets konstruksjon gjennomføres en PCR-reaksjon med plasmid pINT69d og de to oligonukleotider

Dette fører til dannelse av et fragment med insulinforløper-genet og det angjeldende ribosombindingssete hvori dets 5'-enderegion har et spaltningssete for enzym Xhol og i dets 3'-enderegion et spaltningssete for Sali. Fragmentet kuttes med de to ovennevnte enzymer og renses. Plasmid pINT69d blir så linearisert med Sali, de to DNA-ender som frembringes blir defosforylert med fosfatase (fra kalvetarm) og ligert med fragmentet fra PCR-reaksjonen til å gi plasmid pINT73d.

På analog måte oppnås plasmidet pINT88d og pINT89d når plasmid pINT72d (eksempel 9) modifiseres analogt ved å anordne "mini-proinsulingenet" to ganger eller tre ganger i sekvens.

EKSEMPEL 11

Konstruksjon av plasmid pINL41d

Utgangsplasmidet pRUD3 har en struktur analog med strukturen av plasmid pGATTP. I stedet for trp-promoterregionen inneholder det imidlertid en tac-promoterregion som flankeres av spaltningsseter for enzymer EcoRI og Nco. Plasmidet kuttes med EcoRI hvoretter de utstående ender av spaltningssetet innfylles med Klenow-polymerase. Kutting gjennomføres deretter med Nco og det derav følgende promoterfragment isoleres.

trp-promoteren i plasmid pINT41d flankeres av spaltningsseter for enzymer PvulI og Nco. Ettersom plasmidet har et ytterligere spaltningssete for PvuII blir det fullstendig kuttet med Nco, men bare delvis ved PvuII. Vektorfragmentet, som bare mangler promoterregionen, isoleres så fra de derav følgende fragmenter. Dette ligeres så med tac-promoter-fragmentet til å gi plasmid pINL41d.

EKSEMPEL 12

Konstruksjon av plasmid pL41c

Plasmid pPL-lambda (som kan oppnås fra Pharmacia) har en lambda-pL-promoterregion. Sistnevnte er flankert av nukleo-tidsekvensene:

fremstilles for ytterligere flankering av promoterregionen med spaltningsseter for enzymer EcoRI og Nco. En PCR gjennomføres med disse oligonukleotider og pPL-lambda og det resulterende promoterfragment kuttes med EcoRI og Nco og isoleres. Plasmid pINL41d kuttes også med disse to enzymer og det derav følgende vektorfragment, som ikke har noen promoter, blir så ligert med lambda-pL-promoterfragmenter til å gi plasmid pL41c.

EKSEMPEL 13

Konstruksjon av plasmid pL41d

trp-transkripsjons-terminatoren lokalisert mellom resistens-genet og fusjonsproteingenet i plasmid pL41c er ikke effektiv

i E. coli stammer som er egnet for fermentering (f.eks. E. coli N4830-1). Av denne grunn blir et polycistronisk mRNA og med dette en stor mengde resistensgenprodukt dannet ved fermentering. For å forhindre denne bireaksjon erstattes trp-terminatorsekvensen ved hjelp av en effektiv terminator-sekvens av E. coli-rrnB-operonet. Plasmid pANGMA har en struktur lignende strukturen av plasmid pINT41d, men det har et angiogeningen i stedet for fusjonsproteingenet og en rrnB-terminatorsekvens (fra kommersielt plasmid pKK223-3 som kan oppnås fra Pharmacia) i stedet for trp-terminatorsekvensen. Plasmidet kuttes med Pvul og Sali og fragmentet inneholdende rrnB-terminatoren isoleres. Plasmid pL41c kuttes også med disse to enzymer og fragmentet inneholdende insulingenet isoleres. De to isolerte fragmenter blir så ligert til å gi plasmid pL41d.

EKSEMPEL 14

Konstruksjon av plasmid pINTLI

For å fremstille et plasmid for generell anvendelse ved uttrykking av fusjonsproteiner erstattes proinsulingenet i plasmid pINT41d med en polylinkersekvens. Dette gen flankeres av spaltningsseter for enzymer Mlul og Sali. Plasmidet kuttes derfor ved hjelp av de to ovennevnte enzymer og vektorfragmentet isoleres. Dette blir så ligert til å gi plasmid pINTLI med de følgende to syntetiske oligonukleotider.

EKSEMPEL 15

Innskyting av et gen som koder for HMG CoA-reduktase (aktivt domene) i pINTLI og uttrykking av fusjonsproteinet.

Tabell 3 representerer DNA og aminosyresekvensen av genetHMGCoA-reduktase. Det syntetiske gen for HMG CoA-reduktase kjent fra EP-A 0 292 803 (som det her vises til) inneholder et spaltningssete for BstEII i regionen for aminosyrene Leu og Val i stillingene 3 og 4 (se tabell 3). En utstående sekvens tilsvarende enzymet Xbal forekommer ved enden av genet (i det ikke-kodende areal). De tilsvarende spaltningsseter i polylinkeren av plasmid pINTLI er i den samme lese-ramme. Begge spaltningsseter er i hvert tilfelle singulært.

Plasmid pUHIO inneholder det komplette HMG-gen (HMG-fragmenter I, II, III og IV) tilsvarende DNA-sekvensen i tabell3. Konstruksjon av pUHIO (fig. 2) er beskrevet i EP-A 0 292 803 som det her henvises til. Kort sagt fremstilles spesi-elle plasmider for subkloningen av genfragmentene HMG I tilHMG IV og for konstruksjon av det komplette gen. Disse plasmider avledes fra de kommersielt tilgjengelige vektorer pUCl8, pUC19 og M13mpl8 og M13mpl9, med polylinkerregionen som er blitt erstattet med en ny syntetisk polylinker tilsvarende DNA-sekvensen VI

Disse nye plasmider har den fordel at i motsetning til pUC ogM13mp-plasmidene tillater de kloning av DNA-fragmenter med de utstående sekvenser for restriksjonsenzymet Nco. Videre inneholdes gjenkjennelsessekvensene for spaltningssetene Nco, EcoRI, Hindlll, BamHI og Xbal i vektorene i nøyaktig den sekvens hvori de er tilstede i det komplette gen HMG, og dette letter dens sekvensmessige kloning og konstruksjon av dette gen. Det er således mulig å subklone genfragmenteneHMGI til HMG IV i de nye plasmider. Etter at genfragmentene er blitt amplifisert er det mulig for de sistnevnte å bli kombinert til å gi det komplette gen (se det følgende) .

a. Fremstilling av vektorer inneholdende DNA- sekvens VI DNA-sekvens VI kan fremstilles ved hjelp av standard metoder. Det kommersielt tilgjengelige plasmid pUC18 (eller pUC19, Ml3mpl8 eller M13mpl9) åpnes med restriksjonsenzymene EcoRI/HindiII som angitt av produsenten. Behandlingsblandingen fraksjoneres ved elektroforese på 1 % agarosegel. Plasmidbåndene som er blitt visualisert ved hjelp av etidium-bromidfarging kuttes ut og elueres fra agarosen ved hjelp av elektroforese. 2 0 fmol av det resterende plasmid oppnådd på denne måte blir så ligert med 2 00 fmol av DNA-fragmentet tilsvarende DNA-sekvensen VI ved romtemperatur over natten. En ny kloningsvektor pSU18 (eller pSU19, M13mUS18 eller M13mUS19) oppnås. I motsetning til de kommersielt tilgjengelige utgangsplasmider kan de nye plasmider kuttes med restriksjonsenzymet Nco. Restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll kutter likeledes plasmidene bare en gang fordi polylinkeren som er innskutt via EcoRI- og Hindlll-spaltningssetene ødelegger disse spaltningsseter som opprinnelig er tilstede.

b. Fremstilling av de hybride plasmider som inneholder oenfraamentene HMG I til HMG IV

i) Plasmid inneholdende genfragmentet HMG I

Plasmidet pSU18 kuttes åpent med restriksjonsenzymene EcoRI og Nco analogt med beskrivelsen i eksempel 15 (a) i det foregående og ligeres med genfragmentet I som på forhånd er blitt fosforylert.

ii) Plasmid inneholdende genfragmentet HMG II

Plasmidene med gensubfragmentene HMG II-l, II-2 og II-3 underkastes restriksjonsenzymbehandling med EcoRI/MluI, MluI/BssHII eller BssHII/Hindlll for å isolere henholdsvis genfragmentene HMG II-1, HMG II-2 og HMG II-3. De sistnevnte blir så på kjent måte ligert inn i plasmidet pSU18 som er blitt åpnet med EcoRI/Hindlll.

iii) Plasmid inneholdende genfragmentet HMG III

Plasmidene med gensubfragmentene HMG III-l og III-3 behandles med restriksjonsenzymene EcoRI/Hindlll og de kuttes så med

Sau96I for å isolere genfragmentet HMG III-l, eller med BamHI/Banll for å isolere genfragmentet HMG III-3. Disse fragmenter kan innskytes med HMG III-2 - fragmentet inn i et pSU18-plasmid som er blitt åpnet med Hindlll/BamHI.

iv) Plasmid inneholdende genfragmentet HMG IV

Plasmidene med gensubfragmentene HMG IV-(1+2) og IV-(3+4) åpnes med restriksjonsenzymene EcoRI/BamHI henholdsvis EcoRI/Xbal, og genfragmentet HMG IV-(1+2) og HMG IV-(3+4) renses ved hjelp av elektroforese.

De resulterende fragmenter ligeres så inn i et pSU18-plasmid som er blitt åpnet med BamHI/Xbal og hvori EcoRI-spaltningssetet på forhånd er blitt ødelagt med Sl-nuklease som beskrevet i det følgende. Et hybrid plasmid som fremdeles inneholder en ytterligere AATT-nukleotidsekvens i DNA-sekvensen IV oppnås. Det hybride plasmid åpnes ved dette punkt ved behandling med restriksjonsenzymet EcoRI og de utstående AATT-ender fjernes med Sl-nuklease. For dette formål blir 1 fig plasmid etter EcoRI-behandling inkubert med to enheter av Sl-nuklease i 50 mM natriumacetatbuffer (pH 4,5) inneholdende 200 mM NaCl og 1 mM sinkklorid ved 20°C i 3 0 minutter. Plasmidet resirkuleres på kjent måte via de butte ender. Et hybrid plasmid inneholdende genfragmentet IV oppnås.

c. Konstruksjon av det hybride plasmid pUHIO inneholdende DNA- sekvensen V

Det hybride plasmid med genfragmentet HMG I åpnes med EcoRI/HindiII og ligeres med fragmentet HMG II som oppnås ved restriksjonsenzymbehandling av det tilsvarende hybride plasmid med EcoRI/Hindlll. Det resulterende plasmid åpnes så med Hindlll/BamHI og ligeres med fragmentet HMG III som kan oppnås fra det tilsvarende plasmid under anvendelse av Hindlll/BamHI. Plasmidet oppnådd på denne måte blir i sin tur åpnet med BamHI/Xbal og knyttet til fragmentet HMG IV som oppnås ved behandling av det tilsvarende plasmid medBamHI/Xbal. Det hybride plasmid pUHIO som inneholder det komplette HMG-gen, tilsvarende DNA-sekvensen V, oppnås.

Fig. 2 viser det skjematiske kart av pUHIO idet "ori" og "Apr" indikerer orienteringen i det resterende plasmid tilsvarende pUC18.

Hvis pINTLI kuttes med BstEII og Xbal og det store fragment isoleres og hvis på den annen side plasmid pUHIO (fig. 2) behandles med de samme enzymer og fragmentet som omfatter det meste av DNA-sekvensen V fra dette plasmid isoleres, oppnås etter ligering av de to fragmenter et plasmid som koder for et fusjonsprotein hvori arginin etterfølger de første åtte aminosyrer i ballastsekvensen av pINT41d (tabell 1) som etterfølges, ved å begynne med Leu<3>, av det strukturelle gen av det aktive domene av HMG CoA-reduktase. For sammen-ligningsformål kuttes de to initiale plasmider med enzymer Nco og Xbal og tilsvarende fragmenter ligeres sammen og gir et plasmid som umiddelbart etter startkodonet koder for det aktive domene av HMG CoA-reduktase (i samsvar med DNA-sekvensen V i henhold til EP-A 0 292 803, se tabell 3) .

Uttrykking av de kodede proteiner foregår i samsvar med eksempel 4. Etter knusingen'av cellene gjennomføres sentrifugering hvoretter det forventede protein med omtrent 55 kDa bestemmes i supernatanten ved gelelektroforese. Båndet for fusjonsproteinet er mye mer intensivt her enn for det protein som uttrykkes direkte. Individuelle porsjoner av 100^1 av supernatanten testes i ufortynnet form, i en fortynning på 1:10 og i en fortynning på 1:100 for dannelse av mevalonat. Som en ytterligere sammenligning blir fusjonsproteinet i samsvar med eksempel 4 (fusjonsproteinet med proinsulinbestanddel) testet. Ingen aktivitet er synlig i noen av de tre konsentrasjoner. Fusjonsproteinet med HMG CoA-reduktase-bestanddel fremviser maksimal aktivitet i alle disse tre fortynninger, mens produktet fra den direkte uttrykking viser gradert aktivitet styrt av konsentrasjon. Dette indikerer bedre uttrykking av fusjonsproteinet med en faktor på minst 100 .

EKSEMPEL 16

Konstruksjon av plasmid pB70

Plasmid pINT41d spaltes med MlUI og Sali og det store fragment isoleres. Plasmid pIK4 vist i fig. 3a inneholder et gen for "mini-proinsulin" hvis C-kjede består av arginin alene.

Konstruksjonen av dette plasmid er tidligere beskrevet i EP-A 0 347 781 (som det her vises til). Kort fortalt åpnes det kommersielle plasmid pUC19 under anvendelse av restriksjonsenzymene Kpnl og Pstl og det store fragment (fig. 3-(l)) separeres gjennom en Seaplaque-gel med 0,8 % styrke. Dette fragment omsettes med T4 DNA-ligase under anvendelse av det DNA (fig. 3-(2)) som er syntetisert i samsvar med tabell 4. Tabell 4 viser sekvensen av genfragment IK I, mens tabell 5 representerer sekvensen av genfragment IK II.

Denne 1igeringsblanding inkuberes så med kompetente E. coli 79/02-celler. Transformasjonsblandingen plates ut på IPTG/Xgal-plater som inneholder 20 mg/l ampicillin. Plasmid DNA isoleres fra de hvite kolonier og karakteriseres ved restriksjon og DNA-sekvensanalyse. De ønskede plasmider benevnes pIKl (fig. 3).

Følgelig ligeres DNA (fig. 3-(5)) i henhold til tabell 5 inn i pUC19 som er blitt åpnet under anvendelse av Pstl og Hindlll (fig. 3-(4)). Plasmidet pIK2 (fig. 3) oppnås.

DNA-sekvensene (2) og (5) i fig. 3 i henhold til tabell 4 og 5 reisoleres fra plasmidene pIKl og pIK2 og ligeres med pUC19 som er blitt åpnet under anvendelse av Kpnl og Hindlll (fig. 3- (7)) .

På denne måte oppnås plasmidet pIK3 (fig. 3) som koder for en modifisert human insulinsekvens.

Plasmidet pIK3 åpnes under anvendelse av Mlul og Spel og det store fragment (fig. 3a-(9)) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvensen (10)

som supplerer det siste kodon av B-kjeden (B30) med et argininkodon og erstatter det utkuttede kodon for de første syv aminosyrer av A-kjeden og supplerer kodonet for aminosyrene 8 og 9 i denne kjede. Dermed oppnås plasmid pIK4 (fig. 3a) som koder for human mini-proinsulin.

I tabellene 4 og 5 er B- og A-kjedene av insulinmolekylet i hvert tilfelle indikert ved den første og siste aminosyre. Inntil koderegionen i genfragmentet IK II, er der et spaltningssete for Sali som skal anvendes i den etterfølgende konstruksjon.

Plasmidet pIK4 kuttes med Hpal og Sali og genet som koder for"mini-proinsulin" isoleres. Dette gen ligeres med det ovennevnte store fragment av pINT41d og den følgende syntetiske DNA-sekvens.

Dette gir anledning til plasmid pB70 som koder for et fusjonsprotein hvori ballastsekvensen (tabell 1, linje 1) etterfølges av aminosyresekvensen Met-Gly-Arg som etterfølges av aminosyresekvensen av "mini-proinsulinet".

EKSEMPEL 17

Ved å anvende oligonukleotidene anført i det følgende oppnås plasmidene pINT90d til pINT96d analogt med de foregående eksempler. En stjerne indikerer den samme kodede aminosyre i ballastbestanddelen som i pINT41d.

pINT92 koder for en dobbelt mutasjon i det insulinderivat som er kodet av plasmidet pINT72d ettersom kodonet for Arg ved enden av ballastbestanddelen og "mini C-kjeden" er erstattet med kodonet for Met. Det uttrykte forprodukt kan således spaltes med cyanbromid.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner inneholdende et ønsket protein og en ballastbestanddel,karakterisert ved(a) konstruksjon av et blandet oligonukleotid som koder for det nevnte ønskede protein og en ballastbestanddel, hvori det nevnte oligonukleotid inneholder en DNA-sekvens (kodetråden) (DCD)X hvori D er A, G eller T og x er 4 - 12, og hvor det nevnte oligonukleotid ved sin 3'-ende av kodetråden koder for en aminosyre eller for en gruppe av aminosyrer som tillater en lett avspaltning av det nevnte ønskede protein fra den nevnte ballastbestanddel, og hvor det nevnte oligonukleotid er konstruert slik at ballastbestanddelen ikke forstyrrer foldingen av det nevnte ønskede protein, (b) det blandede oligonukleotid innskytes i en vektor slik at det er funksjonelt knyttet til en regulatorregion og til det strukturelle gen som koder for det nevnte ønskede protein, (c) vertscellene transformeres med den således oppnådde vektorpopulasjon, og (d) fra transformantene selekteres en eller flere kloner som uttrykker et fusjonsprotein i høyt utbytte.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat spaltningen er en enzymatisk spaltning.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det nevnte oligonukleotid er konstruert slik at det fører til et fusjonsprotein som er oppløselig eller som lett kan oppløselig-gj øres.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat x er 4-8.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat oligonukleotidet har sekvensen (kodetråden) ATG (DCD)V(NNN)_ hvori N står for like eller forskjellige nukleotider, ekskluderende stoppkodoner for NNN, z er 1 - 4 og y + z er 6-12, idet y minst er 4.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5,karakterisert vedat y + z er 6 - 10.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5,karakterisert vedat y er 5-8 og z er 1.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det nevnte oligonukleotid har sekvensen (kodetråden) ATG GCW (DCD)4.8CGW hvori W er A eller T.