JPS6024187A - 改良プラスミドベクタ−およびその利用 - Google Patents
改良プラスミドベクタ−およびその利用Info
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- JPS6024187A JPS6024187A JP58132524A JP13252483A JPS6024187A JP S6024187 A JPS6024187 A JP S6024187A JP 58132524 A JP58132524 A JP 58132524A JP 13252483 A JP13252483 A JP 13252483A JP S6024187 A JPS6024187 A JP S6024187A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、有用なポリペプチドの生産に適するように改
良された大腸菌プラスミドベクターおよびその利用に関
する。さらに詳しくは、有用ポリペプチドをコードする
遺伝子が容易に組み入れられ、又該有用ポリペプチドが
実質的に完全な形で高生産されうるように改良された大
腸菌リボプロティン遺伝子の５′末端非翻訳領域を有す
る改良プラスミドベクターと、該プラスミドによって形
質転換された大腸菌形質転換体を用いた有用ポリペプチ
ドの生産に関する。
良された大腸菌プラスミドベクターおよびその利用に関
する。さらに詳しくは、有用ポリペプチドをコードする
遺伝子が容易に組み入れられ、又該有用ポリペプチドが
実質的に完全な形で高生産されうるように改良された大
腸菌リボプロティン遺伝子の５′末端非翻訳領域を有す
る改良プラスミドベクターと、該プラスミドによって形
質転換された大腸菌形質転換体を用いた有用ポリペプチ
ドの生産に関する。
これまで所謂遺伝子組換え技術（以下、 ＤＮＡ技術と
略す）を用いて、種々の有用なポリペプチドが微生物細
胞や高等動物細胞によって生産されるようになってきて
おり、その一般的な手法はすでに確立されていると言え
よう。しかし、個々のポリペプチドについての技術的、
経済的生産方法・には、まだ改良の余地が残されている
。
略す）を用いて、種々の有用なポリペプチドが微生物細
胞や高等動物細胞によって生産されるようになってきて
おり、その一般的な手法はすでに確立されていると言え
よう。しかし、個々のポリペプチドについての技術的、
経済的生産方法・には、まだ改良の余地が残されている
。
ｒＤＮＡ技術を用いである種の有用なポリペプチドを生
産する場合、種々の要因がその生産性に影響をおよぼす
。その中でも、有用ポリペプチドをコードする挿入され
た外来の遺伝子の転写促進に関与するプロモーターの種
類や、ｍ ＲＮ Ａが１６’ＳリポソームＲＮＡの３′
末端配列と相補的に結合する所謂シャインーダルガーノ
（５ｈｉｎｅ −Ｄａｌｇａｒｎ。
産する場合、種々の要因がその生産性に影響をおよぼす
。その中でも、有用ポリペプチドをコードする挿入され
た外来の遺伝子の転写促進に関与するプロモーターの種
類や、ｍ ＲＮ Ａが１６’ＳリポソームＲＮＡの３′
末端配列と相補的に結合する所謂シャインーダルガーノ
（５ｈｉｎｅ −Ｄａｌｇａｒｎ。
配列： ＳＤ配列）が、該有用ペプチドの生産性を大き
く左右することが知られている。しかし、プロモーター
領域やＳＤ配列と個々のポリペプチドの生産性との間に
は、確立された規則性は認められていない。例えば、あ
る種のプロモーターやＳＤ配列がある種の異種遺伝子の
高発現をもたらすからといって、他の異種遺伝子を高発
現させるとは限らない。
く左右することが知られている。しかし、プロモーター
領域やＳＤ配列と個々のポリペプチドの生産性との間に
は、確立された規則性は認められていない。例えば、あ
る種のプロモーターやＳＤ配列がある種の異種遺伝子の
高発現をもたらすからといって、他の異種遺伝子を高発
現させるとは限らない。
外来遺伝子の高発現をもたらす要因として、該遺伝子の
イ末端非翻訳領域の存在も、特に有核細胞における異種
遺伝子の発現の場合型゛要な要因となるが、本発明とは
直接関係がないのでここは述べない。また、宿主細胞に
よっても、目的とする遺伝子の発現に適、不適があるこ
とも知られているが、ここでは言及しない。
イ末端非翻訳領域の存在も、特に有核細胞における異種
遺伝子の発現の場合型゛要な要因となるが、本発明とは
直接関係がないのでここは述べない。また、宿主細胞に
よっても、目的とする遺伝子の発現に適、不適があるこ
とも知られているが、ここでは言及しない。
挿入された異種遺伝子の発現のために、宿主細胞に応じ
ているいろなプロモーターが用いられている。例えば、
大腸菌を宿主とした場合、大腸菌のトリプトファン合成
遺伝子のプロモーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
プロモーター、β−ラクタマーゼ遺伝千のプロモーター
、アルカリ性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター、
リボプロティンのプロモーター、ラムタ責λ）ファージ
のＰＬプロモーターなどがある。各々異種ポリペプチド
の方法には大別して、目的ペプチドをある種の蛋白との
雑種蛋白として生産させる方法と、目的ポリペプチドを
、Ｎ末端にメチオニン残基が付加される場合もあるが、
直接生産させる方法とがある。例えば、目的ペプチドを
ある種の蛋白にメチオニンを介して連結せしめた雑種蛋
白として産生させ、次にブロムシアン（ＣＮＢｒ ）で
メチオニン残基を開裂させることによって目的ペプチド
を単離する場合、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ
ーターを用い、目的とするペプチドをアルカリ性フォス
ファターゼ蛋白との雑種蛋白として生産させることが、
目的ペプチドの生産性と精製に好成績を与える（特願昭
５７ １０７４７４）。
ているいろなプロモーターが用いられている。例えば、
大腸菌を宿主とした場合、大腸菌のトリプトファン合成
遺伝子のプロモーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
プロモーター、β−ラクタマーゼ遺伝千のプロモーター
、アルカリ性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター、
リボプロティンのプロモーター、ラムタ責λ）ファージ
のＰＬプロモーターなどがある。各々異種ポリペプチド
の方法には大別して、目的ペプチドをある種の蛋白との
雑種蛋白として生産させる方法と、目的ポリペプチドを
、Ｎ末端にメチオニン残基が付加される場合もあるが、
直接生産させる方法とがある。例えば、目的ペプチドを
ある種の蛋白にメチオニンを介して連結せしめた雑種蛋
白として産生させ、次にブロムシアン（ＣＮＢｒ ）で
メチオニン残基を開裂させることによって目的ペプチド
を単離する場合、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモ
ーターを用い、目的とするペプチドをアルカリ性フォス
ファターゼ蛋白との雑種蛋白として生産させることが、
目的ペプチドの生産性と精製に好成績を与える（特願昭
５７ １０７４７４）。
また、直接発現（ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）による、例えばインターフェロンのようなポリペプ
チドには、トリプトファン遺伝子やβ−ガラシターゼ遺
伝子やλファージのＰＬプロモーターなどが用いられて
いる（ Ｐ、Ｗ、Ｇｒａｙ らＮａｔｕｒｅ ２９５
： ５０３ 。
）による、例えばインターフェロンのようなポリペプ
チドには、トリプトファン遺伝子やβ−ガラシターゼ遺
伝子やλファージのＰＬプロモーターなどが用いられて
いる（ Ｐ、Ｗ、Ｇｒａｙ らＮａｔｕｒｅ ２９５
： ５０３ 。
１９Ｂ２ 、 Ｄ、ＧｏｅｄｄｅｌらＮａｔｕｒｅ ２
８７ ’： ４１１ 。
８７ ’： ４１１ 。
１９８０ 、Ｔ 、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ら Ｐｒｏｃ
、’Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
、’Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
Ｓｃｉ 、 ７７ ： ５２３０ 、１９８０ 、 Ｒ
，ＤｅｒｙｎｃｋらＮａｔｕｒｅ ２’８ヱ： １９３
．１９８０ など参考〕。
，ＤｅｒｙｎｃｋらＮａｔｕｒｅ ２’８ヱ： １９３
．１９８０ など参考〕。
一方、異種ポリペプチドを大腸菌内で効率よく生産させ
る要因の１つとして、翻訳開始コドン（ＡＴＧ ）の上
流に存在するＳＤ配列がある。そして、このＳＤ配列と
１６８リポソームＲＮＡの３′末端配列との相補性、Ｓ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの距離、また翻訳開始点周辺
のｍＲＮＡの２次構造等が、翻訳開始効率に寄与してい
ると考えられている。従って、生産しようとするポリペ
プチドのＮ末端近傍のアミノ酸配列、いいかえればその
部分に相当するＤＮＡ配列によって該ペプチドの生産性
が左右されることが推察される。
る要因の１つとして、翻訳開始コドン（ＡＴＧ ）の上
流に存在するＳＤ配列がある。そして、このＳＤ配列と
１６８リポソームＲＮＡの３′末端配列との相補性、Ｓ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの距離、また翻訳開始点周辺
のｍＲＮＡの２次構造等が、翻訳開始効率に寄与してい
ると考えられている。従って、生産しようとするポリペ
プチドのＮ末端近傍のアミノ酸配列、いいかえればその
部分に相当するＤＮＡ配列によって該ペプチドの生産性
が左右されることが推察される。
本発明者らは、これらの点に着眼し、大腸菌のリボプロ
ティン遺伝子の５′末端非翻訳領域のヌクレチオド配列
を種々改変することにより、外来遺伝子を容易に挿入で
き而も該遺伝子を極めて効率的に発現せしめ、目的とす
るポリペプチドを実質的に完全な形で効率よ〈生産せし
めつる大腸菌プラスミドを造成し、本発明を完成するに
至った。
ティン遺伝子の５′末端非翻訳領域のヌクレチオド配列
を種々改変することにより、外来遺伝子を容易に挿入で
き而も該遺伝子を極めて効率的に発現せしめ、目的とす
るポリペプチドを実質的に完全な形で効率よ〈生産せし
めつる大腸菌プラスミドを造成し、本発明を完成するに
至った。
また、本発明のプラスミドベクターを用いることによ沙
、ヒト免疫インターフェロン（以下ｈＩＮＦ−γと略す
）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを効率よく生産
でき、高濃度で該ポリペプチドを含有する培養組成物を
得ることができた。
、ヒト免疫インターフェロン（以下ｈＩＮＦ−γと略す
）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを効率よく生産
でき、高濃度で該ポリペプチドを含有する培養組成物を
得ることができた。
情？
・ ポリペプチドが、実質的に完全な形で直接産生でき
るように改良された大腸菌リボプロティン遺伝子の５′
末端非翻訳領域（プロモーター領域およびシャインーダ
ルガーノ配列を含む）を有することを特徴とする大腸菌
プラスミドベクターである。
るように改良された大腸菌リボプロティン遺伝子の５′
末端非翻訳領域（プロモーター領域およびシャインーダ
ルガーノ配列を含む）を有することを特徴とする大腸菌
プラスミドベクターである。
大腸菌のリポプロティンは大腸菌の外膜を構成する蛋白
質であり１細胞当り４．８Ｘ １０５分子存在しくＢａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｂｉｏ
ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ；ｅｄｉｔ
ｏｒ Ｍａｓａｙｏｒｉ Ｉｎｏｕｙｅ＋Ｐ、８＋Ｗｉ
ｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎ。
質であり１細胞当り４．８Ｘ １０５分子存在しくＢａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｂｉｏ
ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ；ｅｄｉｔ
ｏｒ Ｍａｓａｙｏｒｉ Ｉｎｏｕｙｅ＋Ｐ、８＋Ｗｉ
ｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎ。
Ｔｏｒｏｎｔｏ、 １９７９）、またこのリボプロティ
ン遺伝子は強い転写活性を有するプロモーターをもって
いることが知られている。
ン遺伝子は強い転写活性を有するプロモーターをもって
いることが知られている。
このリポプロティンのプロモーター領域（５末端非翻訳
領域）から該プロティンの構造遺伝子の領域を含む遺伝
子は、既にＰＢＲ３２２にクローニングされ、さらに、
挿入された外来遺伝子が発現できるように改良された一
連のプラスミドが造成されている（化学と生物λ曳、Ｎ
ｏ、１．４７〜５８゜１９８２参照）。また、そのプロ
モーター領域を利用した異種ポリペプチドの生産に関す
る特許が公開されている（特開昭５７−１４０８００）
。
領域）から該プロティンの構造遺伝子の領域を含む遺伝
子は、既にＰＢＲ３２２にクローニングされ、さらに、
挿入された外来遺伝子が発現できるように改良された一
連のプラスミドが造成されている（化学と生物λ曳、Ｎ
ｏ、１．４７〜５８゜１９８２参照）。また、そのプロ
モーター領域を利用した異種ポリペプチドの生産に関す
る特許が公開されている（特開昭５７−１４０８００）
。
しかしながら、上記に開示されたクローニングベクター
は次のような重大な欠点を有する。それは、該ベクター
のクローニングサイト（外来ポリペプチドをコードする
遺伝子を挿入する点：該ベクターではＥｃｏＲＩ切断点
）が翻訳開始点から１０〜１１塩基下流にあるため、生
産される目的ポリペプチドのＮ末端側に余分のペプチド
が付加されることである。このことは、生産されるポリ
ペプチドがたとえ生理的な活性を示したとしても、これ
を人体に投与した場合抗原性の問題があり、また生産さ
れるポリペプチドが本来の構造と異なることから決して
好ましいものではない。
は次のような重大な欠点を有する。それは、該ベクター
のクローニングサイト（外来ポリペプチドをコードする
遺伝子を挿入する点：該ベクターではＥｃｏＲＩ切断点
）が翻訳開始点から１０〜１１塩基下流にあるため、生
産される目的ポリペプチドのＮ末端側に余分のペプチド
が付加されることである。このことは、生産されるポリ
ペプチドがたとえ生理的な活性を示したとしても、これ
を人体に投与した場合抗原性の問題があり、また生産さ
れるポリペプチドが本来の構造と異なることから決して
好ましいものではない。
本発明は、リボプロティン遺伝子のＳＤ配列の改良およ
びＳＤ配列と８訳開始点間の距離の改良、さらには新た
なところへのクローニングサイトの挿入などにより、上
記公知のベクターのもつ欠点を補った新規な高発現ベク
ターを造成し、具体的例をもってその有用性を示したも
のである。
びＳＤ配列と８訳開始点間の距離の改良、さらには新た
なところへのクローニングサイトの挿入などにより、上
記公知のベクターのもつ欠点を補った新規な高発現ベク
ターを造成し、具体的例をもってその有用性を示したも
のである。
以下、具体的に本発明のプラスミドベクターおよびその
利用について述べる。
利用について述べる。
外来遺伝子を発現できるように改造されたプラスミドの
１つであるＰＩＮＩ−Ａ２上にある大腸菌のリポプロテ
ィンのプロモーター領域から該プロティン構造遺伝子の
１部（上流部）を含む塩基配列を第１図に示す。このプ
ラスミドは、発現すべき外来遺伝子が挿入されるクロー
ニングサイト（図１のＥｃｏＲＩ）が、リポプロティン
構造遺伝子の中（シグナルペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列中）にあるため、前述したような欠点を有して
いる。尚、第１図に示したプロモーター領域から構造遺
伝子上流（ＥｃｏＲＩ切断点）までの塩基配列は、前記
の特記の特開昭５７−１４０８００に開示された発現ベ
クターの１つのそれと同じである。
１つであるＰＩＮＩ−Ａ２上にある大腸菌のリポプロテ
ィンのプロモーター領域から該プロティン構造遺伝子の
１部（上流部）を含む塩基配列を第１図に示す。このプ
ラスミドは、発現すべき外来遺伝子が挿入されるクロー
ニングサイト（図１のＥｃｏＲＩ）が、リポプロティン
構造遺伝子の中（シグナルペプチドをコードしているＤ
ＮＡ配列中）にあるため、前述したような欠点を有して
いる。尚、第１図に示したプロモーター領域から構造遺
伝子上流（ＥｃｏＲＩ切断点）までの塩基配列は、前記
の特記の特開昭５７−１４０８００に開示された発現ベ
クターの１つのそれと同じである。
そこで本発明者らは、生産すべき異種ポリペプチドのＮ
末端に余分なペプチドが付加されないようにするため、
第１図に示したＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を化学的に合
成したオリゴヌクレオチド断片（両端に各々ＸｂａＩ
、ＥｃｏＲＩ粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ ）を
もち、リポプロティンのＳＤ配列を含む）で置き換え、
次に該Ｅ ｃｏ ＲＩサイトの下流に生産するべき有用
ペプチド（具体的例では、ｈＩＦＮ−γノアミノ酸配列
を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を連結せし
めた。かくの如くして造成はれたプラスミド、、ｌＮ４
Ｇ、ＩＦ５４によって形質転換された大腸菌（Ｗ３１１
’Ｏ／ｐｌＮ４ＧＩＦ５４）は、リポプロティン遺伝子
のプロモーターの支配下に、Ｎ末端に余分なペプチドが
付加されてないｈｌＦＮ−γを生産することができた。
末端に余分なペプチドが付加されないようにするため、
第１図に示したＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を化学的に合
成したオリゴヌクレオチド断片（両端に各々ＸｂａＩ
、ＥｃｏＲＩ粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ ）を
もち、リポプロティンのＳＤ配列を含む）で置き換え、
次に該Ｅ ｃｏ ＲＩサイトの下流に生産するべき有用
ペプチド（具体的例では、ｈＩＦＮ−γノアミノ酸配列
を有するポリペプチド）をコードする遺伝子を連結せし
めた。かくの如くして造成はれたプラスミド、、ｌＮ４
Ｇ、ＩＦ５４によって形質転換された大腸菌（Ｗ３１１
’Ｏ／ｐｌＮ４ＧＩＦ５４）は、リポプロティン遺伝子
のプロモーターの支配下に、Ｎ末端に余分なペプチドが
付加されてないｈｌＦＮ−γを生産することができた。
尚、ここでは説明を明確にするため、異種有用ポリペプ
チドをｈＩＦＮ−γの例で示したが、原理的にはそれ以
外のポリペプチドの生産にも適用できることは明らかで
ある。
チドをｈＩＦＮ−γの例で示したが、原理的にはそれ以
外のポリペプチドの生産にも適用できることは明らかで
ある。
第２図に、ＰＩＮ４ＧｊＦ５４の造成の概略を示してい
る。図中 ＰＧＩＦ５４は、特願昭５７−８６１８０に
開示した。、ＧＩＦ４と本質的に同しプラスミドであり
、第６図に示したようなｈＩＦＮ−γのアミノ酸配列を
コードする化学的に合成された遺伝子を有する該プラス
ミドによって形質転換はれた大腸菌ＷＡ８０２／ＰＧＩ
Ｆ４ は、ＳＢＭＧ１０５と命名し工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている〔受託番号は、微工研菌
寄第６５２２号（ＦＥＲＭＰ−６５２２）。また、ブダ
ペスト条約にもとづく国際寄託番号は微工研菌条第２８
２号（ＦＥＲＭ Ｂｐ−２８２））。一方、ＰＩＮＩ
−Ａ２は、ニューヨーク州立大学の井上氏の御好意によ
り譲渡を受けたプラスミドであり、該プラスミドによっ
て形質転換された宿主大腸菌はＪＡ２２１／ＰＩＮＩＡ
２と命名され、微生物工業技術研究所に微工研菌′架第
、３２０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０）をもって寄託
されている。
る。図中 ＰＧＩＦ５４は、特願昭５７−８６１８０に
開示した。、ＧＩＦ４と本質的に同しプラスミドであり
、第６図に示したようなｈＩＦＮ−γのアミノ酸配列を
コードする化学的に合成された遺伝子を有する該プラス
ミドによって形質転換はれた大腸菌ＷＡ８０２／ＰＧＩ
Ｆ４ は、ＳＢＭＧ１０５と命名し工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている〔受託番号は、微工研菌
寄第６５２２号（ＦＥＲＭＰ−６５２２）。また、ブダ
ペスト条約にもとづく国際寄託番号は微工研菌条第２８
２号（ＦＥＲＭ Ｂｐ−２８２））。一方、ＰＩＮＩ
−Ａ２は、ニューヨーク州立大学の井上氏の御好意によ
り譲渡を受けたプラスミドであり、該プラスミドによっ
て形質転換された宿主大腸菌はＪＡ２２１／ＰＩＮＩＡ
２と命名され、微生物工業技術研究所に微工研菌′架第
、３２０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２０）をもって寄託
されている。
第３図には、本発明において改良されたリボプロティン
遺伝子の５′末端非翻訳領域から挿入されたｈｌＦＮ−
γ遺伝子上流の１部に至るヌクレオチド配列を示した。
遺伝子の５′末端非翻訳領域から挿入されたｈｌＦＮ−
γ遺伝子上流の１部に至るヌクレオチド配列を示した。
第３図に示されたＳＤ配列は、リボプロティン遺伝子の
それと同じであり、ＳＤ配列から翻訳開始コドンまでの
距離も変ってない。
それと同じであり、ＳＤ配列から翻訳開始コドンまでの
距離も変ってない。
第２図に示したようにして造成されたＰＩＮ４ＧＩＦ５
４ によって形質転換された大腸菌も（Ｗ３′１．１０
／ＰＩＮ４６Ｆ５４）も、ｈＧＩＦ−γを生産したが（
詳しくは後述）、さらに生産性を高めるためにＳＤ配列
の改良を試みた（第４図参照〕。ＳＤ配列のオリゴヌク
レオチドとしては、大腸菌の１６８リポソームＲＮＡの
３′末端の配列と相補的になるようにデザインし、第４
図に示したようなりＮＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ を化
学的に 合成した。次に、１Ｎ４ＧＩＦ ５４のＸ ｂａ Ｉ
−Ｅ ｃｏ ＲＩ断片をこのＤＮＡ断片と置き換えるこ
とにより、ＰＩＮ５ＧＩＦ５４ を造成した。このプラ
スミドによって形質転換された大腸菌（Ｗ３１１０／、
、ｌＮ５ＧＩＦ５４）はｗ３１１’０／ＰＩＮ４ＧＩＦ
’５４の場合より４倍のｈＩＦＮ−γを生産することが
認められ（第２表参照）、本発明におけるＳＤ配列の改
変が有効であることが示された。また、該形質転換株の
培養菌体より、高濃度のｈｌＦＮ−γを含む培養組成物
を得ることができた。
４ によって形質転換された大腸菌も（Ｗ３′１．１０
／ＰＩＮ４６Ｆ５４）も、ｈＧＩＦ−γを生産したが（
詳しくは後述）、さらに生産性を高めるためにＳＤ配列
の改良を試みた（第４図参照〕。ＳＤ配列のオリゴヌク
レオチドとしては、大腸菌の１６８リポソームＲＮＡの
３′末端の配列と相補的になるようにデザインし、第４
図に示したようなりＮＡＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ を化
学的に 合成した。次に、１Ｎ４ＧＩＦ ５４のＸ ｂａ Ｉ
−Ｅ ｃｏ ＲＩ断片をこのＤＮＡ断片と置き換えるこ
とにより、ＰＩＮ５ＧＩＦ５４ を造成した。このプラ
スミドによって形質転換された大腸菌（Ｗ３１１０／、
、ｌＮ５ＧＩＦ５４）はｗ３１１’０／ＰＩＮ４ＧＩＦ
’５４の場合より４倍のｈＩＦＮ−γを生産することが
認められ（第２表参照）、本発明におけるＳＤ配列の改
変が有効であることが示された。また、該形質転換株の
培養菌体より、高濃度のｈｌＦＮ−γを含む培養組成物
を得ることができた。
以下、具体的実施例をもって説明する。
実施例
１、ＰＩＮ４ＧＩＦ５４の造成
プラスミド、ｌＮ４ＧＩＦ５４は、第２図に示したよう
に、■プラスミドＰＩＮＩＡ２を制限酵素ＸｂａＩとＰ
ｓｔｌで消化して得られるリポプロティン遺伝子のプロ
モーター領域（図中１ｐｐで示す）を含むＤＮＡ断片、
■ＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩ の粘着末端（ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｄ ）をもつオリゴヌクレオチド、■プラ
スミドＰＧＩＦ５４をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化して
得られるｈＩＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ断片の３つの
断片から以下のようにして造成した。尚、制限酵素類は
、いずれも全酒造社製のものを用いた。
に、■プラスミドＰＩＮＩＡ２を制限酵素ＸｂａＩとＰ
ｓｔｌで消化して得られるリポプロティン遺伝子のプロ
モーター領域（図中１ｐｐで示す）を含むＤＮＡ断片、
■ＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩ の粘着末端（ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｄ ）をもつオリゴヌクレオチド、■プラ
スミドＰＧＩＦ５４をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化して
得られるｈＩＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ断片の３つの
断片から以下のようにして造成した。尚、制限酵素類は
、いずれも全酒造社製のものを用いた。
Ａ、ＰＩＮＩＡ２ のＸｂａｌ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片
の調製 ＰＩＮＩＡ２ ＤＮＡ ３μｇをＩＸＴＡ溶液（３３ｍ
Ｍ）リス酢酸緩衝液、ｐＨ７，６、６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび０，５ｍＭジチオ
スレイトル）１５０．Ｊ中でＸｂａｌ及びＰｓｔｌ各々
１５単位を加え３７℃ ６０分間反応させ、ＤＮＡを切
断した。次に、１．０％寒天ゲル電気泳動を行った後、
約９８０ ｂ、ｐ、に相当する位置のゲルを切Ｖ出し、
透析チューブに入れ電気泳動することによりＸｂａ Ｉ
−Ｐｓｔ ｌＤＮＡ断片を溶出した。溶出液に等量の
フエ７−ルを加えエチジウムブロマイドを抽出除去した
後、２．５倍量のエタノールを加え、−８０°Ｃ３０分
間放置し、１０゜Ｑ（ｌＱｒｐｍ １０分間遠心を行い
、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿物として得た。このエタ
ノール沈澱物に１０４の蒸留水を加え、ＤＮＡ断片を溶
解した。
の調製 ＰＩＮＩＡ２ ＤＮＡ ３μｇをＩＸＴＡ溶液（３３ｍ
Ｍ）リス酢酸緩衝液、ｐＨ７，６、６６ｍＭ酢酸カリウ
ム、１０ｍＭ酢酸マグネシウムおよび０，５ｍＭジチオ
スレイトル）１５０．Ｊ中でＸｂａｌ及びＰｓｔｌ各々
１５単位を加え３７℃ ６０分間反応させ、ＤＮＡを切
断した。次に、１．０％寒天ゲル電気泳動を行った後、
約９８０ ｂ、ｐ、に相当する位置のゲルを切Ｖ出し、
透析チューブに入れ電気泳動することによりＸｂａ Ｉ
−Ｐｓｔ ｌＤＮＡ断片を溶出した。溶出液に等量の
フエ７−ルを加えエチジウムブロマイドを抽出除去した
後、２．５倍量のエタノールを加え、−８０°Ｃ３０分
間放置し、１０゜Ｑ（ｌＱｒｐｍ １０分間遠心を行い
、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿物として得た。このエタ
ノール沈澱物に１０４の蒸留水を加え、ＤＮＡ断片を溶
解した。
Ｂ、ＰＧＩＦ５４のＥｃｏ Ｒ１−Ｐｓｔ Ｉ ＤＮＡ
断片の調製 ＰＧＩＦ５４ ＤＮＡ ３μｇをＩＸＴＡ溶液 ３０μ
β中でＥＣ０ＲＩ及びＰｓｔ１５単位を加え３７℃ ６
０分反応させＤＮＡを切断した。次ＫＯ１７％寒天ゲル
電気泳動を行い、前述の如く電気泳動を行うことにより
ゲルより約３．４ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断
片を溶出した。溶出液を前述の如くフェノール処理後、
エタノール沈澱を行い、エタノール沈澱物に１０ｄの蒸
留水を加え Ｄ’Ｎ Ａ断片を溶解した。
断片の調製 ＰＧＩＦ５４ ＤＮＡ ３μｇをＩＸＴＡ溶液 ３０μ
β中でＥＣ０ＲＩ及びＰｓｔ１５単位を加え３７℃ ６
０分反応させＤＮＡを切断した。次ＫＯ１７％寒天ゲル
電気泳動を行い、前述の如く電気泳動を行うことにより
ゲルより約３．４ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断
片を溶出した。溶出液を前述の如くフェノール処理後、
エタノール沈澱を行い、エタノール沈澱物に１０ｄの蒸
留水を加え Ｄ’Ｎ Ａ断片を溶解した。
Ｃ，ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ粘着末端をもつオリゴヌク
レオチドの調製 完全なｈＩＦＮ−γ蛋白を発現させる為、ＰＩＮＩＡ２
のＸｂａｌ切断部位から下流にリボプロティンのシャイ
ンーダルガーノ（ＳＤ）配列をもち、ＥｃｏＲ１粘着末
端をもつオリゴヌクレオチド、、ＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ
・ □５を ＸｂａＩ ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ ＥｃｏＲＩ ｃ
ｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ固相法で合成した。合成法の詳
細は特願昭５７−８６１８０に開示している。
レオチドの調製 完全なｈＩＦＮ−γ蛋白を発現させる為、ＰＩＮＩＡ２
のＸｂａｌ切断部位から下流にリボプロティンのシャイ
ンーダルガーノ（ＳＤ）配列をもち、ＥｃｏＲ１粘着末
端をもつオリゴヌクレオチド、、ＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ
・ □５を ＸｂａＩ ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ ＥｃｏＲＩ ｃ
ｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ固相法で合成した。合成法の詳
細は特願昭５７−８６１８０に開示している。
上記オリゴヌクレオチド１００１００ｐを３０７Ｊ中の
キナーゼ反応溶液（５０ｍＭ ト’Ｊス塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ８，０，１０ｒｎ Ｍ Ｍｇ ｃｌ□、１０ ｒｎＭ
ジチスレイトール）中で２単位のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造社製）を加え、３７℃ ６０分間で
５’−ＯＨをリン酸化した。
キナーゼ反応溶液（５０ｍＭ ト’Ｊス塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ８，０，１０ｒｎ Ｍ Ｍｇ ｃｌ□、１０ ｒｎＭ
ジチスレイトール）中で２単位のＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（全酒造社製）を加え、３７℃ ６０分間で
５’−ＯＨをリン酸化した。
Ｄ、ＰＩＮ４ＧＩＦ５４の造成
ＰＩＮ４ＧＩＦ５４ プラスミドの造成は、上記の如く
調製した３種のＤＮＡ断片を以下のようにしてライゲー
ションすることにより行った。ＰＩＮＩＡ２のＸｂａＩ
−Ｐｓｔｌ ＤＮＡ 断片５ｄ（エタノール沈澱をｌ
Ｏｄの蒸留水に溶解したもの）、ＰＧ Ｉ Ｆ ５４の
ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ ＤＮＡ断片５．、ｆｆ１（エタ
ノール沈澱を１０４の蒸留水に溶解したもの）及び、リ
ン酸化したオリゴヌクレオチドの３ｄ（１０ｐｍｏｌ）
に１００倍量のライゲーション反応液（２０ｍ、Ｍ ）
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７，６、１０ｍＭ ＭｇＣ４）
２Ｊ １４ ｍＭ ＡＴ Ｐ ２４及びＴ ４ Ｉ）Ｎ
Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製） １Ａ （
５単位）を混ぜ、１６℃ −夜反応を行った。
調製した３種のＤＮＡ断片を以下のようにしてライゲー
ションすることにより行った。ＰＩＮＩＡ２のＸｂａＩ
−Ｐｓｔｌ ＤＮＡ 断片５ｄ（エタノール沈澱をｌ
Ｏｄの蒸留水に溶解したもの）、ＰＧ Ｉ Ｆ ５４の
ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌ ＤＮＡ断片５．、ｆｆ１（エタ
ノール沈澱を１０４の蒸留水に溶解したもの）及び、リ
ン酸化したオリゴヌクレオチドの３ｄ（１０ｐｍｏｌ）
に１００倍量のライゲーション反応液（２０ｍ、Ｍ ）
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７，６、１０ｍＭ ＭｇＣ４）
２Ｊ １４ ｍＭ ＡＴ Ｐ ２４及びＴ ４ Ｉ）Ｎ
Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社製） １Ａ （
５単位）を混ぜ、１６℃ −夜反応を行った。
■、大腸菌への形質転換
Ａ、大腸菌ＷＡ８０２への形質転換
大腸菌ＷＡ８０２を（、、−ｂｒｏｔｈ ２．Ｏｍｌで
３７℃−夜培養後、その培養液０．３ｍＡ’を３０ｒｎ
ｌのＬ−ｂｒｏｔｈに加え、３７℃で２時間振盪培養を
行った。その後 ３０００ｒｐｍ１０分間 遠心を行い
、得られた菌体に ５０ ｒｎＭ ＣａＣｌ２１０ｒｎ
ｌを加え、菌体を懸濁し、さらに３０００ｒｐｍ １０
分間遠心を行った。
３７℃−夜培養後、その培養液０．３ｍＡ’を３０ｒｎ
ｌのＬ−ｂｒｏｔｈに加え、３７℃で２時間振盪培養を
行った。その後 ３０００ｒｐｍ１０分間 遠心を行い
、得られた菌体に ５０ ｒｎＭ ＣａＣｌ２１０ｒｎ
ｌを加え、菌体を懸濁し、さらに３０００ｒｐｍ １０
分間遠心を行った。
得られた菌体に１．０ｍｌの５０ ｍＭ Ｃａ ｃ４溶
液を加え、氷中６０分間放置した。このＣａ処理菌０．
２１ｎｌに、実施例Ｉ−’Ｄで得られたライゲーション
反応液（ライゲーションされた前記３種のＤＮＡ断片を
含む）１０ｄを加え、氷中６０分間放置後、２ｄのＬ
−ｂｒｏｔｈを加え、３７℃ ６０分間 培養を行った
。培養液を４０ｄ／ｙｄのアンピシリンを含むＮｕｔｒ
ｉｅｎｔ寒天培地（ＢＢＬ社）にブレーティングし、３
７℃−夜培養を行いアンピシリン耐性を示す形質転換株
を選択した。次に得られた形質転換株についての１株か
ら常法（ｃｌｅａｒｅｄＩｙｓａｔ’ｅ法 ）に従いプ
ラスミドＤＮＡを分離後、挿入したＸｂａ Ｉ −Ｅｃ
ｏＲＩ領域周辺のＤＮＡ塩基配列をマキサム−ギルバー
ト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、６５：４
９９〜５６０．１９８０）により決定し、当初の目的の
ＤＮＡ塩基配列を持つことを確認した。このプラスミド
をＰＩＮ４ＧＩＦ５４と命名し、その形質転換大腸菌を
ＷＡ８０２／ＰＩＮ４ＧＩＦ５４と命名した。
液を加え、氷中６０分間放置した。このＣａ処理菌０．
２１ｎｌに、実施例Ｉ−’Ｄで得られたライゲーション
反応液（ライゲーションされた前記３種のＤＮＡ断片を
含む）１０ｄを加え、氷中６０分間放置後、２ｄのＬ
−ｂｒｏｔｈを加え、３７℃ ６０分間 培養を行った
。培養液を４０ｄ／ｙｄのアンピシリンを含むＮｕｔｒ
ｉｅｎｔ寒天培地（ＢＢＬ社）にブレーティングし、３
７℃−夜培養を行いアンピシリン耐性を示す形質転換株
を選択した。次に得られた形質転換株についての１株か
ら常法（ｃｌｅａｒｅｄＩｙｓａｔ’ｅ法 ）に従いプ
ラスミドＤＮＡを分離後、挿入したＸｂａ Ｉ −Ｅｃ
ｏＲＩ領域周辺のＤＮＡ塩基配列をマキサム−ギルバー
ト法（Ｍｅｔｈｏｄｓ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、６５：４
９９〜５６０．１９８０）により決定し、当初の目的の
ＤＮＡ塩基配列を持つことを確認した。このプラスミド
をＰＩＮ４ＧＩＦ５４と命名し、その形質転換大腸菌を
ＷＡ８０２／ＰＩＮ４ＧＩＦ５４と命名した。
ＰＩＮ４ＧＩＦ５４のプロモーター周辺の塩基配列を第
４図に示した。この、ｌＮ４ＧＩＦ５４ではシャインー
ダルガ−７（ＳＤ）配列はＰＩＮＩＡ２と同一であり、
又、ＳＤ配列からｈｌＦＮ−γの翻訳開始コドンＡＴＧ
までの距離はｇ ｂ、ｐ、であり ＰＩＮＩＡ２のそれ
と同じである。しかしＳＤ配列とＥ訳開始コドンＡＴＧ
の間ＫＥｃｏＲ’ｌ切断部位を導入したことによりＳＤ
配列の変換、ＳＤ配列から翻訳開始コドン間の距離の変
換が容易に行える為、ｂＩＦＮ−γ遺伝子のみならず、
他の遺伝子の高発現ベクターの造成に有利なベクターと
考えられる。
４図に示した。この、ｌＮ４ＧＩＦ５４ではシャインー
ダルガ−７（ＳＤ）配列はＰＩＮＩＡ２と同一であり、
又、ＳＤ配列からｈｌＦＮ−γの翻訳開始コドンＡＴＧ
までの距離はｇ ｂ、ｐ、であり ＰＩＮＩＡ２のそれ
と同じである。しかしＳＤ配列とＥ訳開始コドンＡＴＧ
の間ＫＥｃｏＲ’ｌ切断部位を導入したことによりＳＤ
配列の変換、ＳＤ配列から翻訳開始コドン間の距離の変
換が容易に行える為、ｂＩＦＮ−γ遺伝子のみならず、
他の遺伝子の高発現ベクターの造成に有利なベクターと
考えられる。
Ｂ、大腸菌Ｗ３１１０への形質転換
得られた ｌＮ４ＧＩＦ５４ プラスミドを前述の方法
で大腸菌Ｗ３１１０へ形質転換を行い、アンピシリン耐
性株を分離し、その形質転換体の１つをＷ３１１０／Ｐ
ＩＮ４ＧＩＦ５４と命名した。この形質転換体について
抗ウィルス活性を調べた。
で大腸菌Ｗ３１１０へ形質転換を行い、アンピシリン耐
性株を分離し、その形質転換体の１つをＷ３１１０／Ｐ
ＩＮ４ＧＩＦ５４と命名した。この形質転換体について
抗ウィルス活性を調べた。
■、形質転換体Ｗ３１１０／ｐｌＮ４ＧＩＦ５４の抗ウ
ィルス活性の測定 ｈＩＦＮ−γの発現量を調ヘルため、Ｗ３１１０／ＰＩ
Ｎ、４ＧＩＦ５４および比較としてＷ３１１０／ｐＧＩ
Ｆ５４（特願昭５７−８６１８０に開示し、微工研菌寄
第６５５２の寄託番号を得ている形質転換株と本質的に
同じ株）を下記のように培養し、その抗ウィルス活性を
測定した。尚コントロールとして、それらの室主株であ
るＷ３１１０株を用いた。
ィルス活性の測定 ｈＩＦＮ−γの発現量を調ヘルため、Ｗ３１１０／ＰＩ
Ｎ、４ＧＩＦ５４および比較としてＷ３１１０／ｐＧＩ
Ｆ５４（特願昭５７−８６１８０に開示し、微工研菌寄
第６５５２の寄託番号を得ている形質転換株と本質的に
同じ株）を下記のように培養し、その抗ウィルス活性を
測定した。尚コントロールとして、それらの室主株であ
るＷ３１１０株を用いた。
Ｗ３］１０／ｐｌＮ４ＧＩＦ５４およびＷ３１１０株は
、４０μｇ／艷のアンピシリンを含む２．０ｒｎｌのＬ
−ｂｒｏｔｈで一夜３７℃で前培養後、その０．１７７
１７！を同じＬ−ｂｒｏｔｈ ５ ｍｌに接種し、３７
℃でさらに４時間培養した。Ｗ３１１０／ＰＧＩＥ５４
は、前培養液０．１−を上記のＬ −ｂｒｏｔｈ ５
ｒｎｌに接種し、３７℃で２時間培養後に、最終濃度が
１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（以下ＩＰＴＧと略）を加え、さらに２時
間培養した。
、４０μｇ／艷のアンピシリンを含む２．０ｒｎｌのＬ
−ｂｒｏｔｈで一夜３７℃で前培養後、その０．１７７
１７！を同じＬ−ｂｒｏｔｈ ５ ｍｌに接種し、３７
℃でさらに４時間培養した。Ｗ３１１０／ＰＧＩＥ５４
は、前培養液０．１−を上記のＬ −ｂｒｏｔｈ ５
ｒｎｌに接種し、３７℃で２時間培養後に、最終濃度が
１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（以下ＩＰＴＧと略）を加え、さらに２時
間培養した。
各々の培養液の４ｒｎｌを３．００Ｏｒｐｍ 、 １５
分間遠心して集菌し、得られた菌体に１ｍ′！／７ｒＬ
ｌのリゾチーム（米国シグマ社製）を含む０．１５Ｍ−
リン酸ナトリウム緩衝液、 ５０ ｍＭ Ｎａ Ｃ（１
、ｐＨ７，２（以下ＩＸＰＢＳと略）２００．認を加え
、氷中３０分間放置して溶菌を行った。溶菌後、ドライ
アイス−メタノール中で急速に凍結、次に３７℃恒温槽
で急速融解の操作を３回くり返し菌体を破壊後、１ｏ。
分間遠心して集菌し、得られた菌体に１ｍ′！／７ｒＬ
ｌのリゾチーム（米国シグマ社製）を含む０．１５Ｍ−
リン酸ナトリウム緩衝液、 ５０ ｍＭ Ｎａ Ｃ（１
、ｐＨ７，２（以下ＩＸＰＢＳと略）２００．認を加え
、氷中３０分間放置して溶菌を行った。溶菌後、ドライ
アイス−メタノール中で急速に凍結、次に３７℃恒温槽
で急速融解の操作を３回くり返し菌体を破壊後、１ｏ。
０００ｒｐｍで１０分遠心し、その」二清の抗ウィルス
活性を測定した。抗ウィルス活性は、特願昭５７−８６
１８０に記した方法に従って測定した。
活性を測定した。抗ウィルス活性は、特願昭５７−８６
１８０に記した方法に従って測定した。
その結果を表１に示す。
表 １
形質転換体の抗ウィルス活性
菌株 抗ウィルス活性 １．ｕ／、ｎ１Ｗ３１１０ ０
Ｗ３１１０／ｐＧＩＦ５４ ４００
尚、この抗ウィルス活性は、ＰＨ２で完全に失活Ｌ ｔ
ｖ。また、ｈＩＦＮ−γ特異抗体との中和反応によって
も完全に活性は失活したが、α型およびβ形インターフ
ェロン特異抗体ではほとんど失活しなかった。
ｖ。また、ｈＩＦＮ−γ特異抗体との中和反応によって
も完全に活性は失活したが、α型およびβ形インターフ
ェロン特異抗体ではほとんど失活しなかった。
表１にみられる如＜ 、Ｗ３１１０／ｐＩＮ４ＧＩＦ５
４はＷ３１１０／ｐＧＩＦ５４ と比較して、２，５倍
の抗ウィルス活性を有していたカベ満足できる発現量で
あるとは言えない。そこでリポプロティンＳＤ配列の変
換を行った。リボプロティンのＳＤ配列はＧＡＧＧ （
４ｂｐ ）であり、この配列は大腸菌１６Ｓ ！Ｊ 、
ｔ” ７−Ａ ＲＮＡ （１）３’；４１１７） ’Ａ
ＵＵＣＣＵＣＣＡＧ’のＣＵＣＣ配列（で示した）七相
補する。
４はＷ３１１０／ｐＧＩＦ５４ と比較して、２，５倍
の抗ウィルス活性を有していたカベ満足できる発現量で
あるとは言えない。そこでリポプロティンＳＤ配列の変
換を行った。リボプロティンのＳＤ配列はＧＡＧＧ （
４ｂｐ ）であり、この配列は大腸菌１６Ｓ ！Ｊ 、
ｔ” ７−Ａ ＲＮＡ （１）３’；４１１７） ’Ａ
ＵＵＣＣＵＣＣＡＧ’のＣＵＣＣ配列（で示した）七相
補する。
この１６Ｓ リポソームＲＮＡの相補するリボプロティ
ンのＳＤ配列をＲＩ７Ａ’ＰＭＳ２Ａ蛋白のＳＤ配列に
使われているＡＧＧＡＧＧＴに変換することより、１６
８ リポソームＲＮＡとの相補性が強くなり、翻訳活性
が上昇してｈＩＦＮ−γ蛋白の発現量の増加が期待でき
る。
ンのＳＤ配列をＲＩ７Ａ’ＰＭＳ２Ａ蛋白のＳＤ配列に
使われているＡＧＧＡＧＧＴに変換することより、１６
８ リポソームＲＮＡとの相補性が強くなり、翻訳活性
が上昇してｈＩＦＮ−γ蛋白の発現量の増加が期待でき
る。
そこで、プラスミドＰＩＮ４ＧＩＦ５４のＸｂａＩ’−
ＥｃｏＲＩ間に、ＡＧＧＡＧＧＴのＳＤ配列を挿入する
ことを試みた。そのため、上記の配列をもち５′末端に
ＸｂａＩとＥｃｏＲＩの粘着末端を有するオリゴヌクレ
オチド ＣＴＡＧＧＡＧＧＴＡＧ ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ を合成し、これをＰＩＮ４Ｇ
ＩＦ５４のＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ間に挿入することに
より、プラスミドＰＩＮ５ＧＩＦ５４ を造成した（第
４図参照）。
ＥｃｏＲＩ間に、ＡＧＧＡＧＧＴのＳＤ配列を挿入する
ことを試みた。そのため、上記の配列をもち５′末端に
ＸｂａＩとＥｃｏＲＩの粘着末端を有するオリゴヌクレ
オチド ＣＴＡＧＧＡＧＧＴＡＧ ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡ を合成し、これをＰＩＮ４Ｇ
ＩＦ５４のＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ間に挿入することに
より、プラスミドＰＩＮ５ＧＩＦ５４ を造成した（第
４図参照）。
以下、その詳細を記す。
ＩＶ、ＰＩＮ５ＧＩＦ５４プラスミドの造成（第４図参
照） Ａ、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ粘着末端をもつオリゴヌク
レオチドの調製 ＡＧＧＡＧＧＴのＳＤ配列をもち、５′末端ＫＸｂａＩ
及びＥｃｏＲＩ 粘着末端をもつオリゴヌクレオチ固相
法（特願昭５７−８６１８０参照）で合成された。上記
オリゴヌクレオチドｌ Ｑ Ｑ ｐｍｏｌを５０Ｉのキ
ナーゼ反応溶液（実施例Ｉ−Ｃに記述）中で２単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え前述
の如く３７℃６０分間で５′−０Ｈをリン酸化した。
照） Ａ、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ粘着末端をもつオリゴヌク
レオチドの調製 ＡＧＧＡＧＧＴのＳＤ配列をもち、５′末端ＫＸｂａＩ
及びＥｃｏＲＩ 粘着末端をもつオリゴヌクレオチ固相
法（特願昭５７−８６１８０参照）で合成された。上記
オリゴヌクレオチドｌ Ｑ Ｑ ｐｍｏｌを５０Ｉのキ
ナーゼ反応溶液（実施例Ｉ−Ｃに記述）中で２単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え前述
の如く３７℃６０分間で５′−０Ｈをリン酸化した。
Ｂ、ＰＩＮ４ＧＩＦ５４のＸｂａ Ｉ −Ｅｃｏ ＲＩ
ＤＮＡ断片の調製 ＰＩＮ４ＧＩＦ５４２．５μｇをＩＸＴＡ溶液３０パで
Ｘｂａｌ 及びＥＣ０ＲＩ各々５単位加え、３７℃６０
分間反応させ、ＤＮＡを切断した。切断後０．７％寒天
ゲル電気泳動を行い、ゲルより約４．３ ＫｂのＸｂａ
Ｉ −ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片（ＳＤ配列を含まない長
い方の断片）を前記の如く電気泳動で溶出した。
ＤＮＡ断片の調製 ＰＩＮ４ＧＩＦ５４２．５μｇをＩＸＴＡ溶液３０パで
Ｘｂａｌ 及びＥＣ０ＲＩ各々５単位加え、３７℃６０
分間反応させ、ＤＮＡを切断した。切断後０．７％寒天
ゲル電気泳動を行い、ゲルより約４．３ ＫｂのＸｂａ
Ｉ −ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片（ＳＤ配列を含まない長
い方の断片）を前記の如く電気泳動で溶出した。
溶出液を前述の如くフェノール処理後、エタノール沈澱
を行い、エタノール沈澱物にｉｏ、ｒの蒸留水を加え、
ＤＮＡ断片を溶解した。
を行い、エタノール沈澱物にｉｏ、ｒの蒸留水を加え、
ＤＮＡ断片を溶解した。
Ｃ，ＰＩＮ５ＧＩＦ５４の造成
、、ｌＮ５ＧＩＦ５４ プラスミドの造成は、上記の２
種のＤＮＡ断片を以下に示すようにライゲーションする
ことにより行った。ＰＩＮ４ＧＩＦ５４のＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩＤＮＡ断片５μｌ（エタノール沈澱を１０Δの
蒸留水に溶解したもの）、及びリン酸化したオリゴヌク
レオチドの５ｉ （１０ｐｍｏｌ ）に１０倍濃度のラ
イゲーション反応液（前述）３Ｊ、１００ｍＭＤＴＴ、
４ｍＭＡ’ｒＰ、蒸留水１０Ｊ及びＴ４ＤＮＡす、ガー
ゼ（ヘーリンガー・マンハイム社製）１μβ（５単位）
を混ぜ１６℃−夜反応を行った。
種のＤＮＡ断片を以下に示すようにライゲーションする
ことにより行った。ＰＩＮ４ＧＩＦ５４のＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩＤＮＡ断片５μｌ（エタノール沈澱を１０Δの
蒸留水に溶解したもの）、及びリン酸化したオリゴヌク
レオチドの５ｉ （１０ｐｍｏｌ ）に１０倍濃度のラ
イゲーション反応液（前述）３Ｊ、１００ｍＭＤＴＴ、
４ｍＭＡ’ｒＰ、蒸留水１０Ｊ及びＴ４ＤＮＡす、ガー
ゼ（ヘーリンガー・マンハイム社製）１μβ（５単位）
を混ぜ１６℃−夜反応を行った。
■、大腸菌への形質転換
Ａ、大腸菌ＷＡ８０２への形質転換
前述（実施例ＩＩ−Ａ ）の如く、Ｌ −ｂｒｏｔｈで
培養した大腸菌ＷＡ ８０２の菌体をＣａ Ｃ１，、処
理し、その菌体懸濁液０．２−と実施例ＩＶ−Ｃで得ら
れたライゲーション反応液とを混合することにより、大
腸菌ＷＡ８０２の形質転換を行った。形質転換株の選択
は＼ ４０μ！／ｍｌのアンピシリンを含むＮｕｔｒｉ
６Ｈｊ 寒天培地で（ＢＢＬ社）行い、アンピシリン耐
性を示す形質転換株を得た。得られた形質転換株の１株
について、常法（実施例ＩＩ−Ａ参照）に従いプラスミ
ドを分離し、挿入したＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ領域周辺の
ＤＮＡ塩基配列を解析した。ＰＩＮ５ＧＩＦ５４には、
図５に示したように１．ｌＮ４ＧＩＦ５４ （図３）に
あったＸｂａｌ切断部位が消失しているはずである゛。
培養した大腸菌ＷＡ ８０２の菌体をＣａ Ｃ１，、処
理し、その菌体懸濁液０．２−と実施例ＩＶ−Ｃで得ら
れたライゲーション反応液とを混合することにより、大
腸菌ＷＡ８０２の形質転換を行った。形質転換株の選択
は＼ ４０μ！／ｍｌのアンピシリンを含むＮｕｔｒｉ
６Ｈｊ 寒天培地で（ＢＢＬ社）行い、アンピシリン耐
性を示す形質転換株を得た。得られた形質転換株の１株
について、常法（実施例ＩＩ−Ａ参照）に従いプラスミ
ドを分離し、挿入したＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ領域周辺の
ＤＮＡ塩基配列を解析した。ＰＩＮ５ＧＩＦ５４には、
図５に示したように１．ｌＮ４ＧＩＦ５４ （図３）に
あったＸｂａｌ切断部位が消失しているはずである゛。
そこで、分離′シタ該プラスミドをＸｂａｌと処理後、
０．７％寒天ゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩで切断され
ないプラスミドＤＮＡについて、挿入したオリゴヌクレ
オチド断片近傍のＤＮＡ配列をマキサム−ギルバート法
で決定した。その結果、図５に示すように目的のＤＮＡ
塩基配列をもつことが確認できた。このプラスミドを、
、ｌＮ５ＧＩＦ５４と命名し、それによって形質転換さ
れたＷＡ８０２株をＷＡ８０２ ／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４
と命名した。
０．７％寒天ゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩで切断され
ないプラスミドＤＮＡについて、挿入したオリゴヌクレ
オチド断片近傍のＤＮＡ配列をマキサム−ギルバート法
で決定した。その結果、図５に示すように目的のＤＮＡ
塩基配列をもつことが確認できた。このプラスミドを、
、ｌＮ５ＧＩＦ５４と命名し、それによって形質転換さ
れたＷＡ８０２株をＷＡ８０２ ／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４
と命名した。
Ｂ、大腸菌Ｗ３１１０への形質転換
上記で得られたＰＩＮ５ＧＩＦ５４ プラスミドを、大
腸菌Ｗ３１１０へ前述の如く形質転換した。アンピシリ
ン耐性を示す形質転換株を分離し、それをＷ３１１０／
ＰＩＮ５ＧＩＦ５４と命名した。この形質転換株につい
て、抗ウィルス活性をＷ３１１０／ｐＩＮ４ＧＩＦ５４
と比較した。
腸菌Ｗ３１１０へ前述の如く形質転換した。アンピシリ
ン耐性を示す形質転換株を分離し、それをＷ３１１０／
ＰＩＮ５ＧＩＦ５４と命名した。この形質転換株につい
て、抗ウィルス活性をＷ３１１０／ｐＩＮ４ＧＩＦ５４
と比較した。
Ｖｌ、Ｗ３１１０ ／ ｐ、ｌＮ４ＧＩＦ５４およびＷ
３１１０／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４の抗ウィルス活性の測定
Ｗ３１１０／ＰＩＮ４ＧＩＦ５４及びＷ３１１’０／Ｐ
ＩＮ５ＧＩＦ５４．それに：ｌ ン） ｏ −ルとして
Ｗ３３１０、をＬ−ｂｒｏｔｈ （４０Ｊｙ／ｍ１．の
アンピシリンを含む）２．０ｍｌで３７℃−夜培養し、
Ｌ−ｂｒｏｔｈ （４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
）５ｍｌに上記の培養液０．１ｍｌを接種し、さらに２
時間培養した。培養液２ｒｎｌを３００Ｏｒｐｍ１５分
間遠心し、得られた菌体に１ｍ’ｉ／／ｍｌのリゾチー
ムを含む１．（Ｌ＋７！のＩＸＰＢＳを加え 氷中３０
分間放置し、溶菌を行っに０溶菌後、ドライアイス−メ
タノール中での急速凍結、３７℃での急速隔解を３回く
り返し菌体を破壊後、１０．００Ｏｒｐｍ １０分遠心
し、その上清について特願昭５７−８６１８０に記した
方法に従って抗ウィルス活性の測定を行った。その結果
を表２に示す。
３１１０／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４の抗ウィルス活性の測定
Ｗ３１１０／ＰＩＮ４ＧＩＦ５４及びＷ３１１’０／Ｐ
ＩＮ５ＧＩＦ５４．それに：ｌ ン） ｏ −ルとして
Ｗ３３１０、をＬ−ｂｒｏｔｈ （４０Ｊｙ／ｍ１．の
アンピシリンを含む）２．０ｍｌで３７℃−夜培養し、
Ｌ−ｂｒｏｔｈ （４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
）５ｍｌに上記の培養液０．１ｍｌを接種し、さらに２
時間培養した。培養液２ｒｎｌを３００Ｏｒｐｍ１５分
間遠心し、得られた菌体に１ｍ’ｉ／／ｍｌのリゾチー
ムを含む１．（Ｌ＋７！のＩＸＰＢＳを加え 氷中３０
分間放置し、溶菌を行っに０溶菌後、ドライアイス−メ
タノール中での急速凍結、３７℃での急速隔解を３回く
り返し菌体を破壊後、１０．００Ｏｒｐｍ １０分遠心
し、その上清について特願昭５７−８６１８０に記した
方法に従って抗ウィルス活性の測定を行った。その結果
を表２に示す。
表 ２
抗ウィルス活性の測定
菌株 １．ｕ／ｒｎｌ
Ｗ３１１０ ０
Ｗ３１１０／ ｌＮ４ＧＩＦ５４ １０００Ｗ３１１０
／ ｌＮ５ＧＩＦ５４ ４０００表２から明らかな如く
、Ｗ３１１０／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４はＷ３１］０／ＰＩ
Ｎ４ＧＩＦ５４に比べ４倍の抗ウィルス活性を示し、Ｓ
Ｄ配列の改良がｈＩＦＮ−γ蛋白の発現効率向上に有効
であったことを物語っている。
／ ｌＮ５ＧＩＦ５４ ４０００表２から明らかな如く
、Ｗ３１１０／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４はＷ３１］０／ＰＩ
Ｎ４ＧＩＦ５４に比べ４倍の抗ウィルス活性を示し、Ｓ
Ｄ配列の改良がｈＩＦＮ−γ蛋白の発現効率向上に有効
であったことを物語っている。
尚、この抗ウィルス活性は１．Ｈ２での処理およびｈＩ
ＦＮ−γ特異抗体との中和反応により消失したことから
、これらの形質転換株がｈＩＦＮ−γを生産しているこ
とは明らかである。
ＦＮ−γ特異抗体との中和反応により消失したことから
、これらの形質転換株がｈＩＦＮ−γを生産しているこ
とは明らかである。
第１図は、プラスミドＰＩＮＩ−Ａ２ 上にある大腸菌
のリボプロティン遺伝子のプロモーター領域およびＳＤ
配列を含む５′末端非翻訳領域と該プロティン構造遺伝
子の１部（上流部）の塩基配列を示す。第２図は、ｈＩ
ＦＮ−γ遺伝子発現プラスミトヘクター、、ｌＮ４ＧＩ
Ｆ５４の造成法の概略を示す。 第３図は、プラスミドＰＩＮ４ＧＩＦ５４上にあるリボ
プロティン遺伝子の改良された５′末端非翻訳領域を含
む塩基配列を示す。第４図は、ｈＩＮＦ−γ遺伝子発現
プラスミドベクターＰＩＮ５ＧＩＦ５４の造成法の概略
を示す。第５図は、プラスミドｐ Ｉ Ｎ５ＧＩＦ５４
上にあるリボプロティン遺伝子の改良された５′末端非
翻訳領域を含む塩基配列を示す。 第６図は、化学的に合成されたｈｌＦＮ−γ遺伝子の塩
基配列並びにアミノ酸配列を示す。 特許出願人 サントリー株式会社 第６図 １ １０ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ”
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ５’ＡＡＴＴＣＡＴＧ ＴＧＣＴＡＣＴＧ
ＣＣＡＧ ＧＡＣＣＣＡ ＴＡＣＧＴＧ ＡＡＧ ＧＡ
Ａ ＧＣＴ ＧＡＡ ＡＡＣ３″ Ｇ ＴＡＣＡＣＧ
ＡＴＣＡＣＧ ＧＴＣＣＴＧ ＧＣＴＡＴＧ ＣＡＣτ
ＴＣＣＴＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＴＴＧ０ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ ＡｓｎＧＴＴ ＧＣＴ ＧＡＣＡＡＣＧＧＴ ＡＣ
Ｔ ＣＴＧ ＴＴＣＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＣ（、ＴＧ
ＡＡＡ ＡＡＣＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣ
Ａ ＴＧＡ ＧＡＣＡＡＧ ＧＡＣＣＣＡ ＴＡＧ Ｇ
ＡＣＴＴＴ ＴＴＧＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣＧＴＴ Ｔ
ＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣＡＡ
Ａ ＡＡＣＴＴＣＡＧＡ ＧＴＣＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧ
Ａ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣＧＡＣＡＡＧ Ｔ
Ｔｒ ＴＴＧ ＡＡＧ０ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅ
ｒ ＡｓｎＡＣＴ ＡＴＣＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＣＡＴ
Ｇ ＡＡＣＧＴＴ ＡＡ（３ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴ
ＡＡＣＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡ
ＣＴＴＧ ＣＡＡ ＴＴＣＡＡＧＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧ
Ａ ＴＴＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡ
ＣＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ
ＧＣＴ ＡＴＣＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＧ
Ａ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ ＧＴＣＧＣＡ
ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＧＬｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ
ＡｓｐＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＣＴＴＣＡＡＣ
ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣＧＡＣＴＴＣ
τＴＴ ＡＴＧ ＡＡＧＴＴＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＧＴ
Ａ ＡＧＡ ＣＴＧ０ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａ
ｒｇ Ｌｙｓ ｌｉｅ Ｍｅｔ ＧｉｎＴＧＧ ＡＡＡ
ＧＡＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＡＣＣＧＴ ＡＡＡ Ａ
ＴＣＡＴＧ ＣＡＧＡＣＣＴＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ Ａ
ＧＡ ＣＴＧ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＡＣＧＴＣ
０ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ ＧｌｕＡＡＧ ＧＡＣ
ＧＡＣＣＡＧ ＴＣＴ ＡＴＣＣＡＧ ＡＡＡ ＴＣＴ
ＧＴＴ ＧＡＡＴＴＣＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣＡＧＡ
ＴＡＧ ＧＴＣＴＴＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＴＴ０
のリボプロティン遺伝子のプロモーター領域およびＳＤ
配列を含む５′末端非翻訳領域と該プロティン構造遺伝
子の１部（上流部）の塩基配列を示す。第２図は、ｈＩ
ＦＮ−γ遺伝子発現プラスミトヘクター、、ｌＮ４ＧＩ
Ｆ５４の造成法の概略を示す。 第３図は、プラスミドＰＩＮ４ＧＩＦ５４上にあるリボ
プロティン遺伝子の改良された５′末端非翻訳領域を含
む塩基配列を示す。第４図は、ｈＩＮＦ−γ遺伝子発現
プラスミドベクターＰＩＮ５ＧＩＦ５４の造成法の概略
を示す。第５図は、プラスミドｐ Ｉ Ｎ５ＧＩＦ５４
上にあるリボプロティン遺伝子の改良された５′末端非
翻訳領域を含む塩基配列を示す。 第６図は、化学的に合成されたｈｌＦＮ−γ遺伝子の塩
基配列並びにアミノ酸配列を示す。 特許出願人 サントリー株式会社 第６図 １ １０ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ”
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
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ＡＡＡ ＡＡＣＣＡＡ ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＧ ＣＣ
Ａ ＴＧＡ ＧＡＣＡＡＧ ＧＡＣＣＣＡ ＴＡＧ Ｇ
ＡＣＴＴＴ ＴＴＧＴＣＴ ＣＡＧ ＡＴＣＧＴＴ Ｔ
ＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ ＣＴＧ ＴＴＣＡＡ
Ａ ＡＡＣＴＴＣＡＧＡ ＧＴＣＴＡＧ ＣＡＡ ＡＧ
Ａ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣＧＡＣＡＡＧ Ｔ
Ｔｒ ＴＴＧ ＡＡＧ０ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅ
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Ｇ ＡＡＣＧＴＴ ＡＡ（３ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴ
ＡＡＣＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＣＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡ
ＣＴＴＧ ＣＡＡ ＴＴＣＡＡＧＡＡＧ ＴＴＧ ＡＧ
Ａ ＴＴＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＡ
ＣＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ
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Ａ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＣＡＴ ＧＴＣＧＣＡ
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ＧＴＴ ＧＡＡＴＴＣＣＴＧ ＣＴＧ ＧＴＣＡＧＡ
ＴＡＧ ＧＴＣＴＴＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＣＴＴ０
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）有用ポリペプチドが、実質的に完全々形で直接産
生できるように改良された大腸菌リボプロティン遺伝子
の５′末端非翻訳領域（プロモーター領域およびシャイ
ンーダルガーノ配列を含む）を有することを特徴とする
大腸菌プラスミドベクター。 （２）シャインーダルガーノ配列が、大腸菌の１６−Ｓ
リポソームＲＮＡのイ末端と安定に相補的結合しうるよ
うに改良された配列を有する特許請求の範囲第１項記載
のプラスミドベクター。 （３） シャインーダルガーノ配列と翻訳開始コドンＡ
ＴＧの間に、適当な制限酵素切断配列をもつ特許請求範
囲第１項及至第２項記載のプラスミドベクター。 （４）制限酵素切断部位がＥｃｏＲＩ によって切断さ
れうる配列である特許請求範囲第３項記載のプラスミド
ベクター。 ・（５） シャインーダルガー／配列がイＡＧＧＡＧＧ
Ｔ’配列を含む特許請求範囲第２項記載のプラスミドベ
クター。 （６）５′末端非翻訳領域（プロモーター領域およびシ
ャインーダルガーノ配列を含む）の下流に、有用なポリ
ペプチドをコードする遺伝子連挿入された特許請求範囲
第１項記載のプラスミドベクター。 （７）有用なポリペプチドがヒト免疫インターフェロン
のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第６項記載のプ
ラスミドベクター。 （８） ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子が、化学的に合成された遺伝子、もしく
はヒト膵臓組織又は末梢血液リンパ球から精製した免疫
インターフェロンのｍＲＮＡからつくられた遺伝子であ
る特許請求の範囲第７項記載のプラスミドベクター。 （９）化学的に合成された遺伝子が、図６に示された塩
基配列を含む特許請求の範囲第８項、記載のプラスミド
ベクター。 ００） プラスミドがＰＩＮ４ＧＩＦ５４もしくはＰＩ
Ｎ５ＧＩＦ５４ からなるグループから選択される特許
請求の範囲第１項記載のプラスミドベクター。 （１１１第３図に示された塩基配列を含むことを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクター。 ０２）第５図に示された塩基配列を含む特許請求の範囲
第５項記載のプラスミドベクター。 ０３）特許請求の範囲第７項から第１２項のいずれかに
記載のプラスミドによって形質転換された大腸菌形質転
換株。 圓 形質転換株がＷＡ８０２／ＰＩＮ４ＧＩＦ５４．Ｗ
Ａ８０２／ＰＩＮ５ＧＩＦ５４ 、Ｗ３１１０／ＰＩＮ
４ＧＩＦ５４およびＷ３１．１０／ｐＩＮ５ＧＩＦ５４
からなるグループから選択される特許請求の範囲第１３
項記載の形質転換株。 ０５）特許請求の範囲第１３項または第１４項記載の形
質転換体を培養することにより得られるヒト免疫インタ
ーフェロンのアミノ酸配列ヲ有するポリペプチドを含む
培養物。
Priority Applications (16)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58132524A JP2551746B2 (ja) | 1983-07-19 | 1983-07-19 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
| EP84304901A EP0134673B1 (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Improved plasmid vector and use thereof |
| NZ208942A NZ208942A (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Plasmid comprising promoter region and shine-dalgarno sequence of e. coli lipoprotein gene; production of human immune interferon by e. coli transformant |
| AU30786/84A AU575331B2 (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Improved e. coli plasmid containing modified 5' cipoprotein sequence |
| AT84304901T ATE68206T1 (de) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Plasmidvektor und seine verwendung. |
| ZA845543A ZA845543B (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Improved plasmid vector and use thereof |
| IE1853/84A IE57985B1 (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Improved plasmid vector and use thereof |
| GB08418273A GB2143535B (en) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Improved plasmid vector and use thereof |
| KR1019840004220A KR850001286A (ko) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | 개량 플라스미드 벡타의 제조방법 |
| DE8484304901T DE3485148D1 (de) | 1983-07-19 | 1984-07-18 | Plasmidvektor und seine verwendung. |
| CA000459269A CA1338900C (en) | 1983-07-19 | 1984-07-19 | Escherichia coli plasmid vector with lipoprotein promoter and modified shine-dalgarno sequence |
| CH3542/84A CH666284A5 (fr) | 1983-07-19 | 1984-07-19 | Vecteur plasmide d'escherichia coli ameliore et son utilisation. |
| MX841004U MX7726E (es) | 1983-07-19 | 1984-07-19 | Proceso biotecnologico para producir el vector plasmido de escherichia coli |
| IL72449A IL72449A (en) | 1983-07-19 | 1984-07-19 | Plasmid and escherichia coli transformant obtained therewith for producing human immune interferon |
| FR8412103A FR2550800B1 (fr) | 1983-07-19 | 1984-07-19 | Vecteur plasmide ameliore et son utilisation |
| US08/915,851 US5955307A (en) | 1983-07-19 | 1997-08-21 | Plasmid vector and use thereof for the production of interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58132524A JP2551746B2 (ja) | 1983-07-19 | 1983-07-19 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6024187A true JPS6024187A (ja) | 1985-02-06 |
| JP2551746B2 JP2551746B2 (ja) | 1996-11-06 |
Family
ID=15083315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58132524A Expired - Lifetime JP2551746B2 (ja) | 1983-07-19 | 1983-07-19 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5955307A (ja) |
| EP (1) | EP0134673B1 (ja) |
| JP (1) | JP2551746B2 (ja) |
| KR (1) | KR850001286A (ja) |
| AT (1) | ATE68206T1 (ja) |
| AU (1) | AU575331B2 (ja) |
| CA (1) | CA1338900C (ja) |
| CH (1) | CH666284A5 (ja) |
| DE (1) | DE3485148D1 (ja) |
| FR (1) | FR2550800B1 (ja) |
| GB (1) | GB2143535B (ja) |
| IE (1) | IE57985B1 (ja) |
| IL (1) | IL72449A (ja) |
| MX (1) | MX7726E (ja) |
| NZ (1) | NZ208942A (ja) |
| ZA (1) | ZA845543B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502656A (ja) * | 1985-04-03 | 1987-10-15 | ノルデイスク・ゲントフテ・エ−・エス | Ｄｎａ配列体 |
| JPH0744457U (ja) * | 1994-08-29 | 1995-11-21 | エヌティエヌ株式会社 | スライド装置 |
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|---|---|---|---|---|
| JPS60172999A (ja) * | 1983-12-20 | 1985-09-06 | Suntory Ltd | 新規な塩基性ポリペプチドおよびその製造法 |
| US5391485A (en) * | 1985-08-06 | 1995-02-21 | Immunex Corporation | DNAs encoding analog GM-CSF molecules displaying resistance to proteases which cleave at adjacent dibasic residues |
| WO1987002037A1 (en) * | 1985-09-26 | 1987-04-09 | Genetics Institute, Inc. | Pulmonary surfactant proteins |
| JPS63102695A (ja) * | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Chisso Corp | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
| GB2429207A (en) | 2004-02-02 | 2007-02-21 | Ambrx Inc | Modified human interferon polypeptides and their uses |
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|---|---|---|---|---|
| JPS589687A (ja) * | 1981-06-17 | 1983-01-20 | セルテク リミテッド | ポリペプチドの生産方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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