RU1825376C - Способ получени ДНК, кодирующей гормон роста лосос , способ конст-ни промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , дл получени плазмид pS GH1, pS GH3, pS GH9, pS GH10, pS GH14 и pS GH17, способ получени реком-ной плазмидной ДНК pS GH1B2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ной плазмидной ДНК pSGH II С2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ного гормона роста лосос - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к генетической инженерии и касаетс  получени  кДНК, кодирующей гормон роста рыбы, получение рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих данный гормон, а также способа получени  полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма. Сущность изобретени ; информационную РНК извлекают из гипофиза лосос , после чего синтезируют ДНК, комплементарную иРНК (кДНК). Получают пробу ДНК, соответствующую последовательности аминокислот. NIKON ца гормона роста лосос , после чего клонируют ген гормона роста лосос  путем отбора кДНК, котора  гибридизуетс  с пробой ДНК, и определ ют последовательность оснований ДНК. Описана экспресси  и накопление в питательной среде гормона роста лосос  в результате культивировани  микроорганизма, содержащего рекомби- нантнуюплазмидную ДНК, в которую введена кДНК, кодирующа  гормон роста лосос . 4 з. п. ф-лы. Ј

Description

Изобретение относитс  к генетической инженерии и касаетс  получени  ДНК, кодирующей гормон роста рыб, получени  рекомбинантных ДНК, кодирующих данных гормон, а также способа получени  полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма.

Сущность изобретени  состоит в следующем .

Полную РНК получают из гипофиза лосос  (Omorhynchus Кегэ)и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой , дл  выделени  РНК, имеющую поли- аденилировую кислоту (поли (А) РНК). Дву- нитевую ДНК, использу  поли (А) РНК в качестве матрицы и ревертазы. Рекомби- нантную ДНК синтезируют, использу  In vitro технологию рекомбинантной ДНК. вставл   синтезированную ДНК в векторную ДНК, трансформируют полученными ДНК штамм Escherichla coll.

Ниже подробно по сн етс  способ получени  ДНК и рекомбинантной ДНК изобретени .

У пойманных лососей удал ют гипофиз, который сразу же замораживают в жидком азоте, К замороженному гипофизу добавл ют тиоцианат гуанидина, после чего гипофиз размельчают и солюбилизуют, Затем солюбилизованный гипофиз помещают в слой раствора CSC и подвергают ультрацентрифугированию дл  получени  в качеств осадка полной цитоплазмической РНК, Или же к солюбилизованному матери- злу добавл ют в месте с тиоцианатом гуанидина LiCI дл  выделени  в качестве осадка только РНК.

Выделенную РНК раствор ют в изотоническом растворе NaCI или KCI (например, 0,5 мол ) и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой, с адсорбированием в колонке иРНК, имеющей полиаденилированную кислоту (поли (А)). Вымывание провод т водой или гипотони- ческим солевым раствором, например 10 мМ буферной смеси (трис-HCI) с выделением иРНК, имеющей поли (А).

Синтезируют векторную затравку. Вектор , например, pCDVI, обрабатывают Kpn I в соответствующем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например , рН 7,5, 10 мМ), MgCl2 (например, 6 мМ), NaCI (например, 10 мМ), дл  удалени  pCDVI на участке Kpnl. ДНК инкубируют с концевой дезоксинуклеотидилтрансфера- зой при подход щей температуре (например , 37°С) в течение подход щего периода (например, 20 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 6,8, 30 мМ), кокодилат натри  (например, 140 мМ), CoCl2 (например, 1 мМ), дитиотреитол (например, 0,1 мМ), дТТФ (например, 0,25 мМ) дл  присоединени  около 60 остатков тимидина на обоих З -концах векторной ДНК. Затем ДНК обрабатывают в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 10 мМ), MgCte (например, 6 мМ), NaCI (например, 100 мМ). Раствор фракционируют с помощью низкотемпературного гелевого элек- трофореза на геле агарозы (в дальнейшем сокращено называемом методом НТТ) с целью выделени  фрагментов ДНК примерно в 3,1 кВ. Затем ДНК раствор ют в гипертоническом растворе NaCI или KCI (например, 0,5 М) и пропускаютчерез колонку , заполненную поли (дА) целлюлозой с адсорбированием в колонке только молекул векторной затравки, имеющей поли (Т). Вымывание провод т водой или гипотониче- ским солевым раствором, например буфером трис-HCI, дл  выделени  молекул только векторной затравки с поли (Т).

Затем синтезируют св зующую ДНК. Например, pLI ДНК обрабатывают Pstl в

подход щем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например. рН 7,5; 10 мМ), MgCl2 (например, 6 мМ), NaCI (например, 50 мМ) дл  удалени  pL1 на участке pstl. Затем ДНК обрабатывают так же, как при синтезе векторной затравки, за тем исключением, что вместо дТТФ добавл ют дСТФ и ввод т примерно 15 цепей олиго (дГ). Обрабатывают ДНК с помощью Hind III в подход щем растворе, например, растворе , содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 10 мМ), MgCl2(например, 6 мМ), NaCI (например, 60 мМ). Фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ фракционируют электрофорезом на геле агарозы и выдел ют на ЕАЕ-бумаге. Тем самым получают св зующую ДНК.

Полученные поли (А) РНК, векторную затравку и св зующую ДНК используют дл  синтеза кДНК, который заключаетс  в следующем . Поли (А) РНК и векторную затравочную ДНК ввод т в реакцию с ревертазой при подход щей температуре (например, 37°С) и в течение подход щего периода времени (например, 40 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 8,3; 50 мМ), MgCl2 (например, 8 мМ), KCI (например , 30 мМ) дитиотреитол (например, 0,3 мМ), дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ (например , каждого по 2 мМ). Примерно 15 олиго- (дЦ)-цепей присоедин ют к З -концам полученной РНК-ДНК двойной нити в тех же услови х, что и в случае присоединени  (дТ)- цепей к векторной затравке, за исключением того, что вместо дТТФ примен ют дЦТФ. В подход щем растворе, содержащем буфер трис-HCL (например, рН 7,5; 10 мМ), MgClz (например, 6 мМ), NaCI (например, 60 мМ), ДНК обрабатывают Hind III. Ранее полученную св зующую ДНК смешивают с ДНК и приготовленную смесь инкубируют ДНК- лигазой E.coll при подход  щей температуре (например, 12°С) в течение подход щего периода времени (например, 16 ч) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 20 мМ), MgCte (например, 4 мМ), ()2SCM (например, 10 мМ), KCI (например , 0,1 мМ) и/ -никотинамидадениндинук- леозид -НАД) (например, 0,1 мМ) дл  приготовлени  кольца кДНК и св зующей ДНК. К реакционному раствору добавл ют 40 мкМ (конечна  концентраци ) каждого: дАТФ, дТТФ, дГТФ м дЦТФ. Дл  замещени  РНК-части ДНК и получени  рекомби- нантной плазмиды, содержащей двунитевую кДНК. добавл ют ДК-лигазу, ДНК-полимеразу 1 и рибонуклеазу Н. Escherichia coll.

Штамм Escherlchia coll, например, Esch erlchia coll с 600 SF8, трансформируют

с помощью полученной рекомбинантной плазмиды. Поскольку в указанной плазмиде имеетс  ген устойчивости к ампициллину, трансформант Escherichla coll также устойчив к амплициллину,

Отбор штамма микроорганизма, несущего новую рекомбинантную плазмидную ДНК с геном, комплементарным иРНК гормона роста рыб, из устойчивых к ампициллину (Ап) провод т следующим образом. Полученный трансформант фиксируют на фильтре из нитроцеллюлозы и с ним гибри- дизируют искусственную пробу, имеющую ДНК-последовательность, котора  была задана последовательностью аминокислот известного полипептидного роста лосос , с целью отбора трансформанта, про вл ющего повышенную гибридизацию.Пробу ДНК синтезируют обычным триэфирным методом . Рекомбинантную плазмиду, комплементарную иРНК гормона роста лосос , идентифицируют вышеуказанным методом.

Полученными таким способом рекомби- нантными плазмидами  вл ютс  pS GH1 и pSGH14, Плазмиды используют в качестве источника ДНК, кодирующей гормон роста лосос .

Способ получени  полипептидного гормона роста лосос  экспрессией ДНК, кодирующей гормон лосос , в микроорганизме состоит в следующем:

ДНК, кодирующую гормон роста лосос , отсекают от плазмиды, несущей ДНК, и вставл ют в векторную ДНК. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют микроорганизм и трансформант культивируют с целью накоплени  в питательной среде полипептидного гормона роста лосос . Затем из культуры выдел ют гормон роста лосос .

Примерами плазмид, содержащих ДНК, кодирующую гормон роста лосос ,  вл ютс  плазмиды pSGHCI и pSGHH.

Примен ют векторные ДНК, в которые встраивают чужеродную ДНК в рамке считывани  от подход щего промотора, например , тгр-промотора, вас-промотора или Р2-промотора, и длину между последовательностью Шайн-Дальгарно (дал ее обозначаетс  как последовательность ЩД) и инициирующим кодоном (АТГ) устанавливают , например, в 6-18 основных пар. Предпочтительно использование векторной ДНК -pGELI.

Рекомбинацию ДНК, кодирующей полипептид , и векторной ДНК осуществл ют общеизвестными приемами.

Получают Mboll-S-зИ фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , Sall-BamHI фрагмент, а также Hmri lll-BamHI фрагмент

плазмиды pGELI, содержащий триптофано- вый промотор. Искусственную линкерную ДНК получают по приведенной схеме

Hind III И™ 1

5 I ACCTTATCATACAAAAAC Гз

1I-1

3-IATACTATCTTTTTj 5

Me/lie Gtu AS/

I.3

Фрагменты ДНК и линкерную ДНК сши- вают с помощью Т4-ДНК-лигазы получают рекомбинантную плазмиду pSGH1B2, котора  кодирует зрелый гормон роста лосос .

Из pSGH1 отдельно получают МЬо II- PVU II фрагмент, кодирудющий область вблизи N-конца зрелого пептида гормона роста лосос , и PVU ll-HInd II фрагмент, содержащий оставшуюс  «ДНК и векторную часть. С другой стороны линкерную ДНК получают по приведенной схеме.

Hind IIuSoll

:Ц

С I 3

Г еАССТТАТССААААС А Т А С С,Т Т Т Т Uet ОН/ И5Л

5 Фрагменты ДНК и линкерную ДНК св - зываютс помощью Т4-ДНК-лигазы и получают рекомбинантную плазмиду pSGHIIBQ. Затем из плазмиды pSGH11B9 получают Hind Ill-Bam HI фрагмент, содержащий зре0 лый пептид гормона роста лосос , а из pCELI получают Hind Ill-Bam HI фрагмент, содержащий триптофановый промотор. Оба фрагмента св зывают с помощью Т4-ДНК- лигазы дл  получени  плазмиды pSGHI 1C2.

5 Обработку ДНК ресктриктазами прово-. д т следующим образом: 0,1-2 мг ДНК с О.Т-100 единицами, предпочтительно с 1-3 единицами рестриктазы на 1 мг ДНК в смеси 2-200 мМ; предпочтительно 10-40мМ,трис0 НС (рН 6-99,5, предпочтительно рН 7-8), 0-2/00 мМ NaCl и 2-30 мМ, предпочтительнее 5-10 мМ, MgCl2 при 20-70°С (оптимальна  температура зависит от примен емого ограничивающего фермента) от 15 мин до

5 24 ч. Прекращают реакцию обычно нагреванием до 55-75°С в течение 5-30 мин или же инактивацией фермента с помощью такого реагента, как фенол или диэтилпирокарбо- нат.

0Очистку фрагментов ДНК, образующихс  в результате гидролиза рестриктазами, провод т методом НТГ или электрофорезом на полиакриламидном геле.

Св зывание фрагментов ДНК прово5 д т с помощью Т4-ДН-лигазы (0,3-10 единиц ) в смеси 2-200 мМ, предпочтительнее 10-40 мМ. трис-HCI (рН 6,1-9,5, предпочтительнее 7-8), 2-20, предпочтительнее 5-10 мМ MgClz. 0.1-10 мМ. предпочтительнее 0,5-2 мМ, АТФ и 1-50 мМ, предпсчтительнее 5-10 мМ, дитиотреитола при 1-37°С, предпочтительнее при 3-20°С, от 15 мин до 72 ч, предпочтительнее в течение 2-20 ч.

Полученную рекомбинантную плазмиду ДНК ввод т вб Eschertchla coll.

Выделение рекомбинантной плазмид- ной ДНК Escerlchia coll осуществл ют методом , описанным в примере 1.

Плазмиду ДНК гидролизуют 1-10 видами эндонуклеаз, места расщеплени  изучают с помощью электрофореза на геле агарозы или на полиакрилоамидном геле. В случае необходимости, последовательность оснований ДНК определ ют методом Makam-Gilbert или методом Sanger.

Штамм EscerichacoliK-12HB101 трансформируют с помощью плазмид pSGH11C2 и pSGH1B2, после чего штамм Escherichla coll, несущий pSGH11C2 или pSGH1B2, отбирают из устойчивых к ампициллину колоний . Штамм Escherichia coli, несущий pSGH1B2 или pSGH11C2, культивируют в питательной среде с получением в клетках культуры полипептидного гормона роста рыб.

В качестве питательной среды используют искусственную или естественную среду , если только она подходит дл  выращивани  Escherichla coli или дл  производства полипепгидного гормона роста рыб.

В качестве источника углерода используют глуюкозу, фруктозу, глицерин, маннит, сорбит и т. д.

В качестве источника азота используют NH4CI, ()2S04, казаминокислоты, дрожжевой экстракт, полипептон, м сной экстракт , боктотриптон, зерновой экстракт и т.

Д.

Кроме того, используют питательные вещества как К2НР04, КНаРСМ, NaCI, MgSGM, витамин Bi и MgClz.

Культивирование провод т при рН 5,5- 8,5 и при аэрации и перемешивании .

В результате культивировани  в течение 5-90 ч в культуральных клетках накапливаетс  полипептидный гормон роста лосос . Собранные клетки обрабатывают лизозимом, разрушают неоднократным замораживанием и оттаиванием и подвергают центрифугированию. Полученную таким образом надосадочную жидкость подвергают экстрагированию обычным методом экстракции полипептидов с целью их выделечи .

Детектирование полипептида провод т растворением при нагревании в буфере Saelmmli и действием НДС на полиакрила- мидном геле и окрашиванием реактивов Coomassle Brilliant голубым.

Изобретение иллюстрируетс  следующими примерами.

Пример 1.2г замороженного гипофиза лосос  (от 30 особей) разрушают и гомогенизируют в 10 мл раствора, содержащего 4 М тиоцианатагуанидина, 0,5% саркозила, 5 мМ цитрита натри  (рН 7) и 0,1 М / -меркаптоэтанола. Гомогенат пропускают через инжектор на 18 G и помеща0 ют в слой 5,7 М CSCI и 0,6 М ЭДТА (рН 8) по 1,2 мл каждого раствора в ультрацентрифужных пробирках. РНК осаждают центрифугированием при 35000 об/мин в течение 15 ч. Осадок РНК раствор ют в растворе

5 трис-НС1 (10 мл, рН 8), содержащем 1 мМ ЭДТА, экстрагируют смесью фенол : хлороформ и осаждают этанолом. 1 мг полученной РНК раствор ют в 1 мл 10 мМ трис-HCI (рН 8) и 1 мМ ЭДТА, инкубируют при 65°С в

0 течение 5 мин, добавл ют 1 мл 5 М NaCI. Смесь хроматографируют на олиго-дТ целлюлозе (производство P-L Blochemlcals обь- ем колонки 0,5 мл). Абсорбированную на колонке РНК, содержащую поли (А), вымы5 вают раствором 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА, порци ми по 0,2 мл с получением примерно 10 мг иРНК (3-5 фракции). Пример 2. Синтез кДНК и конструирование реком0 бинантной плазмиды.

400 мкг ДНК плазмиды pCDVI добавл ют к 300 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgCl2 и 10 мМ NaCI, и затем 500 единиц Kpnl (производство

5 Takava shuzo Co, все использованные ферменты  вл ютс  продуктом Takava shuzo Co, если нет особых указаний добавл ют. Реакцию провод т при 37°С 6 ч. После эктраги- ровани  смесью фенол: хлороформ ДНК

0 осаждают этанолом.

200 мг ДНК, гидролизованной рестрик- тазой Kpnl, добавл ют к 200 мл раствора, приготовленного добавлением 0,25 мМ дТТР к буферу (далее упоминаемого просто

5 как буфер) содержащему 40 мМ какодилата натри , 30 мМ трис-HCI (рН 6,80), 1 мМ СаСЬ и 0,1 мМ дитиотреитола (далее обозначаемого как ДТТ). Затем добавл ют 81 единицу концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы

0 (далее обозначаемой как КдТ) и реакцию ведут 11 мин при 37°С. Таким образом, к 3 концам pCDVI, расщепленной с помощью Kpnl, присоедин ют около 67 поли (дТ) цепей . Экстрагируют смесью фенола с хлоро5 формом, из раствора выдел ют в результате осаждени  этанолом примерно 100 мкг pCDV ДНК, св занной с поли (дТ) цеп ми. Полученную ДНК добавл ют к 150 мл буфера , содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), б мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI Затем добавл ют

100 единиц ECORI и в течение 2 ч при 37°С провод т реакцию. Продукт реакции подвергают НТГ дл  получени  фрагмента ДНК примерно в 3,1 кВ. который представл ет собой примерно 60 мкг pCDVI с поли (дТ) цеп ми. Полученную ДНК раствор ют в 500 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС1 (рН 8) и 1 мМ ЭДТА. Приготовленный раствор инкубируют 5 мин при 65°С, после чего при охлаждении льдом добавл ют 50 мл 5 М раствора NaCI. Полученную смесь подвергают колоночной хроматографии на олиго (дА) целлюлозе с адсорбированием на колонке ДНК, имеющей достаточное количество поли (дТ)-цепей. Вымывание провод т раство- ром, содержащим 10 мМ трис-HCI (рН 8 ) и 1 мМ ЭДТА, с получением 27 мкг pCDVI с поли (дТ) цеп ми (далее называемый векторной заправкой).

Затем описанным способом получают линкерную ДНК.

Примерно 14 мкг добавл ют к 200 мл буфера, содержащего мМ трис-HCI (рН 7,7), 6 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCI. Затем добавл ют 50 единиц Pstl и дл  отсечени  pLI ДНК в области Pstl 4 ч при 37°С ведут реакцию. Продукт реакции подвергают экстрагированию смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с получением 13 мкг рЦ ДНК. усеченной в Pstl-области. Примерно 13 мкг полученной ДНК добавл ют к 50 мл КдТ буферу, содержащему 0,25 мМ (конечна  концентраци ) дГТФ. Затем добавл ют 54 единицы КдТ и инкубируют 13 мин при 37°С с присоединением примерно 14 (дГ) цепей у С -концах pLI, усеченной с помощью Pstl. Выдел ют ДНК экстрагированием смесью фенола с хлороформом и осаждением этанолом. Полученную ДНК добавл ют к 100 мл буфера, содержащего 10 мМ трис- HCI (рН 7,5), 6мМ MgCl2 и 60 мМ NaCI. Затем добавл ют 80 единиц Hind III и инкубируют 3 ч при 37°С с целью удалени  pLI ДНК в Hind ll-области. Продукт реакции фракционируют электрофорезом на геле агарозы, после чего выдел ют фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ, использу  метод с ЕАЕ-бу- магой. Полученна  ДНК  вл етс  св зующей ДНК с олиго (дГ) цеп ми (далее называема  св зывающей ДНК).

Примерно 2 мкг поли (А) РНК и примерно 1,4 мкг векторной затравки, полученной указанным способом, раствор ют в 22,3 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 8,3), 8 мМ MgCb, 30 мМ KCI, 0,3 мМ ДТТ, 2 мМ дНТФ (дАТФ, ДТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 10 единиц рибонуклеазного ингибитора. Затем добавл ют 10 единиц репертэзы и инкубируют 40 мин при 37°С с цепью получени  ДНК, комплементарной РНК Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с выделением векторэ-затравки ДНК, св занной с двойной нитью РНК-ДНК. ДНК раствор ют в 20 мл КдТ-буфера, содержащего 66 мкМ дЦТФ и 0,2 мкг поли (А). Затем добавл ют четырнадцать единиц КдТ и в течение 8 мин при 37°С провод т инкубирование с присоединением к З -кольцам кДНК 12 (дЦ)-цепей. Продукт реакции подвергают экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с выделением кДНК-вектора- затравки ДНК. св занной с (дЦ) цеп ми. Полученную ДНК раствор ют в 400 мл раствора , содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) 6 мМ MgCl2 и 60 мМ NaCI. Добавл ют 20 единиц Hind III и инкубируют 2 ч при 37°С с отсечением ДНК в Hind-lll-области. Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с получением 0,5 пмол  кДНК-вектора-затравки ДНК, св занной с (дЦ) цеп ми. Затем 0,08 пмол  ДНК и 0,16 пмол  упом нутой св зующей ДНК добавл ют к 40 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 0,1 М NaCI и 1 мМ ЭДТА, и инкубируют при 65°С, 42°С и 0°С в течение соответственно 10, 25 и 30 мин. Реакционный раствор довод т до 400 мл (полный объем) раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5)4 мМ MgCl2, 10 мМ (, 0,1 М KCI и 0,1 мМ . К реакционному раствору добавл ют 10 единиц ДНК-лигазы Escherlchla coll и инкубируют в течение 1 сут при 11°С. Реакционный раствор довод т до раствора, содержащего 40 мкМ дНТФ и 0,15 мкМ /2-НАД. Затем добавл ют п ть единиц ДНК-лигазы Esherlchla coll, 2 единицы рибонуклеазы Н Escherlchia coll и 7 единиц ДНК-полимеразы 1 Eschtricla coll и инкубируют сначала 1 ч при/12°С и затем еще 1 ч при 25°С. Приведенной реакцией осуществл ют циклизацию рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК, причем часть двунитевой РНК-ДНК замещаетс  ДНК, в результате чего образуетс  рекомбинантна  плазмида, содержаща  полную двунитевую ДНК.

Пример 3. Escherichia coll 600JF8 трансформируют, использу  рекомбинант- ную плазмиду, полученную в примере 2. Среди примерно 10000 колоний, полученных по этой методике, 4800 колоний закрепились на нитроцеллюлозе. Отбирают восемь штаммов, накрепко гибридизирую- щихс  при 40°С с пробой, причем Д IK соответствует последовательности аминокислот от 23-ей и до 28-ой, начина  от N-конца гормона роста лосос , а именно

1 23456789 10 11 12 13 14 15 16 17

5 -AAAATGTTTAACGACTT (G)(С)CD СП

(3-е основание  вл етс  А или С, 9-е - Т или С, 12-е - С или Т, 15-е - С или Т, и комбинацией указанных оснований получают 16 видов искусственных ДНК) помечают 32Р. Методом Southern подтверждают, что 8 штаммов гибридизуютс  с упом нутой пробой , и искусственна  ДНК-проба соответствует последовательности аминокислот вокруг С-конца:

1 23456789 1011 12 13 14 15 16 17

САСAAAGTAGAGАС

(Т) (G)СП А

(G) (С)

(3-е основание  вл етс  С или Г, 6-е - А или С, 9-е - А, Т, С или С, 12-е - С или А и комбинаци  оснований дает 32 года искусственных ДНК). Плазмиды, названные соответственно pSGHI, 3, 6, 8, 9, 10, 14 и 17 имеют ДНК-последовательность, заданную последовательностью аминокислот в известном гормоне роста лосос  и, как полагают, содержат кДНК гормона роста.

Пример 4. 8 плазмид, полученных указанным способом, гидролизуют.различными эндонуклеазами, после чего определ ют карты расщеплени  частей кДНК. Плазмиды разбивают на три группы, а именно группу pSGHI. 6, 9, 10 и 17, группу pSGH3 и группу pSGHS и 14 исход  из положени  участков ограничивающей эндонуклеазы.

Полную последовательность нуклеоти- дов трансл ционной области плазмид, которые хорошо гибридизуютс  с пробой искусственной ДНК (см, пример 3) и которые , как полагают, содержат почти полную кДНК, в особенности pSGHI, определ ют по методу Sanger с использованием М13- фага. Основани  под номерами 1-66 кодируют сигнальный пептид, а 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосос .

Плазмиды pSGH8 и pSGH 14 отличаютс  друг от друга следующим образом, pSGH14 содержит более длинную кДНК почти полной длины. Последовательность основани  в pSGH14 определ ют по методу Sanger, использу  М13-фаг.

Основани  1-66 кодируют сигнальный пептид, а под номерами 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосос .

Полипептид, закодированный кДНК. полностью совпадает с полипептидом, закодированным с помощью pSGHI в 22 аминокислотах сигнального пептида, но различаетс  12 аминокислотами зрелого пептида из 188 аминокислот. Далее, если

речь идет о последовательности N-конце- вых 40 аминокислот, определенной в полипептидном гормоне роста лосос , то 5 аминокислот в ней  вно отличны. Таким образом , считают, что кДНК, содержаща с  в pSGHH, кодирует гормон роста рыб, отличный от pSGHI.

Пример 5. 5 мкг плазмиды pSGHI, кодирующей полипептидный гормон роста

о лосос , раствор ют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ Mg2Cl2 и 10 мМ NaCI (далее называемый буферным раствором У-10). Затем добавл ют 10 единиц рестриктаэы Mboll и в течение

53ч при 37°С провод т реакцию гидролиза. Затем концентрацию NaCI в растворе довод т до 175 мМ, после чего добавл ют 10 единиц Salt. Снова провод т реакцию гидролиза в течение 3 ч при 37°С. Методом НТГ

0 получают примерно 0,2 мкг фрагмента ДНК в 163 Ьр, соответствующего N-концевой области .

Затем 5 мкг pSGHI раствор ют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН

5 7,5) 10 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-100). Добавл ют дес ть единиц Bam HI, после чего в течение 3 ч при 37°С провод т реакцию гидролиза. Затем концентрацию NaCI в ре0 акционном растворе довод т до 175 мМ и добавл ют 10 единиц Sail. Снова провод т в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза, методом НТГ из реакционного раствора выдел ют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК

5 900 Ьр, содержащего С-концевую область и З -нетрансл ционную область.

Отдельно раствор ют в 40 мл буферного раствора У-100 5 мкг pCbLI и добавл ют Ват HI и Hind III no 10 единиц каждого. ПриЗО°С

0 ° течение 3 ч провод т реакцию гидролиза, .после чего из реакционного раствора выдел ют примерно 1 мкг фрагмента ДНК в 2,7 кВ, содержащего триптофановый промотор. С целью присоединени  трансл цион5 ного инициирующего кодона АТГ, необходимого дл  экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосос , и дл  св зывани  векторной ДНК и вышеупом нутой ДНК, синтезируют липидную

0 ДНК по приведенной схеме.

« и oil

/TACAAAACJ -347 per Т А Т С Т Т Т Т -ЧЧ2-ГГ ffle Glu /4/75

5

Met

Две единичные нити ДНК в 17-mer и 12-mer синтезируют обычным триэфирным методом. Затем 17-mer и 12-mer ДНК по 12 пмолей каждой раствор ют в 20 мл раствора , содержащего 50 мМтрис HCI(pH 7 5)- 10

мМ MgCIa, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Добавл ют шесть единиц Т4-полинук- леотидкиназы и при 37°С в течение 60 мин провод т реакцию фосфорилировани .

Затем 0,1 пмолк Mbo Il-Sal l-фрагмента (163 op) pSGHI, 0,06 пмол  Sal l-Bam Hl- фрагмента (примерно 900 op) pSGHI и 0,02 пмол  Hind Ill-Bam Н1-фрагмента(примерно 2,7 KB) pGELI, полученных вышеуказанными способами, раствор ют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМтрис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCJ2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Затем добавл ют 5 мл раствора дл  осуществлени  реакции фосфорилировани  искусственной ДНК, полученного вышеприведенным способом. К полученной смеси добавл ют шесть единиц Т4-ДНК-ли- газы и при 4°С в течение 18 часов провод т реакцию св зывани .

Дл  получени  Апг-колонии трансформируют E.coli HB101. Из колонии выдел ют плазмиду ДНК pSGH1B2 с помощью поли- акриламидного гел  и использованием ДЕАЕ-бумаги. Выдел ют примерно 0,05 мкг фрагмента ДН К размером 108 ьр, соответствующего N-концевой области.

Затем 5 мкг pSCH14 раствор ют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-50). Затем добавл ют PVU II и Hind III no 10 единиц каждого и в течение 3 ч при 37°С провод т реакцию гидролиза. Методом НТГ из реакционного раствора выдел ют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК размером 3,3 кВ, содержащего С-концевой участок и 3- нетрансл - участок гормона роста, образованного из pSGH14 и части вектора.

Дл  присоединени  трансл ционного инициирующего кодона АТГ, необходимого дл  экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосос  и дл  св зывани - векторной ДНК и упом нутой ДНК, синтезируют по приведенной схеме св зующую ДНК.

МвоИ

С А А А С| -3 14 ir.fr С Т Т Т Г AS/t

Htnd III

5- A С С Т Т

А Т С Т А С HZl

9 тег

Две единичные нити 14-mer и 9-mer синтезируют обычным триэфирным способом. Затем 14-mer и 9-mer ДНК по 39 пмолей каждой раствор ют в 20 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI, 10мММдС12, ЮмМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Добавл ют шесть Т4-полинуклеотидкиназы и в течение 60 мин при 37°С ведут реакцию фосфорилировани . Строение pSGH1B2 исследуют расщеплением с помощью ECoRI, Hind III,

Clal, Bge II, Sail, и Bam H и электрофорезом на геле агарозы. Последовательность ДНК, кодирующую N-конечную область полипептидного гормона роста лосос  в pSGH1B2, устанавливают методом Sanger использу  У13-фаг.

0

Hind

A JKC С Т Т Т Т С С АЧА

н 8 он

АТАСААААС ,САА Т А Т С Т Т Т ЪС Т Т

3 1е Ми /5Л 01л

подтверждают, что

Met

В результате pSGH1B2 содержит ДНК, кодирующую зрелый полипептидный гормон роста лосос . Пример 6. 1) Конструирование из

5 pSGH14 рекомбинантной плазмиды pSGH11В9, кодирующей зрелый гормон роста лосос :

5 мкг плазмиды pSGH14, кодирующей гормон роста лосос , раствор ют в 100 мл

0 раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgClj и 10 мМ NaCI. Затем добавл ют 10 единиц рестриктаэы Mbo II и при 37°С в течение 3 ч провод т реакцию гидролиза . Концентрацию NaCI в растворе дово5 д т до 50 мМ, после чего добавл ют 10 единиц PVUII. Снова провод т в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза. Из реакционного раствора электрофорезом на полиак- риламидном геле выдел ют плазмидную

0 ДНК.

Затем 0,08 пмол  Mbo II-PVU И-фраг- мент (108 bp) pSGH14 и 0,02 пмол  PVU Il-Hlnd Ill-фрагмент (примерно 3,7 кв) pSGH14, раствор ют в 30 мл раствора, со5 держащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Затем добавл ют фосфорилированную синтетическую ДНК в. количестве 5 мл. К полученной смеси добавл ют шесть единиц

0 14-ДНХ-лигазы и при 4°С в течение 18 ч ведут реакцию св зывани 

Использу - полученный реакционный раствор, трансформируют Escherichia coll НВ101, получают Amr-колонию, из которо й

5 выдел ют плазмиду ДН К pSGH11B9. Строение pSGHI 1B9 устанавливают расщеплением с помощью Hind II, Xbal, Boll) и Bam HI и электрофорезом на агарозном геле.

2) На этой стадии 5 мкг pSGH 11В9 рас0 твор ют в 40 мл буферного раствора У-50, после чего добавл ют Bam HI и Hind III no 10 единиц каждого. Затем провод т в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза. Методом HIT из реакционного раствора выдел ют

5 примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК примерно в 1200 вр, кодирующий полный полипептидный гормон роста взрослого лосос .

Отдельно раствор ют 5 мкг pCELJ в 40 мл буферного раствора Y-50,после чего добавл ют Bam HI и Hind III no Юединицкаждого. После проведени  в течение 3 часов при 37°С реакции гидролиза из реакционного раствора методом НГТ выдел ют примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК размером 2,7 Кв, содержащего триптофановый промотор.

Затем 0,01 мкг Hind Ill-Bam HI фрагмента (примерно 1200 вр). pSG Н11В9 и 0,05 мкг Hind Ill-Bam Hl-фрагмента(примерно 2,7 Кв pCELI раствор ют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитол и 1 мМ АТФ, после чего добавл ют 6 единицТ4-ДНК-ли- газы. Реакцию св зывани  провод т в течение 18ч при4°С.

Использу  полученный раствор, трансформируют штамм Escherlchla coll HB101, получают Am , колонию, из которой выдел ют плазмиду ДНК pSGH11C2. Строение pSGH 11С2 установлено расщеплением с помощью EcoRI, Hind III, Clal, Bgl II и Bam HI и электрофорезом на агарозном геле.

Пример 7. Штамм Estchtrlchia coli N 3110 (FEPM-BP-732) трансформируют с помощью рекомбинантной плазмиды pSGH11B2 или pSGH11C2. Полученную Ат- колонию инокулируют в 8 мл питательной МЦГ-среды (рН 7,2), содержащей 0,6 % Na2P04, 3 % КН2РСч 0,5 % NaCI, 0,1 % МНдС, 0,5 % глюкозы, 0,5 % казаминокислоты , 1 мМ MgSCM и 4 мкг/мл витамина Bi и в течение 18 ч продолжают при 30°С куль1- тивирование. Бульон, содержащий культуру , центрифугируют 10 мин при скорости 8000 об/мин с выделением клеток, которые суспендируют в буфере Taemmll и подвергают действию НДС в сочетании с электрофорезом на полиакриламидном геле с окрашиванием реактивом Coomasse Brilliant голубым дл  обнаружени  полипептидной полосы во фракции с молекул рным весом примерно 25000. В случае применени  штамма Е. coli, не содержащего плазмиду , указанна  полоса не наблюдаетс . Тем самым подтверждено, что Eschtrichla coll, несуща  pSGH1 В2 или pSGH 11С2, продуцирует в больших количествах полипептидный гормон роста лосос .

Формул-а изобретени 

1. Способ получени  ДНК, кодирующей гормон роста лосос , заключающийс  в том, что экстрагируют мРНК из гипофиза рыбы путем пропускани  через колонку с олиго- (аТ)-целлюлозой, синтезируют кДНК со следующей нуклеотидной последовательностью:

102030ЛО5060

ATGGGACAAGTGTTTCTGCTGATGCCAGTCTTACTGGTCOGTTGTTTCCTGAGTCAAOGG «etGlxGlnValPh«LeuLeuf1etPr-oV«1L«uLeuValSei-CyoPheLeuSerGlnBly

70ВО90100110120

GCAGCGATA3AAAACCAACGGCTCTTCAACATCGCGGTCAGTCGGG1GCAACATCTCCAC AlaAlallaGluAonGlnArgLeuPhaAsnllffAlaValSar-AroValGlnHiBLauHis

130140ISO160170180

CTATTGGCTCAGAAAAIGTTCAATGACTTTGACGGTACCDTGTTGCCTGATGAACGCAGA LauLeuAlaGlnLxin tPheAanAapFheAapGlyTK-LeuLeuP -oAapGlijAroAre

190200210220230240

CAGCTGAACAAGATATTCCTGCTGGACTTCTGTAACTCTGACTCCATCGTGAGCCCAGTC GlnLeuAsnLysl 1 aPhcLruLtuAapPheCrsAsnSerAioSer I «ValSarProVal

250260270290290300

GACAAGTACGAGACTCAGAAGAGTTCAGTCCTGAAOCTGCTCTACATTTCTTTCCOTCTO ) r-GluTbi-Glnl.)4S«rSerValL ul,. jTVrII«S«rPh Ai-0L«u

Э10320330ЗЛО350360

ATTGAATCCTGGGAGTACCCTAGCCAGACCCTGATTATCTCCAACAGCCTAATGGTCAGA IlaGluSerTrpGluTyrProSerGlnTtvLeuItelleSarAanSc -l.cuMatValAro

370380390400 410120

AACGCCAACCAGATC fCTGAGAAGC rCAGCGACCTCAAAGTGGGCATCAACCTGCTCATC AsnAl aAsnGln I U5arG1 u(yr( AsptauUysVa IG1 у I1 «AanL.uLauI1

430440450460470480

ACGGGGAGCCAGGATGGCGTACTGAGCCTGGATGACAATGACTCTCAGCAGCTGCCCCCC TbrGI rSarGlnAapGl yV« ILeuSvr-UeuAapAapAanAsoSerGl nGtnLaoProPro

« 0500310520530540

TACGGOAACTACTACCAGAACCTGGGOGGCOACGGAAACGTCAGGAGG ACTACGAOrTG TyrGlyAanTyrTyrGlnAanLeuSlyGlyAapGlyAorWalAroAr A TyrGluttu

5505605705805°0600

TTGGCATOCTTCAAGAAGG4CATGCACAAGGTCGAGACCTACCTGACCGTCCCCAAGTGC L uAlaCyiP i«LysLy A3pM.tMioLysV«ISIuT v-TyrL«uTtv-Va1Alal.yaCr

«10623630

AGGAAGTCACTCGAGGCCAACTGCACTCTGTAG A gLyaSarLauOluAl aAanCyaT v L«ufl ia

10203040SO«0

ATGGeACAACTGTTTCTGCTGATCCCACTCTTACTCGTCAGTTCTTTCCTGAGTCAAGGG MetGlyGlnValPhet.euLeuKetPcoVaLLeu.«uValSerCy Phel.cuS«rGlnGly

TO8090100110120

GCGGCGATGCAXAACCAACGGCTCTTCAACATCGTCGTCAACCGGGTGCAACACCTCCAC AlaAlaHetCluA«nClnArqLeuPheAnnIleVatValA8 r9V«lClnBUL«aHt

1)0140ISO1(0170HO

СТХТТСССТСАСААЛАТОТТСЛАССАСГГТСЛЛСССАСССТСТТСТСТСАТСМСССАНА Le4l.auMaClnl.y«HetJheAanf.jpPheCliiClyThrLeuI.euSef pCl4Ar9 tq

190200210220DO240

CActTGAACAACATATTCCTGCTGGACTTCTGTAAC-. CTCACTCCATCCTGACCCCCATC ClnkeuMi Ly llePheLeuLeuXspPheCysAsn-cierA Eb5erIlcValSccProIlc

2SO260270260290300

GACAAGCAGGAGACTCAGAAGAGITCAGTCCTCWiGCTGCTCCATATCTCTTTCCCCCTG AepLyeGlnGluThtrClnI.ysSetSerV ll.euLy LeuLeuHlaIleSetPh«Ar9L«u

310320330Э40 350360

ATTGAATCCTGGGAGTACCCTAGCCAGACCCTGACCATCTCCAACAGCCTAATGGTCACA IltCluStrTcpCluTytPreSecClnThrLeuTbcIleStrAsnSetLeuHetVaLAcq

370180390400415420

imCTCCAACCAGXTCTCTCAGAAGCTCAGCGACCTCAAAGTGGGCATCXACCTGCTCATC AinSe.cAEnGlnlleSerGluLysLeuSerAspLentjytValGlylleAanLeuLeuIle

430440450460470 BO

nAGGGGAGCCAGCAACCGGTACTGACCCTGGATGACXATGACTCTC OCATCTGCCCCCC luClySerClnGluClyValLeuScf LeuAppAapAaf apScrClnKjrLcurf oPco

490SOOS10S20S30540

lACGGGAACTACTACCACAACCTGGGGGCCCACGG -AACCTCACCf,CCA CTACCimCTG TyrGlyAinTytTytGlnA nbeuGlyGly.-.epClyAinValArgArqAanTytGluLeu

SSOS60570590590(00

TT GCCTGCTTCAACAAGGACATGCATAAGCTTCAGACCTACCTCACCCTCGCTAACTGC L«uAlaCyaPhct,yaLycAcpHttRlaLy«valCl JThcTyrLtuTh VtlAltI,yiCya

(10620630

АССААСТСАСТеСЛССССЛЛСТССЛСТСГСТАА AujbyiSatLauGluAlaAinCyaThfLeu

с использованием обратной транскрипгазы и мРНК в качестве матрицы.

2.Способ конструировани  промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК. содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , дл  получени  плаз- мид pSGH1. pSGH3, pSGHG, pSGH9, pSGHIO. pSGHH и pSGH17, заключающийс  в том, что получают векторный фрагмент путем расщеплени  pCDVI ДНК рестрикта- зой Kpnl, добавлени  олиготимидильных остатков к З -концами расщепленной плазмиды с помощью концевой дезоксинук- леотидилтрансферазы, обработки pCDVI ДНК с олиготимильными остатками с по- мощью EcoRI и выделени  ДНК-фрагмента размером 3,1 кВ электрофорезом, затем констрируют линкерную ДНК путем расщеплени  pL1 с помощью pSrl, добавлени  олигогуанильных остатков к З -концам одно- нитевой pL1 с помощью концевой дезокси- нуклеотидилтрансферазы, обработки ДНК с олигогуанильными остатками ре- стриктазой Hind III и выделени  линкерной ДНК размером 0,5 кВ электрофорезом, да- лее получают кДНК, кодирующую гормон роста лосос , конструируют плазмидную ДНК путем добавлени  олигомерных остатков к З -концам, векторной затравки, имеющей двунитевую структуру мРНК-ДНК, с помощью концевой дезоксинуклеотидилт- рансферазы, отжига ДНК векторный затравки , св занной с олигоцитидильными остатками с помощью Hind III, лигировани  ДНК затравочного вектора, расщепленного с использованием Hind III и линекрной ДНК,

с помощью ДНК-лигазы и замены РНК-части в двунитевой структуре РНК-ДНК на ДНК с помощью ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы II и отбирают целевую плаз- миду по способности гибридизироватьс  с ДНК-пробой, имеющей следующую ДНК-последовательность известного гормона роста лосос .

5 - ААА TGTTTAACGAC ТТ

(G) (С) СП

3.Способ получени  рекомбинантной плазмидной ДНК pS GH1B2, кодирующей гормон роста лосос , заключающийс  в том, что осуществл ют получение ДНК-фрагмен- та, имеющего N-концевой участок пептида путем обработки плазмиды ps GH1 рестрик- тазами Sal I, Mbo II, выделени  ДНК-фрагмента , содержащего С-концевой участок

полипептида в результате расщеплени  плазмиды pS GH1 рестриктазами Sal I и Bam HI, далее конструируют ДНК-фрагмент с триптофановым промотором путем расщеплени  плазмиды pGELI рестриктазами Hind III и Bam HI, синтезируют ДНК-линкер следующей формулы

5 - AG СТТАТ ATA GAAAAC - 3

3 - ATA CTATC ТТГТ - 5

и лигируют полученные ДНК-фрагменты и ДНК-линкеры с помощью ДНК-лигазы.

4. Способ получени  рекомбинантной плазмидной ДНК pSGHH C2, кодирующей гормон роста лосос , заключающийс  в том, что получают ДНК-фрагмент, содержащий концевой участок полипептида путем расщеплени  плазмиды pSGH14 рестриктазами Mbo II и PVU II, затем конструируют ДНК-фрагмент с С-концевым участок полипептида путем расщеплени  плазмиды PSGH14 рестриктазами PVU II и Hind III, синтезируют ДНК-линкер с последовательностью

5 - AG СТТАТ GG ААААС - 3

3 - АТА СС ГПТ - 5

далее лигируют полученные ДНК-фрагменты с ДНК-линкером с помощью ДНК-ли- гаэы, получают ДНК-фрагмент полного полипептида гормона роста лосос  путем обработки полученной рекомбинантной плазмиды с рестриктазами Hind III и Bam HI, конструируют ДНК-фрагмемт с триптофановым промоторором путем расщеплени  pGE41 рекстриктазами Hind III и Bam HI и получают целевую плазмиду св зыванием ДНК-фрагментов с помощью ДНК-лигазы.

5 Способ получени  рекомбинантного гормона роста лосос , заключающийс  в том, что культивируют штамм Escherlchia coll трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pSGH1B2 или pSGH11C2 в питательной среде при 30°С в течение 18 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Jarnuer и др. Gen. Сотр. Endocrln., 1976,30,91.

S.W. Tarmer et al. Endocrinology, 1981 108. 377.

A.F. Cook и др. Gen. Сотр. Endocrln., 1983 50. 335.

Приоритет попунктам:

29.06.84.no nn. 1 и 2; 12.10.84 по пп.З и 5;

13.03.85.по пп. 2,4 и 5.