KR20230167614A - 증가된 아디프산 생산능을 갖는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 아디프산을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
증가된 아디프산 생산능을 갖는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 아디프산을 생산하는 방법을 제공한다.
Description
증가된 아디프산 생산능을 갖는 재조합 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 아디프산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
아디프산(adipic acid)은 탄소 6개로 이루어진 디카르복실산이며 분자량이 146.14이다. 아디프산은 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine)과 아마이드 결합을 통해 폴리아마이드 형태인 나일론 6,6를 만드는 소재로 이용되는 물질이다. 또한 아디프산은 아디프산 세미알데히드(adipic acid semialdehyde)와 6-아미노카프로산(6-aminocaproic acid)을 거쳐 나일론 6의 소재인 카프로락탐(caprolactam)으로 전환될 수 있다. 아디프산은 나일론 6,6 및 나일론 6 외에도 다양한 섬유소재를 만드는 데에 이용된다.
산업 공정에서 아디프산은 주로 사이클로헥사논(cyclohexanone)과 사이클로헥사놀(cyclohexanol)의 혼합물의 산화 반응에 의해 생산된다. 또한 지방 및 장쇄(long chain)의 오일로부터 지방산 대사경로에서 주로 사용하는 ω-산화(oxidation) 반응을 통해 장쇄의 디카르복실산을 만들고, 이를 β-산화 반응을 통해 아디프산으로 합성하는 반응도 알려져 있다.
그러나, 상기한 종래 기술에도 불구하고 아디프산 생산능이 증가된 미생물 및 그를 이용한 아디프산 생산방법에 대한 요구가 있다.
일 양상은 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 및 비히클 또는 부형제를 포함하는 아디프산을 생산하는데 사용하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 양상은 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification) 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 미생물에 도입하는 단계를 포함하는, 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)는 ATP 존재하에서 판토테네이트(비타민 B5)를 인산화시켜 4'-포스포판토테네이트로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 판토테네이트 키나제는 EC 2.7.1.33에 속하는 것일 수 있다. 상기 판토테네이트 키나제는 CoA 생합성에 있어서 율속 단계일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)는 아세테이트, CoA, 및 ATP로부터 아세틸-CoA, 피로포스페이트 및 AMP 형성을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 아세틸-CoA 신테타제는 EC 6.2.1.1에 속하는 것일 수 있다.
상기 유전자는 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 재조합 미생물의 게놈 또는 게놈 외에 존재하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절서열은 폴리뉴클레오티드로부터 상기 단백질을 생합성 또는 생산하는데 있어서 필요한 서열일 수 있다. 상기 조절서열은 전사 조절서열, 번역조절서열, 및 번역 후 수식 조절서열일 수 있다. 상기 조절서열은 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터, 인핸서, 리보좀 결합 자리, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조절서열은 상기 재조합 미생물이 재조합되기 전에 내재적으로 존재하는 것 또는 외래 조절서열일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 복수 개의 카피로 상기 세포에 포함된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 2 이상, 5 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상, 2 내지 1000, 2 내지 500, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 10, 2 내지 5, 5 내지 100, 5 내지 50, 5 내지 10, 5 내지 100, 5 내지 10, 10 내지 100, 또는 10 내지 50 개 카피로 상기 세포에 포함된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 조절서열과 발현 가능하도록 연결된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 내재적 폴리뉴클레오티드 발현에 비하여 증가된 수준으로 발현되도록 하는 조절서열에 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 내재적 프로모터에 비하여 더 강한 전사 개시능을 갖는 프로모터에 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 유전자는 T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 유전적 변형(genetic modification) 방법에 의하여 재조합되기 전의 미생물 세포에 도입된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 형질변환, 형질도입, 트란스펙션, 또는 전기충격(electroporation)에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합되기 전의 미생물 세포내의 유전자를 유전자 교정(gene editing)하여 생성될 것일 수 있다. 상기 유전자 교정은 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 유전자 교정과 같은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 미생물은 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE), 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자, 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및 숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA)는 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있다.
아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB)는 2개 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA와 CoA로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 이 효소는 EC 2.3.1.9에 속하는 것일 수 있다.
알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE)는 아세틸-CoA를 NADH를 사용하여 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다.
숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD)는 ADP, 포스페이트 및 숙시닐-CoA를 ATP, CoA 및 숙시네이트로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 이 효소는 EC 6.2.1.5에 속하는 것일 수 있다.
숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1)는 아세틸-CoA 및 숙시네이트를 아세테이트 및 숙시닐-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 이 효소는 EC 2.8.3.18에 속하는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 아세틸-CoA와 숙시닐-CoA로부터 아디프산을 합성하는 생합성 경로를 포함하는 것일 수 있다.
상기 생합성 경로는 외래 생합성 경로가 도입된 것일 수 있다. 상기 생합성 경로는 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase), β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase), 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase), 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase), 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8), 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자, 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaF 유전자일 수 있다. β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaJ 유전자일 수 있다. 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaH 유전자일 수 있다. 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자는 Treponema denticolar 유래 tdTer 유전자일 수 있다. 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)을 코딩하는 유전자는 Mus musculus 유래 acot8 유전자일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 paaJ, paaH, 및 acot8 유전자는 제1 벡터에 포함되어 있고, 상기 cat1, paaF 및 tdTer 유전자는 제2 벡터에 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 제1 벡터 및 제2 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합 미생물에 있어서, panK 유전자가 포함되는 경우, 상기 cat1, paaF, tdTer 및 pank 유전자는 제2 벡터에 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물에 있어서, acs 유전자가 포함되는 경우, 상기 cat1, paaF, tdTer 및 acs 유전자는 제2 벡터에 포함되어 있는 것일 수 있다. 제1 벡터 및 제2 벡터는 동일하지 않은 것일 수 있다. 제1 벡터 및 제2 벡터는 pRSFDuetTM-1 또는 pCDFDuetTM-1 벡터일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 Escherichia 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 대장균일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 대응하는 유전적 변형이 없는 미생물에 비하여 증가된 아디프산 생산능을 갖는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 아디프산 생합성 경로를 구성하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 또는 아디프산을 분해하는 대사 경로가 약화된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 아디프산 생합성 경로를 구성하는 하나 이상의 유전자의 카피 수의 증가일 수 있다. 상기 유전적 변형은 아디프산 생합성 경로를 구성하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 조절서열의 변형일 수 있다.
도 1은 pank 유전자 및 acs 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하고 아디프산 생합성 경로가 도입된 아디프산 생합성능이 증가된 재조합 미생물의 대사 경로를 나타낸 도면이다. 도 1은 예시적인 것으로 청구발명에 도 1의 기재의 예로만 한정되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 및 비히클 또는 부형제를 포함하는 아디프산 생산에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 고체, 액체, 점성 형태 또는 에어로졸로 존재하는 것일 수 있다. 상기 비히클 또는 부형제는 상기 미생물을 배양에 사용되는 배지, 버퍼, 또는 보관 용액일 수 있다. 상기 비히클 또는 부형제는 냉동 보존제, 예를 들면 DMSO 등일 수 있다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물을 포함하는 아디프산 생산에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기한 재조합 미생물을 아디프산 생산에 사용하데 필요한 용기, 배지, 시약, 또는 설명서를 포함할 수 있다.
다른 양상은 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification) 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 미생물에 도입하는 단계를 포함하는, 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 미생물은 Escherichia 속에 속하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE), 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자, 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및 숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 아세틸-CoA와 숙시닐-CoA로부터 아디프산을 합성하는 생합성 경로를 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 생합성 경로는 외래 생합성 경로일 수 있다. 상기 생합성 경로는 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase), β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase), 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase), 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase), 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8), 또는 그 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자, 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 상기 미생물에 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaF 유전자일 수 있다. β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaJ 유전자일 수 있다. 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaH 유전자일 수 있다. 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자는 Treponema denticolar 유래 tdTer 유전자일 수 있다. 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)을 코딩하는 유전자는 Mus musculus 유래 acot8 유전자일 수 있다.
다른 양상은 상기한 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 아디프산을 생산하는 방법을 제공한다.
아디프산을 생산하는 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및 제조된 상기 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 아디프산을 생산하는 방법을 제공한다.
재조합 미생물을 제조하는 단계에서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 상기 미생물로 도입하는 것일 수 있다. 상기 도입은 알려진 방법, 예를 들면, 형질전환, 형질도입, 트란스펙션, 전기충격 등의 방법에 의한 것일 수 있다. 또한, CRISPER9과 같은 유전자 편집 기술을 이용하여 도입된 것일 수 있다.
상기 배양은 상기 재조합 미생물 및 배지를 포함하는 혼합물을 재조합 미생물이 성장하고 아디프산을 생산하기에 적합한 조건에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 선택된 재조합 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양은 숙신산, 판토텐산, 그의 염 또는 그 조합으로 보충된 배지 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 배지는 숙신산, 또는 그의 염을 10mM 내지 100mM, 20mM 내지 80mM, 30mM 내지 70mM, 40mM 내지 60mM, 45mM 내지 55mM, 또는 약 50mM의 농도로 포함할 수 있다. 상기 배지는 판토텐산, 또는 그의 염을 1mM 내지 10mM, 2mM 내지 8mM, 3mM 내지 7mM, 4mM 내지 6mM, 4.5mM 내지 5.5mM, 또는 약 5mM의 농도로 포함할 수 있다.
상기 배지는 선택되는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 포함할 수 있다.
상기 배양의 조건은 선택되는 아디프산 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 없이 또는 교반과 함께 수행될 수 있다. 상기 배양은 배치(batch), 페드 배치 또는 연속식적으로 배양되는 것일 수 있다. 연속식 배양은 배양물 중 미생물 또는 상등액의 일부를 제거하면서 배지를 보충하면서 연속적으로 배양하는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 아디프산을 아디프산 결합 단백질과의 복합체의 형태로 세포외로 분비될 수 있어, 배양물로부터 세포를 제거한 상등액으로부터 분리할 수 있다.
용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다.
상기 방법은 상기 아디프산을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 아디프산을 분리하는 단계는 세포를 파쇄하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 아디프산을 분리하는 단계는 배양물로부터 상등액을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 상기 상등액으로부터 상기 아디프산을 분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리하는 단계는 상기 배양과 동시에 수행되는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 Escherichia 속인 것일 수 있다. Escherichia 속 미생물은 E. coli 일 수 있다.
다른 양상은 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE) 유전자, 및 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및 숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase, paaF) 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase, paaJ) 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase, paaH) 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase, tdTer) 유전자, 및 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8, acot8) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 아디프산 생산능을 갖는 대장균을 제공한다.
일 양상에 따른 재조합 미생물은 아디프산을 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 아디프산을 생산하는데 사용하기 위한 조성물 및 키트는 아디프산을 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 아디프산을 생산하는 방법에 의하면, 아디프산을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 pank 유전자 및 acs 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하고 아디프산 생합성 경로가 도입된 아디프산 생합성능이 증가된 재조합 미생물의 대사 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 제1 벡터 "pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8"의 구성을 나타낸 도면이다.
도 3은 제2 벡터 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"의 구성을 나타낸 도면이다.
도 4는 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-panK 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 5는 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-acs 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 6은 pank 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 성장을 나타낸 도면이다.
도 7은 pank 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 배양액 중 아디프산 농도를 나타낸 도면이다.
도 2는 제1 벡터 "pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8"의 구성을 나타낸 도면이다.
도 3은 제2 벡터 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"의 구성을 나타낸 도면이다.
도 4는 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-panK 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 5는 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-acs 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 6은 pank 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 성장을 나타낸 도면이다.
도 7은 pank 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 배양액 중 아디프산 농도를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 아디프산 생산능을 갖는 미생물에서 pank 유전자 또는 acs 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형의 영향
본 실시예에서는 대장균에 아디프산 생산 경로를 도입하여 아디프산을 생산능을 갖는 미생물을 제조하고, 여기에 pank 유전자 또는 acs 유전자를 도입하고, 그에 따른 아디프산 생산에 미치는 영향을 확인하였다.
(1) 아디프산 생산능을 갖는 미생물 제조
출발 대장균 세포는 BL21(DE3) 균주[E. coli B dcm ompT hsdS(rB -mB -) gal]를 사용하였다. 상기 대장균 세포에 대장균 유래 유전자 paaJ와 paaH 및 Mus musculus 유래 유전자 acot8를 포함하는 pRSFDuet™-1 벡터 (이하 제1 벡터 또는 "pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8"라고도 함)와 Treponema denticola 유래 유전자 tdTer, Clostridium kluyveri 유래 유전자 cat1 및 대장균 유래 유전자 paaF를 포함하는 pCDFDuet™-1 벡터(이하 제2 벡터 또는 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"라고도 함)를 도입하여 아디프산 생합성 대사 경로를 포함하는 재조합 대장균을 제조하였다. 이들 벡터의 도입은 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었고, 제1 벡터와 제2 벡터를 동시에 도입하였다.
얻어진 재조합 대장균의 유전체에서 ldhA, atoB, 및 adhE 유전자를 결실시켰다. 이 결실은 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합으로 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법에 의하여 수행되었다. ldhA, atoB, 및 adhE 유전자는 아디프산 생산 경로에서 부산물 생성에 관여하는 유전자들이다. 또한, 얻어진 재조합 대장균의 유전체에서 sucD 유전자를 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합으로 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법에 의하여 결실시켰다. 그에 따라 부산물 생산은 감소되고 아디프산 필수 전구체인 succinyl-CoA의 생산 및 축적을 증가시켜 아디프산 생산을 강화시킨 균주를 제작하였다. 이 균주를 AA 균주로 명명하고, 이하 실험에서 아디프산 생산능을 갖는 기본 균주로 사용하였다.
대장균 AA 균주의 유전형은 다음과 같다: E. coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE + pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8 + pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer
도 1은 pank 유전자 및 acs 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하고 아디프산 생합성 경로가 도입된 아디프산 생합성능이 증가된 재조합 미생물의 대사 경로를 나타낸 도면이다.
도 1에서, paaF는 2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase, paaJ는 β-ketoadipyl-CoA thiolase, paaH는 3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase, tdTer는 Trans-2-enoyl-CoA reductase, acot8는 Acyl-coenzyme A thioesterase 8, cat1는 Succinyl-CoA: coenzyme A transferase를 각각 나타낸다.
도 2는 제1 벡터 "pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8"의 구성을 나타낸 도면이다. 제1 벡터에서, 2개 유전자 paaJ-paaH 단위는 하나의 T7 프로모터에 의하여 전사가 제어된다. S-Tag은 친화도를 이용해 단백질을 정제하는 목적으로 연결된 표지 단백질이다. acot8 유전자는 다른 T7 프로모터에 의하여 제어된다.
도 3은 제2 벡터 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"의 구성을 나타낸 도면이다. 제2 벡터에서, 2개 유전자 cat1-paaF 단위는 하나의 T7 프로모터에 의하여 전사가 제어된다. tdTer 유전자는 다른 T7 프로모터에 의하여 제어된다.
(2) panK 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 미생물의 제작
대장균 AA 균주에서, 제2 벡터 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"가 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-panK"로 변형하여, panK 유전자가 강화된 균주를 제조하였다. 제조과정은 먼저 E. coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE + pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8 균주를 제작하고, 여기에 새로 제작된 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-pank"를 도입하는 것을 포함한다.
panK 유전자 과발현을 위해서 E. coli BL21(DE3) 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각 제한효소 자리가 포함된 pCDF_infu_PanK_XhoI_0F(서열번호 1) 및 pCDF_infu_PanK_XhoI_951R(서열번호 2)을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여, 증폭 산물을 얻었다. XhoI 제한 효소 처리가 된 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer 벡터와 PCR산물을 infusion cloning kit를 사용하여 panK 과발현 벡터 pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-panK를 얻었다. 얻어진 재조합 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE + pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8에 열충격 형질전환(heat shock transformation)을 통하여 도입시켰고, streptomycin 및 kanamycin이 포함된 고체 배지에 배양하여 벡터가 삽입된 세포에서 벡터 추출 후 염기서열 분석을 통해 확인한 후 선별하였다. 이하 실험에서는 선별된 재조합 세포를 사용하였다. 선별된 세포에서 플라스미드를 추출하여 최종적으로 재조합된 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-panK 벡터를 얻었다. panK 유전자 및 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer 벡터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3 및 4에 각각 개시되어 있다. 또한, 도 4는 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-panK 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
(3) acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 미생물의 제작
대장균 AA 균주에서, 제2 벡터 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer"를 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-acs"로 치환하여, acs 유전자가 강화된 균주를 제조하였다. 제조과정은 E.coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE + pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8에 새로 제작된 "pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-acs"를 도입하는 것을 포함한다.
acs 유전자 과발현을 위해서 E. coli BL21(DE3) 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각 제한효소 자리가 포함된 pCDF_infu_acs_XhoI_0F(서열번호 5) 및 pCDF_infu_acs_XhoI_1959R(서열번호 6)을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여, 증폭 산물을 얻었다. XhoI 제한 효소 처리가 된 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer 벡터와 PCR산물을 infusion cloning kit를 사용하여 acs 과발현 벡터 pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-acs를 얻었다. 얻어진 재조합 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE + pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8에 열충격 형질전환(heat shock transformation)을 통하여 도입시켰고, streptomycin 및 kanamycin이 포함된 고체 배지에 배양하여 벡터가 삽입된 세포에서 벡터 추출 후 염기서열 분석을 통해 확인한 후 선별하였다. 이하 실험에서는 선별된 재조합 세포를 사용하였다. 선별된 세포에서 플라스미드를 추출하여 최종적으로 재조합된 pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-acs 벡터를 얻었다. acs 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 개시되어 있다.
도 5는 pCDFDuet™-1/cat1_paaH_tdTer-acs 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
(4) panK 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 미생물의 및 아디프산 생산량 확인
상기에서 제작된 형질전환 대장균 세포를 4 % 포도당, 0.01 mM IPTG 및 50 μg/ml streptomycin 및 50 μg/ml kanamycin을 함유한 SOB 배지(트립톤 20 g/l, 효모 추출물 5 g/l, 소듐 클로리드 0.5 g/l, 포타슘 클로리드 0.186 g/l, 마그네슘 설페이트 2.4 g/l) 25 ml에 1% 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 24 시간 동안 호기 조건에서 배양하였다.
다음으로, 배양된 형질전환 대장균 세포를 4 % glycerol, 0.01 mM IPTG, 50 mM 숙시네이트, 5 mM 판토텐산(pantothenic acid) 및 50 μg/ml streptomycin 및 50 μg/ml kanamycin을 함유한 SOB 배지 25 ml에 분광계(spectrophotometer)를 이용하여 OD600 측정값 기준으로 1OD (약 2.66x109 cells)의 세포를 접종하고, 37 ℃에서 200 rpm으로 교반하면서 144 시간 동안 호기 조건에서 배양하였다.
세포 성장은 분광계를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 배양 중 세포 배양액 중 아디프산은 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하였다.
배양결과 (24, 48, 72, 144 h), 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값 및 세포 배양액 내 아디프산의 농도는 표 1, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같다. 표 1은 panK 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균을 배양한 경우, 세포 성장 및 배양액 중 아디프산 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
| 세포 성장 (OD600) | 아디프산 (mg/L) | |||||||
| 24 h | 48 h | 72 h | 144 h | 24 h | 48 h | 72 h | 144 h | |
| Control | 26.6 | 31.9 | 36.4 | 39.4 | 117.3 | 165.0 | 202.6 | 337.6 |
| PanK 강화 균주 | 25.6 | 37.8 | 38.9 | 43.2 | 317.5 | 753.2 | 805.6 | 1037.7 |
| Acs 강화 균주 | 22.9 | 32.4 | 32.0 | 34.7 | 334.3 | 526.9 | 710.4 | 822.0 |
표 1, 도 6 및 도 7에서 Control은 AA균주 (E. coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE+pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8+pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer)를 나타낸다. PanK 강화 균주는 E. coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE+pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8+pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer-panK를 나타낸다. Acs 강화 균주는 E. coli BL21(DE3) ΔldhA ΔatoB ΔsucD ΔadhE+pRSFDuet™-1/paaJ-paaH-acot8+pCDFDuet™-1/cat1_paaF_tdTer-acs를 나타낸다.
도 6은 panK 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 성장을 나타낸 도면이다. 도 6에서, 세포 농도는 OD600 값으로 나타내었다.
도 7은 panK 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균의 배양액 중 아디프산 농도를 나타낸 도면이다.
표 1, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, panK 또는 acs 유전자가 도입된 아디프산 생산능을 갖는 대장균은 대조군에 비하여 성장은 차이가 없으나 아디프산 생산량은 현저하게 증가하였다.
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<223> primer
<400> 1
tctaaagatc tctcgaggaa ggaggaatat accatgagta taaaagagca aacgttaa 58
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 2
tctttaccag actcgagtta tttgcgtagt ctgacctc 38
<210> 3
<211> 951
<212> DNA
<213> E.coli BL21(DE3)
<400> 3
atgagtataa aagagcaaac gttaatgacg ccttacctac agtttgaccg caaccagtgg 60
gcagctctgc gtgattccgt acctatgacg ttatcggaag atgagatcgc ccgtctcaaa 120
ggtattaatg aagatctctc gttagaagaa gttgccgaga tctatttacc tttgtcacgt 180
ttgctgaact tctatataag ctcgaatctg cgccgtcagg cagttctgga acagtttctt 240
ggtaccaacg ggcaacgcat tccttacatt atcagtattg ctggcagtgt cgcggtgggg 300
aaaagtacaa ccgcccgtgt attgcaggcg ctattaagcc gttggccgga acatcgtcgt 360
gttgaactga tcactacaga tggcttcctt caccctaatc aggttctgaa agaacgtggt 420
ctgatgaaga agaaaggctt cccggaatcg tatgatatgc atcgcctggt gaagtttgtt 480
tccgatctca aatccggcgt gccaaacgtt acagcacctg tttactcaca tcttatttat 540
gatgtgatcc cggatggaga taaaacggtt gttcagcctg atattttaat tcttgaaggg 600
ttaaatgtct tacagagcgg gatggattat ccacacgatc cacatcatgt atttgtttct 660
gattttgtcg atttttcgat atatgttgat gcaccggaag acttacttca gacatggtat 720
atcaaccgtt ttctgaaatt ccgcgaaggg gcttttaccg acccggattc ctattttcat 780
aactacgcga aattaactaa agaagaagcg attaagactg ccatgacatt gtggaaagag 840
atcaactggc tgaacttaaa gcaaaatatt ctacctactc gtgagcgcgc cagtttaatc 900
ctgacgaaaa gtgctaatca tgcggtagaa gaggtcagac tacgcaaata a 951
<210> 4
<211> 7286
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pCDFDuet™-1/cat1-paaF-tdTer
<400> 4
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atggctaagg gtattaagaa tagccaactg aaaaagaaaa atgtgaaagc 120
gagcaatgtc gcggagaaaa ttgaagaaaa agttgagaaa acggacaaag ttgtggagaa 180
gccgccgaag ttaccgagaa gcgtatccgc aatctgaagc tgcaagaaaa agtcgttacc 240
gcagacgtcg cagcggatat gattgagaac ggcatgattg ttgcgattag cggtttcacg 300
ccgagcggtt atccgaaaga agtgccgaag gctctgacca aaaaagtgaa cgcgctggaa 360
gaagaattta aagttactct gtacaccggt agcagcacgg gtgcagatat cgatggtgag 420
tgggcgaagg ctggcatcat tgagcgtcgt atcccgtacc agaccaacag cgacatgcgc 480
aaaaagatta acgacggttc catcaaatat gccgatatgc atctcagcca catggcgcag 540
tacatcaatt acagcgttat tcctaaagtt gacatcgcga ttatcgaagc tgtggcaatt 600
accgaagagg gcgacatcat tccgtccacg ggtattggta atacggcgac tttcgttgag 660
aacgcagaca aagtgatcgt cgagattaac gaagcgcagc cgctggaact tgagggtatg 720
gctgacattt acaccttgaa gaatccgccg cgccgcgagc cgatcccgat cgtcaacgcc 780
ggtaatcgta tcggcaccac ctatgtcacg tgcggtagcg agaaaatttg cgcgattgtg 840
atgaccaata cccaggacaa gacccgtccg ctgaccgaag tgagcccggt gtctcaggca 900
atcagcgaca atctgatcgg cttcttgaac aaagaggttg aggaaggcaa gctgccgaag 960
aacctgttgc cgatccaatc tggtgtgggc tccgtggcga acgcagtcct ggccggtctg 1020
tgcgagtcga atttcaagaa cctgagctgt tatactgaag taatccaaga cagcatgctg 1080
aagctgatta agtgtggcaa agctgatgtt gtcagcggta cgagcatcag cccgtcaccg 1140
gaaatgctgc cagagttcat taaagacatt aactttttcc gtgagaaaat tgtgctgcgc 1200
ccgcaagaaa ttagcaacaa cccggaaatt gcgcgtcgta ttggtgtgat cagcatcaac 1260
acggccttag aagtcgatat ctatggcaac gtcaatagca cgcacgttat gggttcgaag 1320
atgatgaacg gtattggtgg cagcggtgat ttcgcgcgca atgcatacct gacgatcttt 1380
acgaccgagt ctatcgcaaa aaagggcgat atttccagca ttgtgccgat ggtcagccat 1440
gtggaccaca ccgagcacga cgttatggtg attgttaccg aacagggtgt cgcggatctg 1500
cgtggcctga gcccacgtga gaaagccgtt gcgatcatcg agaattgtgt tcatccggat 1560
tacaaagata tgttgatgga atactttgaa gaagcgtgca agtccagcgg cggcaacacc 1620
cctcataatc tggaaaaggc actgagctgg cacaccaagt ttatcaagac cggtagcatg 1680
aaataagaat tcgaaggagg aatataccat gagcgaactg atcgtcagcc gtcagcaacg 1740
agtattgttg ctgaccctta accgtcccgc cgcacgtaat gcgctaaata atgccctgct 1800
gatgcaactg gtaaatgaac tggaagctgc ggctaccgat accagcattt cggtctgtgt 1860
gattaccggt aatgcacgct tttttgccgc tggggccgat ctcaacgaaa tggcagaaaa 1920
agatctcgcg gccaccttaa acgatacacg tccgcagcta tgggcgcgat tgcaggcctt 1980
taataaacca cttatcgcag ccgtcaatgg ttacgcgctt ggggcgggtt gcgaactggc 2040
attgttgtgc gatgtggtgg ttgccggaga gaacgcgcgt tttgggttgc cggaaatcac 2100
tctcggcatc atgcctggcg caggcggaac gcaacgttta atccgtagtg tcggtaaatc 2160
gttagccagc aaaatggtgc tgagcggaga aagtatcacc gctcagcaag cacagcaggc 2220
cgggctggtt agcgacgtct tccccagcga tttaaccctc gaatacgcct tacagctggc 2280
atcgaaaatg gcacgtcact cgccgctggc cttacaagcg gcaaagcaag cgctgcgcca 2340
gtcgcaggaa gtggctttgc aagccggact tgcccaggag cgacagttat tcaccttgct 2400
ggcggcaaca gaagatcgtc atgaaggcat ctccgctttc ttacaaaaac gcacgcccga 2460
ctttaaagga cgctaagagc tcggcgcgcc tgcaggtcga caagcttgcg gccgcataat 2520
gcttaagtcg aacagaaagt aatcgtattg tacacggccg cataatcgaa attaatacga 2580
ctcactatag gggaattgtg agcggataac aattccccat cttagtatat tagttaagta 2640
taagaaggag atatacatat gatcgttaag ccgatggtcc gtaacaatat ttgtctgaac 2700
gcgcacccac agggctgtaa gaaaggtgtc gaggaccaga tcgagtacac caagaaacgt 2760
attacggccg aagtaaaggc tggcgcgaaa gcaccgaaaa acgttctggt gctgggttgc 2820
tcgaatggtt atggcctcgc gagccgcatc accgcggcgt ttggttacgg cgcagcgacc 2880
atcggtgtta gctttgagaa agccggcagc gaaacgaaat atggtacgcc tggctggtat 2940
aacaacttgg ccttcgatga agcggcgaag cgtgagggcc tgtacagcgt gaccattgat 3000
ggtgacgcat ttagcgacga aatcaaggca caggttattg aagaagcgaa gaaaaagggt 3060
attaagtttg atctgatcgt ttatagcctg gcatctccgg tgcgcacgga cccggatacc 3120
ggtattatgc acaagagcgt gctgaagccg ttcggtaaga cctttaccgg taagaccgtg 3180
gatccgttca ccggtgagct gaaagaaatc tccgcggagc cggcgaatga cgaagaggct 3240
gccgcgacgg ttaaggtcat gggtggcgag gactgggagc gttggattaa acaactgagc 3300
aaagagggcc tgctggaaga gggctgcatc accctggcgt actcttacat tggtccggaa 3360
gcaacccaag ccttgtaccg taagggtacg attggtaaag ctaaagaaca tctggaagct 3420
actgcccatc gcttgaataa agaaaacccg tccattcgcg cgtttgtcag cgtgaataaa 3480
ggtctggtga cgcgtgcaag cgcggtgatc ccggtcattc cgctgtattt ggcgagctta 3540
ttcaaagtta tgaaagaaaa gggcaaccac gagggttgca ttgagcaaat tacccgtctg 3600
tacgcagagc gcctgtatcg taaggacggt actatcccgg tcgatgaaga gaaccgtatc 3660
cgcatcgatg actgggaact ggaagaagat gttcagaaag ctgttagcgc gctgatggaa 3720
aaagtgacgg gcgagaatgc agagtccctg accgatctgg caggctaccg tcacgacttc 3780
ctggccagca atggtttcga cgttgagggt atcaattacg aagccgaagt cgagagattc 3840
gaccgtatct aaagatctct cgagtctggt aaagaaaccg ctgctgcgaa atttgaacgc 3900
cagcacatgg actcgtctac tagcgcagct taattaacct aggctgctgc caccgctgag 3960
caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 4020
cctcaggcat ttgagaagca cacggtcaca ctgcttccgg tagtcaataa accggtaaac 4080
cagcaataga cataagcggc tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcatcg 4140
tggccggatc ttgcggcccc tcggcttgaa cgaattgtta gacattattt gccgactacc 4200
ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 4260
aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 4320
tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 4380
gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 4440
cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 4500
tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 4560
cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 4620
gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 4680
cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 4740
tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 4800
tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 4860
tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 4920
acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc cctcatactc 4980
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 5040
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata gctagctcac tcggtcgcta cgctccgggc 5100
gtgagactgc ggcgggcgct gcggacacat acaaagttac ccacagattc cgtggataag 5160
caggggacta acatgtgagg caaaacagca gggccgcgcc ggtggcgttt ttccataggc 5220
tccgccctcc tgccagagtt cacataaaca gacgcttttc cggtgcatct gtgggagccg 5280
tgaggctcaa ccatgaatct gacagtacgg gcgaaacccg acaggactta aagatcccca 5340
ccgtttccgg cgggtcgctc cctcttgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gtttaccgga 5400
tacctgttcc gcctttctcc cttacgggaa gtgtggcgct ttctcatagc tcacacactg 5460
gtatctcggc tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtaagcaag aactccccgt 5520
tcagcccgac tgctgcgcct tatccggtaa ctgttcactt gagtccaacc cggaaaagca 5580
cggtaaaacg ccactggcag cagccattgg taactgggag ttcgcagagg atttgtttag 5640
ctaaacacgc ggttgctctt gaagtgtgcg ccaaagtccg gctacactgg aaggacagat 5700
ttggttgctg tgctctgcga aagccagtta ccacggttaa gcagttcccc aactgactta 5760
accttcgatc aaaccacctc cccaggtggt tttttcgttt acagggcaaa agattacgcg 5820
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct actgaaccgc tctagatttc 5880
agtgcaattt atctcttcaa atgtagcacc tgaagtcagc cccatacgat ataagttgta 5940
attctcatgt tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc 6000
aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg 6060
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 6120
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag 6180
tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg 6240
gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggtta acggcgggat 6300
ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc gagatgtccg caccaacgcg 6360
cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag 6420
catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat 6480
ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt 6540
atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc 6600
gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg 6660
ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac 6720
attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca tccagcggat agttaatgat 6780
cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc 6840
gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat 6900
cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag 6960
caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc 7020
catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac 7080
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tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa 7200
ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc tcccttatgc gactcctgca 7260
ttaggaaatt aatacgactc actata 7286
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 5
tctaaagatc tctcgaggaa ggaggaatat accatgagcc aaattcacaa acaca 55
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 6
tctttaccag actcgagtta cgatggcatc gcgata 36
<210> 7
<211> 1959
<212> DNA
<213> E.coli BL21(DE3)
<400> 7
atgagccaaa ttcacaaaca caccattcct gccaacatcg cagaccgttg cctgataaac 60
cctcagcagt acgaggcgat gtatcaacaa tctattaacg tacctgatac cttctggggc 120
gaacagggaa aaattcttga ctggatcaaa ccttaccaga aggtgaaaaa cacctccttt 180
gcccccggta atgtgtccat taaatggtac gaggacggca cgctgaatct ggcggcaaac 240
tgccttgacc gccatctgca agaaaacggc gatcgtaccg ccatcatctg ggaaggcgac 300
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gtgattttcg gcggcttctc gccggaagcc gttgccgggc gcattattga ttccaactca 540
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gttgagcaag cgagcgatca gcaccaggcg gaagagatga acgccgaaga tccgctgttt 780
attctctaca cctccggttc taccggtaag ccaaaaggtg tgctgcatac taccggcggt 840
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atccgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgatcgaag gcaccgaccg ttcgtcgctg 1140
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aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aaccggcggt 1260
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cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500
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tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860
ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920
ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaa 1959
Claims (20)
- 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE), 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자, 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및 숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 재조합 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 아세틸-CoA와 숙시닐-CoA로부터 아디프산을 합성하는 생합성 경로를 포함하는 것인 재조합 미생물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 생합성 경로는 외래 생합성 경로인 것인 재조합 미생물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 생합성 경로는 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase), β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase), 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase), 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase), 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8), 또는 그 조합을 포함하는 것인 재조합 미생물.
- 청구항 3에 있어서, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자, 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)을 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물.
- 청구항 6에 있어서, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaF 유전자이고,
β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaJ 유전자이고,
3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래 paaH 유전자이고,
트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자는 Treponema denticolar 유래 tdTer 유전자이고,
아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)을 코딩하는 유전자는 Mus musculus 유래 acot8 유전자인 것인 재조합 미생물. - 청구항 1에 있어서, Escherichia 속에 속하는 것인 재조합 미생물.
- 청구항 1의 재조합 미생물 및 비히클 또는 부형제를 포함하는 아디프산 생산에 사용하기 위한 조성물.
- 청구항 1의 재조합 미생물을 포함하는 아디프산 생산에 사용하기 위한 키트.
- 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification) 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 미생물에 도입하는 단계를 포함하는, 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 방법으로서, 상기 미생물은 Escherichia 속에 속하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE) 유전자, 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자, 또는 이들의 조합의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및 숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 아세틸-CoA와 숙시닐-CoA로부터 아디프산을 합성하는 생합성 경로를 상기 미생물에 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 생합성 경로는 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase), β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase), 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase), 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase), 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8), 또는 그 조합을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase)를 코딩하는 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase)를 코딩하는 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자, 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 상기 미생물에 도입하는 단계 포함하는 것인 방법.
- 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 아디프산을 생산하는 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 배양은 숙신산, 판토텐산, 또는 그 조합이 보충된 배지 중에서 수행되는 것인 것인 방법.
- 판토테네이트 키나제(pantothenate kinase, panK)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 및 아세틸-CoA 신테타제(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 아디프산을 생산하는 재조합 미생물을 제조하는 단계;
제조된 상기 재조합 미생물을 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 아디프산을 생산하는 방법. - 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 숙신산, 판토텐산, 또는 그 조합이 보충된 배지 중에서 수행되는 것인 것인 방법.
- 락테이트 데히드로게나제 A(Lactate dehydrogenase A, ldhA) 유전자, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제(Acetyl-CoA acetyltransferase, atoB) 유전자, 알데히드-알콜 데히드로게나제(aldehyde-alcohol dehydrogenase, adhE), 및 숙시네이트-CoA 리가제 [ADP-형성] 서브유니트 알파(Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, sucD) 유전자의 발현을 감소시키는 유전적 변형 및
숙시닐-CoA: 코엔자임 A 트란스퍼라제(Succinyl-CoA:coenzyme A transferase, cat1) 유전자, 2,3-데히드로아디필-CoA 히드라타제(2,3-dehydroadipyl-CoA hydratase, paaF) 유전자, β-케토아디필-CoA 티올라제(β-ketoadipyl-CoA thiolase, paaJ) 유전자, 3-히드록시아디필-CoA 데히드로게나제(3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase, paaH) 유전자, 트란스-2-에노일-CoA 리덕타제(trans-2-enoyl-CoA reductase, tdTer) 유전자, 및 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 8(acyl-coenzyme A thioesterase 8, acot8) 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 아디프산 생산능을 갖는 대장균.
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| Microbial Cell Factories, Vol.20(155), pp.1-11 (2021)* * |
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