NL8100718A - Microbiologisch gevormd polypeptide met de aminozuur-volgorde van menselijk interferon, dna en plasmiden, die deze volgorde coderen, microoerganismen, die deze genetische informaties bevatten en werkwijze voor het maken daarvan. - Google Patents

Description

vo 135¼ 3etr.: Microbiologisch gevormd polypeptide met de aminozuurvalgorde van. menselijk interferon, DM en plasmiden, die de'ze volgorde coderen, microorganismen, die deze genetische informaties "bevatten en werkwijze voor het maken daarvan.

Sinds meer dan 20 jaren is het bekend, dat interferon de virus-produktie remt. Onderzoekingen van de laatste jaren hebben verder uitgewezen, dat interferon ook de deldeling remt en vele reacties van het immunosyst eem reguleert JU. deze resultaten onderstrepen het grote 5 therapeutische belang van interferon.

De hoeveelheden interferon, die tot dusver voor wetenschappelijke en therapeutische onderzoekingen konden worden gebruikt, werden uit fibroblast- en lymfocytenculturen gewonnen. Meris er echter met beide methoden niet in geslaagd, grotere of ook slechts voor afzonderlijke 10 problemen toereikende hoeveelheden aan interferon te bereiden. Dit is te-‘ gelijkertijd de oorzaak ervoor, dat de kennis op het interferongebied - slechts zeer langzaam voortschrijdt en dat slechts zeer weinig van de dringend gewenste onderzoekingen op het kankergebied konden worden ‘uitgevoerd. Het is dus beslist nodig, nieuwe wegen bij de produktie 15 van interferon ia te slaan.

Sen dergelijke weg wordt gewezen door de onderhavige uitvinding.

Deze betreft de isolatie van nucleotidevolgorden, die de genetische code voor interferon bevatten, de synthese van DM met deze specifieke nucleotidevolgorden en de transfer van dit DM in een microorganisme 20 als gastheer, waarin de replicatie en vorming van dit DM plaatsvindt. , «v’Vl

De uitvinding betreft in het bijzonder de vorming van genen voor leucocyten-interferon, de transfer van deze genen in een microbe-gast-heer, replicatie van gastheer en genten expressie van het gen door de gastheer. Daarbij ontstaat interferon-proteïne met de voor dit proteïne 25 karakteristieke biologische en immunologische eigenschappen.

Voor het bereiken van het onderhavige doel kan men op de volgende wijze tewerk gaan, waarbij de aangegeven weg slechts een voorbeeld is . voor meerdere mogelijke.

Menselijk leucocyten-interferon houdende cellen werden gedena-30 tureerd en het RM als neerslag met een cesiumchloridecentrifugering gewonnen. Ha verder opnieuw neerslaan werd uit dit RM het mRM via een oligo-dT-cellulosekölam afgescheiden. Het gewonnen mRM werd met behulp van het enzym reverse—transcriptase tot een RM-DM-dubbelstreng -2- ge complet eer d. Ha afbraak van de RNAstreng werd de DNA-streng (het complementaire DMA = cDNA) met reverse-transcriptase of het enzym polymerase I tot een DNA-DNA-dubbelstreng (dsDNA) gecompleteerd.

Dit duhhelstrengige DHA moet nu in een piasmi de worden ingehouwd. Daartoe is een verlenging van het 3’-uiteinde van het DNA, h.v. met dCMP-resten, nodig. Het plasmide, h.v. pBR 322, werd met het restrictie-nuclease PstI opengeknipt en h.v. met dGMP-resten verlengd. Bij samen- voeging van het aldus verlengde DM met het passend verlengde plasmide vindt een hasenparing tussen DNA en plasmide plaats. Dit cirkelvormig gemaakte molecuul werd hierna in mieroörganismen (vooral "bacteriën, liefst E. coli als E. coli K 12 of X 1776) getransformeerd; de nog niet gesloten bindingen werden door de enzymen van het organisme covalent - ίλ* · verknoopt. De getransformeerde microörganismen werden op agarplaten uitgestreken en op antibioticaresistenties, die door het gekozen plasmide en het "gebruikte restrictienuclease zijn gegeven, geselecteerd.

Met behulp van immunologische en biologische proeven werden de clonen, die interferonhoudende proteïnen vormen, uitgezocht. Deze clonen werden gekweekt, de microörganismenmassa afgecentrifugeerd, geëxtraheerd en op interferongehalte nagegaan. De door ontsluiting van de interferon-producerende clonen gewonnen oplossing bevatte interferon-proteïne:.

Het onderhavige procédé kan op de volgende wijze worden uitgevoerd:

1. Werkwijze voor het isoleren van RNA

a) De winning van interferon-producerende lymfoblastoïde cellen. Cellen van de lymfoblastoïde cel^lijn namalvar werden op een g op zichzelf bekende wijze tot een celconcentratie van 1-6x10 o cellen/cm vermeerderd. Voor de interferoninductie werden de cellen in een vers medium opgenomen en bij een concentratie van 6 3 " 1 - 10 x 10 cellen/cm3 met Newcastle Disease Virus of Sendai-virus geïnfecteerd (multiplieiteit van de infectie: } 1,0).

Ha U-2U uren incuberen bij 37°C werden de cellen afgecentrifugeerd.

b) Winning van interferon-producerende leucocyten.

Voor het winnen van interferon-producerende leucocyten werden leucocytensuspensies uit het bloed van gezonde donoren gewonnen. Hiertoe werd de witte cellaag aan de grens tussen erythrocyten 8100718 -3- en serum ran gecentrifugeerde bloedmonsters in geschikte buffer-oplossingen gesuspendeerd en door gefraetioneerd sedimenteren, b.r. af zetten bij 1 g of laagtoerig centrifugeren ran erythrocyten en thrombocyten. gescheiden. Vervolgens verden de leucocyten in 5 een gebruikelijk roedingsmedium gesuspendeerd en als bovenbeschre- ren geïnduceerd.

c) Winning ran RNA

De verkregen cellen verden in een denaturerend medium, 4 M gua-nidiumthiocyanaat, 1 M mercapöëthanol, 0,15 M natriumacetaat met 10 pH 5,5, opgenomen en 1 minuut bij 0°C met een ultra-turrax gehomo geniseerd. Het hcmogenisaat verd 15 minuten bij ^°C met 20.000 tpm gecentrifugeerd.

De bovenstaande vloeistof verd vervolgens op een oplossing (kussen) van 5 cm-3 5,7 M CsCl, 10 mM tris-hydroxyaminomethaan (tris), 15 10 mM ethyleendiaminotetraazijnzuur (EDTA) met pH f,6 laagsgevijze aangebracht en in een Beckman-SW 27 rotor 36 uren bij 20°C en 22.000 tpm gecentrifugeerd.

Er verd gevonden, dat in.tegenstelling tot de opgave in de literatuur, een toevoeging van CsCl aan het lysaat moet vorden vermeden 20 cm een zo volledig mogelijke afscheiding ran het mRNA in de vol gende reactietrap te bereiken. Na afloop van het centrifugeren verden de polyallomeer-buisjes in vloeibare stikstof ingevroren en de bodem van de buisjes, vaarcrp zich een RNA-neerslag bevond, afgesneden. Het neerslag verd in een oplossing aan 10 mM tris, 25 10 mM EDTA en 1% "sarcosyl (N-lauryl-sarcosine-natriumzout) met pH 7,6 qpgenamen en de suspensie bij 20.000 tpm 20 minuten af gecentrifugeerd. Het verkregen neerslag verd nogmaals in dezelfde buffer opgencmen, 5 minuten op 65°C vervarmd en opnieuv gecentrifugeerd. De verenigde bovenstaande vloeistoffen verden met 30 natriumacetaat op 0,3 M natriumacetaat gebracht, met een 2,5-voudig volume aan ethanol gemengd en bij-20°C bevaard.

2. Winning van mRNA

Het RNA verd door afcentrifugeren uit de ethanoloplossing (20.000 tpm, 30 minuten, -5°C) afgescheiden en in 0,5 M NaCl, 35 10 mM tris met pH 7,5 opgelost. Deze oplossing verd op een oligo- dT-cellulosekolam (van Collaborative Research, type 3), die 8100718 -Ιμ- 5 met dezelfde "buffer was geëquilibreerd, aange"bracht en met 1 mM tris, pH 7,6 of gedestilleerd water geëlueerd. De elutie van · het poly-A-houdende RM (mRM) kan door extinctiemetingen bij 26ο nm worden gevolgd. Het aldus verkregen mRM werd met natriumacetaat tot 'een eindconcentratie van 0,3 M begiftigd, het 2,5-voudig volume aan ethanol toegevoegd en de oplossing bij 20°C bewaard.

3. Winning van cDM

a) Winning van enkelstrang-cDM

10 15 20 25 30 35

De transcriptie van.mRM naar het overeenkomstige DM (cDM) vindt plaats met behulp van het enzym Reverse Transcriptase.

Het incubatiemengsel bevatte: 50 mM tris, pH 8,3, 10 mM MgClg, 30 mM 2-mercaptoëthanol, 0,5' mM aan alle vier gebruikelijk voorkomende desoxyribonucleosidetrifosfaten (de trifosfaten van ade-nine, guanine, cytosine en thymidine), 100,ug/cm oligo-dT^^g van Boehringer Mannheim) ca. 100 jug/cm? gepolyadenyleerd RM en 800 eenheden/cm^ Reverse Transcriptase (van Life Science Inc., St. Petersburg, USA). Voor het volgen van de reactie kan een op de -plaats met 32 P-gemerkt desoxyribonucleosidetrifosfaat (specifieke activiteit: 50 Ci/mmol) aan het mengsel worden toegevoegd. Het mengsel werd 60 minuten bij k2°C geïncubeerd, waarna door een toevoeging van 20 mM EDTA de reactie werd afgebroken.

De oplossing werd met een gelijk volume met water verzadigde fenol geëxtraheerd, de fenol door uitschudden met ether verwijderd en resten ether met stikstof afgedestilleerd. Uiet ingebouwde desoxyribonucleosidetrifosfaten werden door een kolomchromatografie over Sephadex G50 in 10 mM tris, pH 9,0, 100 mM HaCl, 1 mM EDTA afgescheiden. Het geëlueerde cDM werd door een toevoeging van 0,3 M natriumacetaat en het 2,5-voudig volume ethanol neergeslagen.

Ha centrifugeren werd het neerslag in 0,1 M natronloog opgenomen en 20 minuten bij 70°C geïncubeerd of in 0,3 M natronloog \ een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het mengsel werd met 1 M zoutzuur en 1 M tris op pH 7,6 gebracht.

b) Vorming van dubbelstreng-cDM (ds DM) 8 1 00 7 1 8 -5-

Voor een. synthese van de tweede DHA-streng kan weder cm het enzym reverse transcriptase of het enzym polymerase I worden gebruikt. Vorming van dëDHA met reverse transcriptase:

Het incubatiemengsel met pH 8,3 bevatte 50 xnM tris, 10 mM MgClg, 5 30 mM 2-mercaptoëthanol, 0,5 mM van de bovengenoemde vier desoxy- 3 3 ribanucleosidetrifosfaten, 50 ng/cm cDHA en 800 eenheden/cm reverse transcriptase. De reactie werd 120 minuten bij U2°C uitgevoerd en door een toevoeging van EDTA tot een eindconcentratie van 20 mM afgebroken. Vervolgens werd met fenol geëxtraheerd en 10 de gelpermeatiechromatografie over sephadex G50 als bovenbeschre ven uitgevoerd.

Vorming van dsDITA met polymerase I:

Het incubatiemengsel met pH 6,9 bevatte 200 mM hepes, 0,5 mM van de bovengenoemde h desoxyribonucleosidetrifosfaten, 10 mM 15 MgClg, 30 mM 2-mercaptoethanol en TO mM KC1. Door een toevoeging van met 32 F-gemerkte des oxyribonuclêotideni- (op dec/-plaatsen) aan het incubatiemengsel kan de reactie worden gevolgd.

3

De reactie werd met 800 eenheden/cm polymerase! op gang gebracht en 2 uren bij 15°C uitgevoerd. Door een toevoeging van 0,1# na- 20 triumdodecylsulfaat en 100 /ig/cm BBA werd de reactie afgebroken.

*

De oplossing werd als bovenbeschreven geëxtraheerd. De na de extractie verkregen oplossing werd op een sephadex G50-kolom aan-gebracht en gechramatografeerd met 10 mM tris, pH 9,0, 100 mM FaCl en 1 mM EDTA. Het geëlueerde DMA kon door zijn radioacti-25 viteit worden bepaald en werd door een toevoeging van 0,3 natriumacetaat en het 2,5-voudig volume ethanol :neergeslagen.

Het ethanolneerslag werd in een oplossing met pH h,5 van 300 mM HaCl, 30 mM natriumacetaat en 3 mM ZnClg opgenomen en met 1500 eenheden/cm^ S1 nuclease (van Boehringer Mannheim) gemengd. De 30 reactie werd na 1 uur hij 3T°C door een toevoeging van EDTA tot een eindconcentratie van 20 mM afgebroken. Vervolgens werd met fenol geëxtraheerd en met ethanol als bovenbeschreven neergeslagen .

c) Winning van cDHA met een eenreactororoeëdé 35 Haast de beschreven reacties kan het dsDUA uit het mRUA ook 81 00 7 1 8 -6- met een eenreaetorprocédé worden gewonnen. Daarbij wordt de reactie van het reverse transcriptase als beschreven uit gevoerd, maar aan. hddacubatiemengsel wel nog lUo mM KC1 toegevoegd. Na afloop van de reactie werd het monster h minuten op 100 °C verhit en het 5 gevormde neerslag afgecentrifugeerd. Aan de bovenstaande vloeistof werd een gelijk volume 0,H M hepes buffer met pH 6,9 toegevoegd, waarbij de U desoxyribonucleotiden in de buffer in een hoeveelheid 3 van 0,5 mM aanwezig waren. Door een toevoeging van 800 eenheden/cm • polymerase I werd de reactie als beschreven bij 15°C uitgevoerd 10 en door een toevoeging van natriumdodecylsulfaat en RNA afgebroken.

Vervolgens werd als onder 3b) "Vórming van dsDNA met polymerase; I" verder gewerkt.

k.. Verlenging van de 3’-uiteinden van cDNA met .dCTE(desOxycytosine- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 8 1 00 7 1 8 trifosfaat). _- 2

Voor de inbouw in het plasmide ia de verlenging van het 3/-.

3 uiteinde van het DNA met een van de bovengenoemde U desoxynucleotiden 4 nodig. Voorts werden de 3’-uiteinden van het ópengeknipte plasmide met 5

het complementaire desoxynucleotide verlengd. Bij samenvoeging van DNA

6 en plasmide vindt dan een baseparing tussen DNA en plasmide plaats.

7

Dit weer cirkelvormig gemaakte molecuul kan voor het transformeren van 8 bacteriën worden gebruikt; de nog niet gesloten bindingen worden door 9 een enzymsysteem in het bacterieorganisme covalent verknoopt.

10 B.v. kunnen de 3 '-uiteinden van cDNA met dCMP-resten (desoxy- 11 cytosinemonofosfaatresten) en het plasmide met dGMP-resten (desoxy- 12 guard.dinemonofosfaat-resten) worden verlengd. Bij toepassing van deze 13 desoxynucleotiden op de beschrevén wijze en bij'openknippen van het 14 plasmide door het restrictie-enzym Pst I werd na inbouw van het vreemde 15 DNA een Pst I-splijtplaats op elke insertieplaats nieuw gevormd, zodat 16 na vermeerdering van het plasmide het geïnsereerde DNA voor verder 17 onderzoek gemakkelijk weer. met het restrict!eeenzym Pst I kan worden 18 uitsekniot. - 19

Het neerslas na toevoeging van alcohol na afbraak met S1 nuclease 20 werd in een waterige oplossing met τ>Η 6,7 “van 30 mM tris. 1 mM CoClg.

21 lilO mM kalium-cacodylaat j 150 p.z/ dCTP_j 100 ug ge autoclave er d gelatine- 22 hvdrolvsaat en 0.1 M' dithioervthritol oogelost. Voor het volgen van de -τ- reactie kan met 32 P-gemerkt cLCTP -worden gebruikt. De reactie wordt door een toevoeging van terminaal desoxynucleotidyl-transferase qp gang getracht en 10 minuten hij 37 °C uitgevoerd. Na afloop van de reactietijd werd het monster in ijs getracht en door een radioactivitexts-5 meting in het met tri chloor azijnzuur verkregen neerslag het aantal van de ingetouwde dCMP-resten bepaald. Bij de reactie moeten liefst ca. 10% van de oorspronkelijk aanwezige nucleotiden zijn ge-addeerd; wanneer dit niet het geval is, kan door een toevoeging van verder enzym de reactie worden voortgezet. Indien een te groot aantal 10 dCMP-r esten werd geaddeerd, kan de gevormde keten met tehulp van het enzym S1 nuclease worden ingekort.

5. Werkwijze voor het integreren van DM in een -plasmide.

Een geschikt circulair plasmide, t.v. pBR 322, werd met een restric-tieëndonuclease opengeknipt, dat slechts e'en volgorde op het plasmide 15 onderkent. Gunstig is het, wanneer deze splitsingsplaats achter een sterke of induceertare premotor ligt en/of zo gelocaliseerd is, dat èeh antihioticaresistentie wordt teinvloed.

Het aldus lineair gemaakte plasmide werd vervolgens aan de 3*-uiteinden met e'en van de vier desoxynucleotiden verlengd.

20 Dit werd t.v. als volgt uitgevoerd: 30 yug plasmide werd met 50 eenheden Pst I restrict!eëndonuclease tij aanwezigheid van 50 mM UaCl,

O

6 mM tris, 6 mM MgGl^, 6 mM 2-mercaptoëthanol en 0,1 mg/cm gelatine kO minuten tij 37 °C en een pH van 7,5 geincuteerd. Vervolgens werd met fenol en ether als beschreven geëxtraheerd en het opengeknipte plasmide 25 met ethanol tij aanwezigheid van 0,3 M natriumacetaat neergeslagen.

De verlenging van de 3’-uiteinden van het plasmide met dGTP (desoxy-guanidinetrifosfaat) vond plaats analoog de bovenbeschreven verlenging van cDM met dCTP.

Het verlengde piasmi de-DM werd hierna in een oplossing met pH 30 8,0 van 0,1 M HaCl, 10 mM tris en 1 mM EDTA met het verlengde ds cDM

gemengd, 2 minuten op 56°C verwarmd, 2 uren tij U2°C geincuteerd en daarna langzaam op kamertemperatuur af gekoeld. Het aldus verkregen hybride DM werd daarna voor het transformeren van E. coli gebruikt.

6. Clonering van hybrideplasmide in E. coli.

35 De bacteriën, t.v. E. coli X 1776, werden tij 37°C in 50 cm^ 8100718 -δ

van een gebruikelijke voedingsbodem tot een optische dichtheid van Agoo = 0,5 “ 0,6 gekweekt, gesedimenteerd, eenmaal met 10 mM tris , pH

7,5 gewassen, en daarna in 1+0 crn^ van een oplossing van 75 mM CaClg, 5 mM MgClo en 5 mM tris. met pH 8,0 hersuspendeerd. en 20 minuten in ijs ge- ^ 3

incubeerd. Daarna werden de cellen gesedimenteerd en in 2 cm 75 mM

CaCl5, 5 mM MgCl?, 5 mM tris met pH 8,0 hersuspendeerd.

3 0,2 cm van dezelbactenesuspensie werden daarna met 0,1 cm hybride-DITA-oplossing gemengd en. U5 minuten op ijs geïncubeerd.. Daarna o 3 werd 90 seconden op h2°C verwarmd en vervolgens met 0,2 cnr voedings- ιό 15 20 25 30 35 bodem gemengd. 50-75 mm van deze suspensie werden daarna op tetracycline en ampicillinehoudende agarplaten uitgestreken en op antibiotica-resistentie geselecteerd.

7. Isolatie van stammen, die interferonhoudende proteïnen produceren. a) Immunologische aantoning .

-Met behulp van een door Brocrne en Gilbert (PITAS 75., 2jk6, 1978) ontwikkeld proefsysteem werden de clonen op de produktie van interferonhoudende proteïnen onderzocht. Clonen die interferonhoudende proteïnen vormen werden door de binding van radioactieve antilichamen aan deze proteïnen met daaropvolgende autoradiografie daardoor onderkenbaar, doordat de röntgenfilm op deze plaatsen werd gezwart. Daartoe werden tot 50 clonen per nitrocellulosefilter 2 dagen bij 37°C gekweekt. Vervolgens werden de filters op een agarblok gelegd, dat 1 mg/cm lysozyme bevatte; op de bacteriekolonie werd een met interferon-antilichaam beklede FVC-folie aangebracht en daarna werd 2-3 uren bij 1+°C geïncubeerd. De PVC-folie werd vervolgens 15 uren bij 1+°C in een • oplossing van met 132 jodium gemerkt interferon-antilichaam ge- incubeerd. De specifieke activiteit van de oplossing bedroeg 6 3 ca. 1 x 10° cpm/cm · ÏTa wassen en drogen van de folie werd deze geautoradiografeerd. b) Biologische aantoning.

3 .....

De clonen werden in' 50 cm van een gebruikelijk voedmgsmedium een nacht bij 37°C gekweekt. Daarna werden de bacteriën gesedimenteerd, tweemaal met koude 10 mM tris, 30 mM NaCl met pH 8,0 gewassen en in 20$ saccharose in 30 mM tris met pH 8,0, 81 00 7 1 8 -9- 1 mM EDTA. her suspendeer d. Er werd vervolgens hij kamertemperatuur 10 minuten geschud, gesedimenteerd, in ijskoud water hersuspen-deerd en in een ij shad 10 minuten geïncubeerd. De bacteriën werden hierna gesedimenteerd en de bovenstaande vloeistof op een op zichzelf bekende wijze met een virus-remmingsproef op zijn gehalte aan interferonhoudend proteïne onderzocht.

8. Winning van interferon-proteïne.

De clonen, die bij de verschillende proeven een interferon-activiteit vertoonden, werden in een gebruikelijke voedingsbodem gekweekt, de bacteriën afgecentrifugeerd en met waterige buffers geëxtraheerd. De extractieoplossing bevatte het interferon-pro-texne.

8100718

Claims (8)

1. Microbiologisch gevormd polypeptide, dat dé aminozuurvolgorde van menselijk interferon geheel of gedeeltelijk, bevat.

2. Microbiologisch gevormd polypeptide volgens conclusie 1, dat de aminozruurvolgorde van menselijk leucocyteninterferon geheel of ge- 5 deeltelijk bevat. 3. cDNA, die de aminozuurvolgorde van menselijk interferon volgens conclusies 1-2 codeert, verkregen met mRNA uit menselijke leucocyten-cellijnen. b. Piasmi de, dat de aminozuurvolgorde van menselijk leucocyten- 10 interferon volgens conclusies 1-2 codeert, verkregen uit het cDNA volgens conclusie 3 en een plasmide, liefst het piasmide pBR 322.

5. Mier oor ganisme, liefst E. eoli met de genetische informatie voor de biosynthese van het polypeptide volgens conclusie 1 of 2.

6. Werkwijze voor het bereiden van het polypeptide volgens conclu-15 sies 1-2, met het. kenmerk, dat men de genetische informatie voor de biosynthese van het polypeptide met leucocyten mRNA. wint, het verkregen gen op een op zichzelf bekende wijze in microSrganismen brengt en die microörganismen op een op zichzelf bekende wijze uitselecteert en cultiveert, die dit polypeptide produceren.

20 J. Werkwijze voor het bereiden van cDNA volgens conclusie 3» met het kenmerk, dat men uit leucocyten RNA wint, daaruit het mRNA isoleert en hiermede op een op zichzelf bekende wijze cDNA vormt.

8. Werkwijze voor het bereiden van het plasmide volgens conclusie b, mt het kenmerk, dat men een plasmide,liefst het plasmide pBR 322 met 25 het cDNA volgens conclusie 3 combineert..

9. Werkwijze voor het vormen van een microörganisme volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een microörganisme, liefst E. coli met een plasmide volgens conclusie k transformeert.

10. Werkwijze voor het winnen van RNA, met het kenmerk, dat men een 30 cesiumchloride-vrij lysaat op een waterige geconcentreerde cesium- chlorideoplossing als een laag aanbrengt, centrifugeert en het RNA wint. 8100718