JPS62502656A - Ｄｎａ配列体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ配列体 本発明は、望ましいポリペプチドをコードするプラスミドまたは他の複製可能な りローニング媒体への導入を意図するＤＮＡ配列体に関する。

望ましいポリペプチドまたはたんばく質の生合成的生産方法においては、望まし いポリペプチドまたはたんばく質をコードするプラスミドまたは同様の発現ベク ターを用いて形質転換させた微生物を使用し、この微生物を適当な基質を用いて 培養して、この薇生物に望ましいポリペプチドまたはたんぽ、く質を生産させ、 この望ましいポリペプチドまたはたんばく質を既知法によって発酵溶液から分離 することが知られている。これに適した微生物には大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）が ある。

プラスミドまたは同様の発現ベクターは、例えば、関与している微生物中で機能 するプラスミドから、これを酵素開裂し、それから、このプラスミドに既知の組 換え法によって望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡ配列体を導入して、合 成的μたは半合成的に製造できる。

望ましいポリペプチドをコードするＤＮＡ配列体に加えて、機能するプラスミド は、ＲＮＡポリメラーゼが結合しコードＤＮＡ配列体の転写を開始してｍＲＮＡ を形成するプロモーター領域をも゛含んでいなければならない。このｍＲＮＡは 、それから、リポソーム上での翻訳によって望ましいポリペプチドへ翻訳される 。

プロモーター領域の後には、しばしばシャインーダルガルノ（Ｓ　ｈｉｎｅ　Ｄ 　ａｌｇａｒｎｏ　）領域と呼ばれるリポソーム結合部位が続いている。この領 域は、好ましくはヌクレオチド配列ＡＧＧＡを包含するＳＤ配列を含む。

既知の組換え法によるプラスミドの形成を可能にするためには、プロモーター領 域は、酵素開裂と実際のＤＮＡ配列体の導入とを起こす制限酵素開裂部位を含ま なければならない。

更に、通常は、その微生物を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子を導入す る。これらには例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはストレプトマイシン耐性 遺伝子がある。耐性の形質転換された微生物は、この抗生物質を用いて、形質転 換されていない微生物から分離できる。

望ましいたんばく質を高収率で生産するためには、次の条件を満たすことが重要 である。

１、　プロモーター中のポリメラーゼ結合部位は、ＲＮＡポリメラーゼの最適な 結合を促進する構造を持たなければならない。

２、リポソーム結合部位は、リポソームに効果的に結合する相補的ｍ　ＲＮ　Ａ の形成を可能にする最適構造を持たなければならない。

本発明の目的は、複製可能なりローニング媒体へ導入されたとき、ｍＲＮＡのリ ポソームへの良好な結合を確実にし、従って、望ましいたんばく質を提供する効 果的な翻訳をも確実にするリポソーム結合部位をコードするＤＮＡ配列体を提供 することである。

本発明の他の目的は、望ましいたんばく質の発現のために使用されるプラスミド または他の転移ベクター中のリポソーム結合部位の構成を、翻訳の収率を改良す るために変化させることである。

種々の微生物におけるリポソーム結合部位のＤＮＡ構造がこれまでに調べられて おり（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

（１９８２）　１０．６３１．９−６３２９）　、この構造の種々の変化が翻訳 結果に及ぼす影響が調べられている。

リポソーム結合部位は、しばしばヌクレオチドＡＧＧＡから構成されるＳＤ配列 を包含する。この配列とメチオニンをコードする開始コドンＡＴＧの間には、複 数のヌクレオチドまたはスペーサー領域があり、その構成と大きさは翻訳の効率 に影響を与える。

本発明はこのスペーサー領域の構成と大きさの重要性の試験に基づいている。従 って、本発明によって、リポソーム結合部位が関連するＳＤ配列および開始コド ンと共に請求の範囲第１項に記載する式を有する場合に、最適な翻訳が得られる ことが見出された。９本発明の好ましい具体例によれば、このＤＮＡ配列体は、 最適な翻訳速度と翻訳収率とを提供する請求の範囲第２項から第７項までのいず れか１項に記載する構成を有する。

ここに述べる効果は、前掲の文献などのこれまでの研究に基づいては予測できな かった。

本発明の新規なりＮＡ配列体は、既知の組換え法によって、発現される遺伝子と 共にプラスミドなどの通常の複製可能なりローニング媒体へ導入でき、それから 、このクローニング媒体は、既知法によって、基質を用いる培養によって望まし いたんばく質を生産する微生物へ移転できる。

このＤＮＡ配列体は、どのようなたんばく質の生産を望むかに関係なく、任意の 複製可能なりローニング媒体と関連させて使用できる。従って、この配列体は、 インシュリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロンまたは他の任意の望ましい ポリペプチドまたはたんばく質をコードするプラスミドと関連させて使用でき、 これらの全ての場合において、得られる生産収率は驚く程に改良される。

リポソーム結合部位の効果に対しては、複製可能なりローニング媒体が有する他 の構造は重要でない。クローニング媒体に抗生物質耐性遺伝子を導入することが 望ましい場合には、その型は、形質転換された微生物を形質転換されていない微 生物から効果的に分離できるように自由に選択できる。

プロモーターは、最適な転写を達成するようにその構成を選ぶ。適当なプロモー ターは例えば次のＤＮＡ配列体である。

Ａ）　ＢａｍＨＩ ｃｏＲＩ ｇｌｎ ｉｎｄｍ ＨｉｎｄＩＩＩ ＴＴＡＡＧＣＴＴ これらの式においては中鎖（＋　５ｔｒａｎｄ　）のみを示した。

以下でも特に断わらない限り中鎖のみを示す。

次に、具体例によって本発明をより詳細に説明する。

例Ｉ　ＳＤ配列体ＡＧＧＡと ＳＤ配列体ＴＡＡＧＧＡＧＧＴとの比較合成プロモーターの制御下でＭｅｔ−ｈ ＧＨを発現するプラスミドを次のように構築した。

Ｍｅｔ−ｈＧＨをコードする配列体と翻訳停止シグナル、並びに、ｈＧＨ配列体 に対する２塩基５′および６非翻訳塩基３′を、制限酵素Ｃ１ａｌ／ＳｍａＩを 用いてプラスミドｐＨＤ５９−１０から切断し、ゲル電気泳動によって分離した 。

特にＥｃｏＲＩ中心、ＲＮＡポリメラーゼ結合中心、リポソーム結合中心および Ｃ１ａｌ中心を含んで、合成りＮＡ断片を構築した。

このプロモーターＳＰ３は次のようなヌクレオチド配列を有している。

ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＡＧＡＧＣＴＣ ＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣ ＴＴＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＣＧＡＴ 発現させる遺伝子中の翻訳停止シグナルの後に導入した転写ターミネータ−は、 転写停止時に他の遺伝子やＤＮＡ複製の調節領域および開始領域の読取りを防ぎ 、従ってそれらによる干渉を防ぐので、有利であることが文献から知られている 。そのようなターミネータ−には、例えば、ファージｆｄ由来のターミネータ− がある（ＲｏＧｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

ｆｄターミネータ−を含む約３７５ｂｐのＨｉｎｄ■断片を分離し、タレノウ　 ポリメラーゼとｄＮＴＰとによってブランド　エンドを形成した。それから、こ の断片を制限酵素ＢａｍＨＩを用いて切断し、プラント５′末端と３′末端にＢ ａｍＨ１オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）とを伴う約３６５ｂｐの断片を分 離した。

上述の３つの分離した断片をプラスミドｐＡＴ１５３に連結させ、これを、Ｅｃ ｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断した。

このようにして、ｈＧＨ生産は合成プロモーターに従属となった。ここで構築し たプラスミドをｐＨＤ６７ｓＰ３と称する。

連結混合物を用いて既知法により大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。クローン ｐＨＤ６７１１ｓＰ３を選び、アンピシリンと混合した１０ｍのＬＢ媒質中で培 養した。８時間成長させた後、細胞を収穫し、超音波処理によって溶菌させ、Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡ　（Ｂ、　Ｄｌｎｅｓｅｎ　ａｎｄ　Ｈ，Ｄａｌｂｐｇｅ　Ａｎｄ ｅｒｓｅｎ、−Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　１６３．　 １１９−１２５　（１９８４）　）およびＲＩＡによってｈＧＨ免疫反応性ペプ チドの含有量を分析した。

脳下垂体ｈＧＨ，ナノルモン（Ｎ　ａｎｏｒｍｏｎ■）とＨＤ６７−１１　８Ｐ ３の培養によって生産したＭｅｔ−ｈＧＨとのＲＩＡおよびＥＬ　Ｉ　ＳＡの結 果を比較したところ、それらが並行して希釈されることが示された。ＨＤ６７１ １ＳＰ３からの溶菌物を、一部を純粋な溶菌物として、一部をナノルモン■と混 合した溶菌物として、ＨＰＬＣで分析した。両方の場合にｈＧＨのピーク特性が 得られた。生成物を精製した後、最初の１５のアミノ酸を自動エドマン分解によ って決定しくＰ、Ｅｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｂｅｇｇ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１゜８０−９１　（１９６７）　）　、Ｍ　ｅ　ｔ　−ｈ　Ｇ　Ｈに対す るアミノ酸配列と同一であることを見出した。

生産した細菌のＭｅｔ−ｈＧＨの生物活性を脛骨試験によって調べた結果、それ がナノルモン■の活性に相当することが見出された。

修正したＳＤ配列体の効果を調べるために、プラスミドｐＨＤ６７１１ｓＰ３を 制限酵素Ｈｉｎｄｍ／Ｃ１ａｌを用いて切断し、その本来のＳＤ領領域除去を可 能にした。その代わり、配列、 ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＣ を有する合成りＮＡ断片を導入し、プラスミドｐＨＤ６７１１ＳＰ１４を得た。

得られたプラスミドを用いて既知法により大腸菌ＭＣ１０６１を形質転換した。

クローン　ｐＨＤ６７１１ｓＰ１４−１を選び、アンピシリンと混合した１０ｍ ｚのＬＢ媒質中で培養した。８時間成長させた後、細胞を収穫し、超音波処理に よって溶菌させ、ＨＤ６７１１３Ｐ３と同様の分析を行った。

ＨＤ６７１１ＳＰ３とＨＤ６７１１ＳＰ１４−１の発現レベルを測定した。その 結果を第１表に示す。ＨＤ６７１１ＳＰ３と比較して、ＨＤ６７１１ＳＰ１４の 発現レベルが約１０倍高いことが見出された。

第１表 ＳＤ−ｍｇｈＧＨ／ プロモーター　ＡＴＧ　配列　１０ＤＩＳＰ１４−１　１１　ＡＧＣＴＴＡＡＧ ＧＡＧＧ−１０ＤＮＡ配列分析では、プロモーター　シャインーダルガルノ領域 を対照として測定した。

ＰＩ　２　Ｓ　Ｄ　−Ａ　Ｔ　Ｇ距離がＭｅｔ−ｈＧＨ発現に及ぼす影響の試験 ＳＤ配列体ＴＡＡＧＧＡＧＧＴはそのままで、ＳＤ領領域第■表に示す種々の長 さの合成りＮＡ断片の導入によって変化させて、ＡＧＧＡとＡＴＧと間の最適な 距離を調べる試験を、プラスミド　ｐＨＤ６７１１ｓＰ１４を出発物質として使 用して行った。プラスミド　ＨＤ６７１１ＳＰ１４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ Ｃ１ａｌを用いて切断し、そのプラスミド断片をゲル上で精製した。

８の合成りＮＡ断片を第■表に示すようにプラスミドに連結させ、表中に示す構 造を得た。

大腸菌ＭＣ１０６１の形質転換を行い、クローンの選別を行った後、これらをア ンピシリンと混合したＬＢ媒質中で培養した。１６時間成長させた後、細胞を収 穫し、超音波処理によって溶菌し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによってｈＧＨの含有量を分 析した。第■表および第１図に見られるように、５Ｄ−ＡＴＧ距離が１０塩基と １２塩基の間のときに、Ｍｅｔ−ｈＧＨが最大に発現された。

全てのＤＮＡ配列を分析し、それが予期されたものであることを確認した。

第■表 ５Ｐ６−５　１３　ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−８，４ＴＡＴＡＡＡＴＴＣＧ ＡＴＧ ＳＦ３−１０　１．２　ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−８，９３Ｐ１３−２　９ 　ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴ−７，７ＳＰＩＩ−６６ＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧ ＧＴ−４，４例３　ＭＡ、Ｅ−ｈＧＨ，ＭＡＥＡＥ−ｈＧＨ，および、ＭＡＥＥ −ｈＧＨの発現 プロモーターが、Ｍｅ　ｔ−ｈＧＨ以外の遺伝子の発現にも使用できるかどうか を調べるために、Ｍｅ　ｔ−Ａｔ　ａ−Ｇｌｕ−ｈＧＨ，Ｍｅ　ｔ−Ａ　ｌ　ａ −Ｇ　１　ｕ−Ａ　１　ａ−Ｇ　１　ｕ−ｈＧＨおよびＭｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−ｈＧＨに対する遺伝子を、既知のＤＮＡ技法を使用して、プロモータ ー５Ｐ１３を含むプラスミドへ導入した。

これらのプラスミドを用いて大腸菌ＤＭ１０６１の形質転換を行った後、例２と 同様に培養し溶菌して、ＥＬ　Ｉ　ＳＡによりｈＧＨ生産を測定した。得られた 収率を第■表に示す。

〜ＩＡＥ−ｈＧＨ１０ ＭＡＥＡＥ−ｈＧＨ８ ＭＡＥＥ−ｈＧＨ８，５ ｍｇ　ｈＧ’ｒ−１ＡＯＤ　ｉ 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、次の配列：【配列があります】 ［式中、Ｙ１…Ｙｍは一つまたはそれ以上の制限酵素部位を有するプロモーター を表わし、ｍはプロモーター中の塩基対の数に対応する整数であり、それぞれの Ｘ並びにＺ、ＶおよびＷはヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＴの任意の一つであり 、ｎは３から１２までの整数である、ただし、配列Ｘ１…Ｘｎは開始コドンを含 んではならない］ で表わされるヌクレオチド配列体からなることを特徴とするＤＮＡ配列体。
2. ２．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、次の配列：【配列があります】 ［式中、配列Ｙ１…Ｙｍは一つまたはそれ以上の制限酵素部位を有するプロモー ターを表わし、ｍはプロモーター中の塩基対の数に対応する整数であり、それぞ れのＸはヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣまたはＴの任意の一つであり、ｎは３から１０ までの整数である、ただし、配列Ｘ１…Ｘｎは開始コドンＡＴＧを含んではなら ない］ で表わされるヌクレオチド配列体からなることを特徴とする、ＳＤ配列ＡＧＧＡ および開始コドンＡＴＧを伴うリボソーム結合部位を包含する請求の範囲第１項 記載の合成ＤＮＡ配列体。
3. ３．ＤＮＡ配列体におけるＹ１…Ｙｍの＋鎖が、次のヌクレオチド配列体： Ａ）【配列があります】 からなることを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列体。
4. ４．ＤＮＡ配列体におけるＹ１…Ｙｍの＋鎖が、次のヌクレオチド配列体： Ｂ）【配列があります】からなることを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮ Ａ配列体。
5. ５．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、式、【配列があります】 ［式中、それぞれのＸおよびｎは請求の範囲第１項で定義したとおりである］ を有する配列体を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列体。
6. ６．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、式、【配列があります】 を有する配列体を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列体。
7. ７．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、式、【配列があります】 を有する配列体を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列体。
8. ８．ＤＮＡ配列体における＋鎖が、式、【配列があります】 を有する配列体を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列体。
9. ９．請求の範囲第１項から第８項までのいずれか１項に記載するＤＮＡ配列体と 望ましいたんぱく質をコードする遺伝子とを含み、場合によっては、その後に翻 訳停止シグナルが続くことを特徴とする複製可能なクローニング媒体。
10. １０．請求の範囲第９項に記載する複製可能なクローニング媒体を含むことを特 徴とする微生物。