NO174717B - Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmaaten - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmaaten Download PDFInfo
- Publication number
- NO174717B NO174717B NO852568A NO852568A NO174717B NO 174717 B NO174717 B NO 174717B NO 852568 A NO852568 A NO 852568A NO 852568 A NO852568 A NO 852568A NO 174717 B NO174717 B NO 174717B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- growth hormone
- polypeptide
- escherichia coli
- added
- Prior art date
Links
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title claims description 60
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 11
- 241000277329 Oncorhynchus keta Species 0.000 title claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 37
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 112
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 51
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 43
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 43
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 25
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 24
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 24
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 8
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 8
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- -1 140 mM) Chemical compound 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 7
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 7
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 101900063352 Escherichia coli DNA ligase Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 244000195895 saibo Species 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 2
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101710200526 DNA polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101900242680 Escherichia coli Ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 101000868151 Rattus norvegicus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- JFRSSYYNWAGMIW-UHFFFAOYSA-M cesium;guanidine;thiocyanic acid;chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+].SC#N.NC(N)=N JFRSSYYNWAGMIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/31—Linker sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmåten.
Pattedyrveksthormoner fremstilles i hypofysen. Aktiviteten og strukturen til pattedyrveksthormoner er kjent. F.eks. har humanveksthormoner blitt rapportert i J. A. Chem. Soc, 80, 4429 (1958) av U.J. Lewis et al., Biochem. J., 100, 754
(1966) av A.S. Hartree; og Arch. Biochem. Biophys. (Suppl.), 1, 327 (1962) av C.H. Li, et al.
Mange rapporter angående isolering av fiskeveksthormoner har blitt publisert som følger.
Isolering fra Tilapia
S.W. Farmer, et al., Gen. Comp. Endocrin, 30, 91 (1976)
Isolering fra stør
S.W. Farmer, et al., Endocrinology, 108, 377 (1981)
Isolering fra karpe
A.F. Cook, et al., Gen. Comp. Endocrin., 50, 335 (1983)
På den annen side, som for pattedyrveksthormongener er rotteveksthormon [P.H. Seeburg, et al., Nature 270, 486
(1977)], bovin- og svineveksthormongener [P.H. Seeburg, et al., DNA, 2, 37 (1983)] og humanveksthormongen [J.A. Martial, et al., Science, 205, 602 (1979 )] allerede kjent. Det er imidlertid ingen rapport om fiskeveksthormongener og en fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid ved rekombinant DNA-teknologi ved bruk av genet.
Fiskeveksthormoner har en stimulerende effekt på veksten av fisk, og er nyttig som en komponent i agn for fiskeoppdrett. Mengden av fiskeveksthormon som tilveiebringes ved utvinning fra fiskehypofysen, er begrenset. Det har derfor vært ønsket å utvikle en fremgangsmåte for tilveiebringelse av en stor mengde fiskeveksthormoner til lav pris.
I sammenheng med foreliggende oppfinnelse har man studert metoder for fremstilling av fiskeveksthormoner ved rekombinant DNÅ-teknikker. Som resultat har man på vellykket måte utvunnet en DNA som er komplementær til et fiskeveksthormon-polypeptid og anvendbart i fremstillingen av fiskeveksthormoner, og produsert en rekombinant DNA inneholdende DNA'en. Det vil si, mRNA ble ekstrahert fra laksehypofysen og en DNA (cDNA) komplementær til mRNA'en ble syntetisert. Deretter ble en DNA-probe tilsvarende aminosyresekvensen omkring N-terminalen i lakseveksthormonet syntetisert, og et lakseveksthormongen ble klonet ved seleksjon av en cDNA som hybridiserte med DNA-proben. Videre ble basesekvensen til cDNA'en bestemt.
I sammenheng med foreliggende oppfinnelse har man videre studert og funnet at en stor mengde av lakseveksthormon-polypeptidet dannes og akkumuleres i et medium ved dyrkning av en mikroorganisme inneholdende en rekombinant DNA hvori en cDNA som koder for lakseveksthormonet, er inkorporert. Fig. 1, (1) og (2) er et flytskjema for syntetisering av cDNA ved metoden ifølge Akayama-Berg og for konstruksjon av et rekombinant plasmid inneholdende cDNA'en. Fig. 2 illustrerer restriksjonsenzymkartene for cDNA'en i pSGHl, pSGH3 og pSGH14. Fig. 3 er et flytskjema for konstruksjon av det rekombinante plasmid pSGHIB2. Skjønt mange MboII-seter er til stede i pSGHl og pSGEIB2, er bare de seter som er nødvendig for konstruksjon av plasmidet referert til i fig. 3. Fig. 4 er et flytskjema for konstruksjon av de rekombinante plasmidene pSGHIIB9 og pSGHIIC2.
Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes ekspresjons-vektorene pSGHIB2 (fig. 3) og pSGHIIC2 (fig. 4), som er kjennetegnet ved at de inneholder og kan uttrykke en DNA-sekvens som koder for et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta, hvilken DNA-sekvens henholdsvis er den som er vist i krav 1 transformert til Escherichia coli FERM BP-612, og den som er vist i krav 2 transformert til Escherichia coli FERM BP-708.
Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt fremgangsmåter for fremstilling av et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta som har polypeptidsekvensen som vist i krav 3 henholdsvis polypeptidsekvensen vist i krav 4, kjennetegnet ved dyrking i et naeringsmedium av en Escherichia col i-stamme som er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 1, henholdsvis ifølge krav 2, akkumulering av fiskeveksthormon-polypeptidet i mediet og utvinning av polypeptidet derfra.
Polypeptidet kan fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker som følger. Det vil si, en mRNA fra fiskeveksthormon isoleres fra hypofysen hos fisk og benyttes som en templat for å fremstille et rekombinant plasmid som innbefatter cDNA'en. Det rekombinante plasmid inkorporeres i en vertmikroorga-nisme. DNA'en og det rekombinante plasmid kan benyttes for ekspresjon av fiskevektshormongen i bakterier slik som Escherichia coli. Fiskevektshormoner fremstilles ved dyrking av mikroorganismer som bærer det rekombinante plasmidet.
Det rekombinante plasmid ifølge oppfinnelsen fremstilles ved følgende generelle metode.
Hel RNA fremstilles fra hypofysen fra laks (Oncorhynchus keta) og føres gjennom en oligo dT-cellulosekolonne for å isolere RNA som har polyadenylsyre [poly(A)RNA]. En dobbeltkjedet DNA syntetiseres ved bruk av poly(A)RNA'en som en templat og en revers transkriptase. Foreliggende ekspresjonsvektor (i det følgende også betegnet rekombinant DNA) oppnås ved bruk av in vitro rekombinante DNA-teknikker ved innføring av den syntetiske DNA i en vektor DNA slik som Escherichia coli plasmid DNA.
Fremstilling av DNA'en og rekombinant DNA forklares i detalj i det nedenstående.
Hypofysen utskjæres fra innfangede laks og nedfryses umid-delbart i flytende nitrogen. Guanidiniumtiocyanat tilsettes til den nedfryste hypofysen, og hypofysen opprives og oppløseliggjøres. Deretter anbringes den oppløseliggjorte hypofysen på CsCl-oppløsningslag og underkastes ultrasentri-fugering for oppnåelse av hel cytoplasmisk RNA som et bunnfall. Alternativt tilsettes LiCl til det oppløseliggjorte materiale med guanidiniumtiocyanat for å utvinne bare RNA som et bunnfall.
Den ekstraherte RNA oppløses i en NaCl eller KC1 hypertonisk oppløsning (f.eks. 0,5 M) og føres gjennom en oligo (dT)-cellulosekolonne for å la mRNA som har polyadenylsyre [poly(A)] bli adsorbert på kolonnen. Eluering utføres med vann eller en hypotonisk saltoppløsning slik som 10 mM Tris-HCl buffer for å isolere mRNA'en som har poly(A).
Syntese av cDNA og innføring av cDNA'en i en vektor foretas ifølge metoden til Okayama-Berg [Okayama & Berg; Mol. Cell. Biol. 2, 161 (1982)] som følger.
Først syntetiseres en vektor-primer. En vektor, f.eks. pCDVl, behandles med Kpnl i en passende oppløsning slik som en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 10 mM), MgCl2 (f.eks. 6 mM) og NaCl (f.eks. 10 mM) for å spalte pCDVl ved Kpnl-setet. DNA'en inkuberes med terminal deoksynukleotidyl transferase ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i et passende tidsrom (f.eks. 20 min.) i en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 6,8, 30 mM), natriumcacodylat (f.eks. 140 mM), C0CI2 (f.eks. 1 mM), ditiotreitol (f.eks. 0,1 mM) og dTTP (f.eks. 0,25 mM) for å addere ca. 60 tymidylrester til begge 3'-endene i vektor-DNA'en. Deretter spaltes DNA'en med EcoRI i en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 10 mM), MgCl2 (f.eks. 6 mM) og NaCl (f.eks. 100 mM. Ned-brytningsoppløsningen fraksjoneres ved lavgeleringstempera-tur-agarosegelelektroforese (i det følgende betegnet LGT-metoden [Lars Wieslander: Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979 )] for å utvinne et DNA-fragment på ca. 3,1 Kb. Deretter oppløses DNA'en i en NaCl eller KC1 hypertonisk oppløsning (f.eks. 0,5 M) og føres gjennom en poly(dA)— cellulosekolonne for å la bare vektor-primermolekyler som har poly(T) bli adsorbert på kolonnen. Eluering utføres med vann eller en hypotonisk saltoppløsning slik som 10 mM Tris-HCl buffer for å isolere kun vektor-primermolekylet med poly(T).
Deretter syntetiseres en linker-DNA som følger. F.eks. behandles pLl DNA med Pstl i en passende oppløsning slik som en oppløsning bestående av Tris-HCL buffer (f.eks. 7,5, 10 mM), MgCl2 (f.eks. 6 mM) og NaCl (f.eks. 10 mM) for å spalte pLl ced Pstl-setet. DNA behandles ved den samme metoden som i syntesen av vektor-primeren med unntagelse for at dGTP tilsettes istedenfor dTTP, og ca. 15 oligo (dG)--kjeder adderes. DNA'en spaltes med HindiII i en passende oppløsning slik som en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 10 mM), MgCl2, (f.eks. 6 mM) og NaCl (f.eks. 60 mM). Et DNA-fragment på ca. 0,5 Kb fraksjoneres ved agarosegel-elektroforese og utvinnes med DEAE-papir. Det oppnås dermed en linker-DNA.
Således oppnådd poly(A)RNA, vektor-primer og linker DNA benyttes for å syntetisere cDNA som følger. Poly(A)RNA'en og vektor-primer-DNA'en reageres med en revers transkriptase ved en passende temperatur (f.eks. 37°C) i et passende tidsrom (f.eks. 40 min.) i en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 8,3, 50 mM), MgCl2 (f.eks. 80 mM), KC1 (f.eks. 30 mM), ditiotreitol (f.eks. 0,3 mM), og dATP, dTTP, dCTP og dGTP (f.eks. 2 mM av hver). Ca. 15 oligo (dC)-kjeder adderes ved 3'-endene til den således oppnådde RNA-DNA--dobbeltkjeden under de samme betingelser som tilfellet er for addisjonen av (dT)-kjeder til vektor-primeren med unntagelse for at dTTP erstattes med dCTP. DNA'en spaltes med Hindlll i en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 10 mM), MgCl2 (f.eks. 6 mM) og NaCl (f.eks. 60 mM). Den tidligere fremstilte linker-DNA blandes med DNA'en og blandingen inkuberes med Escherichia coli DNA-ligase ved en passende temperatur (f.eks. 12°C) i et passende tidsrom (f.eks. 16 timer) i en oppløsning bestående av Tris-HCl buffer (f.eks. pH 7,5, 20 mM), MgCl2 (f.eks. 4 mM), (NH4)2S04 (f.eks. 10 mM), KCl (f.eks. 0,1 M) og (3-nikotin-amidadenindinukleotid (g<->NAD) (f.eks. 0,1 mM) for å fremstille en ring av cDNA'en og linker-DNA'en. Til reaksjons-oppløsningen tilsettes 40 pM (sluttkonsentrasjon) hver av dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Escherichia coli DNAligase, Escherichia coli DNA-polymerase I og Echerichia coli ribonuklease H tilsettes for å erstatte RNA-delen med DNA og for å oppnå et rekombinant plasmid inneholdende en komplett dobbeltkjedet cDNA.
En Escherichia coli stamme, f.eks. Escherichia coli C600SF8, transformeres med det således oppnådde rekombinante plasmid, f.eks. ved metoden ifølge Scott, et al. [Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Engineering), 2, 616 (1983)]. Siden et ampicillin-resistent gen eksisterer i det ovennevnte rekombinante plasmid, er Escherichia coli-transformanten resistent overfor ampicillin.
Valg av en mikroorganismestamme som bærer en ny rekombinant plasmid-DNA som har et gen komplementært til mRNA'en i fiskeveksthormon fra ampicillin-resistente (Ap<R>) stammer, utføres som følger. Således blir de ovenfor oppnådde trans-formanter fiksert på et nitrocellulosefilter og en syntetisk DNA-probe som har en DNA-sekvens som er antatt ut fra aminosyresekvensen til et kjent lakseveksthormon-polypeptid, hybridiseres dertil for å selektere den transformanten som viser sterk hybridisering (The Method of Grunstein-Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 72, 3961 (1975 )§. Probe-DNA'en syntetiseres ved en konvensjonell triestermetode [J. Am. Chem. Soc., 97, 7327 (1975)]. Seleksjon av den syntetiserte DNA-proben blir mer bestemt utført ved metoden ifølge Southern, et al. [J. Mol. Biol., 98,503 (1975)] og et rekombinant plasmid med genet som er komplementært til en lakseveksthormon-mRNA identifiseres ved den samme metoden som nevnt ovenfor.
pSGHl og pSGH14 er eksempler på de således oppnådde rekombinante plasmider. Plasmidet kan anvendes som en kilde for den DNA som koder for lakseveksthormon.
Fremstilling av lakseveksthormon-polypeptid ved ekspresjon av den DNA som koder for lakseveksthormon i en mikroorganisme : Den DNA som koder for lakseveksthormon utspaltes fra plasmidet som bærer DNA'en og innføres i en ekspresjonsvektor-DNA. Den således oppnådde rekombinante DNA transformeres til en mikroorganisme, og den således oppnådde transformant dyrkes for å akkumulere lakseveksthormon-polypeptid i et medium. Deretter utvinnes lakseveksthormon fra kulturen.
Som plasmid inneholdende den DNA som koder for lakseveksthormon er ovennevnte pSGHl og pSGE14 foretrukne eksempler.
Som vektor-DNA kan en hvilken som helst vektor anvendes så lenge som den DNA som er inkorporert deri kan uttrykkes i en mikroorganisme. En vektor-DNA hvori en fremmed DNA kan innsettes nedstrøms fra en egnet promotor slik som trp--promotor, lac-promotor eller PL-promotor og lengden mellom Shine-Dalgarno-sekvens (i det følgende betegnet SD-sekvens) og initieringskodon (ATG) er justert, f.eks. til 6-18 base-par, blir fortrinnsvis benyttet. Foretrukket eksempel på vektor-DNA er plasmid pGELl. pGELl er et plasmid som illustrert på fig. 3 og fig. 4 og en mikroorganisme inneholdende plasmidet ble deponert hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (i det følgende betegnet FRI) som Escherichia coli IGEL1 under FERM BP-629 den 6. oktober 1984.
Rekombinasjon av den DNA som koder for polypeptidet og vektor-DNA'en kan utføres ved hjelp av konvensjonelle rekombinante DNA-teknikker, hvori begge DNA'er nedbrytes med restriksjonsenzymer og religeres med T4 DNA-ligase.
I tilfellet for pSGHl og pGELl, som illustrert på fig. 3, blir MboII-Sall-nedbrytningsfragment som koder for lakseveksthormon og Sall-BamHI-nedbrytningsfragment, separat fremstilt fra PSGHl og HindiII-BamHI-nedbrytningsfragment inneholdende tryptofan-promotor fremstilles fra pGELl. På den annen side fremstilles den syntetiske DNA-linker som angi 11 nedenfor.
DNA-fragmentene og den syntetiske DNA-linkeren som beskrevet ovenfor, ligeres med T4 DNA-ligase for oppnåelse av det rekombinante plasmid pSGHIB2 som illustrert på fig. 3. Plasmidet koder for et modent lakseveksthormon.
I tilfellet for pSGH14 og pGELl, som illustrert på fig. 4, utføres en totrinnskonstruksjon. Det vil si, MboII-PvuII--nedbrytningsfragment som koder for nærheten av N-terminalen i det modne lakseveksthormon-peptidet og PvuII-Hindlll-
-nedbrytningsfragment inneholdende den resterende cDNA og vektordelen, fremstilles separat fra pSGHl. På den annen side fremstilles den nedenfor angitte syntetiske DNA-linkeren.
DNA-fragmentene og den syntetiske DNA-linkeren som beskrevet ovenfor, ligeres med T4 DNA-ligase for oppnåelse av det rekombinante plasmidet pSGHIIB9 som illustrert på fig. 4. Deretter oppnås HindiII-BamEI-nedbrytningsfragment som koder for det modne lakseveksthormon-peptidet fra pSGHIIB9 og HindiII-BamHI-nedbrytningsfragment inneholdende tryptofan-promotor oppnås fra pGELl. De to DNA-fragmentene ligeres med T4 DNA-ligase for oppnåelse av det rekombinante plasmid pSGHIIC2 som illustrert på fig. 4. Plasmidet har en konstruksjon hvori et område som koder for modent lakseveksthormon er ligert nedstrøms fra tryptofan-promotor.
Reaksjonsbetingelser som er nødvendige for de rekombinante DNA-teknikkene beskrevet ovenfor, er generelt som følger.
Nedbrytning av DNA'en med restriksjonsenzymer utføres vanligvis ved å reagere 0,1-20 >jg DNA med 0,1-100 enheter, for trinnsvis 1-3 enheter restriksjonsenzym pr. 1 pg DNA i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinnsvis pH 7,0-8,0), 0-200 mM NC1 og 2-30 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2 ved 20-70°C) optimal temperatur avhenger av benyttede restriksjonsenzymer) ifra 15 min. til 24 timer. Reaksjonen stoppes vanligvis ved oppvarming ved 55-75°C i 5-30 min. eller alternativt ved å inaktivere restriksjonsenzymet med en reagens slik som fenol og dietyl-pyrokarbonat.
Rensing av DNA-fragmentene dannet ved nedbrytning med restriksjonsenzymer utføres ved LGT-metoden eller poly-akrylamid-gelelektroforese.
Ligering av DNA-fragmentene utføres med 0,3-10 enheter T4 DNA-ligase i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 mM Tris-HCl (pH 6,1-9,5, fortrinnsvis 7,0-8,0), 2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2, 0,1-10 mM, fortrinnsvis 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, fortrinnsvis 5-10 mM ditiotreitol ved 1-37°C, fortrinnsvis 3-20°C ifra 15 min. til 72 timer, fortrinnsvis 2-20 timer.
Den rekombinante plasmid DNA dannet ved ligeringsreaksjonen innsettes i Escherichia coli ved transformasjonsmetoden ifølge Cohen et al. [S.N. Cohen, et al.: Proe. Nati, Acad. Sei, USA, 69, 2110 (1972)].
Isolering av den rekombinante plasmid-DNA fra Escherichia coli som bærer DNA'en, utføres ved metoden beskrevet i eksempel 1 eller metoden ifølge Birnboim, et al. [H.C. Birnboim, et al.: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)].
Plasmid DNA ligeres med 1-10 typer av restriksjonsendonukleaser og spaltningssetene undersøkes ved agarosegel-elektroforese. Videre blir om nødvendig basesekvensen for DNA'en bestemt ved metoden ifølge Maxam-Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei 74, 560 (1977)] eller metoden ifølge Sanger [Sanger, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 5463 (1977); Amersham Co., M13 cloning and sequencing handbook].
En rekombinant plasmid-DNA kan fremstilles som omtalt ovenfor.
Fiskeveksthormon-polypeptidet fremstilles ved følgende metode.
Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid slik som pSGHIB2 og pSGHIIC2 og en Escherichia coli stamme som inneholder pSGHIB2 eller pSGEIIC2 velges fra ampicillin--resistente kolonier. Den Escherichia coli stammen som inneholder pSGHIB2 eller pSGHIIC2, dyrkes i et medium for produksjon av fiskevektshormon-polypeptidet i de dyrkede cellene.
Som medium kan enten et syntetisk medium eller et naturlig medium anvendes, så lenge som det er egnet for vekst av Escherichia coli og produksjon av fiskeveksthormon-polypeptidet.
Som karbonkilde kan glukose, fruktose, laktose, glycerol, mannitol, sorbitol osv. benyttes.
Som nitrogenkilde kan NH4CI, (NE^^SC^, casaminosyre, gjærekstrakt, polypepton, kjøttekstrakt, baktotrypton, eller maisstøpevæske osv. anvendes.
I tillegg kan næringsmidler slik som K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgS04, vitamin B^ og MgCl2 anvendes.
Dyrking utføres ved pH 5,5-8,5 og ved 18-40°C under beluft-ning og omrøring.
Etter dyrking i 5-90 timer akkumuleres lakseveksthormon--polypeptidet i dyrkede celler. De oppsamlede cellene behandles med lysozym, brytes ved gjentatt frysing og tining og underkastes sentrifugering. Den således oppnådde super-natantvæske underkastes ekstrasjon ifølge en konvensjonell metode for ekstraksjon av polypeptider for å utvinne polypeptidet.
Detektering av polypeptidet utføres ved varmeoppløsnning av de dyrkede cellene direkte i Sample-buffer ifølge Laemmli [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] og ved bruk av SDS-polyakrylamidgel (metoden ifølge Laemmli: den ovenfor refererte metode) og ved farging med Coomassie Brilliant Blue.
Visse spesifikke utførelser av oppfinnelsen illustreres ved følgende representative eksempler.
Eksempel 1
Fremstilling av poly( A) RNA fra hypofysen hos laks
En RNA med poly(A) ble fremstilt fra hypofysen fra laks ifølge guanidiniumtiocyanat-ceciumklorid-metoden [utgitt av Maniatis, et al. Molecular Cloning, pl96, publisert av Cold Spring Harbour; Katsuya Shigesada, Saibo Kogaku (Cell Engineering), 2, 616, (1983)] som følger.
I dette trinnet ble 2 g av den nedfryste hypofysen fra laks (tilsvarende ca. 30 individer) oppbrutt og oppløseliggjort ved hjelp av en "Teflon"-homogenisator (5 omdr./min.) i 10 ml av en oppløsning bestående av 4M guanidiniumtiocyanat, 0, 5% sarkosin, 5 mM natriumcitrat (pH 7) og 0,1 M p<->merkapto-etanol. Eomogenatet ble ført gjennom 18 g injektor for å spalte DNA'en og anbragt på et lag av 1,2 ml hver av 5,7M CsCl og 0,1M EDTA (pE 8) i et ultrasentrifuger ingsrør. Sentrifugering ble utført ved 35.000 omdr./min. i 15 timer i Eitachi RPS40 rotor for å utvinne RNA'er somet bunnfall. RNA-bunnfallet ble oppløst i 10 ml Tris-ECl-oppløsning (pE 8,0) inneholdende 1 mM EDTA. Etter ekstraksjon med fenol--kloroform ble RNA'en utvunnet med etanol som et bunnfall. Ca. 1 mg av den således oppnådde RNA ble oppløst i 1 ml av en oppløsning bestående av 10 mM Tris-ECl (pE 8,0) og 1 mM EDTA. Oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min og 0,1 ml 5M NaCl ble tilsatt. Blandingen ble underkastet kromatografi i en oligo (dT)-cellulosekolonne (kolonnevolum 0,5 ml). mRNA'en med poly(A) adsorbert på kolonnen ble eluert med en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og IM EDTA og fraksjonert ved 0,2 ml porsjoner for oppnåelse av ca. 10 pg av mRNA'en med poly(A) i tredje til femte fraksjoner.
Eksempel 2
Syntese av en cDNA og innføring av cDNA' en i en vektor
Syntese av en cDNA og konstruksjon av et rekombinant plasmid som bærer cDNA'en, ble utført ifølge metoden til AkayamaBerg [Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)] som følger. Prosessen er illustrert på fig. 1.
I dette trinnet ble 400 pg pCDVl [Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] tilsatt til 300 pl av en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 10 mM NaCl, og ytterligere 500 enheter Kpnl ble tilsatt. Reaksjonen ble utført ved 37°C i 6 timer for å spalte plasmidet ved Kpnl-setet. Etter fenol-kloroformekstraksjon ble en DNA fjernet ved etanolutfelling. Ca. 200 pg av DNA'en spaltet med Kpnl ble tilsatt til 200 pl av en oppløsning fremstilt ved tilsetning av 0,25 mM dTTP til en buffer (i det følgende referert til som TdT-buffer) bestående av 40 mM natrium-kakodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl2 og 0,1 mM ditiotreitol (i det følgende betegnet DTT). Videre ble 81 enheter terminal deoksynukleotidyl-transferase (i det følgende betegnet TdT) tilsatt og reaksjon utført ved 37°C i 11 min. Derved ble ca. 67 poly(dT )-kjeder addert ved 3'-endene til pCDVl spaltet med Kpnl. Ca. 100 pg pCDVl DNA som var tilknyttet poly(dT)-kjeder ble utvunnet fra oppløs-ningen ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling. DNA'en ble tilsatt til 150 pl av en buffer bestående av 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 100 mM NaCl. Videre ble 360 enheter EcoRI tilsatt, og reaksjon utført ved 37°C i to timer. Reaksjonsproduktet ble underkastet LGT-metoden for oppnåelse av et DNA-fragment på ca. 3,1 Kb, hvilket er ca. 60 pg av pCDVl med poly(dT)-kjeder. DNA'en ble oppløst i 500 pl av en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Oppløsningen ble inkubert ved 65°C i 5 min., og 50 pl 5M NaCl ble tilsatt under isavkjøling. Blandingen ble underkastet kromatografi på oligo(dA)-cellulosekolonne. DNA'en med tilstrekkelig poly(dT )-kjeder ble adsorbert på kolonnen. Eluering ble utført med en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA for oppnåelse av 27 pg pCDVl med poly(dT)-kjeder (i det følgende betegnet som vektor-primer ) .
Deretter ble en linker-DNA fremstilt som følger.
Omkring 14 pg pLl [Okaya & Berg: Mol.Cell. Biol., 3, 280
(1983)] ble tilsatt til 200 pl av en buffer bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl. Videre ble 50 enheter Pstl tilsatt, og reaksjon ble utørt ved 37°C i 4 timer for å spalte pLl DNA ved Pstl-setet. Reaksjonsproduktet ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling for å utvinne ca. 13 pg pLl DNA spaltet ved Pstl-setet. Ca. 13 pg av DNA'en ble tilsatt til 50 pl TdT-buffer inneholdende 0,25 mM (sluttkonsentrasjon) dGTP. Videre ble 54 enheter TdT tilsatt, og inkubering ble utført ved 37°C i 13 min. for å addere ca. 14 (dG)-kjeder ved 3'-endene til pLl spaltet ved Pstl. En DNA ble utvunnet ved fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling. DNA'en ble tilsatt til 100 pl av en buffer bestående av 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. Videre ble 80 enheter Hindlll tilsatt og inkubering utført ved 37°C i 3 timer for å spalte pLl DNA ved Hindlll-setet. Reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved agarosegel-elektroforese, og et DNA-fragment på ca. 0,5 Kb ble utvunnet ved DEAE-papirmetoden [Dretzen, et al., Anal. Biochem., 112, 295(1981)]. DNA'en var linker-DNA med oligo(dG )-kjede (i det følgende betegnet linkerDNA).
Ca. 2 pg poly(A)RNA og ca. 1,4 pg vektor-pr imer fremstilt ovenfor ble oppløst i 22,3 pl av en oppløsning bestående av
50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM HC1, 0,3 mM DDT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP og dCTP) og 10 enheter ribonuklease-inhibitor. 10 enheter revers transkriptase ble tilsatt og inkubering ble utført ved 37°C i 40 min. for å syntetisere en DNA komplementær til mRNA. Reaksjonsproduktet ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling for å utvinne en vektor-primer-DNA forbundet med RNA-DNA— dobbeltkjede. DNA'en ble oppløst i 20 ml TdT-buffer inneholdende 66 pM dCTP og 0,2 pg poly(A). 14 enheter TdT ble tilsatt og inkubering ble utført ved 37°C i 8 min. for å addere 12 (dC)-kjeder ved 3'-enden til cDNA'en. Reaksjonsproduktet ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling for å utvinne en cDNA-vektorprimer-DNA forbundet med (dC)-kjeder. DNA'en ble oppløst i 400 pl av en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. 20 enheter Hindlll ble tilsatt og inkubering utført ved 37°C i to timer for å spalte DNA' en ved Hindlll--setet. Reaksjonsproduktet ble underkastet fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling for å oppnå 0,5 pmol av en cDNA-vektorprimer-DNA forbundet med (dC)-kjeder. Deretter ble 0,08 pmol av DNA'en og 0,16 pmol av linkeren nevnt ovenfor, tilsatt til 40 pl av en oppløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0, IM NaCl, 0, IM NaCl og 1 mM EDTA og inkuberinger ble utført ved 65°C, 42°C og 0°C i 10 min., 25 min. og 30 min., respektivt. Reaksjonsoppløsningen ble justert til 400 pl (totalvolum) av en oppløsning som hadde en sammensetning av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2S04, 0,IM HC1 og 0,1 mM g-NAD. 10 enheter Escherichia coli DNA-ligase ble tilsatt til reaksjons-oppløsningen og inkubering ble utført ved 11°C natten over. Reaksjonsoppløsningen ble justert til en oppløsning inneholdende 40 pm dNTP og 0,15 mM p-NAD. 5 enheter Escherichia coli DNA-ligase, 7 enheter Escherichia coli DNA-polymerase I og 2 enheter Escherichia coli ribonuklease H ble tilsatt og inkubering ble utført ved 12°C i 1 time, og suksessivt ved 25°C i 1 time. Ved den ovennevnte reaksjon ble en rekombinant DNA inneholdende cDNA ringsluttet, RNA-delen i RNA-DNA--dobbeltkjeden ble erstattet med DNA, og et rekombinant plasmid med komplett dobbeltkjedet DNA ble dannet.
Eksempel 3
Seleksjon av en rekombinant DNA inneholdende en lakseveksthormon- cDNA
Escherichia coli c600SF8 [Cameron: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3426 (1975)] ble transformert under anvendelse av det rekombinante plasmidet ble oppnådd i eksempel 2 ved metoden ifølge Scott et a!. [Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Engineering) 2, 616 (1983)]. Blant ca. 10.000 kolonier oppnådd på denne måten ble 4800 kolonier fiksert på nitro-cellulose. Det ble valgt 8 stammer som hybridiserte sterkt ved 40°C med proben hvori en syntetisk DNA tilsvarende fra den 23. til den 28. aminosyresekvensen fra N-terminalen i lakseveksthormonet, dvs. (3. base er A eller G, den 9. er T eller C, den 12. er C eller T, den 15. er C eller T og kombinasjon av basene ut-gjør 16 typer av syntetiske DNA'er) er merket med <32>P [metoden ifølge Grunstein-Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 72, 3961 (1975)]. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Southern [J. Mol. Biol., 98, 503 (1975 )] at de 8 stammene hybridiserte med den ovennevnte probe og den syntetiske DNA-proben tilsvarende aminosyresekvensen omkring C-terminalen
(den 3. basen er C eller T, den 6. er Å eller G, den 9. er A, T, G eller C, den 12. er G eller A og kombinasjon av basene utgjør 32 typer av syntetiske DNA'er. Plasmidene betegnet pSGH 1, 3, 6, 8, 9, 10, 14 og 17, respektivt, har den DNA-sekvens som er antatt fra aminosyresekvensen i det kjente lakseveksthormonet og antas å inneholde en vekst-hormon-cDNA.
Eksempel 4
Basissekvensen i plasmider pSGHl og PSGH14
De 8 plasmidene oppnådd ovenfor ble nedbrutt med forskjellige restriksjonsendonukleaser og spaltningskart over cDNA-delene ble bestemt. Plasmidene ble klassifisert i 3 grupper, dvs. gruppen av pSGHl, 6, 9, 10 og 17, gruppen av pSGH3 og gruppen av pSGH8 og 14 fra stillingene til restriksjonsendonuklease-seter. Restriksj onsendonukleasekart over hver gruppe er illustrert på fig. 2.
Hele nukleotidsekvensen i translasjonsområdet til plasmidene som hybridiserte sterkest med den syntetiske DNA-proben som foretatt i eksempel 3 og antas å inneholde nesten komplett cDNA, spesielt pSGHl, ble bestemt ved metoden ifølge Sanger ved bruk av zzml3 fag [Sanger, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 74, 5463 (1977): Amersham, M13 cloning and sequencing handbook]. Sekvensen er illustrert i tabell 1. I tabell 1 koder basenumrene 1-66 for signalpeptid og 67-630 koder for det modne lakseveksthormon-polypeptidet.
Videre, blant pSGH 8 og pSGH14 som adskiller seg fra den pSGHl-innbefattende gruppen i restriksjonsseter, underkastes pSGH14 som antas å inneholde den cDNA som er lengre og har nesten fullstendig lengde, for metoden ifølge Sanger ved bruk av M13 fag. I tabell 2 koder basenumrene 1-66 for signalpeptid og 67-630 koder for det modne lakseveksthormon-polypeptidet.
Polypeptidet som er kodet av cDNÅ'en overensstemmer fullstendig med det polypeptid som er kodet av pSGHl i 11 aminosyrer i signalpeptidet, men adskiller seg med hensyn til 12 aminosyrer i det modne peptid i 188 aminosyrer som illustrert i tabell 2 ved understrekninger. Videre, så lenge som det refereres til den ZN-terminale 40 aminosyresekvensen bestemt fra lakseveksthormon-polypeptidet, er 5 aminosyrer klart forskjellige. Det anses derfor at cDNA'en som innehol-des i pSGH14 koder for et fiskehormon som adskiller seg fra pSGHl. Escherichia coli inneholdende pSGHl og pSGH14 ble deponert hos FRI som Escherichia coli ESGH1 (FERM BP-551) og ESGH14 (FERM BP-611) den 23. juni 1984 og 20. september 1984, respektivt.
Eksempel 5
Konstruksjon av rekombinant plasmid pSGH IB2 som koder for det modne lakseveksthormon- polypeptidet
I dette eksempel ble 5 pg plasmid pSGHl inneholdende en DNA som koder for lakseveksthormon-polypeptidet, oppløst i 40 pl av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 10 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-10 buffer-oppløsning". Deretter ble 10 enheter av restriksjonsenzymet MboII tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Konsentrasjonen av NaCl i oppløsningen ble justert til 175 mM, og 10 enheter Sali ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,2 pg DNA--fragment med 163 Bp tilsvarende N-terminalområdet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Deretter ble 5 pg pSGHl oppløst i 40 pl av en oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 100 mM
NaCl (i det følgende betegnet "Y-100 bufferoppløsning"). 10 enheter BamEI ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble konsentrasjonen av NaCl i reaksjonsoppløsningen justert til 175 mM og enheter Sali ble tilsatt. Nedbrytningreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0 ,5 pg av et DNA-fragment på ca. 900 bp inneholdende C-terminalområdet og 3'-ikke-translasjonsområdet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Separat ble 5 pg pGELl oppløst i 40 pl Y-100 bufferoppløs-ning, og 10 enheter hver av BamEI og Eindlll ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 30°C i 3 timer. Ca. 1 pg av et DNA-fragment på 2,7 Kb inneholdende en tryptofan-promotor ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen.
For å addere et translasjon-initieringskodon ATG som er nødvendig for ekspresjon av den DNA som koder for det modne lakseveksthormon-polypeptidet og å ligere en vektor-DNA og den ovennevnte DNA, ble en DNA-linker syntetisert som angitt nedenfor.
To enkeltkjedede DNA'er på 17-mer og 9-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., 75, 5765 (1978)]. Deretter ble 12 pmol hver av 17-mer og 12-mer DNA'ene oppløst i 20 pl av en oppløsning bestående av 50 mM Tris-ECl (pE 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 1 mM ATP. 6 enheter T4 polynukleotidkinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,1 pmol MbolI-SalI-fragment (163 bp) ipSGHl, 0,006 pmol Sal I-BamHI-fragment (ca. 900 bp)i pSGHl og 0,02 pmol Hindi 11-BamHI-fragment (ca. 2,7 Kb) i pGELl oppnådd som angitt ovenfor, oppløst i 30 pl av en oppløsning bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 1 mM ATP. 5 pl av den syntetiske DNA-fosfor-yleringsreaksjonsoppløsningen oppnådd ovenfor ble tilsatt. 6 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt til blandingen, og 1igeringsreaksjon utført ved 4°C i 18 timer.
Escherichia coli HB101 [Bolivar, et al., Gene, 2, 75 (1977)] ble transformert ved anvendelse av reaksjonsoppløsningen for oppnåelse av en Ap<R->koloni. Et plasmid DNA pSGHIB2 som illustrert på fig. 3 ble utvunnet fra kolonien. Strukturen til pSGHIB2 ble erkjent ved spalting med EcoRI, Hindlll, Clal, Bgllll, Sali og BamHI og agarosegel-elektroforese. Sekvensen til den DNA som koder for N-terminalområdet i lakseveksthormon-polypeptidet i pSGHIB2 ble bestemt ifølge metoden til Sanger [Sanger, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 5463 (1977 ); Amersham Co., M13 cloning and sequencing handbook] ved anvendelse av M13 fag som illustrert nedenfor.
Som resultat ble det bekreftet at pSGHIB2 inneholder den DNA som koder for det modne lakseveksthormon-polypeptidet. Escherichia coli inneholdende plasmid pSGHIB2 ble deponert hos FRI som Escherichia coli ESGHIB2 som FERM BP-612 den 20. september 1984.
Eksempel 6
( 1) Konstruksjon av rekombinant plasmid PSGHIIB9 som koder for det modne lakseveksthormon- polypeptidet fra pSGH14
I dette eksempelet ble 5 pg plasmid pSGH14 inneholdende en DNA som koder for et lakseveksthormon-polypeptid, oppløst i 100 pl av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 109@ mM MgCl2 og 10 mM NaCl. Deretter ble 10 enheter av restriksjonsenzym MboII tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Konsentrasjonen av NaCl i oppløsningen ble justert til 50 mM og 10 enheter PvuII ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,05 pg DNA-fragment på 108 bp tilsvarende til N-terminalområdet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved polyakrylamidgel-elektroforese og DEAE-papirmetode.
Deretter ble 5 pg pSGH14 oppløst i 40 pl av en oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 50 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-50 bufferoppløsning"). 10 enheter hver av PvuII og Hindlll ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,5 pg av et DNA-fragment på ca. 3,3 kb inneholdende C-terminalområdet og 3'-ikke-translasjonsområdet i veksthormonet av-ledet fra pSGH14 og en del av vektoren, ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
For å addere et translasjonsinitieringskodon ATG som er nødvendig for ekspresjon av den DNA som koder for det modne lakseveksthormon-polypeptidet og for å ligere en vektor-DNA og den ovennevnte DNA, ble en DNA-linker som angitt nedenfor syntetisert.
To enkeltkjedede DNA'er på 14-mer og 9-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978)]. Deretter ble 39 pmol hver av 14-mer og 9-mer DNA'ene oppløst i 20 pl av en oppløsning bestående av 50 mM Tris HC1 (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 1 mM ATP. 6 enheter T4-polynukleotidkinase ble tilsatt og fosforyleringsreaksjon utført ved 37°C i 60 min.
Deretter ble 0,08 pmol MbolI-PvuII-fragment (108 bp) i pSGH14 og 0,02 pmol pvuII-Hindlll-fragment (ca. 3,7 kb) i pSGH14 oppnådd som angitt ovenfor, oppløst i 30 pl av en oppløsning bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 1 mM ATP. 5 pl av den syntetiske DNA-fosforyleringsreaksjonsoppløsningen oppnådd ovenfor, ble tilsatt. 6 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt til blandingen, og ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 18 timer.
Escherichia coli HB101 [Bolivar, et.al., Gene, 2, 75 (1977)] ble transformert ved anvendelse av reaksjonsoppløsningen for oppnåelse av en Ap<R->koloni. Et plasmid DNA pSGHIIB9 som illustrert på fig. 4 ble utvunnet fra kolonien. Strukturen til pSGHIIB9 ble erkjent ved spaltning med Hindlll, Xbal, Bglll og BamHI og agarosegel-elektroforese.
(2) Innsetning av et område som koder for det modne lakseveksthormon- polypeptidet i PSGEIIB9 i en ekspresjonsvektor pGELl
I dette trinnet ble 5 pg pSGHIIB9 oppløst i 40 pl Y-50--bufferoppløsning og 10 enheter hver av BamHI og Hindlll ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,1 pg av et DNA-fragment på ca. 1200 bp som koder for hele det modne lakseveksthormon-polypeptidet ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Separat ble 5 pg pGELl oppløst i 40 pl Y-50-bufferoppløs-ning, og 10 enheter hver av BamHI og Hindlll ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,1 pg av et DNA-fragment på ca. 2,7 kb inneholdende en tryptofanpromotor ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.
Deretter ble 0,01 pg Hindi 11-BamHI-fragment (ca. 1200 bp) i pSGHIIB9 og 0,015 pg HindiII-BamHI-fragment (ca. 2,7 Kb) i pGELl, oppløst i 30 pl av en oppløsning bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 1 mM ATP og 6 enheter T4 DNA-ligase ble tilsatt. Ligeringsreaksjonen ble utført ved 4°C i 18 timer.
Escherichia coli HB101 ble transformert ved anvendelse av reaksjonsoppløsningen for oppnåelse av en Ap^-koloni. Et plasmid DNA pSGHIIC2 som illustrert på fig. 4, ble utvunnet fra kolonien. Strukturen til pSGHIIC2 ble erkjent ved spaltingen med EcoRI, Hindlll, Clal, Bglll og BamHI og agarosegel-elektroforese.
Escherichia coli stammer inneholdende plasmider pSGHIIB9 og pSGHIIC2 ble deponert hos FRI som Escherichia coli ESGHIIB9 og ESGHIIC2 under FERM BP-707 og 708, respektivt, den 8. februar 1985.
Eksempel 7
Fremstilling av det nve lakseveksthormon- polypeptidet med Escherichia coli inneholdende pSGHIB2 og pSGHIIC2
Escherichia coli W3110 (FERM BP-732) ble transformert med rekombinantplasmidet pSGHIB2 eller pSGHIIC2 oppnådd i eksempel 5 eller eksempel 6, ved en konvensjonell metode. En oppnådd Ap-R-koloni ble inokulert i 8 ml av MCG-medium (pH 7,2) bestående av 0, 6% Na2HP04, 0, 3% KH2P04, 0,5$ NaCl, 0,156 NH4C1, 0,5$ glukose, 0,5$ Kasaminosyre, 1 mM MgS04 og 4 jjg/ml vitamin Bl, og dyrking ble utført ved 30°C i 18 timer. Kulturen ble sentrifugert ved 8000 omdr./min. i 10 min. for å utvinne celler. Cellene ble suspendert i prøvebufferen til Laemmli og underkastet SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og farging med Coomassie Brilliant Blue for å detektere et polypeptidbånd ved delen med en molekylvekt på ca. 25.000. Båndet ble ikke observert i tilfelle for bruk av Escherichia coli som ikke inneholder plasmidet. Som resultat ble det bekreftet at Escherichia coli inneholdende pSGHIB2 eller pSGHIIC2 produserte lakseveksthormon-polypeptidet i en stor mengde.
Claims (4)
1.
Ekspresjonsvektor pSGHIB2 (fig. 3), karakterisert ved at den inneholder og kan uttrykke følgende DNÅ-sekvens som koder for et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta:
transformert til Escherichia coli FERM BP-612.
2 .
Ekspresjonsvektor pSGHIIC2 (fig. 4), karakterisert ved at den inneholder og kan uttrykke følgende DNA-sekvens som koder for et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta:
transformert til Escherichia coli FREM BP-708.
3.
Fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta som har følgende polypeptidsekvens:
karakterisert ved at man i et næringsmedium dyrker en Escherichia coli-stamme som er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav l, akkumulerer fiskeveksthormon-polypeptidet i mediet og utvinner polypeptidet derfra.
4 .
Fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon av Oncorhynchus keta som har følgende polypeptidsekvens:
karakterisert ved at man i et næringsmedium dyrker en Escherichia coli-stamme som er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 2, akkumulerer fiskeveksthormon-polypeptidet i mediet og utvinner polypeptidet derfra.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134536A JPS6115699A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| JP59213361A JPS6193197A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモンポリペプチド |
| JP21336084A JPS6193196A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| JP60050096A JPS61210100A (ja) | 1985-03-13 | 1985-03-13 | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO852568L NO852568L (no) | 1985-12-30 |
| NO174717B true NO174717B (no) | 1994-03-14 |
| NO174717C NO174717C (no) | 1994-06-22 |
Family
ID=27462444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO852568A NO174717C (no) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmåten |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4689402A (no) |
| EP (1) | EP0166444B1 (no) |
| AU (1) | AU575961B2 (no) |
| CA (1) | CA1272144A (no) |
| NO (1) | NO174717C (no) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894362A (en) * | 1985-07-10 | 1990-01-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Eel growth hormone |
| JPS62224297A (ja) * | 1986-03-25 | 1987-10-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモンポリペプチドの製造法 |
| DE3751144D1 (de) * | 1986-12-31 | 1995-04-13 | Lucky Ltd | Verfahren zur herstellung eines lachswachstumshormons mittels eines kunstgens. |
| US5270180A (en) * | 1986-12-31 | 1993-12-14 | Lucky, Ltd. | Method for the production of salmon growth hormone using a synthetic gene |
| US5366876A (en) * | 1986-12-31 | 1994-11-22 | Lucky Ltd. | Method for production of bovine growth hormone using a synthetic gene |
| US4985544A (en) * | 1987-08-04 | 1991-01-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for renaturing fish growth hormone |
| SE8901264L (sv) * | 1988-04-11 | 1989-10-12 | Phillips Petroleum Co | Uttryck av laxtillvaexthormon i metylotropisk jaest av slaektet pichia |
| EP0387457A1 (en) * | 1989-01-06 | 1990-09-19 | Eurogentec S.A. | Recombinant fish hormone proteins |
| JPH03240800A (ja) * | 1990-02-19 | 1991-10-28 | Nippon Oil Co Ltd | 成長ホルモン様糖タンパク質 |
| US5232708A (en) * | 1990-06-20 | 1993-08-03 | Monsanto Company | Coated veterinary implants |
| IS3778A7 (is) * | 1990-10-31 | 1992-05-02 | Amgen Inc. | Aðferð til að gefa dýrum vaxtarhormón, þar sem gefnu magni er stýrt |
| US5122513A (en) * | 1991-03-19 | 1992-06-16 | Monsanto Company | Fish growth using bovine placental lactogen |
| EP0524360B1 (en) * | 1991-07-22 | 1994-11-30 | Eurogentec S.A. | A somatotropin-based improved process for the farming of salmonids, particularly in seawater |
| FR2686606A1 (fr) * | 1992-01-23 | 1993-07-30 | Tsumura Co | Nouveaux peptides, adn recombinants codant ces peptides et microorganismes transformes avec ces adn recombinants. |
| WO1993023552A1 (en) * | 1992-05-21 | 1993-11-25 | Government Of The United States As Represented By Secretary Department Of Health And Human Services | Targeting gene expression to living tissue using jet injection |
| US5476779A (en) * | 1992-09-30 | 1995-12-19 | University Of Maryland At College Park | DNA encoding insulin-like growth factor II isolated from rainbow trout |
| US5476762A (en) * | 1993-12-21 | 1995-12-19 | Konica Corporation | Silver halide photographic light-sensitive material |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| JPS60214798A (ja) * | 1984-04-06 | 1985-10-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン |
| CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
-
1985
- 1985-06-25 CA CA000485108A patent/CA1272144A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-26 AU AU44195/85A patent/AU575961B2/en not_active Ceased
- 1985-06-26 NO NO852568A patent/NO174717C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-06-27 EP EP85107987A patent/EP0166444B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-01 US US06/750,587 patent/US4689402A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-14 US US07/017,630 patent/US4849359A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4419585A (en) | 1986-01-02 |
| CA1272144A (en) | 1990-07-31 |
| AU575961B2 (en) | 1988-08-11 |
| EP0166444B1 (en) | 1990-11-28 |
| EP0166444A2 (en) | 1986-01-02 |
| US4849359A (en) | 1989-07-18 |
| EP0166444A3 (en) | 1987-08-19 |
| US4689402A (en) | 1987-08-25 |
| NO174717C (no) | 1994-06-22 |
| NO852568L (no) | 1985-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO174717B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmaaten | |
| AU648670B2 (en) | A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| CA1299507C (en) | Grf analogs | |
| CA1340830C (en) | Process for production of physiologically active peptide containing cysteine residue | |
| NO301483B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av humaninsulinanaloger | |
| EP0104920B1 (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swing growth hormone-like polypeptides | |
| NO308667B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av fusjonsproteiner | |
| NO177009B (no) | Analogifremgangsmåte ved fremstilling av insulinanaloger | |
| US5599792A (en) | Bone-stimulating, non-vasoactive parathyroid hormone variants | |
| EP0209068B1 (en) | Eel growth hormone | |
| EP0259891B1 (en) | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| FI93125C (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| AU643194B2 (en) | Recombinant fish hormone proteins | |
| EP0239075A2 (en) | Process for producing fish growth hormone polypeptide | |
| EP0534705A2 (en) | Expression of low molecular weight recombinant polypeptides | |
| EP0201882A2 (en) | Fish prolactin polypeptide and derivatives thereof | |
| US5420113A (en) | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| JPH051800B2 (no) | ||
| RU1825376C (ru) | Способ получени ДНК, кодирующей гормон роста лосос , способ конст-ни промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , дл получени плазмид pS GH1, pS GH3, pS GH9, pS GH10, pS GH14 и pS GH17, способ получени реком-ной плазмидной ДНК pS GH1B2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ной плазмидной ДНК pSGH II С2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ного гормона роста лосос | |
| JPH0695938B2 (ja) | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド | |
| JPH05268969A (ja) | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド | |
| JPH051799B2 (no) | ||
| JPH062065B2 (ja) | 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド | |
| JPS61257999A (ja) | 魚類のプロラクチンポリペプチド | |
| NO875114L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et forloeperpolypeptid inneholdende et spesifikt polypeptid. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |