JPH012584A - Ｄｎａおよびプラスミド並びにそれらを含有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人間のホルモンは治療にますます必要とされてきている
。これらにはなかんずくホルモンインシュリンが包含さ
れる。人間の器官から比較的大量にホルモンを得るのは
不可能なので、これらのホルモンを人間の器官外で産生
させるための適当な技術が開発されねばならない。

本発明はかかる方法を開示するものである。

本発明は特定の蛋白質のための遺伝暗号を包含している
ヌクレオチド配列の単離、これら特定のヌクレオチド配
列を用いるＤＮＡの合成、およびこのＤＮＡの複製およ
び発現（ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）が行われる宿主微生
物中へのこのＤＮＡの転移に関する。

所望のポリペプチドあるいは蛋白質をコード化する遺伝
子を有するプラスミドを担持している細菌の培養により
ポリペプチドおよび蛋白質を調製することは知られてい
る。またプラスミドを担持する宿主をしてその宿主にと
っては本来的な特徴ではない遺伝子生成物を産生せしめ
るようなプラスミドを組み立てることが可能であること
も知られている。またＤＮＡ組みかえ技術により、ラッ
トのプレプロインシュリンの遺伝情報が細菌中でクロー
ン（ａｌｏｎｅ）化されることも知られている。これら
−細菌がインシュリンの抗原決定基を有する蛋白質を発
現することが判っている。さらに、人間のインシュリン
の八−およびＢ−鎖の遺伝情報が細菌中で別々にクロー
ン化されることが知られている。これはＡ−およびＢ−
鎖のための相当するＤＮＡ類を新たに合成することによ
り達成される。細菌により産生されたＡ−およびＢ−鎖
は次いで生体外で結合されてインシュリン分子を形成し
うる。

これら方法のいずれも人間の治療に使用されうる薬剤を
生じない。ラットのプロインシュリンの場合、最終生成
物すなわちラットインシュリンはアレルギー反応を招来
する蛋白質である。人間のＡ−およびＢ−鎖の場合、Ｂ
−鎖は重合し易いという性質があり、またＡ−およびＢ
−鎖の結合の収量が非常に低いので、人間のインシュリ
ンを産生ずるという最終目的には適さない。

従って本発明では異なる方法が採択される。

猿および人間のインシュリンが同じ構造を有しているこ
とは知られている。従って、猿のプロインシュリンを製
造すれ！！、人間のインシュリンはそれから解裂により
製造されろ。

今や本発明は特に猿のプロインシュリンの遺伝子の調製
、微生物宿主へのこれら遺伝子の転移、宿主および遺伝
子の複製、および宿１主による遺伝子の発現（ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ）に関する。この方法で形成される蛋白質
は猿のプロインシュリンのアミノ酸配列を包含している
。

本発明による目的を達成するためには以下の操作がなさ
れるが、その開示されている方法は使用されるいく通り
かの方法の１例である。

猿、（尾のある猿と尾のない猿の両方を意味する）、好
ましくは赤毛ｍ　（Ｒｈ、ｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ）あ
るいはマカクｌＩ（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）の膵臓から、
蛋白分解的消化（これは過剰の分解がありうるから非常
に注意深く制御されねばならない）およびそれに続く遠
心分離により単細胞が得られる。

これら単細胞から、密度勾配遠心操作によりβ−細胞に
富んだ層が得られる。この細胞層は変性せしめられ、そ
して塩化セシウム遠心分離の後にＲＮＡが沈殿として得
られる。さらに沈殿させたのち、このＲＮＡからオリゴ
−ｄＴ−セルロースカラムによってｍＲＮＡが分離され
る。得られるｏ＋ＲＮＡは逆転写酵素の助けにより完成
されてＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を生ずる。ＲＮＡ鎖を消化
したのち逆転写酵素あるいは酵素ポリメラーゼＩを用い
てＤＮＡ鎖（相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　＝　ｃＤＮＡ）が完成
されてＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（ｄｓＤＮＡ）を生ずる。

この二重鎖ＤＮＡを、次にプラスミド中に組み込まなけ
ればならない。この目的のために　　、は、ＤＮＡの３
′末端を例えばｄＣＭＰ残基を用いて延長することが必
要である。プラスミド（例えばｐＢＲ３２２）が制限ヌ
クレアーゼＰｓｔｌで切断されそして例えばｄＧＭＰ残
基を用いて延長される。この方法で延長されたＤＮＡが
相当して延長されているプラスミドと一緒にされると、
ＤＮＡとプラスミドとの間に塩基の対合（ｂａｓｅｐａ
ｉｒｉｎｇ）が起る。この環状になされた分子は次に微
生物（特に細菌好ましくは大腸菌に１２あるいはχ」７
７６のような大腸菌）中に形質転換される。まだ完結さ
れていない結合は微生物の酵素によって共有結合に変え
られる。形質転換された微生物は寒天板上に置かれ、そ
して抗生物質耐性（これは選択されたプラスミドおよび
使用される制限ヌクレアーゼにより決められる）に基づ
いて選択される。

インシュリン含有蛋白質を発現するクローンは免疫学的
試験を用いて選択される。これらクローンは繁殖され、
そして微生物塊を遠心分離して分離し、抽出しそしてイ
ンシュリン金屑を試験する。この方法において、培養溶
液２当り１インシュリン単位（＝１１υ）以上のインシ
ュリン値が１連のクローン中で測定されうる。

この培養溶液は猿のプロインシュリンそしてそれに続く
人間のインシュリンの調製にとっての出発物質として用
いられる。

本発明による方法は以下の様式で行われうる。

１、ＲＮ　Ａの単離 ａ）インシュリン産生性膵臓細胞の単離猿類好ましくは
赤毛猿あるいはマカク猿（ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）から滅
菌条件下に膵臓を得、そして皮および比較的大きい血管
を除去したのち、裁断器（カッター）を用いて機械的に
粉砕する。

こめ処理の際、そこに含有されているパンクレアチン酵
素混合物に由来する自然発生的な消化を阻止するために
、作業が行われている間は組織が冷たく保持されるのを
確実ならしめるための注意が払われるべきである。粉砕
された組織を冷たい哺乳類の血清好ましくは仔牛の血清
で数回洗い、そして小フラスコ中に入れそしてＰＢＳ中
の加温された０、１２５％の滅菌コラ−ゲナーゼ溶液で
処理する。コラ−ゲナーゼ溶液は消化に先立って常に新
しく調製されるべきである。コラ−ゲナーゼに２０％も
しくはそれ以上の血清、好ましくは仔牛の血清を同時に
添加することは膵臓からの細胞の収量にとって決定的で
ある。この混合物を１０分間撹拌しそしてすべての上澄
み液をはじめに捨てる。次いでコラ−ゲナーゼ／血清混
合物を再び加えそして生ずる混合物を約６〜１０分間撹
拌する。この過程を約１θ回くり返しそして消化された
生成物を冷却容器中に集める。酵素的に得られる細胞を
有する集められた物質を冷却遠心分離器中で約１０００
ｒｐ■で１０分間遠心分離し、上澄み液を捨てそして細
胞沈着物をグルコース１９７ｅおよび仔牛の血清２０％
を含有している新鮮なダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ）培地中に再懸濁させる。この遠心分離をくり返しそ
して得られる沈着物を添加血清！５％を含有しているダ
ルベツコ培地ｌ０ｚ（ｌ中に再懸濁させる。

β−細胞、線維芽細胞および上皮様細胞の混合物からな
るこの細胞物質を次いで例えばフィコール（Ｆｉｃｏｌ
１）あるいはパーコール（Ｐｅｒｃａｌ　１）の密度勾
配により分離する。フィコールの密度勾配がこの目的に
とって最良であると判った。

従って、フィコール４００（ファルマシア社製）を血清
を有しないダルベツコ培地中に溶解させ、そしてこの溶
液を屈折計中で粘度１．３８あるいはスピンドルの場合
密度１．１６に調節し、０．４５μの孔幅を有する膜濾
過器を用いて滅菌炉遇しそして使用されるまで４℃に保
持する。このフィコニルの原料懸濁液から、ダルベツコ
培地を添加することにより粘度１．３７３．１．３７０
および１．３６７２を有する異なる密度のものを調製し
、そして小さい遠心分離管中で順に積層する。再懸濁さ
れた膵臓細胞を上部に加えそして４℃で３２０Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心分離する。遠心分離ののち個々のバンド
を注意深く取得しそしてダルベツコ培地を用いて洗うこ
とにより残留フィコールを除去する。インシュリン産生
性β−細胞の主要部分は最低の密度および１Ｊ６７２の
粘度を有する最上層上に濃縮される。

ｂ）ＲＮＡの取得 得られた細胞を「変性作用媒質」（チオシアン酸グアニ
ジニウムについて４Ｍ１度、メルカプトエタノールにつ
いてＩＭ濃度、そして酢酸ナトリウムについて０．１５
Ｍａ度、ｐＨ５，５）中ニとりそして０℃で１分間ウル
トラーツラックス（Ｕｌｔｒａ　−Ｔｕｒｒａｘ）を用
いて均質化する。この溶液を８０℃で５分間加温しそし
て直ちに水浴中に入れる。

次いでこの溶液をｐＨ７，６、ＣｓＣ１２について５．
７Ｍ濃度、トリス−ヒドロキシアミノメタン（Ｔｒｉｓ
）についてｌＯミリモル濃度、そしてエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）について１０ミリモル濃度からなる
溶液（［クツションＪ）Ｆ＋１上に積層させそしてベッ
クマン（Ｂｅｃｋａａｎ）ＳＷ２７０−ターで２２，０
００ｒｐｍｌこおいて３６時間２０℃で遠心分離する。

文献中のデータに反して、続く反応段階においてｎＲＮ
Ａの可能な限り完全な分離を達成するために、溶解物（
１ｙｓａｔｅ）へのＣｓＣρの添加は回避されねばなら
ないことが見出された。遠心分離が終了した後、ポリア
ロマ−（Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ）小管を溶体窒素の中
で冷凍させ、モしてＲＮＡ沈殿が存在している小管の底
部を切り出す。Ｔｒｉｓについて１０ミリモル濃度、Ｅ
ＤＴＡについて１０ミリモル濃度および［ザルコシル（
５ａｒｃｏｓｙ１）Ｊ　（Ｎ−ラウリルザルコシンナト
リウム塩）について１％濃度であるｐｎｙ、ａの溶液中
に沈殿をとり、そしてこの懸濁液を２０．００Ｏｒｐｍ
で２０分間遠心分離する。得られる沈殿をもう一度同じ
緩衝液中にとり、６５℃に５分間加温しそして新たに遠
心分離する。合した上澄み液を酢酸ナトリウムについて
０．３Ｍ濃度となしく２．５倍量のエタノールを加え、
そして−２０℃で保管する。

２、ｌｌＲＮＡの取得 ＲＮＡを遠心分離によりエタノール性溶液から分離しく
２０，０００ｒｐ■、３０分、−５℃）そしてＮａＣＱ
　　Ｏ，５Ｍ濃度およびＴｒｉｓｌＯミリモル濃度ｐＨ
７，５の溶液中に溶解させる。この溶液を同じ緩衝液で
平衡化されているオリゴ−ｄＴ−セルロース−カラム（
Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社製、
３型）に充填し、ｐＨ７，６の１ミリモル濃度のＴｒｉ
ｓ溶液らしくは蒸留水を用いて溶離する。ポリ−Ａを含
有するＲ　Ｎ　Ａ　（ＩＲＮＡ）の溶離は２６０ｎｏ＋
での吸光測定により追跡されうる。かくして得られるＩ
ＲＮＡに酢酸ナトリウムを最終浸度０．３Ｍとなるまで
加え、２．５倍量のエタノールを加えそしてこの溶液を
一２０℃で保管する。

３、ｃＤＮＡの取得 ａ）−木組ｃＤＮＡの取得 ｍＲＮＡの相当するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への転移が逆転
写酵素を用いて行われる。培養バッチには以下のものが
包含される：　ｐＨ８，３、Ｔｒｉｓ　５０　ｍＭ１Ｍ
ｇＣＮ＊　　ｌ　Ｏ５Ｍ１２−メルカプトエタノール３
０ミリモル濃度、全４種の普通に存在するデオキシリボ
ヌクレオシド三燐酸（アデニン、グアニン、シトシンお
よびチミジンの相当する三燐酸）０　、５ｎＭ１オリゴ
ーｄＴ＋ｔ−＋ｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ社製品）１００μ９／峠、ポリアデニル化ＲＮＡ
約１０ｈ９／　ｘ（ｌおよび８００単位ＩＲＱ、の逆転
写酵素（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、社（Ｓｔ、
　Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、　ＵＳＡ）製品）。

反応を追跡するには、α−位が３！Ｐで標識されている
デオキシリボヌクレオシド三燐酸（比活性５０Ｃｉ／ミ
リモル）がバッチに加えられうる。

この混合物を４２℃で６０分間培養し、次いでＥＤＴＡ
２０ミリモルを添加することにより反応を停止させる。

この溶液を水で飽和したフェノールの同量で抽出し、こ
のフェノールをエーテルと振盪することにより抽出しそ
して残留エーテルを窒素を用いて蒸発させる。取り込ま
れなかったデオキシリボヌクレオシド三燐酸はｐＨ９゜
０、Ｔｒｉｓ　　ｌ　ＯｍＭ、　ＮａＣＱ　１００ｍＭ
およびＥＤＴＡＩＩＩＩＭの各濃度の溶液中セファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　５０でカラムクロマトグ
ラフィーすることにより分離される。溶離されたｃＤＮ
Ａは酢酸ナトリウムの０．３Ｍ１ｌ液および２．５倍量
のエタノールを添加することにより沈殿される。

遠心分離したのち、沈殿をＯ，１Ｍ　Ｎａ０Ｉ！溶液中
にとりそして７０℃で２０．分間培養するか、あるいは
０．３Ｍ　　ＮａＯＨ溶液中で室温で一夜培養する。こ
の混合物をＩＭＨｃ（！およびＩＭＴｒｉｓ溶液を用い
てｐＨ７，６となす。

ｂ）二重鎖ｃＤＮ＾（ｄｓＤＮＡ）の形成第二のＤＮＡ
鎖を合成するには、逆転写酵素あるいは酵素ポリメラー
ゼＩが再び用いられうる。

〔逆転写酵素を用いるｄｓＤＮＡの形成〕培養バッチ（
ｐＨ８Ｊ）はＴｒｉｓ　　５０ｍＭ、　ＭＭｇＣ１２ｔ
１０ａ、２−メルカプトエタノール３０１１上記４種の
デオキシリボヌクレオシド三燐酸０．５ｄ１ｃＤＮＡ　
５０１１９／　ｘ（ｌおよび逆転写酵素８００単位／Ｊ
ｌｆｆを包含している。反応は４２℃で１２０分間行わ
れ、そして最終濃度２０ｍＭとなるまでＥＤＴＡを添加
することにより停止される。続いてフェノール抽出およ
びセファデックスＧ５０でのゲル浸透クロマトグラフィ
ーが前述のようにして行われる。

〔ポリメラーゼ■を用いるｄｓＤＮＡの形成〕培養バッ
チ（ｐＨ６，９）はヘペス（Ｈｅｐｅｓ）　２００ｍＭ
１上記４種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸０．５ｍ
Ｍ％ＭｇＣ（Ｉｔ　　１０＋ａＭ、　　２−メルカプト
エタノール３０ｍＭおよびＫＣＱ７０ｍＭを包含してい
る。

培養バッチにｓｓｐで（α−位において）標識されたデ
オキシリボヌクレオチドを添加することにより反応は追
跡されうる。反応はポリメラーゼｌ８００単位／３１１
２を用いて開始されそして１５℃で２時間行われる。ド
デシル硫酸ナトリウム０．１％才、及びＲＮ　Ａ　１０
０ｕ９／Ｍ（ｌを添加することにより反応を停止させる
。この溶液を前記のようにして抽出する。抽出後に得ら
れる溶液をセファデックスＧ５０のカラムに充填し、そ
してＰＨ９，０、Ｔｒｉｓ　　１０　ｍＭ、　ＮａＣｌ
２１００ｍＭおよびＥＤＴＡ　ｌ　ｍＭからなる溶液を
用いてクロマトグラフィーを行う。溶離されたＤＮＡは
放射能により測定され得、そして０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよび２．５倍量のエタノールを添加することにより
沈殿される。エタノール沈殿物をＮａＣＱ　３００ｔａ
Ｍ、酢酸ナトリウム３０ｍＭおよびＺｎＣＱｔ　３　ｍ
Ｍの各濃度からなる溶液中（ｐＨ４゜５）にとりそして
１５００単位／ｉのＳｔヌクレアーゼ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を加える。反応は３７℃で１時間後に最
終濃度２０１ＭとなるまでＥＤＴＡを添加することによ
り終了される。続いてフェノールを用いる抽出およびエ
タノールを用いる沈殿が前記のようにして行われる。

ｃ）ｒｌボット法」におけるｃＤＮＡの取得前記されて
いる反応の代わりに、ｄｓＤＮＡはｍＲＮＡから「ｌボ
ット法」でも得られうる。この方法では、逆転写酵素の
反応は前述のようにして行われるが、１４０＋ｅＭのＫ
Ｃｌ２溶液も培養バッチに添加される。反応終了後、試
料を１００℃で４分間加熱しそして形成される沈殿を遠
心分離する。

同量の０．４Ｍのヘペス緩衝液（ｐＨ６，９）が上澄み
液に加えられる、その際上記４種のデオキシリボヌクレ
オチドが緩衝液中に０　、５ｍＭの濃度で存在している
。８００単位／　ｚ　（ｌのポリメラーゼＩを添加する
ことにより反応が前記のようにして１５℃で行われそし
てドデシル硫酸ナトリウムおよびＲＮＡの添加により停
止される。続いて３ｂ）の「ポリメラーゼＩを用いるｄ
ｓＤＮＡの形成Ｊに記載されているようにしてさらに操
作される。

４、ｄＣＴＰ（デオキシシトシン三燐酸）を用いるｃＤ
ＮＡの３′−末端の延長 上記４種のデオキシヌクレオチドの一つを用いるＤＮＡ
の３′−末端の延長はプラスミドへの組み込みにとって
必要である。さらに、切断されているプラスミドの３′
−末端は相捕的デオキシヌクレオチドを用いて延長され
る。ＤＮＡおよびプラスミドを一緒にすると、ＤＮＡと
プラスミドとの間に塩基の対合・が行われる。この再び
環状とされた分子は細菌の形質転換に使用されうる。ま
だ完結されていない結合は細菌中の酵素系によって共有
結合に変えられる。

例えば、ｃＤＮＡ３’−末端はｄＣＭＰ残基（デオキシ
シトシン−燐酸残基）を用いてそしてプラスミドはｄＧ
ＭＰ残基（デオキシグアニジン−燐酸残基）を用いて延
長されうる。これらデオキシヌクレオチドを前述の様式
で用いそしてプラスミドを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉにより開
環させると、外来ＤＮＡの組み込み後に、Ｐｓｔ　Ｉ解
裂部位がすべての挿入部位において新たに形成され、従
ってプラスミドの増大後に、挿入されたＤＮＡはさらに
吟味するために、限定酵素Ｐｓｔｌを用いて容易に再び
切断されうる。

Ｓｌヌクレアーゼを用いる崩壊後のアルコール沈殿から
の沈殿をＴｒｉｓ　３０　ｍＭ、　ＣｏＣ１２ｔ　１　
ｍＭ、カコジル酸カリウム　１４０５ＭおよびｄＣＴＰ
　１５０μ績、オートクレーブ処理されたゼラチン加水
分解物１００μ９／　ＩＩＱおよびジチオエリトリトー
ル０．１Ｍからなろ水溶液（ｐＨ６，７）中に溶解させ
る。反応を追跡するにはａｌｐで標識されたｄＣＴＰが
使用されるべきでる。反応は末端デオキシヌクレオチジ
ルートランスフエラーゼを添加することにより開始され
そして３７℃で１０分間行われる。

反応時間の経過後、試料を水中に置きそしてトリクロル
酢酸で沈殿されうる沈殿中での放射能測定により、取り
込まれたｄｃＭＰ残基の数を測定する。反応に際しては
、最初に存在していたヌクレオチドの約１０％が取り込
まれているべきである。そうでない場合は、さらに酵素
を添加することにより反応が継続されうる。あまりに多
数のｄＣＭＰ残基が添加された場合は、生ずる鎖は酵素
Ｓ１ヌクレアーゼを用いて短縮されうる。

５、ＤＮＡのプラスミド中への組み込み適当な環状プラ
スミド例えばｐＢＲ３２２を、プラスミド上の１配列の
みしか認識しない制限エンドヌクレアーゼを用いて切断
する。この解裂部位が強力なもしくは誘導性のプロモー
ターの後方にあるかそして／または抗生物質抵抗性が影
響されるように位置されているのが好都合である。

かかる方法で線状形となされたプラスミドが次いで４種
のデオキシヌクレオチドの１種により３′−末端にて延
長される。

これは例えば以下のようにし・て行われる。

プラスミド３０μ９をＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ
５０単位と共に、ＮａＣＱ　５０　ｍＭ、　Ｔｒｉｓ　
６−Ｍ、ＭｇＣＱ＊　６　ｓＭ、　　２−メルカプトエ
タノール６膳輩の各濃度およびゼラチン０．１ｗｇ／ｘ
（ｌを含有する溶液の存在下に３７℃でそしてｐＨ７，
５で４０分間培養する。続いて前記のようにしてフェノ
ールおよびエーテルを用いて抽出し、そして切断された
プラスミドを０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下にエタノ
ールを用いて沈殿させる。ｄＧＴＰ【デオキシグアニジ
ン玉燐酸）を用いるプラスミドの３′−末端の延長はｄ
ＣＴＰを用いるｃＤＮＡの前記された延長と同様にして
行われる。

延長されたプラスミド−ＤＮＡは次いでＮａＣｌ２０．
１Ｍ、　Ｔｒｉｍ　　ｌ　ＯｍＭおよびＥＤＴＡ　　ｌ
　ｍＭからなる溶液（ｐＨ８，０）中で延長された二本
鎖ｃＤＮ＾と混合し、５６℃に２分間加温し、４２℃に
２時間培養しそして次にゆっくりと室温まで冷却する。

かかる方法で得られる混成りＮＡは次に大腸菌の形質転
換Ｚこ使用される。

６、大腸菌における混成プラスミドのクローニング 細菌例えば大腸菌χ１７７６、を３７℃で光学濃度Ａ６
゜。；０．５〜０．６となるまで慣用の栄養培地５０ｍ
（ｌ中で生長せしめ、沈降させ、ｐＨ７，５の１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ溶液で１回洗い、次いでＣａＣＱ　＊７５
　ａＭＳＭｇＣ（ｈ　５　ａ＋ＭおよびＴｒｉｓ　５　
ｍＭのｆ！ｒｉ１１度であり、ｐＨ８，０の４０ｘｉ２
中に再懸濁しそして水中で２０分間培養させる。次いで
細胞を沈降させモしてＣａＣＱ、　　７５１１１Ｍ％　
ＭｇＣｌ２ｔ　　５ｍＭ、　Ｔｒｉｓ　　５Ｊの各濃度
である溶液（ｐＨ８，０）　２ｉ＋２中に再懸濁させる
。

次いでこの細菌懸濁液０．２ｘＱを混成りＮＡ溶液０．
１１１２と混合しそしてこの混合物を氷上で４５分間培
養させる。次いでこれを４２℃に９０秒間加温しそして
続いて栄養培地０゜２ｘ（Ｊと混合する。

この懸濁液５０μＱ〜７５μｇをテトラサイクリンおよ
びアンピシリンを包含している寒天プレート上に平らに
流しそして抗生物質抵抗について選別する。

７、インシュリン含有蛋白質を産生ずる菌株の単離 ＢｒｏｏｓｅおよびＧｌｌｂｅｒｔ両氏（ｒＰＮＡｓＪ
第７５巻第２７４６頁（１９７８））により開発された
試験システムを用いて、インシュリン含有蛋白質の発現
についてクローンを検査する。インシュリン含有蛋白質
を発現するクローンは放射性物質で標識された抗体がこ
れら蛋白質に結合する結果として、Ｘ線フィルムがこの
位置で黒ずむことを利用し、オートラジオグラフィーを
用いて検出されうる。

これにはニトロセルロースフィルター当り５０個までの
クローンとなるまで３７℃で２日間放置生長される。次
いでフィルターを１　ｍｇ／峠のりゾチームを包含して
いる寒天塊の上におく。インシュリン抗体で被覆された
ＰｖＣフイルムヲ細菌コロニーに適用しそして次いで４
℃で２〜３時間培養する。次いでｐｖｃフィルムを１３
１１で標識されたインシュリン抗体の溶液中で４℃で１
５時間培養する。この溶液の比活性は約Ｉ　Ｘ　１０　
”ｃｐＩＩｌ／　ｔｘＱＴ！あった。洗浄オヨヒ乾燥後
、このフィルムをオートラジオグラフィーにかける。

プレート上で免疫学的にインシュリンに反応するクロー
ンを慣用の栄養培地中で培養し、細菌を遠心分離し、抽
出しそしてそこで放射線免疫検定によってインシュリン
含量を試験する。

その際多数のクローンが培養溶液ＩＱ当りＩＩＵ（国際
単位）以上のインシュリン値を示す。

特許出願人　　ヘキスト・アクチーエンゲゼルシャフト
外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）猿類のｍＲＮＡを用いて調製された、猿類のプロイ
   ンシュリンのアミノ酸配列をコーディングするｃＤＮＡ
   。 ２）アミノ酸配列が猿類のプロインシュリンのＣ−ペプ
   チドのアミノ酸配列を包含している、特許請求の範囲第
   １項に記載のｃＤＮＡ。 ３）（ａ）猿類のｍＲＮＡを用いて調製された、猿類の
   プロインシュリンのアミノ酸配列をコーディングするｃ
   ＤＮＡおよび（ｂ）プラスミドから調製されるプラスミ
   ド。 ４）アミノ酸配列が猿類のプロインシュリンのＣ−ペプ
   チドのアミノ酸配列を包含している、特許請求の範囲第
   ３項に記載のプラスミド。 ５）猿類のプロインシュリンのアミノ酸配列を包含して
   いるポリペプチドの生合成のための遺伝情報を有する微
   生物。 ６）ポリペプチドが猿類のプロインシュリンのＣ−ペプ
   チドのアミノ酸配列を包含している、特許請求の範囲第
   ５項に記載の微生物。 ７）猿類の膵臓からＲＮＡを取得し、それからｍＲＮＡ
   を単離しそして後者を用いてそれ自体既知の方法でｃＤ
   ＮＡを調製することを特徴とする、猿類プロインシュリ
   ンのアミノ酸配列をコーディングするｃＤＮＡの製造方
   法。