JPS6193196A - 魚類の成長ホルモン遺伝子 - Google Patents
魚類の成長ホルモン遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産 土の利用
本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ％該組換
え体ＤＮＡを含む微生物および該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ％該組換
え体ＤＮＡを含む微生物および該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。
一旦迷五韮匝一
哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ
らによってＪ、＾ｔｎ、Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、、 ８（
１。
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗｉｓ
らによってＪ、＾ｔｎ、Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、、 ８（
１。
４４２９ （１９５８）に、＾、Ｓ、 Ｈａｒｔｒｅｅ
によってＢｉｏｃｈｅｍ。
によってＢｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ、、 １００ 、７５４（１９６６）に、Ｃ，Ｈ，Ｌ
ｉらによって＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、＾ｃｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）、ユ。
ｉらによって＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、＾ｃｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）、ユ。
３２７ （１９６２）に報告されている。
魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。
ティラビアよりの単離例 Ｓ、 １１． Ｆａｒｍａｒ
ら、Ｇｅｎ。
ら、Ｇｅｎ。
Ｃａｍｐ、Ｂｎｄｏｃｒｉｎ、、 ３０．９］ （１
９７６）。
９７６）。
チョウザメよりの単離例 Ｓ、 Ｗ、Ｆａｒｍｅｒら、
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、 １０８．３７７（１９
８１）。
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、 １０８．３７７（１９
８１）。
コイよりの単離例 Ａ、 Ｆ、Ｃｏｏｋら、Ｇｅｎ、Ｃ
ｏＩＴｌｐ。
ｏＩＴｌｐ。
Ｂｎｄｏｒｃｒｉｎ、、 ５０．３３５（１９８３）。
一方補乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子ＣＰ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇら：Ｎａｔ
ｕｒｅ ２７０４８６（１９７７）］ 、ウシおよびブ
タの成長ホルモン遺伝子〔Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇら：
ＤＮＡ４゜３７（１９８３３］ 、ヒト成長ホルモン遺
伝子（Ｊ、＾。
長ホルモン遺伝子ＣＰ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇら：Ｎａｔ
ｕｒｅ ２７０４８６（１９７７）］ 、ウシおよびブ
タの成長ホルモン遺伝子〔Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇら：
ＤＮＡ４゜３７（１９８３３］ 、ヒト成長ホルモン遺
伝子（Ｊ、＾。
Ｍａｒ類ａｌ ら： ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２０５．６０
２（１９７９） ）などがすでに知られているが、魚類
の成長ホルモン遺伝子についてはいまだに報告がない。
２（１９７９） ）などがすでに知られているが、魚類
の成長ホルモン遺伝子についてはいまだに報告がない。
本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発日が解゛しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られて（−る。従って魚類
の成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望
まれている。
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発日が解゛しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られて（−る。従って魚類
の成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望
まれている。
問題点を ′するための 段
本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ
（ｃＤＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンの
Ｎ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを
合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選
択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン
化することに成功した。さらにこのＣＤＮＡの全塩基配
列を決定し、本発明を完成するに至った。
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ
（ｃＤＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンの
Ｎ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを
合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選
択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン
化することに成功した。さらにこのＣＤＮＡの全塩基配
列を決定し、本発明を完成するに至った。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチル配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。゛ 即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を調製
し、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製
する。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿
入する。該ＤＮ／ｌよび組換え体プラスミドは、とくに
エッシエリヒア・コリのような細菌中でサケ成長ホルモ
ン遺伝子の増幅に使用することができる。繊組換え体プ
ラスミドを有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大
量に製造するために有用である。
１表に示されたペプチル配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。゛ 即ち、魚類成長ホルモンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を調製
し、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製
する。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿
入する。該ＤＮ／ｌよび組換え体プラスミドは、とくに
エッシエリヒア・コリのような細菌中でサケ成長ホルモ
ン遺伝子の増幅に使用することができる。繊組換え体プ
ラスミドを有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大
量に製造するために有用である。
従って、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａならびに繊組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する。
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａならびに繊組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する。
本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。
法で調製される。
シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポ！ＩＡ”ＲＮＡ）を分離する。
ｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリＡ）
を有するＲＮＡ （ポ！ＩＡ”ＲＮＡ）を分離する。
このポリＡ″）ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素により二
重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換
え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベク
ターＤＮＡに該合成りＮＡを挿入して得られる。シロサ
ケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有する
組換え体プラスミドを選択する。 。
重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組換
え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベク
ターＤＮＡに該合成りＮＡを挿入して得られる。シロサ
ケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有する
組換え体プラスミドを選択する。 。
次に本発明のＤＮＡおよび組換え体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。
ついて具体的に説明する。
捕獲されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｒＩＩｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｕｒＩＩｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。
次いでＣｓＣ，１溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物と
し全細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・インチオ
シアネート可溶化物にＬｉＣｊ！を加えてＲＮＡのみを
沈殿させ回収することもできる。
し全細胞質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・インチオ
シアネート可溶化物にＬｉＣｊ！を加えてＲＮＡのみを
沈殿させ回収することもできる。
抽出したＲＮＡをＮａＣｌ１またはＫ（ｌの高塩濃度（
たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ＞
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍＲ
ＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭト！ＩスーＨ
Ｃ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポＩ
Ｊ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ＞
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有するｍＲ
ＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭト！ＩスーＨ
Ｃ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポＩ
Ｊ（Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
以下、口ｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法（Ｏｋａｙａｍ
ａ ＆ Ｂｅｒｇ；Ｍｏｌ、 Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏ！、
２．１６１（１９ｇ２＞ ）に従い、ｃＤＮＡの合成
および、そのベクターへの組み込みを行う。
ａ ＆ Ｂｅｒｇ；Ｍｏｌ、 Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏ！、
２．１６１（１９ｇ２＞ ）に従い、ｃＤＮＡの合成
および、そのベクターへの組み込みを行う。
まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐｃＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
Ｃｊ！緩衝液（たとえばＰＨ７，５，１０ｍＭ）、
ＭｇＣ１ｘ＜たとえば６ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば１
０ｍＭ＞を含む溶液中でＫｐｎ Ｉで処理し、ｐｃＤＶ
ｌのＫｐｎ １部位を切断する。
たとえばｐｃＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
Ｃｊ！緩衝液（たとえばＰＨ７，５，１０ｍＭ）、
ＭｇＣ１ｘ＜たとえば６ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば１
０ｍＭ＞を含む溶液中でＫｐｎ Ｉで処理し、ｐｃＤＶ
ｌのＫｐｎ １部位を切断する。
このＤＮＡをトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ６、
８，３０＋＋＋Ｍ）、 カコジル酸ナトリウム（たと
えば１４０ｍＭ＞、ＣｏＣｊ！＊（たとえば１ｍＭ＞、
ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ＞およびｄＴ
ＴＰ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度
（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イ
ンキユベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個
前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをト
リス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ１，５，１０ｍ Ｍ
） 、Ｍ ｇ Ｃ１ａ（たとえば６ｍＭ）、Ｎａ（Ｊ
（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切
断後、低融点アガロースゲル電気泳動（Ｌａｒｓ Ｗｉ
ｅｓｌａｎｄｅｒ ：＾ｎａｌｙ類ｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、 ９８．３０５（１９７９） ）にて
分画し、約３．１キロベースの断片を回収する。次いで
該ＤＮＡをＮａＣＲまたはＫＣｊ！の高塩濃度（たとえ
ば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、ポＩＪ（ｄＡ）セルロ
ースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープラ
イマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）
リス−Ｈ（Ｊ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出
し、ポ！Ｉ （Ｔ）の付加したベクタープライマー分子
のみを単離する。
８，３０＋＋＋Ｍ）、 カコジル酸ナトリウム（たと
えば１４０ｍＭ＞、ＣｏＣｊ！＊（たとえば１ｍＭ＞、
ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ＞およびｄＴ
ＴＰ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定温度
（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間）イ
ンキユベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６０個
前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡをト
リス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ１，５，１０ｍ Ｍ
） 、Ｍ ｇ Ｃ１ａ（たとえば６ｍＭ）、Ｎａ（Ｊ
（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで切
断後、低融点アガロースゲル電気泳動（Ｌａｒｓ Ｗｉ
ｅｓｌａｎｄｅｒ ：＾ｎａｌｙ類ｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、 ９８．３０５（１９７９） ）にて
分画し、約３．１キロベースの断片を回収する。次いで
該ＤＮＡをＮａＣＲまたはＫＣｊ！の高塩濃度（たとえ
ば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、ポＩＪ（ｄＡ）セルロ
ースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープラ
イマー分子のみをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）
リス−Ｈ（Ｊ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出
し、ポ！Ｉ （Ｔ）の付加したベクタープライマー分子
のみを単離する。
次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ（１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ ＞ 、 Ｍ ｇ Ｃ１！（た
とえば６ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば５０ｍＭ＞を含む
溶液中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌのＰｓｔＩ部位を切
断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを
加える以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎮を付加する。該ＤＮＡ
を適当な溶液たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣ１２Ｃたとえば５ｍＭ
）。
を適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ（１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１０ｍＭ ＞ 、 Ｍ ｇ Ｃ１！（た
とえば６ｍＭ）、ＮａＣ１（たとえば５０ｍＭ＞を含む
溶液中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌのＰｓｔＩ部位を切
断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰを
加える以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎮を付加する。該ＤＮＡ
を適当な溶液たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえば
ｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣ１２Ｃたとえば５ｍＭ
）。
ＮａＣ１（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中）１ｉｎｄ
ｌＩ［にて切断する。アガロースゲル電気泳動ニて約０
．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパ
ーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得る
。
ｌＩ［にて切断する。アガロースゲル電気泳動ニて約０
．５キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパ
ーにて回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得る
。
以上のようにして辱たポリ （＾）′″ＲＮＡ、ＲＮＡ
、ベクタープライマーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ（＾）”ＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０ｍ
Ｍ）、ＭｇＣ１５（たとえば８ｍＭ）、ＫＣｊ！ （た
とえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（たとえば０．
３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。
、ベクタープライマーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行
う。ポリ（＾）”ＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０ｍ
Ｍ）、ＭｇＣ１５（たとえば８ｍＭ）、ＫＣｊ！ （た
とえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（たとえば０．
３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ （たとえば各々２ｍＭ
＞を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−Ｄ、ＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴ
ＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ
Ｉを付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５個
前後付加する。
＞を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−Ｄ、ＮＡ二重鎮の３′末端に、ｄＴＴ
ＰがｄＣＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ
Ｉを付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５個
前後付加する。
このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐ Ｈ７
，５、１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１ａ （たとえ
ば６ｍ＆Ｉ）。
，５、１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１ａ （たとえ
ば６ｍ＆Ｉ）。
ＮａＣ１（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄｌ
ｌ［で切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−
ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ
７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣ１゜（たとえば４ｍＭ）
、（ＮＨｔｌａＳＣＬ （たとえば１０ｍＭ）、ＫＣｊ
！ （たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たとえば０．１ｍＭ
）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに一定時
間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃）
でインキ二ベー卜する。こうしてｃＤＮＡとリンカ−Ｄ
ＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ。
ｌ［で切断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカ−
ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ
７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣ１゜（たとえば４ｍＭ）
、（ＮＨｔｌａＳＣＬ （たとえば１０ｍＭ）、ＫＣｊ
！ （たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たとえば０．１ｍＭ
）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼとともに一定時
間（たとえば１６時間）、一定温度（たとえば１２℃）
でインキ二ベー卜する。こうしてｃＤＮＡとリンカ−Ｄ
ＮＡとの環状化が行われる。この反応液にｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ。
ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰを各々、１１ｋ濃度４０μＭとなる
よう加え、大腸菌ＤＮＡ！ｌガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼ■、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ
部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二重鎖ｃＤ
ＮＡを含む組換えプラスミドを得る。
よう加え、大腸菌ＤＮＡ！ｌガーゼ、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼ■、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え、ＲＮＡ
部分をＤＮＡに変換することにより、完全な二重鎖ｃＤ
ＮＡを含む組換えプラスミドを得る。
こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大腸菌ｃ６００ｓＦ８株を、たとえばＳｃｏ ｔ ｔら
の方法〔重定勝哉：細胞工学 上。
大腸菌ｃ６００ｓＦ８株を、たとえばＳｃｏ ｔ ｔら
の方法〔重定勝哉：細胞工学 上。
６１６（１９８３） ］により形質転換する。上記で１
尋た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子
が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐
性を示す。以下の手法はこれらアンビンリン耐性（Ａｐ
’）菌株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示
す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有す
る菌株を選択するのに一般的に用いられる。すなわち、
上記で辱られた形質転換株をニトロセルロースフィルタ
ー上に固定し、既知のシロヂケ成長ホルモンのアミノ酸
配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプロ
ーブと会合させ、強く会合するものを選択する（Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
尋た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子
が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐
性を示す。以下の手法はこれらアンビンリン耐性（Ａｐ
’）菌株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示
す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有す
る菌株を選択するのに一般的に用いられる。すなわち、
上記で辱られた形質転換株をニトロセルロースフィルタ
ー上に固定し、既知のシロヂケ成長ホルモンのアミノ酸
配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成りＮＡプロ
ーブと会合させ、強く会合するものを選択する（Ｇｒｕ
ｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 ロＳＡ、、 ７２．
３９６Ｈ１９７５）） 、プローブＤＮＡは通常のトリ
エステル法（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、。
３９６Ｈ１９７５）） 、プローブＤＮＡは通常のトリ
エステル法（Ｊ、Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、。
町、７３２７（１９７５） ：ｌで合成される。合成り
ＮＡプローブによる選択は５ｏｕｔｈｅｒｎらの方法（
Ｊ、 Ｍｏｌ。
ＮＡプローブによる選択は５ｏｕｔｈｅｒｎらの方法（
Ｊ、 Ｍｏｌ。
口ｉｏｎ、 ９８．５０３ （１９７５））によってさ
らに確実にでき、この方法でシロザケ成長ホルモンｍＲ
ＮＡに相補性を示す遺伝子を存する組換え体プラスミド
ＤＮＡを同定できる。
らに確実にでき、この方法でシロザケ成長ホルモンｍＲ
ＮＡに相補性を示す遺伝子を存する組換え体プラスミド
ＤＮＡを同定できる。
本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のような微生
物、あるいは真核細胞による魚類成長ホルモンポリペプ
チドの大量生産に用いられる。
物、あるいは真核細胞による魚類成長ホルモンポリペプ
チドの大量生産に用いられる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１． シロザケ脳下垂体よりのポ！ＩＡ”ＲＮＡ
の調製： シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオンアネート−セ
ンラムクロライド法ＣＭａｎｉａ類ｓ ら４ｉｉ１Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ１９６． Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ刊；重定勝哉、細胞
工学、 ２ 、６１６＜１９８３） ）に従いポリ八を
有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
の調製： シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオンアネート−セ
ンラムクロライド法ＣＭａｎｉａ類ｓ ら４ｉｉ１Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐ１９６． Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ刊；重定勝哉、細胞
工学、 ２ 、６１６＜１９８３） ）に従いポリ八を
有するＲＮＡを下記のごとく調製した。
ンロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネー）、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０． Ｉ Ｍβ
−メルカプトエタノールからなる溶液１３ｍｌ中でテフ
ロンホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した
。このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡ
を分断した。５．７ ＭＣ５ＣＲ，０，ＩＭ ＥＤＴ
Ａ （ｐＨ８）の溶液各１．２ｍｌを超遠心管中に分注
してふき、前記ホモジネートを重層した。Ｈｉｔａｃｈ
ｉ ＲＰ Ｓ ４００−ターにて３５，０００ｒｐｌＴ
ｌ、 １５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。
アニジウムチオシアネー）、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０． Ｉ Ｍβ
−メルカプトエタノールからなる溶液１３ｍｌ中でテフ
ロンホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した
。このホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡ
を分断した。５．７ ＭＣ５ＣＲ，０，ＩＭ ＥＤＴ
Ａ （ｐＨ８）の溶液各１．２ｍｌを超遠心管中に分注
してふき、前記ホモジネートを重層した。Ｈｉｔａｃｈ
ｉ ＲＰ Ｓ ４００−ターにて３５，０００ｒｐｌＴ
ｌ、 １５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。
ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス−ＨＣ
ｊ！（ｐＨ８，０）溶液１０ｍ１に溶解し、フェノール
−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収し
た。得られたＲＮＡ約１■を１０ｍＭ）すＸ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
１＋ｎｌに溶かした。
ｊ！（ｐＨ８，０）溶液１０ｍ１に溶解し、フェノール
−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収し
た。得られたＲＮＡ約１■を１０ｍＭ）すＸ−Ｈ（Ｊ
（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
１＋ｎｌに溶かした。
６５℃、５分間インキュベートし、０．１＋＋＋ｌの５
ＭＮａＣ１を加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・
カラム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
りｌｊ？トゲラフイーにかけた。吸着したポリ八を有す
るｍＲＮＡをｌＱｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０お
よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポリＡを
有するｍＲＮＡ約１０μｇ＋４だ。
ＭＮａＣ１を加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・
カラム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
りｌｊ？トゲラフイーにかけた。吸着したポリ八を有す
るｍＲＮＡをｌＱｍＭ）リス−ＨＣｊ！（ｐＨ８，０お
よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポリＡを
有するｍＲＮＡ約１０μｇ＋４だ。
実施例２． ｃＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの
挿入： Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法（：Ｍｏｌ、Ｃｅ１１
．Ｂｉｏｌ、、 ２．１６１（１９ｇ２） ）に従い、
ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミド
の造成を行った。その工程の概略を第１図に示す。
挿入： Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法（：Ｍｏｌ、Ｃｅ１１
．Ｂｉｏｌ、、 ２．１６１（１９ｇ２） ）に従い、
ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組換え体プラスミド
の造成を行った。その工程の概略を第１図に示す。
ｐｃＤＶ ｌ （Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ ：
Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｌ、、 ３．２８０＜１９８３） ３４００Ｍｇ
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ
Ｍｇ（Ｊ２および１０ｍＭ ＮａＣ１からなる溶
液３００ｐｌに加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝
酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のＫｐｎ １部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。Ｋｐｎ Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム、３ＱｍＭト リｘ−ＨＣＩ
＜ｐＨ６，８ン 、 １ｍＭ ＣａＣ１ｍおよ
び０．１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記す
る）からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する〉に
ｄＴＴＰを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μ
！に加え、さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記するン
（Ｐ −Ｌ Ｂｒｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加
えて、３７℃１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶｌ
のＫｐｎ Ｉ切断部位の３′末端にポ１ＪｄＴ鎖が約６
７個付加された。該溶液からフェノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈殿により、ポリ６丁鎖の付加したｐ
ＣＤＶＩＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ２２゜１００ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝
液１５０μｊ！に加え、さらに３６０単位のＥＣ０ＲＩ
（宝酒造社製）を加え、３７℃２時間反応させた。該
反応物を低融点アガロースゲル電気泳動後、約３． Ｉ
ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０μｇのポ’ＪｄＴ
鎮付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭ）すｙ、
−Ｈ（１（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡから
なる溶液５００μｌに溶解し、６５℃５分間インキニベ
ート後、氷冷して５０μｌの５Ｍ Ｎａｃｌを加えた
。混合物をオリゴｄＡセルロースカラム（コラボラティ
ブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリｄ
Ｔ鎮長が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭ
）リス−Ｈ（１（ｐＨ８，０）および１ｍＭＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポＩＪ ｄ Ｔ 鎮の付加したｐ
ＣＤＶ １（以下ベクターブライマーと略記する）２７
μｇを（尋た。
を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ
Ｍｇ（Ｊ２および１０ｍＭ ＮａＣ１からなる溶
液３００ｐｌに加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝
酒造社製）を加えて、３７℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のＫｐｎ １部位で切断した。フェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。Ｋｐｎ Ｉ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを４０ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム、３ＱｍＭト リｘ−ＨＣＩ
＜ｐＨ６，８ン 、 １ｍＭ ＣａＣ１ｍおよ
び０．１ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記す
る）からなる緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する〉に
ｄＴＴＰを０．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μ
！に加え、さらに８１単位のターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記するン
（Ｐ −Ｌ Ｂｒｏｃｈｅ−ｍｉｃａｌｓ社製）を加
えて、３７℃１１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶｌ
のＫｐｎ Ｉ切断部位の３′末端にポ１ＪｄＴ鎖が約６
７個付加された。該溶液からフェノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈殿により、ポリ６丁鎖の付加したｐ
ＣＤＶＩＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ２２゜１００ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝
液１５０μｊ！に加え、さらに３６０単位のＥＣ０ＲＩ
（宝酒造社製）を加え、３７℃２時間反応させた。該
反応物を低融点アガロースゲル電気泳動後、約３． Ｉ
ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、約６０μｇのポ’ＪｄＴ
鎮付加ｐＣＤＶ１を得た。該ＤＮＡを１０ｍＭ）すｙ、
−Ｈ（１（ｐＨ８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡから
なる溶液５００μｌに溶解し、６５℃５分間インキニベ
ート後、氷冷して５０μｌの５Ｍ Ｎａｃｌを加えた
。混合物をオリゴｄＡセルロースカラム（コラボラティ
ブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリｄ
Ｔ鎮長が充分なものはカラムに吸着し、これを１０ｍＭ
）リス−Ｈ（１（ｐＨ８，０）および１ｍＭＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポＩＪ ｄ Ｔ 鎮の付加したｐ
ＣＤＶ １（以下ベクターブライマーと略記する）２７
μｇを（尋た。
次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。
ｐ Ｌ １ （Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ ：
Ｍａｔ、 Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、。
Ｍａｔ、 Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、。
３、 ２８０（１９８３））約１４μｇを１０ｍＭ）リ
ス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５＞、６ｍＭ ＭｇＣｊ！
、および５０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝液２００
．ｕｆに加え、さらに５０単位のｐｓｔＩ（宝酒造社製
）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰ
ｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、ＰｓｔＩで切
断したｐＬＩＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ約
１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴ
Ｐを含む溶液５０ｕｊ！に加え、さらにＴ ｄ Ｔ （
Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）５４単位を加
えて３７℃１３分間インキコペートし、ｐＬｌのＰｓｔ
Ｉ切断部位３′末端にｄＧ鎮を約１４個付加した。フェ
ノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを１００μｊ！のｌＱｍＭ）す７
．−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｊ！、お
よび５（１ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１００μｌに
加え、さらに８０中位のＨｉｎｄｌｌｌ（宝酒造社製）
を加えて３７℃３時ｌ」インキユベートし、ｐＬＩＤＮ
ＡのＨｉｎｄ［１部位で切断した。該反応物をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂのＤＮＡ
断片をＤＥＡＥベーパー法ＣＤｒｅｔｚｅｎ ら、＾ｎ
ａｌ。
ス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５＞、６ｍＭ ＭｇＣｊ！
、および５０ｍＭ ＮａＣｊ！からなる緩衝液２００
．ｕｆに加え、さらに５０単位のｐｓｔＩ（宝酒造社製
）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐＬＩＤＮＡ中のＰ
ｓｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、ＰｓｔＩで切
断したｐＬＩＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ約
１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧＴ
Ｐを含む溶液５０ｕｊ！に加え、さらにＴ ｄ Ｔ （
Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）５４単位を加
えて３７℃１３分間インキコペートし、ｐＬｌのＰｓｔ
Ｉ切断部位３′末端にｄＧ鎮を約１４個付加した。フェ
ノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収した。該ＤＮＡを１００μｊ！のｌＱｍＭ）す７
．−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣｊ！、お
よび５（１ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１００μｌに
加え、さらに８０中位のＨｉｎｄｌｌｌ（宝酒造社製）
を加えて３７℃３時ｌ」インキユベートし、ｐＬＩＤＮ
ＡのＨｉｎｄ［１部位で切断した。該反応物をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂのＤＮＡ
断片をＤＥＡＥベーパー法ＣＤｒｅｔｚｅｎ ら、＾ｎ
ａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、 １１２，２９５（１９８１）
）にて回収し、オリゴｄＧｔＪ付きのリンカ−ＤＮＡ
（以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を辱だ。
）にて回収し、オリゴｄＧｔＪ付きのリンカ−ＤＮＡ
（以下単にリンカ−ＤＮＡと略記する）を辱だ。
上記で調製したボＩＪ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクター
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣＪ （
ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｊ！２．３０ｍＭ
Ｋ（１，０，３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （ｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１
０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２．３
μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業社製
）を加え、３７℃４０分間インキュベートし、ｍＲＮＡ
に相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、ＲＮＡ
−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡを
回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０．２μ
ｇポリ八を含むＴｄＴ緩衝液２０μｌに溶かし、１４単
位のＴｄＴ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）を加えて３７℃８分間インキュベートし、ｃＤＮＡ
３′末端に１２個のｄＣ鎖を付加した。該反応物をフェ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿によりｄ
ｃＪＪｌの付加したｃＤＮＡ−ベクターブライマーＤＮ
Ａを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＮＣＲ（ｐＨ７，５
）、６ｍＭ ＭｇＣｊ！、ｂよび６０ｍＭ ＮａＣ
ｊ！からなる液４００μｌに溶カシ、２０単位（ＤＨｉ
ｎｄＩＩ［（宝酒造社＊）を加え、３７℃２時間インキ
コベートし、Ｈｊｎｄｌ１１部位で切断した。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して
０．５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎮付加ｃＤＮＡ−ベクタープ
ライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．０８ ｐｍｏｌｅ
および前記のリンカ−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌｅを４
０μｌのトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、０．ＩＭ
ＮａＣｊ！右よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
４０μβに加え、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０
分、２５分。
プライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣＪ （
ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｊ！２．３０ｍＭ
Ｋ（１，０，３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ （ｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）および１
０単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２．３
μｌに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業社製
）を加え、３７℃４０分間インキュベートし、ｍＲＮＡ
に相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、ＲＮＡ
−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮＡを
回収した。該ＤＮＡを６６μＭｄＣＴＰおよび０．２μ
ｇポリ八を含むＴｄＴ緩衝液２０μｌに溶かし、１４単
位のＴｄＴ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社
製）を加えて３７℃８分間インキュベートし、ｃＤＮＡ
３′末端に１２個のｄＣ鎖を付加した。該反応物をフェ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿によりｄ
ｃＪＪｌの付加したｃＤＮＡ−ベクターブライマーＤＮ
Ａを回収した。該ＤＮＡをトリス−ＮＣＲ（ｐＨ７，５
）、６ｍＭ ＭｇＣｊ！、ｂよび６０ｍＭ ＮａＣ
ｊ！からなる液４００μｌに溶カシ、２０単位（ＤＨｉ
ｎｄＩＩ［（宝酒造社＊）を加え、３７℃２時間インキ
コベートし、Ｈｊｎｄｌ１１部位で切断した。該反応物
をフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して
０．５ ｐｍｏｌｅのｄＣ鎮付加ｃＤＮＡ−ベクタープ
ライマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．０８ ｐｍｏｌｅ
および前記のリンカ−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌｅを４
０μｌのトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、０．ＩＭ
ＮａＣｊ！右よび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液
４０μβに加え、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０
分、２５分。
３０分間インキュベートした。２０ｍＭトリス−ＨＣｆ
（ｐＨ７，５）、４ｍＭ Ｍｇ Ｃｆ、、 １０ｍ
Ｍ （Ｎｌ（＋）、ＳＯ，。
（ｐＨ７，５）、４ｍＭ Ｍｇ Ｃｆ、、 １０ｍ
Ｍ （Ｎｌ（＋）、ＳＯ，。
０．１Ｍ Ｋ（Ｊおよび０．１ ｍ Ｍｇ−ＮＡＤの
組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調製した。
組成で、全量４００μｌとなるよう反応液を調製した。
該反応液にｌＯ単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ１ａｂｓ社！ＩＩ）を加え、
１１℃−夜インキユベートした。該反応液を各４０μＭ
のｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を
追加Ｊ類し、５単位の大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、
７単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リ
ボヌクＬ／７−ゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ社製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつイン
キュベートした。
Ｅｎｇｌａｎｄ ８ｉｏ１ａｂｓ社！ＩＩ）を加え、
１１℃−夜インキユベートした。該反応液を各４０μＭ
のｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を
追加Ｊ類し、５単位の大腸菌Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ、
７単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リ
ボヌクＬ／７−ゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ社製）を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつイン
キュベートした。
上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡＲ分がＤＮＡに、置換さ
れ、完全な二重１１ｆｉＤＮＡの組換えプラスミドが生
成した。
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡＲ分がＤＮＡに、置換さ
れ、完全な二重１１ｆｉＤＮＡの組換えプラスミドが生
成した。
実施例３． ンロザケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌ｃ６
００ｓＦ８株（Ｃａｍｅｒｏｎ：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
えＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌ｃ６
００ｓＦ８株（Ｃａｍｅｒｏｎ：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
口ＳＡ、ユ、３４１６（１９７５）、 ）を５ｃｏｔｔ
らの方法〔重定勝哉：細胞工学、互６１６（１９８３
）〕に従い形質転換した。得られた約１万個のコロニー
のうち４８００個をニトロセルロース上に固定した。シ
ロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２８番目の
アミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、すなわち（３番目
の塩基はＡまたは０．９番目はＴまたは０．１２番目は
ＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴであり、組み合わせ
て１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３２ｐで標
識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株を選んだ
（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
らの方法〔重定勝哉：細胞工学、互６１６（１９８３
）〕に従い形質転換した。得られた約１万個のコロニー
のうち４８００個をニトロセルロース上に固定した。シ
ロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２８番目の
アミノ酸配列に対応する合成りＮＡ、すなわち（３番目
の塩基はＡまたは０．９番目はＴまたは０．１２番目は
ＣまたはＴ、１５番目はＣまたはＴであり、組み合わせ
て１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３２ｐで標
識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株を選んだ
（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
７２．３９６Ｈ１９？５） ）。得られた８菌株につい
て５ｏｕｔｈｅｒｎの方法（ＪｌＭｏｌ、６ｉａｌ、、
９８．５０３（１９７５） ］により、上記プローブお
よびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡプ
ローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
Ａであり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐＳＧ）１１，３，６，８゜９ 、１０．１４．１７と
命名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長
ホルモンｃＤＮ＾を含んでいるものと考えられた。
て５ｏｕｔｈｅｒｎの方法（ＪｌＭｏｌ、６ｉａｌ、、
９８．５０３（１９７５） ］により、上記プローブお
よびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応する合成りＮＡプ
ローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
Ａであり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐＳＧ）１１，３，６，８゜９ 、１０．１４．１７と
命名したが、いずれも、シロザケ成長ホルモンのアミノ
酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長
ホルモンｃＤＮ＾を含んでいるものと考えられた。
実施例４．該プラスミドｐｓＧＨ１の塩基配列二上記で
得られたプラスミド８！！につき、種々の制限酵素で消
化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。制限酵素部
位の存在位置から、得られたプラスミドは３群に分類で
き、ｐｓＧＨｌ、 ６．９．１０゜１７の群、ｐＳＧＨ
３の群、ｐＳＧＨ８、１４の群と分けられた。それぞれ
の群の制限酵素地図を第２図に示す。
得られたプラスミド８！！につき、種々の制限酵素で消
化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を決定した。制限酵素部
位の存在位置から、得られたプラスミドは３群に分類で
き、ｐｓＧＨｌ、 ６．９．１０゜１７の群、ｐＳＧＨ
３の群、ｐＳＧＨ８、１４の群と分けられた。それぞれ
の群の制限酵素地図を第２図に示す。
次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐＳＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧ）Ｉ
ｌについて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１
３７ｙ−ジを用いたＳａｎｇｅｒ法（Ｓａｒｒｇｅｒら
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ、 ？４，５４６３（１９７７）：＾ｍｅｒｓｈａ
ｍ社 Ｍ ｌ ３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ〕に従って決定した。配
列を第１表に示す。第１表中、塩基数１−６６がシグナ
ルペプチドを、６７−６３０がシロヂケ成長ホルモンの
成熟ペプチドをコードする。）ＳＧＨ１に含まれるｃＤ
ＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、シロザケ成長
ホルモンペプチドから決定されているＮ末端付近および
Ｃ末端付近のアミノ酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮ＾
はシロザケ成長ホルモンをコードしていることが確認さ
れた。ｐｓＧＨｌ 、 ｐＳＧＨ３。
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐＳＧＨ１を含む群のプラスミド、特にｐＳＧ）Ｉ
ｌについて、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１
３７ｙ−ジを用いたＳａｎｇｅｒ法（Ｓａｒｒｇｅｒら
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ、 ？４，５４６３（１９７７）：＾ｍｅｒｓｈａ
ｍ社 Ｍ ｌ ３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ〕に従って決定した。配
列を第１表に示す。第１表中、塩基数１−６６がシグナ
ルペプチドを、６７−６３０がシロヂケ成長ホルモンの
成熟ペプチドをコードする。）ＳＧＨ１に含まれるｃＤ
ＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列は、シロザケ成長
ホルモンペプチドから決定されているＮ末端付近および
Ｃ末端付近のアミノ酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮ＾
はシロザケ成長ホルモンをコードしていることが確認さ
れた。ｐｓＧＨｌ 、 ｐＳＧＨ３。
ｐＳＧＨ８を含む大腸ｌ１Ｉ（それぞれＥＳＧＨ１、Ｅ
ＳＧＨ３゜ＥＳＧＨ８）は昭和５９年６月２３日付で、
ＦＢＩＩＭ ＢＰ−５５１゜５５２および５５３として
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
ＳＧＨ３゜ＥＳＧＨ８）は昭和５９年６月２３日付で、
ＦＢＩＩＭ ＢＰ−５５１゜５５２および５５３として
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
−Ｇｅｎｅ類ｃ Ｃｏｄｅ ＣＵｎｉｕｅｒｓａｌコ
第 １ 書ニチドをコードするＤＮＡを組み
込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換繊組ＤＮＡを含む微生物
が得られ、これらは魚類の成長ホルモンポリペプチドの
大量生産に利用することができる。
第 １ 書ニチドをコードするＤＮＡを組み
込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換繊組ＤＮＡを含む微生物
が得られ、これらは魚類の成長ホルモンポリペプチドの
大量生産に利用することができる。
第１図は０ｋａｙａ酊−Ｂｅｒｇ法によるｃＯＮ八合へ
と、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の概
略を示す。 第２図はｐＳＧＨ１、ｐＳＧ）ｌ ３ 、 ｐＳＧＨ８
に含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第１ ４ＥｃｏＲＩシｋｔ ＋ＨｉｎｄＮ３１’ｌＥ８
゛７ター１”ｙＱ−ＤＮＡ −７ｍＲＮＡＡＭ
Ａ、−−−−−−−−−−−−−−手続補正書（方式） 昭和６０年２月２２日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２１３３６０号 ２、発明の名称 魚類の成長ホルモン遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称（１０
２）協和醗酵工業株式会社 昭和６０年１月９日（発送日：同６０年１月２９日）５
、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 別紙のとおり 明 細 書 １、発明の名称 魚類の成長ホルモン遺伝子 ２、特許請求の範囲 （１ン 第１表に示したペプチド配列を有する魚類の
成長ホルモンポリペプチド。 （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 （３）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ。 （４）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第３項のＤＮＡ
。 （５ン 魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 （６） 魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に
示したペプチド配列を有する特許請求の範囲第５項の組
換え体ＤＮＡ０ （７） プラＸミ）’ｐｓＧＨ１，ｐｓｃ、Ｈ３また
は１ＧＨ８と名づけだ特許請求の範囲第５項の組換え体
ＤＮＡ０ 〔８〕魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物。 （９）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第３図に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第８項の微生物
。 αｑ 該微生物がエフンエリヒア・コリに属する特許請
求の範囲第８項の微生物。 （１１）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養
培地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペ
プチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを採
取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法。 ３、発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
繊組ＤＮＡを含む微生物環よび該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、ニー・ジェイ・レビイス
（Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗ ｉｓ）らによってジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、＾ｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、 ８０．４４２９（１９５
Ｂ）に、エイ・ニス・バートリー（＾、 Ｓ、 １ａｒ
ｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、 ）。 且、 ７５４ （１９６６）に、シー・エイチ・リー（
Ｃ，Ｈ，Ｌｉ）らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストシイ・アンド・バイオフィジクス・アクタ（サブ
ルメント） （Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、＾ｅｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）） 。 ユ、 ３２７ （１９６２） に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。 ティラビアよりの単離例 ニス・ダブリュ・ファーマー
（Ｓ、Ｗ、 Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジェネ５）Ｌｐ−７ン
ド・コンパラティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ。 Ｃａｍｐ、 Ｂｎｄｏｃｒｉｎ、）、 ３０．９Ｈ１９
７６）。 チョウザメよりの単離例 ニス・ダブリニ・ファ−マー
（Ｓ、 １１． Ｆａｒｍｅｒ）ら、エンドクリア
０シイ（Ｅｄｏｃｒ＋ｎｏｌｏｇＶ＞、 １０８．３７
７（１９８１）。 コイよりの単離例 エイ・エフ・クック（＾、Ｆ。 Ｃｏｏｋ ）ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ
・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、 ＣａｒｒＩｐ、ε
ｎｄｏｒｃｒｉｎ、 ）。 ５０、３３５（１９８３）。 一方嘘乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ
９Ｓｅｅｂｕｒｇ）ら：ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）
２７０４８６（１９７７）） 、ウシおよびブタの成長
ホルモン遺伝子〔ビ「・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ，
Ｓｅｅ−ｂｕｒｇ ）らニブイー・エヌ・エイ （ＤＮ
Ａ）、 ２． ３７（１９８３）） 、ヒト成長ホルモ
ン遺伝子〔ジェイ・エイ・マーシャル（Ｊ、＾、 Ｍａ
ｒ類ａｌ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、 ２
０５．６０２（１９７９） ）などがすでに知られてい
るが、魚類の成長ホルモン遺伝子についてはいまだに報
告がない。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ
（ｃＤＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンの
Ｎ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを
合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選
択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン
化することに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配
列を決定し、本発明を完成するに至った。 以下本発明の詳細な説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。 即ち、魚頌成長ホル丁ンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。該ＤＮＡおよび組換え体プラスミドは、とくに工
γシエリヒア・コリのような細菌中でサケ成長ホルモン
遺伝子の増幅に使用することができる。繊組換え体プラ
スミドを有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大量
に製造するために有用である。 従って、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤＮＡ５ＵＸＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡならびに繊組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する
。 本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。 シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセ／ｌ／ Ｃ１−ス（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（
ポリＡ）を有するＲＮＡ （ポリＡ″ＲＮＡ）を分離す
る。 このポＩＪＡ″ＲＮＡ を鋳型とし、逆転写酵素により
二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組
換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベ
クターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シロ
サケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有す
る組換え体プラスミドを選択する。 次に本発明のＤＮＡおよびａｍえ体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。 擁護されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート軸ｕａｎ＋ｄｉｕｍｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。次いで
ＣｓＣ１溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全細胞
質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・イソチオシアネー
ト可溶化物にＬｉＣＪ！を加えてＲＮＡのみを沈殿させ
回収することもできる。 抽出したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫＣｌの高塩濃度（
たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ＞を有するｍＲ
ＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）！ＪスーＨ
Ｃ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ！
Ｉ （Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。 以下、オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆ Ｂｅｒｇ）；モレキンマー・アンド・セルラー・
バイオロジィ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、８ｉｏ１． ） ２
，１６１（１９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成および
、そのベクターへの組み込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐＣＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（たとえばｐ）１７，５．１０ｍＭ）、
Ｍ ｇ ＣＡａ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｌ２（たと
えば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫｐｎ ｌで処理し、ｐ
ＣＤＶ １のＫｐｎ １部位を切断する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ６，
８，３０ｍ１Ｊ）、 カコジル酸ナトリウム（たとえ
ば１４０ ｍＭ） 、 ＣｏＣｊ！ｚ（たとえば１ｍＭ
）、ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）＄よび
ｄＴＴＰ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定
温度（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間
）インキュベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６
０個前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡ
をトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍ
Ｍ ） 、Ｍ ｇ Ｃ１２（たとえば６ｍＭ）、Ｎａ
Ｃ１（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで
切断後、低融点アガロースゲル電気泳動〔ラルス・ライ
スラング−（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ ） ：
アナリティカルー ハイオケミストリイ（＾ｎａｌｙ
類ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）、 ９８゜
３０５ （１９７９） ）にて分画し、約３．１キロベ
ースの断片を回収する。次いで該ＤＮＡをＮａＣ１また
はＫＣＩの高塩濃度（たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶
解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに通塔してポＩＪ
（Ｔ）を有するベクタープライマー分子のみをカラムに
吸着させる。水、ｌＱｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液のよう
な低塩濃度溶液を用いて溶出し、ボ’Ｊ （Ｔ）の付加
したベクタープライマー分子のみを単離する。 次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１（）＋Ｍ） 、 Ｍｇ（１！２（たと
えば６ｍＭ）、ＮａＣｊ！ （たとえば５０ｍＭ）を含
む溶液中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌのＰｓｔ１部位を
切断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰ
を加える以外はベクタープライマー合成の場合と同様に
処理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮ
Ａを適当な溶液たとえばトリス−Ｈｃｉｔｘ衝液（たと
えばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＬ（たとえば６ｍ
Ｍ）。 ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄ［
［にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約０．５
キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパーに
て回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得る。 以上のようにして得たポリ （＾νＲＮＡ、ベクタープ
ライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行う
。ポリ （＾）”ＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０ｍ
Ｍ＞、ＭｇＣ！！２ （たとえば８ｒｒ＋Ｍ） 、 Ｋ
Ｃｊ！ （たとえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（
たとえば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。 ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ （たとえば各々２ｍＭ
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄｃＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ鎖
を付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎮を１５個前
後付加する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐ Ｈ７
，５，１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１！ （たとえ
ば６ ｍＭ） 。 ＮａＣｊ！ （たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄｌｌｌで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリン
カ−ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｆ１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣＲ。 （たとえば４ｍＭ）、（ＮＨ，）ｇｓＯ＊ （たとえば
１０ｍＭ）、ＫＣＲ（たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たと
えば０．１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼ
とともに一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（た
とえば１２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮ
Ａとリンカ−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液
にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。 ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰｔ−各’２．８８度４０ ｕ Ｍ
（！： するよう加え、大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ、大腸
菌ＤＩｔＡポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレアーゼＨ
を加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完
全な二重ｕ４ｃ Ｄ Ｎ Ａを含む組換えプラスミドを
辱る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大１１Ｊ＆［ｃ６００ｓＦｇ株を、たとえ゛ばスコツ）
（Ｓｃｏ ｔ ｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学
２．６１６（１９８３） ）により形質転換する。 上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Ａ ｐ’）菌株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相
補性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡ
を保有する菌株を選択するのに一般的に用いられる。す
なわち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロース
フィルター上に固定し、既知のンロザケ成長ホルモンの
アミノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成り
ＮＡプローブと会合させ、強く会合するものを選択する
〔グルンステインーホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −
Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オブ・ヂ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ Ｉ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ン、 ｔｌｓＡ
、、 ７２゜３９６１ （１９７５） ）。プローブＤ
ＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミ力／Ｌｌ −ソサイエティ（Ｊ、＾ｍ、
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 ） 、 ９７ 。 ７３２７ （１９７５） ）て合成される。合成りＮＡ
プローブによる選択はサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）
らの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ、 Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、＞９８．５０３ （１
９７５）］によってさらに確実にでき、この方法でシロ
ザケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有す
る組換え体プラスミドＤＮＡを同定できる。 本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のような微生
物、あるいは真核細胞による魚類成長ホルモンポリペプ
チドの大量生産に用いられる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例１． シロザケ脳下垂体よりのポＩＪ Ａ″ＲＮ
Ａの調製： ／ロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法〔マニアテイス（＆Ｉａｎ＋ａ類ｓ
）ら鳩、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 Ｉ］１９６． ：ｌ−
ルドースプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｉ（ａｒｂｏｒ ）刊；重定勝哉、細胞工学、 ２．
６１６（１９８３＞）に従いポリ八を有するＲＮＡを下
記のごとく調製した。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノールからなる溶液１０ｍ１中でテフロン
ホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。こ
のホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを分
断した。５．７ＭＣ５Ｃｊ！、０．１Ｍ ＥＤＴＡ
（１−１８）の溶液各１．２１１１１を超遠心管中に分
注してふき、前記ホモジネートを重層した。Ｈｉｔａｃ
ｈｉ ＲＰ Ｓ ４０ローターにて３５．００Ｏｒｐｍ
、 １５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。 ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス−Ｈｃ
ｊ！（ｐＨ８，０）溶液１０ｎ＋１に溶解し、フェノー
ル−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収
した。得られたＲＮＡ約１ｍｇを１０ｍＭ）リス−ＨＣ
１（ｐ）（８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる
溶液１１Ｉ１１に溶かした。 ６５℃、５分間インキコペートし、Ｑ、１ｍｌの５ＭＮ
ａ（１！を加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・カ
ラム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｉｓ社製）り
０７トグラフイーにかけた。吸着したポリＡを有するｍ
ＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，［ｌおよび
ＩｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポリＡを有す
るｍＲＮＡＲＮＡ約１ｍｇ。 実施例２． ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの
挿入： オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、 ）、 ２．１６０１９
８２））に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組
換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略を第
１図に示す。 ｐｃＤｌ［オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ−■
＆ Ｂｅｒｇ ） ：モレキ二う、−・アンド・セルラ
ー・バイオロジ４ （Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ吐）、
３．２８０（１９８３） ） ４００ ｐｇを１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩｔ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２および１０ｍＭＮａＣＲからなる溶液３００μｌに
加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝酒造社製ンを加
えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎ
ＩａＢ位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出後
、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。 Ｋｐｎ Ｉ切断した該ＤＮＡ約２０（ｌｕｇを４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ
６，８）、１ｍＭ ＣａＣ１ｚおよび０．１ ｍ Ｍ
ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる
緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを０
．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μｌに加え、さ
らに８！単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （Ｐ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃１
１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶＩのＫｐｎ Ｉ切
断部位の３′末端にポリ６丁鎖が約６７個付加された。 該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿により、ポリｄＴ鎮の付加したｐＣＤＶＩＤＮＡ約
１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−Ｈ
（１（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣＬ、１００ｍＭ
ＮａＣ１からなる緩衝液１５０μｌに加え、さらに
３６０単位のＥｃｏＲＩ （全酒造社製）を加え、３７
℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガロースゲル
電気泳動後、約３． ｌ Ｋ ｂのＤＮＡ断片を回収し
、約６０μｇのポリｄＴ！Ｊｌ付加ｐＣＤＶ１を得た。 該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０）およ
び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００Δに溶解し、
６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５０μｌの５
Ｍ ＮａＣ１１を加えた。混合物をオリゴｄＡセルロ
ースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグ
ラフィーにかけた。ポリｄＴ鎮長が充分なものはカラム
に吸着し、これを１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｌ１（ｐＨ８
，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
！ＩｄＴＩＮの付加したｐＣＤＶＩ （以下ベクタープ
ライマーと略記する）２７μｇを得た。 次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。 ｐＬｌ （オカヤマパアンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍ
ａ＆ Ｂｅｒｇ） ：モレキユラー・アンド・セルラー
・バイオロジ４ （Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｄｉ吐）、
３．２８０（１９８３） ）約１４μｇを１０ｍＭ）リ
ス−ＨＣ１（＋） ８７．５） 。 ６ｍＭ ＭｇＣ１ｚおよび５０ｍＭ ＮａＣｊ！か
らなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓ
ｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐ
Ｌ Ｉ ＤＮＡ中のＰｓｔ１部位で切断させた。該反
応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿を行い、Ｐｓｔｌで切断したｐＬＩＤＮＡ約１３μｇ
を回収した。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃
度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０μｌに加え、
さらにＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）５４単位を加えて３７ｔ１３分間インキエペートし、
ｐＬｌのＰｓｔＩ切断部位３′末端にｄＧ鎖を約１４個
付加した。 フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００μβの１０ｍＭ）リ
ス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭＭ ｇ Ｃ：
ｆ ２および６０ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１００
ｔｔｌに加え、さらに８０単位のＨｉｎｄＩＩＴく宝酒
造社製）を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ
ＩＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［部位テ切断シた。該反応物を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂ
のＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツエン（Ｄｒ
ｅｔｚｅｎ）ら、アナリティヵル・バイオケミストリイ
（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｃ、 ）、ユ且。 ２９５（１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮付き
のリンカ−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略記す
る）を得た。 上記で調製したポ！Ｊ （Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクタ
ープライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（
ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｊ！ｔ 、３０ｍＭ
ＫＣＪ！、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）およ
びｌＯ単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２
．３μβに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業
社製）を加え、３７℃４０分間イソキュベートし、ｍＲ
ＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮ
Ａを回収シタ。Ａ＊ＤＮＡを６６、ｌＪＭｄｃＴＰおよ
び０．２μｇポＩＪ Ａを含むＴｄＴ緩衝液２０μｌに
溶かし、１４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｒ、ａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間イン
キコベー）Ｌ、ｃＤＮＡ３′末端に１２個のｄＣ鎮を付
加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿によりｄＣ鎮の付加したｃＤＮＡ−ベク
タープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−
ＨＣ１（ｐ Ｈ７，５） 、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
Ｉ！２および６０ｍＭ ＮａＣ１からなる液４００μ
ｊ！に溶かし、２０単位のＨｉｎｄＩ［［（宝酒造社製
）を加え、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩ
［［部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロポ
ルム抽出、エタノール沈殿してＱ、５ ｐｍｏｌｅのｄ
Ｃ鎖付加ｃＤＮ’Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを得た
。該ＤＮＡ０．０ ｇ ｐｍｏｌｅおよび前記のリンカ
−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌｅを４０．ｕＪ！のトリス
−ＮＣＲ（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ Ｎａ（ｌおよび
１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに加え、６５
℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分。 ３０分間インキュベートした。２０ｍＭ）リス−〇Ｃ１
（＋） Ｈ７，５）、４ｄ Ｍｇ Ｃ１，、１０ｍＭ
（ＮＩＩ４）２ＳＯ４゜０．１Ｍ ＫＣｊ！およびＯ
，１ｍＭβ−ＮＡＤの組成で、全量４００μｌとなるよ
う反応液を調製した。 該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡ’Ｊガーゼ（Ｎｅｗ
ｌＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え、Ｉ
ｌｔニー夜インキニベートした。該反応液を各４０μＭ
のｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を
追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ、７単位
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌク
レアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキユベー
トした。 上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＩＩＡに置換さ
れ、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した
。 実施例３． シロザケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ８株〔カメｏ ７ （Ｃａｉｅｒｏｎ） ：
プロシーディング・オブ・ヂ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイｘンｘ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 八ｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ。 ７２．３４１６（１９７５） ）をスコツト（Ｓｃｏｊ
ｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学、 ２，６１６（１
９８３） ）に従い形質転換した。得られた約１万個の
コロニーのうち４８００個ヲニトロニドロース上に固定
した。ンロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２
８番目のアミノ酸配列に対応する合成ＯＮ＾、すなわち
（３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたはＣ，１
２番目はＣまたは７．１５番目はＣまたはＴであり、組
み合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３
７ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株
を選んだ〔グルンスティンーホグ不ス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−１１ｏｇｎｅｓｓ ）の方法、プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ’オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ） ＵＳＡ、 ７２，３９６Ｈ１９７５）
）。得られた８菌株についてサザーン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ ）の方法〔ジャーナル・オブ・モレキユラー・バ
イオロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、 ）、部、 ５０３（１９７５） ）により
、上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応
する合成りＮＡプローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
八であり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐｓＧＨｌ、３．６，８゜９ 、１０．１４．１７と命
名したが、いずれも、シロヂケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。 実施例４．該プラスミドρＳＧＨ１の塩基配列：上記で
得られたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化
し、ｃＤＮ八部への切断地図を決定した。制限酵素部位
の存在位置から、辱られたプラスミドは３群に分類でき
、ｐｓＧｌ（ｌ、 ６．９．１０゜１７の群、ρ５Ｇ）
ｌ ３の群、ｐｓＧＨ８、１４の群と分けられた。それ
ぞれの群の制限酵素地図を第２図に示す。 次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐＳＧＨ］を含む群のプラスミド、特にρ５Ｇ）ｌ
１について、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１
３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法〔サン
が−（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘンｙ、 （Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、）、 Ｕ
ＳＡ、 ７４． ５４６３（１９７７） ： ア７−
シャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ ）社 Ｍ１３クローニング
・アンド・シーフェンシング・ハンドブック （ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ］に従って決定した。配列を第１表に示す。 第１表中、塩基数１−６６がシグナルペプチドを、６７
−６３０がンロヂケ成長ホルモンの成熟ペプチドをコー
ドする。ｐＳＧＨ１に含まれるｃＤＮＡ配列から予想さ
れるアミノ酸鄭列は、シロザケ成長ホルモンペプチドか
ら決定されているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ
酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮＡはシロヂケ成長ホル
モンをコードしていることが確認された。ｐＳＧＨ１、
ｐＳＧＨ３、ｔｌｓＧ）ｌ ８を含む大腸菌（それぞれ
ＥＳＧＨ１、ＥＳＧ）Ｉ ３． ＥＳＧＨ８）は昭和５
９年６月２３日付で、ＦＥＲＭ ０Ｐ−５５１，５５２
および５５３として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。 −Ｇｅｎｅ類ｃ Ｃｏｄｅ ［：Ｕｎｉｕｅｒｓａｌ
コ 第 ｌ Ｌ／Ａｒ９Ｌｙ’５りｅｒＬ＋
’ｕム１ｕＡｌａ八５ｎｃｙｑＴｈｒＬｅｕ簀］１憂チ
ドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、繊
組換え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらは魚類の
成長ホルモンポリペプチドの大量生産に利用することが
できる。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍｓ−Ｂｅｒｇ
）法によるｃＤＮ＾合成と、該ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドの造成過程の概略を示す。 第２図はｐＳＧＨ１、ｐＳＧＨ３、ｐｓＧＨ８に含まれ
るｃＯＮ＾の制限酵素地図を示す。
と、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の概
略を示す。 第２図はｐＳＧＨ１、ｐＳＧ）ｌ ３ 、 ｐＳＧＨ８
に含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第１ ４ＥｃｏＲＩシｋｔ ＋ＨｉｎｄＮ３１’ｌＥ８
゛７ター１”ｙＱ−ＤＮＡ −７ｍＲＮＡＡＭ
Ａ、−−−−−−−−−−−−−−手続補正書（方式） 昭和６０年２月２２日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２１３３６０号 ２、発明の名称 魚類の成長ホルモン遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称（１０
２）協和醗酵工業株式会社 昭和６０年１月９日（発送日：同６０年１月２９日）５
、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 別紙のとおり 明 細 書 １、発明の名称 魚類の成長ホルモン遺伝子 ２、特許請求の範囲 （１ン 第１表に示したペプチド配列を有する魚類の
成長ホルモンポリペプチド。 （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 （３）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ。 （４）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第３項のＤＮＡ
。 （５ン 魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 （６） 魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に
示したペプチド配列を有する特許請求の範囲第５項の組
換え体ＤＮＡ０ （７） プラＸミ）’ｐｓＧＨ１，ｐｓｃ、Ｈ３また
は１ＧＨ８と名づけだ特許請求の範囲第５項の組換え体
ＤＮＡ０ 〔８〕魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物。 （９）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第３図に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第８項の微生物
。 αｑ 該微生物がエフンエリヒア・コリに属する特許請
求の範囲第８項の微生物。 （１１）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養
培地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペ
プチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを採
取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法。 ３、発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、該組換
繊組ＤＮＡを含む微生物環よび該微生物を用いる魚類の
成長ホルモンポリペプチドの製造法に関する。魚類の成
長ホルモンは魚類の養殖産業分野において広い用途が期
待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産されるが
、それらの活性ならびに構造は公知である。たとえば、
ヒト成長ホルモンについては、ニー・ジェイ・レビイス
（Ｕ、 Ｊ、 Ｌｅｗ ｉｓ）らによってジャーナル・
オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、＾ｍ
、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、 ８０．４４２９（１９５
Ｂ）に、エイ・ニス・バートリー（＾、 Ｓ、 １ａｒ
ｔｒｅｅ）によってバイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、 ）。 且、 ７５４ （１９６６）に、シー・エイチ・リー（
Ｃ，Ｈ，Ｌｉ）らによってアーチブス・オブ・バイオケ
ミストシイ・アンド・バイオフィジクス・アクタ（サブ
ルメント） （Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、＾ｅｔａ （Ｓｕｐｐｌ、）） 。 ユ、 ３２７ （１９６２） に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単離された
という報告は多く見られるが、その生理活性と蛋白化学
的な性質で信頼性のあるものは数が少ない。信頼性のあ
る報告の例には次のようなものがある。 ティラビアよりの単離例 ニス・ダブリュ・ファーマー
（Ｓ、Ｗ、 Ｆａｒｍｅｒ）ら、ジェネ５）Ｌｐ−７ン
ド・コンパラティブ・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ。 Ｃａｍｐ、 Ｂｎｄｏｃｒｉｎ、）、 ３０．９Ｈ１９
７６）。 チョウザメよりの単離例 ニス・ダブリニ・ファ−マー
（Ｓ、 １１． Ｆａｒｍｅｒ）ら、エンドクリア
０シイ（Ｅｄｏｃｒ＋ｎｏｌｏｇＶ＞、 １０８．３７
７（１９８１）。 コイよりの単離例 エイ・エフ・クック（＾、Ｆ。 Ｃｏｏｋ ）ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ
・エンドクリノロシイ（Ｇｅｎ、 ＣａｒｒＩｐ、ε
ｎｄｏｒｃｒｉｎ、 ）。 ５０、３３５（１９８３）。 一方嘘乳動物の成長ホルモン遺伝子についてはラット成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ
９Ｓｅｅｂｕｒｇ）ら：ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）
２７０４８６（１９７７）） 、ウシおよびブタの成長
ホルモン遺伝子〔ビ「・エイチ・シーバーブ（Ｐ、Ｈ，
Ｓｅｅ−ｂｕｒｇ ）らニブイー・エヌ・エイ （ＤＮ
Ａ）、 ２． ３７（１９８３）） 、ヒト成長ホルモ
ン遺伝子〔ジェイ・エイ・マーシャル（Ｊ、＾、 Ｍａ
ｒ類ａｌ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、 ２
０５．６０２（１９７９） ）などがすでに知られてい
るが、魚類の成長ホルモン遺伝子についてはいまだに報
告がない。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列（３１個）の決定
を行った。また、この物質が硬骨魚類において成長促進
効果を有することも確認している〔特願昭５９−６８６
７０１゜発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有するので
、養魚用餌料の組成物として有用であるが、魚類の脳下
垂体からの採取は供給量が限られている。従って魚類の
成長ホルモンを安価に大量に供給する方法の開発が望ま
れている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホル
モンを製造する方法について研究を行った。その結果、
魚類の成長ホルモン製造に使用することができる、魚類
の成長ホルモンポリペプチドに相補的なりＮＡの採取な
らびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび微生物の製造に
成功した。即ちサケ脳下垂体からメツセンジャーＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ
（ｃＤＮＡ）を合成し、次いでサケの成長ホルモンの
Ｎ末端付近のアミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを
合成し、このＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを選
択することにより、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン
化することに成功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配
列を決定し、本発明を完成するに至った。 以下本発明の詳細な説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、とくに第
１表に示されたペプチド配列を有するポリペプチドを提
供する。該ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技法を用いて
下記のごとく製造することができる。 即ち、魚頌成長ホル丁ンのｍＲＮＡを鋳型として用いて
該ｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し
、該ｃＤＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを調製す
る。さらに、繊組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入
する。該ＤＮＡおよび組換え体プラスミドは、とくに工
γシエリヒア・コリのような細菌中でサケ成長ホルモン
遺伝子の増幅に使用することができる。繊組換え体プラ
スミドを有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大量
に製造するために有用である。 従って、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするＤＮＡ５ＵＸＤＮＡを組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡならびに繊組換え体ＤＮＡを含む微生物を提供する
。 本発明のＤＮＡと組換え体プラスミドは下記の一般的手
法で調製される。 シロサケ脳下垂体より全ＲＮＡを調製し、これをオリゴ
ｄＴセ／ｌ／ Ｃ１−ス（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ）カラムを通すことによりポリアデニル酸（
ポリＡ）を有するＲＮＡ （ポリＡ″ＲＮＡ）を分離す
る。 このポＩＪＡ″ＲＮＡ を鋳型とし、逆転写酵素により
二重鎖ＤＮＡを合成する。組換え体は試験管内ＤＮＡ組
換え技法を用い、大腸菌のプラスミドＤＮＡのようなベ
クターＤＮＡに談合成りＮＡを挿入して得られる。シロ
サケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを有す
る組換え体プラスミドを選択する。 次に本発明のＤＮＡおよびａｍえ体プラスミドの製法に
ついて具体的に説明する。 擁護されたシロサケより脳下垂体を摘出し、即座に液体
窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体にグアニジウム
・インチオシアネート軸ｕａｎ＋ｄｉｕｍｉｓｏｔｈｉ
ｏｃｙａｎａｔｅ）を加え破砕し、可溶化する。次いで
ＣｓＣ１溶液層に重層し、超遠心後、沈殿物とし全細胞
質ＲＮＡを得る。またグアニジウム・イソチオシアネー
ト可溶化物にＬｉＣＪ！を加えてＲＮＡのみを沈殿させ
回収することもできる。 抽出したＲＮＡをＮａＣｊ！またはＫＣｌの高塩濃度（
たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ＞を有するｍＲ
ＮＡをカラムに吸着させる。水、１０ｍＭ）！ＪスーＨ
Ｃ１緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポ！
Ｉ （Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。 以下、オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
）の方法〔オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍａ
＆ Ｂｅｒｇ）；モレキンマー・アンド・セルラー・
バイオロジィ（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、８ｉｏ１． ） ２
，１６１（１９８２））に従い、ｃＤＮＡの合成および
、そのベクターへの組み込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクターとしては
たとえばｐＣＤＶｌを適当な溶液、たとえばトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（たとえばｐ）１７，５．１０ｍＭ）、
Ｍ ｇ ＣＡａ（たとえば６ｍＭ）、ＮａＣｌ２（たと
えば１０ｍＭ）を含む溶液中でＫｐｎ ｌで処理し、ｐ
ＣＤＶ １のＫｐｎ １部位を切断する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ６，
８，３０ｍ１Ｊ）、 カコジル酸ナトリウム（たとえ
ば１４０ ｍＭ） 、 ＣｏＣｊ！ｚ（たとえば１ｍＭ
）、ジチオスレイトール（たとえば０．１ｍＭ）＄よび
ｄＴＴＰ （たとえば０．２５ｍＭ）中、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとともに一定
温度（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分間
）インキュベートし、ベクターＤＮＡの両３′末端に６
０個前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤＮＡ
をトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（たとえばｐＨ７，５，１０ｍ
Ｍ ） 、Ｍ ｇ Ｃ１２（たとえば６ｍＭ）、Ｎａ
Ｃ１（たとえば１００ｍＭ）を含む溶液中ＥｃｏＲＩで
切断後、低融点アガロースゲル電気泳動〔ラルス・ライ
スラング−（Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ ） ：
アナリティカルー ハイオケミストリイ（＾ｎａｌｙ
類ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）、 ９８゜
３０５ （１９７９） ）にて分画し、約３．１キロベ
ースの断片を回収する。次いで該ＤＮＡをＮａＣ１また
はＫＣＩの高塩濃度（たとえば０．５ Ｍ ）溶液に溶
解し、ポリ（ｄＡ）セルロースカラムに通塔してポＩＪ
（Ｔ）を有するベクタープライマー分子のみをカラムに
吸着させる。水、ｌＱｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液のよう
な低塩濃度溶液を用いて溶出し、ボ’Ｊ （Ｔ）の付加
したベクタープライマー分子のみを単離する。 次にリンカ−ＤＮＡを合成する。たとえばｐＬＩＤＮＡ
を適当な溶液、たとえばトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，１（）＋Ｍ） 、 Ｍｇ（１！２（たと
えば６ｍＭ）、ＮａＣｊ！ （たとえば５０ｍＭ）を含
む溶液中でＰｓｔＩで処理し、ｐＬｌのＰｓｔ１部位を
切断する。このＤＮＡを、ｄＴＴＰの代わりにｄＧＴＰ
を加える以外はベクタープライマー合成の場合と同様に
処理し、１５個前後のオリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮ
Ａを適当な溶液たとえばトリス−Ｈｃｉｔｘ衝液（たと
えばｐＨ７，５，１０ｍＭ）、ＭｇＣＬ（たとえば６ｍ
Ｍ）。 ＮａＣｌ（たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎｄ［
［にて切断する。アガロースゲル電気泳動にて約０．５
キロベースのＤＮＡ断片を分画し、ＤＥＡＥペーパーに
て回収する。このようにしてリンカ−ＤＮＡを得る。 以上のようにして得たポリ （＾νＲＮＡ、ベクタープ
ライマー、リンカ−ＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成を行う
。ポリ （＾）”ＲＮＡ 、ベクタープライマーＤＮＡ
をトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐＨ８，３，５０ｍ
Ｍ＞、ＭｇＣ！！２ （たとえば８ｒｒ＋Ｍ） 、 Ｋ
Ｃｊ！ （たとえば３０ｍＭ）、ジチオスレイトール（
たとえば０．３ｍＭ）、ｄＡＴＰ。 ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ （たとえば各々２ｍＭ
）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７
℃）、一定時間（たとえば４０分間）反応させる。こう
して得たＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の３′末端に、ｄＴＴＰ
がｄｃＴＰに変わる以外はベクタープライマーにｄＴ鎖
を付加した条件と同様の操作でオリゴｄＣ鎮を１５個前
後付加する。 このＤＮＡをトリス−ＨＣｌ緩衝液（たとえばｐ Ｈ７
，５，１０ｍ Ｍ ） 、 Ｍ ｇ Ｃ１！ （たとえ
ば６ ｍＭ） 。 ＮａＣｊ！ （たとえば６０ｍＭ）を含む溶液中Ｈｉｎ
ｄｌｌｌで切断する。このＤＮＡに、先に調製したリン
カ−ＤＮＡを混合し、トリス−ＨＣｆ１緩衝液（たとえ
ばｐＨ７，５，２０ｍＭ）、ＭｇＣＲ。 （たとえば４ｍＭ）、（ＮＨ，）ｇｓＯ＊ （たとえば
１０ｍＭ）、ＫＣＲ（たとえば０．１Ｍ）、β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（β−ＮＡＤ）（たと
えば０．１ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼ
とともに一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（た
とえば１２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮ
Ａとリンカ−ＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液
にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。 ｄＧＴＰ、ｄｃＴＰｔ−各’２．８８度４０ ｕ Ｍ
（！： するよう加え、大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ、大腸
菌ＤＩｔＡポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレアーゼＨ
を加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換することにより、完
全な二重ｕ４ｃ Ｄ Ｎ Ａを含む組換えプラスミドを
辱る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、たとえば
大１１Ｊ＆［ｃ６００ｓＦｇ株を、たとえ゛ばスコツ）
（Ｓｃｏ ｔ ｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学
２．６１６（１９８３） ）により形質転換する。 上記で得た組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性
遺伝子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Ａ ｐ’）菌株から魚類の成長ホルモンｍＲＮＡに相
補性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡ
を保有する菌株を選択するのに一般的に用いられる。す
なわち、上記で得られた形質転換株をニトロセルロース
フィルター上に固定し、既知のンロザケ成長ホルモンの
アミノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有する合成り
ＮＡプローブと会合させ、強く会合するものを選択する
〔グルンステインーホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ −
Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法、プロシーディング・オブ・ヂ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ Ｉ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、ン、 ｔｌｓＡ
、、 ７２゜３９６１ （１９７５） ）。プローブＤ
ＮＡは通常のトリエステル法〔ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミ力／Ｌｌ −ソサイエティ（Ｊ、＾ｍ、
Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 ） 、 ９７ 。 ７３２７ （１９７５） ）て合成される。合成りＮＡ
プローブによる選択はサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）
らの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジイ（Ｊ、 Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、＞９８．５０３ （１
９７５）］によってさらに確実にでき、この方法でシロ
ザケ成長ホルモンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子を有す
る組換え体プラスミドＤＮＡを同定できる。 本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のような微生
物、あるいは真核細胞による魚類成長ホルモンポリペプ
チドの大量生産に用いられる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例１． シロザケ脳下垂体よりのポＩＪ Ａ″ＲＮ
Ａの調製： ／ロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネート−セ
シウムクロライド法〔マニアテイス（＆Ｉａｎ＋ａ類ｓ
）ら鳩、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 Ｉ］１９６． ：ｌ−
ルドースプリング・ハーバ−（Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｉ（ａｒｂｏｒ ）刊；重定勝哉、細胞工学、 ２．
６１６（１９８３＞）に従いポリ八を有するＲＮＡを下
記のごとく調製した。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約３０個体分）を４Ｍグ
アニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシン、５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）および０．ＩＭβ−メ
ルカプトエタノールからなる溶液１０ｍ１中でテフロン
ホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて破砕し可溶化した。こ
のホモジネートを１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡを分
断した。５．７ＭＣ５Ｃｊ！、０．１Ｍ ＥＤＴＡ
（１−１８）の溶液各１．２１１１１を超遠心管中に分
注してふき、前記ホモジネートを重層した。Ｈｉｔａｃ
ｈｉ ＲＰ Ｓ ４０ローターにて３５．００Ｏｒｐｍ
、 １５時間遠心後、ＲＮＡを沈殿として回収した。 ＲＮＡの沈殿を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス−Ｈｃ
ｊ！（ｐＨ８，０）溶液１０ｎ＋１に溶解し、フェノー
ル−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回収
した。得られたＲＮＡ約１ｍｇを１０ｍＭ）リス−ＨＣ
１（ｐ）（８，０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる
溶液１１Ｉ１１に溶かした。 ６５℃、５分間インキコペートし、Ｑ、１ｍｌの５ＭＮ
ａ（１！を加えた。混合物をオリゴｄＴセルロース・カ
ラム（Ｐ −Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｉｓ社製）り
０７トグラフイーにかけた。吸着したポリＡを有するｍ
ＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，［ｌおよび
ＩｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液で溶出しポリＡを有す
るｍＲＮＡＲＮＡ約１ｍｇ。 実施例２． ＣＤＮＡ合成と該ＤＮＡのベクターへの
挿入： オカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ）の方
法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、 ）、 ２．１６０１９
８２））に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組み込んだ組
換え体プラスミドの造成を行った。その工程の概略を第
１図に示す。 ｐｃＤｌ［オカヤマ・アンド・バーブ（Ｏｋａｙａ−■
＆ Ｂｅｒｇ ） ：モレキ二う、−・アンド・セルラ
ー・バイオロジ４ （Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ吐）、
３．２８０（１９８３） ） ４００ ｐｇを１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩｔ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２および１０ｍＭＮａＣＲからなる溶液３００μｌに
加え、さらに５００単位のＫｐｎｌ（宝酒造社製ンを加
えて、３７℃、６時間反応させ、プラスミド中のＫｐｎ
ＩａＢ位で切断した。フェノール−クロロホルム抽出後
、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。 Ｋｐｎ Ｉ切断した該ＤＮＡ約２０（ｌｕｇを４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ
６，８）、１ｍＭ ＣａＣ１ｚおよび０．１ ｍ Ｍ
ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）からなる
緩衝液（以下ＴｄＴ緩衝液と略記する）にｄＴＴＰを０
．２５ｍＭとなるよう加えた溶液２００μｌに加え、さ
らに８！単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（以下ＴｄＴと略記する） （Ｐ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加えて、３７℃１
１分間反応させた。ここで、ｐＣＤＶＩのＫｐｎ Ｉ切
断部位の３′末端にポリ６丁鎖が約６７個付加された。 該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿により、ポリｄＴ鎮の付加したｐＣＤＶＩＤＮＡ約
１００μｇを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−Ｈ
（１（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣＬ、１００ｍＭ
ＮａＣ１からなる緩衝液１５０μｌに加え、さらに
３６０単位のＥｃｏＲＩ （全酒造社製）を加え、３７
℃２時間反応させた。該反応物を低融点アガロースゲル
電気泳動後、約３． ｌ Ｋ ｂのＤＮＡ断片を回収し
、約６０μｇのポリｄＴ！Ｊｌ付加ｐＣＤＶ１を得た。 該ＤＮＡを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０）およ
び１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５００Δに溶解し、
６５℃５分間インキュベート後、氷冷して５０μｌの５
Ｍ ＮａＣ１１を加えた。混合物をオリゴｄＡセルロ
ースカラム（コラボラティブリサーチ社製）クロマトグ
ラフィーにかけた。ポリｄＴ鎮長が充分なものはカラム
に吸着し、これを１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣｌ１（ｐＨ８
，０）および１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポ
！ＩｄＴＩＮの付加したｐＣＤＶＩ （以下ベクタープ
ライマーと略記する）２７μｇを得た。 次にリンカ−ＤＮＡの調製を行なう。 ｐＬｌ （オカヤマパアンド・バーブ（Ｏｋａｙａｍ
ａ＆ Ｂｅｒｇ） ：モレキユラー・アンド・セルラー
・バイオロジ４ （Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｄｉ吐）、
３．２８０（１９８３） ）約１４μｇを１０ｍＭ）リ
ス−ＨＣ１（＋） ８７．５） 。 ６ｍＭ ＭｇＣ１ｚおよび５０ｍＭ ＮａＣｊ！か
らなる緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓ
ｔＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃４時間反応させ、ｐ
Ｌ Ｉ ＤＮＡ中のＰｓｔ１部位で切断させた。該反
応物をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿を行い、Ｐｓｔｌで切断したｐＬＩＤＮＡ約１３μｇ
を回収した。該ＤＮＡ約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃
度０．２５ｍＭのｄＧＴＰを含む溶液５０μｌに加え、
さらにＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製
）５４単位を加えて３７ｔ１３分間インキエペートし、
ｐＬｌのＰｓｔＩ切断部位３′末端にｄＧ鎖を約１４個
付加した。 フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にてＤ
ＮＡを回収した。該ＤＮＡを１００μβの１０ｍＭ）リ
ス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、６ｍＭＭ ｇ Ｃ：
ｆ ２および６０ｍＭＮａＣｊ！からなる緩衝液１００
ｔｔｌに加え、さらに８０単位のＨｉｎｄＩＩＴく宝酒
造社製）を加えて３７℃３時間インキュベートし、ｐＬ
ＩＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［部位テ切断シた。該反応物を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５ Ｋ ｂ
のＤＮＡ断片をＤＥＡＥペーパー法〔ドレツエン（Ｄｒ
ｅｔｚｅｎ）ら、アナリティヵル・バイオケミストリイ
（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｃ、 ）、ユ且。 ２９５（１９８１） ）にて回収し、オリゴｄＧ鎮付き
のリンカ−ＤＮＡ （以下単にリンカ−ＤＮＡと略記す
る）を得た。 上記で調製したポ！Ｊ （Ａ）ＲＮＡ約２μｇ、ベクタ
ープライマー約１．４μｇを５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（
ｐＨ８，３）、８ｍＭ ＭｇＣｊ！ｔ 、３０ｍＭ
ＫＣＪ！、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）およ
びｌＯ単位のりボヌクレアーゼインヒビター（Ｐ −Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）からなる溶液２２
．３μβに溶解し、１０単位の逆転写酵素（生化学工業
社製）を加え、３７℃４０分間イソキュベートし、ｍＲ
ＮＡに相補的なりＮＡを合成させた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ない、Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の付加したベクタープライマーＤＮ
Ａを回収シタ。Ａ＊ＤＮＡを６６、ｌＪＭｄｃＴＰおよ
び０．２μｇポＩＪ Ａを含むＴｄＴ緩衝液２０μｌに
溶かし、１４単位のＴ ｄ Ｔ （Ｐ −Ｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｒ、ａｌｓ社製）を加えて３７℃８分間イン
キコベー）Ｌ、ｃＤＮＡ３′末端に１２個のｄＣ鎮を付
加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿によりｄＣ鎮の付加したｃＤＮＡ−ベク
タープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡをトリス−
ＨＣ１（ｐ Ｈ７，５） 、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ
Ｉ！２および６０ｍＭ ＮａＣ１からなる液４００μ
ｊ！に溶かし、２０単位のＨｉｎｄＩ［［（宝酒造社製
）を加え、３７℃２時間インキュベートし、ＨｉｎｄＩ
［［部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロポ
ルム抽出、エタノール沈殿してＱ、５ ｐｍｏｌｅのｄ
Ｃ鎖付加ｃＤＮ’Ａ−ベクタープライマーＤＮＡを得た
。該ＤＮＡ０．０ ｇ ｐｍｏｌｅおよび前記のリンカ
−ＤＮＡ０．１６ ｐｍｏｌｅを４０．ｕＪ！のトリス
−ＮＣＲ（ｐＨ７，５）、０．１Ｍ Ｎａ（ｌおよび
１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液４０μｌに加え、６５
℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０分、２５分。 ３０分間インキュベートした。２０ｍＭ）リス−〇Ｃ１
（＋） Ｈ７，５）、４ｄ Ｍｇ Ｃ１，、１０ｍＭ
（ＮＩＩ４）２ＳＯ４゜０．１Ｍ ＫＣｊ！およびＯ
，１ｍＭβ−ＮＡＤの組成で、全量４００μｌとなるよ
う反応液を調製した。 該反応液に１０単位の大腸菌ＤＮＡ’Ｊガーゼ（Ｎｅｗ
ｌＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加え、Ｉ
ｌｔニー夜インキニベートした。該反応液を各４０μＭ
のｄＮＴＰ、０．１５ｍＭβ−ＮＡＤとなるよう成分を
追加調製し、５単位の大腸菌ＤＮＡ！Ｊガーゼ、７単位
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ社製）および２単位の大腸菌リボヌク
レアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
を加え、１２℃、２５℃で順次１時間ずつインキユベー
トした。 上記反応で、ｃＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分がＤＩＩＡに置換さ
れ、完全な二重鎖ＤＮＡの組換えプラスミドが生成した
。 実施例３． シロザケ成長ホルモンｃＤＮＡを含む組換
えＤＮＡの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌Ｃ６
００ＳＦ８株〔カメｏ ７ （Ｃａｉｅｒｏｎ） ：
プロシーディング・オブ・ヂ・ナショナル・アカデミイ
・オブ・サイｘンｘ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 八ｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、） ＵＳＡ。 ７２．３４１６（１９７５） ）をスコツト（Ｓｃｏｊ
ｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学、 ２，６１６（１
９８３） ）に従い形質転換した。得られた約１万個の
コロニーのうち４８００個ヲニトロニドロース上に固定
した。ンロザケ成長ホルモンのＮ末端から２３番目−２
８番目のアミノ酸配列に対応する合成ＯＮ＾、すなわち
（３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたはＣ，１
２番目はＣまたは７．１５番目はＣまたはＴであり、組
み合わせて１６通りの合成りＮＡの混合物となる）を３
７ｐで標識したプローブに４０℃で強く会合した８菌株
を選んだ〔グルンスティンーホグ不ス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−１１ｏｇｎｅｓｓ ）の方法、プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ’オブ・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ） ＵＳＡ、 ７２，３９６Ｈ１９７５）
）。得られた８菌株についてサザーン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ ）の方法〔ジャーナル・オブ・モレキユラー・バ
イオロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、 ）、部、 ５０３（１９７５） ）により
、上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に対応
する合成りＮＡプローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたはＧ、９
番目はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、１２番目はＧまたは
八であり、組み合わせて３２通りの合成りＮＡの混合物
となる）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
ｐｓＧＨｌ、３．６，８゜９ 、１０．１４．１７と命
名したが、いずれも、シロヂケ成長ホルモンのアミノ酸
配列から予想されるＤＮＡ配列を有することから成長ホ
ルモンｃＤＮＡを含んでいるものと考えられた。 実施例４．該プラスミドρＳＧＨ１の塩基配列：上記で
得られたプラスミド８種につき、種々の制限酵素で消化
し、ｃＤＮ八部への切断地図を決定した。制限酵素部位
の存在位置から、辱られたプラスミドは３群に分類でき
、ｐｓＧｌ（ｌ、 ６．９．１０゜１７の群、ρ５Ｇ）
ｌ ３の群、ｐｓＧＨ８、１４の群と分けられた。それ
ぞれの群の制限酵素地図を第２図に示す。 次に実施例３で行った合成りＮＡプローブと最も強い会
合を示し、かつほぼ完全長のｃＤＮＡを含むと考えられ
るｐＳＧＨ］を含む群のプラスミド、特にρ５Ｇ）ｌ
１について、その翻訳領域の全ヌクレオチド配列をＭ１
３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法〔サン
が−（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘンｙ、 （Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、）、 Ｕ
ＳＡ、 ７４． ５４６３（１９７７） ： ア７−
シャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ ）社 Ｍ１３クローニング
・アンド・シーフェンシング・ハンドブック （ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ］に従って決定した。配列を第１表に示す。 第１表中、塩基数１−６６がシグナルペプチドを、６７
−６３０がンロヂケ成長ホルモンの成熟ペプチドをコー
ドする。ｐＳＧＨ１に含まれるｃＤＮＡ配列から予想さ
れるアミノ酸鄭列は、シロザケ成長ホルモンペプチドか
ら決定されているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ
酸配列と完全に一致し、該ｃＤＮＡはシロヂケ成長ホル
モンをコードしていることが確認された。ｐＳＧＨ１、
ｐＳＧＨ３、ｔｌｓＧ）ｌ ８を含む大腸菌（それぞれ
ＥＳＧＨ１、ＥＳＧ）Ｉ ３． ＥＳＧＨ８）は昭和５
９年６月２３日付で、ＦＥＲＭ ０Ｐ−５５１，５５２
および５５３として工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されている。 −Ｇｅｎｅ類ｃ Ｃｏｄｅ ［：Ｕｎｉｕｅｒｓａｌ
コ 第 ｌ Ｌ／Ａｒ９Ｌｙ’５りｅｒＬ＋
’ｕム１ｕＡｌａ八５ｎｃｙｑＴｈｒＬｅｕ簀］１憂チ
ドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ、繊
組換え体ＤＮＡを含む微生物が得られ、これらは魚類の
成長ホルモンポリペプチドの大量生産に利用することが
できる。 ４、図面の簡単な説明 第１図はオカヤマーバーグ（Ｏｋａｙａｍｓ−Ｂｅｒｇ
）法によるｃＤＮ＾合成と、該ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドの造成過程の概略を示す。 第２図はｐＳＧＨ１、ｐＳＧＨ３、ｐｓＧＨ８に含まれ
るｃＯＮ＾の制限酵素地図を示す。
Claims (11)
- （１）第１表に示したペプチド配列を有する魚類の成長
ホルモンポリペプチド。 - （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド。 - （３）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ。 - （４）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第３項のＤＮＡ
。 - （５）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 - （６）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第１表に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第５項の組換え
体ＤＮＡ。 - （７）プラスミドｐＳＧＨ１、ｐＳＧＨ３またはｐＳＧ
Ｈ８と名づけた特許請求の範囲第５項の組換え体ＤＮＡ
。 - （８）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物。 - （９）魚類の成長ホルモンポリペプチドが第３図に示し
たペプチド配列を有する特許請求の範囲第８項の微生物
。 - （１０）該微生物がエッシェリヒア・コリに属する特許
請求の範囲第８項の微生物。 - （１１）魚類の成長ホルモンポリペプチドをコードする
ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養
培地に培養し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペ
プチドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを採
取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドの製造法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21336084A JPS6193196A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| CA000485108A CA1272144A (en) | 1984-06-29 | 1985-06-25 | Fish growth hormone polypeptide |
| NO852568A NO174717C (no) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmåten |
| AU44195/85A AU575961B2 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Salmon fish growth hormone by genetic engeneering |
| EP85107987A EP0166444B1 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-27 | Fish growth hormone polypeptide |
| US06/750,587 US4689402A (en) | 1984-06-29 | 1985-07-01 | Fish growth hormone polypeptide |
| CN 85104988 CN85104988A (zh) | 1984-10-12 | 1985-07-01 | 鱼生长激素多肽 |
| US07/017,630 US4849359A (en) | 1984-06-29 | 1987-04-14 | Fish growth hormone polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21336084A JPS6193196A (ja) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6193196A true JPS6193196A (ja) | 1986-05-12 |
Family
ID=16637883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21336084A Pending JPS6193196A (ja) | 1984-06-29 | 1984-10-12 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6193196A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115699A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
-
1984
- 1984-10-12 JP JP21336084A patent/JPS6193196A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115699A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
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