JPH01165384A - 魚類成長ホルモン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新しい魚類成長ホルモン、より詳細にはマダ
イ（Ｐａｇｒｕｓ　ｍａｊｏｒ　）成長ホルモン（Ｇ　
ｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　；　Ｇ　Ｈ）ポリペプチ
ド、これをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む
ベクター、該ベクターで形質転換された組換え体細胞（
形質転換細胞）、該細胞を利用した上記魚類成長ホルモ
ンの製造法に関する。

従来の技術 成長ホルモン（ＧＨ）とは、ヒト及びその他の各種動物
の脳下垂体から分泌され、これら動物の成長促進作用を
発揮するポリペプチドであり、特にヒトではその分泌異
常によって、小人症、先端巨大症等の疾患を生じること
がよく知られている（鎖目和夫、三浦・鎖目編「ポリペ
プチドホルモン」、朝倉書店、第１７７〜１９１頁（１
９７３年））。

従来よりヒト脳下垂体から抽出されたＧＨは、ＧＨの欠
損乃至分泌機能障害によって起こる小人症の治療の目的
で臨床的に用いられているが、その供給量は極めて微量
で、充分な治療を行なうには不充分でおる〔鎖目、日本
内分泌学会誌、立夏。

１４９２−１５０２　（１９８４））。

一方、家畜、魚類等の成長促進、増肉等の面でも、２等
動物のＧＨの有用性はおおいに期待されるが、上記と同
様の理由により、かかる用途面でのＧＨの研究、開発は
殆んど進行していない。

また、ＧＨは種属特異性が高く、異種動物由来のＧＨの
転用は困難でおるとされており〔上記文献（１９７３）
）、この面からもＧＨの研究は進んでいない。

上記ＧＨの化学構造についての最初の報告はリーら（Ｃ
，Ｈ，Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ、）によってなされ（Ｌ、　Ａ
ｍｅｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８８．２０５０　（１９６６）　
）　、その後、遺伝子の単離及び構造解析技術より、各
種動物のＧＨ，例えばヒトＧＨ（Ｊ、Ｈ’、）ｌａｒｔ
ｉａｌ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　、　　２０５．　６０２　（１９７９
）　）　、ラットＧＨ（Ｐ、Ｈ，５ｅｅｂｕｒｃ＋　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２７０゜４８６　（
１９７７））、ウシＧＨ及びブタＧＨ（Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅ
ｂｒｕｇ　ｅｔ　ａｔ、、　ＤＮＡ、　２．３７（１９
８３））、ヒツジＧＨ（特開昭６０−１１５５７号公報
〕、ニワトリＧＨ及びシチメンチョウＧＨ（特開昭５９
−５０１８５２号公報）、シロザケＧＨ（Ｓｅｋｉｎｅ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、且、４３０６（１９８５）、ウナ
ギＧＨ（特開昭６２−２２８００＠公報〕等の＠造が明
らかにされた。また之等に伴って、各種ＧＨ３ｆｆ仏子
も明らかになり、単離された２等遺伝子を用いて、遺伝
子組換え技術によるＧＨの製造も種々検討されつつあり
、かくして得られた組換え体ＧＨの実用性の検討も報告
されてきている（Ｋ、■ａｋａｎｏ　　ｅｔ　　ａｌ、
、Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ、Ｊａｐａｎ、　　５゜５８９
　（１９８６）等参照〕。

上記各種ＧＨが食料資源としての養殖魚、殊に主要海産
養殖魚でおるマダイ、ブリ、ヒラメ等に応用できれば、
その実用価値は非常に高いが、ＧＨの種属特異性を考慮
すれば、上記各種哺乳動物ＧＨについての研究成果は、
養殖魚に関しては全く役立たない。シロザケ、ウナギ等
の魚類についての報告もまた、之等とマダイ等とは分類
学上大きな隔たりがあり、その応用可能性は非常に低い
。従って、瑛在上記主要海産養殖魚類、中でも特に成長
の遅いマダイのＧＨの構造解析及びその量産化技術の確
立が、斯界で切望されている。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記斯界で切望されているマダイのＧ
Ｈを、遺伝子組換え技術を利用して、容易に高純度で且
つ大量に製造可能とする新しい技術を確立することにあ
る。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、遺
伝子組換え技術によるマダイＧＨの製造に有用なマダイ
ＧＨのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ配列）
をはじめて単離し、その構造決定に成功した。また該遺
伝子を含むベクターの構築、該ベクターを保有する組換
え体細胞の造成、かくして得られる組換え体細胞の培養
による目的マダイＧＨの製造、単離に成功し、ここに本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば下記式（１）のアミノ酸配列を有
する新規なポリペプチド（魚類成長ホルモン）が提供さ
れる。

式（１）： ％式％ 本明細書において、ペプチド及びアミノ酸、核酸塩基及
びＤＮＡ配列並びにその他の略号による表示は、Ｉｔ、
ＩＰＡｃ−ＩＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号
に従うものでおる。

また、本明細書に記載のポリペプチドにおけるアミノ酸
番号は、上記式（１）に示す魚類ＧＨアミノ酸配列のア
ミン末端（Ｎ末端）のＧｌｎを１とし、カルボキシ末端
（Ｃ末端）方向に向かって順次１ずつ加えて表示する。

上記Ｎ末端より前にアミノ酸配列が付加される場合は、
直前のアミノ酸を−１とし、以下順次１ずつ除して表示
する。

また本発明によれば、上記式（１）の魚類ＧＨポリペプ
チドを含むアミノ酸配列をコードする魚類成長ホルモン
遺伝子（以下「本発明遺伝子」という〉か提供される。

本発明遺伝子は、これを利用して遺伝子組換え技術によ
り、本発明のマダイＧＨを容易且つ大量に製造可能とす
るものでおり、これにより得られるマダイＧＨは、魚類
養殖産業分野において非常に価値あるものでおる。

税在、各種動物由来のＧＨのアミノ酸配列は知られてい
るか、マダイＧＨのそれについてはいまだ報告がなく、
また本発明により解明されたマダイＧＨのアミノ酸配列
は公知のいかなるＧＨのそれとも異なっている。因みに
本発明マダイＧＨのアミノ酸配列はヒトＧＨとは僅かに
３３％しか相同せず、シロザケＧＨとは約６８％、ウナ
ギＧＨとは約４５％の相同性の認められるものでおる。

以下、本発明遺伝子につき詳述すれば、本発明遺伝子は
、前記式（１）で表わされる魚類ＧＨポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を包含している。該
ＤＮＡ配列の具体例は下記式（４）に示す通りである。

式（４）： ％式％ しかして、本発明遺伝子は、魚類成長ホルモン（マダイ
ＧＨ）のアミノ酸配列をコードするものであり且つこれ
を利用して遺伝子工学的手法によりｊｑられる物質がマ
ダイＧＨの活性を発揮できるものである限り、上記式（
４）に示されるＤＮＡ配列に限定されるものではない。

例えば上記式（１）のアミノ酸配列を構成する各アミノ
酸について、それぞれ知られている１〜６種類のＤＮＡ
コドンの中から任意のコドンを選択して構成される改変
されたＤＮＡ配列もまた之等がマダイＧＨ活性発現を可
能とする限り本発明遺伝子に包含される。また上記式（
４）に示されるＤＮＡ配列を基本として、その５′末端
にＭｅｔのコドンであるＡ丁Ｇを付加したＤＮＡ配列や
之等の［）ＮＡ配列の３′末端に終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＡＧ。

ＴＧＡ等を付加したＤＮＡ配列も本発明遺伝子に包含さ
れる。

更に、マダイＧＨのアミノ酸配列も、これがマダイＧＨ
の活性を発揮するものである限り、前記式（１）で表わ
されるものに限定されるものではない。遺伝子組換え技
術によりマダイＧＨ発現ベクターを創製し、該ベクター
を組込んで得られる宿主細胞が実際に上記マダイＧＨを
発瑛できる限り、その任意の一部、例えばＮ末端部又は
Ｃ末端部のアミノ酸配列の一部を欠失するか、之等を他
のアミノ酸配列に置換させるか、或いは之等に更に任意
のアミノ酸配列を付加することによって改変されたもの
であってもよい。２等改変されたアミノ酸配列をコード
するＤＮＡ配列も本発明遺伝子に包含される。かかる改
変されたアミノ酸配列には、より具体的には、式（１）
のアミノ酸配列のアミン末端に更に５０個以下のアミノ
酸配列が付加されたアミノ酸配列が包含される。その具
体例としては、後記実施例において詳述するマダイＧＨ
の前駆体のアミノ酸配列やマダイＧＨとシグナルペプチ
ドとが連結された融合ポリペプチドのアミノ酸配列を例
示できる。

また本発明遺伝子には、マダイＧＨの産生細胞であるマ
ダイ脳下垂体からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳
型として合成されるｃＤＮＡのＤＮＡ配列も当然に包含
される。

本発明遺伝子は、以下に示す各種の方法により製造する
ことができる。該方法としては、例えば上記マダイＧＨ
の産生細胞であるマダイ脳下垂体からポリ（Ａ＞ＲＮＡ
８−調製し、これを鋳型としてＣＤＮＡを合成し、これ
を適当なベクターに接続して宿主細胞内で増幅させ、目
的のマダイＧＨのｃＤＮＡを有するクローンを選別し、
該クローンの有するベクターより単離する方法、本発明
遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、例えばホスホアミダイ
ト法（Ｎａｔｕｒｅ、　　３１０．　１０５　（１９８
４＞　）等の常法に従って、核酸の化学合成を行なう方
法、之等の組合せ等を例示できる。

以下、上記マダイの脳下垂体から調製単離する方法につ
いて詳述する。

本発明遺伝子を入手するためのマダイの脳下垂体として
は、養殖マダイ及び天然マダイのいずれからでも摘出で
きるが、養殖マダイを用いるのが、−時に大きざの揃っ
た多数の個体を用意できるので有利である。摘出は常法
に従うことができ、かくして得られる脳下垂体は、即座
に液体窒素、ドライアイス−エタノール等を用いて凍結
させた後、ＲＮＡの抽出に用いるのが望ましい。上記Ｒ
ＮＡの抽出操作は、通常の方法、例えばチオシアン酸グ
アニジン−塩化セシウム法（ＣｈｉｒｇＷｉｎ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１８．　５２９４　（
１９７９）　）、チオシアン酸グアニジン−フェノール
・クロロホルム法等に従うこととができる。上記チオシ
アン酸グアニジン−塩化セシウム法は、より詳しくは、
まず凍結脳下垂体をチオシアン酸グアニジン、クエン酸
ナトリウム、Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナトリウム、
β−メルカプトエタノール等の混合液中で、機械的に破
砕、可溶化し、次いで塩化セシウムを含む水溶液上に重
層し、超遠心を行なうことにより実施される。かくして
沈澱としてＲＮＡを得ることができる。該沈澱中には、
ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等の不純物が含まれているため、目
的とするポリＡ鎖を有するＲＮＡを、通常の方法に従い
精製する。これは例えばオリゴｄ’Ｔ−セルロース［コ
ラボレイティプ　リサーチ社］等のアフィニティカラム
を用いて有利に実施できる。

かくして得られるポリ（Ａ）ＲＮＡは、これを鋳型とし
て、例えば逆転写酵素を用いて二本鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮ
Ａ）の合成に供することができる。

このＣＤＮＡの合成は、通常の方法、例えばＳ１ヌクレ
アーゼ法、オカヤマーベルグ法（Ｏｋａｙａｍａｅｔ　
ａｌ、、Ｈｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ！、、　３．２８０
−２８９（１９８３））等により行ない得るが、実用的
には、例えばアマジャム社等から市販されているＣＤＮ
Ａ合成キットを用いて実施するのが便利でおる。

次いで、上記方法では、得られるＣＤＮＡから目的とす
るマダイＧＨのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を
単離する。このＤＮＡの単離は、ＣＤＮＡを適当なベク
ターに挿入し、このベクターを宿主に導入して増幅させ
ると共に該ＤＮＡ配列を含む宿主のプラーク又はコロニ
ーとして個別化した上で、目的のＤＮＡ配列を選択する
ことにより実施される。ここでＣＤＮＡの挿入に用いら
れるベクターとしては、通常のもの、例えばλフアージ
由来の各種ファージＤＮＡ、ｐＢＲ３２２をはじめとす
る各種プラスミド等を例示できる。

上記ファージＤＮＡをベクターとする場合は、容易に多
数の候補株を調製、スクリーニングできる利点がある。

殊に例えばλｇｔ１０ＤＮＡは、外来ＤＮＡ配列が挿入
されたベクターのみ宿主細胞ＮＭ５１４株に対してプラ
ークを形成する特徴があり、上記ベクターとしてより有
利に利用できる。

上記ベクターへのＣＤＮＡの挿入は、合成リンカ−を用
いる方法、ホモポリマー法等の通常の方法により行なう
ことができ、例えばＣＤＮＡの両末端にＥＣＯＲニリン
カーを付加した後、制限酵素ＥＣ０ＲＩで切断し、これ
をベクターのＥＣＯＲ工切断部位に挿入すればよく、こ
れにより所望の組換えベクターを得ることができる。ま
た得られる組換えベクターの宿主への導入及びこれによ
る組換えベクターの増幅と個別化は、一般に用いられて
いる各種の方法、例えば主として対数増殖期に必る細胞
を集め、Ｍ　ＣＪ　Ｓ　Ｏ４処理を行なった後、組換え
ファージを感染させる方法、或いは同様にして集めた細
胞をｃａｃＱ２処理により一自然にＤＮＡを取込みやす
い状態とし、これにベクターを取込ませる方法等により
行ない得る。更に上記組換えベクターの調製及び増幅と
個別化は、市販のＣＤＮＡクローニング用キットを用い
て行なうこともできる。

上記で得られるＣＤＮＡを含むベクターを導入された粗
換え体からの、目的ＤＮＡ配列を含む組換え体の単離は
、ベクターの種類に応じて、それぞれ公知の各種の方法
により実施できる。例えばファージＤＮＡをベクターと
する場合は、プラーレハイブリダイゼーションにより、
またプラスミドをベクターとする場合は、コロニーハイ
ブリダイゼーションにより、それぞれ有利に行ない１ｑ
る。

之等各方法は、いずれもハームスとヒギンズ（Ｂ。

Ｈ，ＨａｍｅＳ　ａｎｄ　Ｓ、Ｊ、旧ｇｇ　ｉ　ｎｓ）
により編集、された「ヌクレイツク　アシッド　ハイブ
リダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂ
ｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）　ｊ　　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ
。

１９８５）に詳述されている。２等方法は、−組換え体
のＤＮＡをナイロンメンブラン等のフィルター上に固定
し、これを標識したプローブと反応させれば、プローブ
は目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するという性質を利
用して、目的の組換え体を単離するものである。ここで
プローブとは、目的のＤＮＡ配列に対して相補的な配列
を有する核酸配列でおり、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが
、化学合成したＤＮＡ配列を用いるのが一般的でありま
た有利でおる。上記プローブのＤＮＡ配列は、目的とす
るマダイＧＨの部分アミノ酸配列に基づいて設定するこ
とができ、また上記マダイＧ１−１遺伝子の少なくとも
一部は、シロザケＧＨＭ伝子のそれとかなり相同性が高
いと考えられるため、かかる相同性の高い既知のシロザ
ケＧＨのＣＤＮＡ配列部分を上記プローブとして利用す
ることも可能でおる。

かくして単離される組換え体中に、本発明遺伝子が含ま
れている。

尚、上記において採用される各種の操作、例えば一部Ｄ
ＮＡの化学合成、ＤＮＡ鎖の切断、削除、付加乃至結合
を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選
択等は、いずれも常法に従うことができる。より具体的
には、上記ＤＮＡの単離精製は、アガロースゲル電気泳
動法等に従うことができ、核酸配列の］トンの一部改変
は、サイトスペシフィック　ミュータジエネシス（Ｓｉ
ｔｅ−３ｒ、ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｈｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
）　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

８１．５６６２−５６６６　（１９８４））等に従えば
よい。

また上記で得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決定は
、サンガー法（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、。

Ｇｅｎｅ、　３３．１０３（１９８５））やマキサム−
ギルバート法（Ａ、門、ＭａＸａｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１
１ｂｅピ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｘｙｍｏｌｏｇＶ、６５．
４９９−５６０（１９８０））等により行ない得る。尚
ファージＤＮＡベクターとして得られる組換え体のＤＮ
Ａ配列の決定に当たっては、該ベクターは分子量が大き
いため、予め上記組換え体中のＣＤＮＡ部分を適当なベ
クター、例えばｐＵＣｌ　９、ＤＢＲ３２２等に移しか
えてから、そのＤＮＡ配列の決定を行なうのが好ましい
。

更に、上記ＤＮＡ配列の決定は市販のシーケンスキット
等を用いることによっても、容易に行ない得る。

上記により、各種の文献〔例えばＪ、　Ｅ、　Ｄａｒｎ
ｅｉ　ｌｅｔ　ａｔ、、　”Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、　５ｃｉｅｒ＋ｔｉｆｉｃＡ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ　（１９８６）　）の記載
を参考にして、組換え体中に含まれる目的のマダイＧＨ
遺伝子を含むＤＮＡ配列、その中の本発明遺伝子のＤＮ
Ａ配列及びマダイＧＨのアミノ酸配列を決定できる。

かくして決定された目的のマグ１０日遺伝子を含むＤＮ
Ａ配列及び対応するアミノ酸配列は、下記式（５）に示
される通りである。これは正確には、マダイＧＨ前駆体
のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。即ち、このＤＮ
Ａ配列はマダイＧＨのアミノ酸配列のＮ末端にシグナル
ペプチドのアミノ酸配列の付加されたアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列となっており、マダイＧＨが上記前
駆体としてまず生合成され、その後シグナルペプチド部
分が除去される分泌性の蛋白質でおることを明らかにし
ている。上記マダイＧＨ前駆体アミノ酸配列中のシグナ
ルペプチド部分のアミノ酸配列は、例えばｖｏｎ　Ｈｅ
１ｊｎｅの方法（ＮｕＣｌ、ＡＣｉｄＳＲｅｓ、、１４
．４６８３　（１９８６））に従い決定できる。それに
よれば、マダイＧＨ前駆体のシグナルペプチドは、前記
式（５）に示されるように、成熟マダイＧＨのアミノ酸
配列のＮ端に付加された１７アミノ酸残基（−１７〜−
１）に相当し、マダイＧＨ前駆体から該シグナルペプチ
ド部分が除去されて生成する成熟マダイＧＨは、前記式
（１）のアミノ酸配列からなることが明らかとなった。

尚、本発明者らの研究によれば、マダイＧＨのＮ末端ア
ミノ酸残塁は上記シグナルペプチドの除去に伴って、前
記式（１）で示されるＧｌｎ（グルタミン）からｐ−Ｇ
ｌｕ（ピログルタミン酸〉に変換されるものとみなされ
る。

式（５）： ％式％ ＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ上記により得られる本発明のマダ
イＧＨ遺伝子を含むベクターの具体例としては、後記実
施例に詳述するｐＴＧＨＥｌ　１を例示できる。該ベク
ターｐＴＧＨＥ１１は、大きざ３．６キロベースベアー
ズ（ｋｂｐ）のプラスミドであり、前記式（１）に示し
たマダイＧＨをコードするＤＮＡ配列と共に、アンピシ
リン耐性遺伝子を保有している。

本発明者らは、該ベクターｐＴＧＨＥ１１を、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株に保有させ、該大腸菌を通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（微工研）に微工研条奇第１４
５７号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ１４５７）として寄託した。

本発明遺伝子は、上記ベクターより制限酵素を利用する
常法に従い取り出すことができる。またこの本発明遺伝
子の利用によれば、遺伝子組換え技術に従って、高純度
のマダイＧＨを容易に且つ大量に製造することができる
。

このマダイＧＨの製造は、本発明遺伝子を利用すること
を除いて、基本的には通常の遺伝子組換え技術に従うこ
とができる。より詳しくは、本発明遺伝子が宿主細胞中
で発現されるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主
細胞に導入して形質転換させ、該形質転換株を培養すれ
ばよい。

ここで宿主細胞としての代表例としては、大腸菌に１２
株由来のＨ８１０１株（Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ
Ｄ、Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、、Ｊ、Ｈｏ１
．ｌ３ｉｏ１．、４１　、４５９−４７２　（１９６９
））、同ＪＭ１０３株（Ｊ。

）１ｅｓｓｉｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　八ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　９゜３０９　（
１９８１））、同ＪＭ１０９株（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　３３．１０３（
１９８５））等を例示できるが、他の公知の各種大腸菌
株も同様に宿主細胞として利用できる。

宿主細胞によるマダイＧＨの産生は、大別してＮ末端に
シグナルペプチドを持たない形で宿主の細胞質内に産生
させる場合と、シグナルペプチドを利用して宿主細胞か
ら分泌産生させる場合とに別れる。いずれの場合も、目
的ポリペプチドのＮ末端は開始コドンに由来するメチオ
ニン（ｆＭｅｔ）でおり、またＣ末端をコードするＤＮ
Ａ配列は、その直接に終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＡ
Ｇ又はＴＧＡを有するものとされる。従って本発明遺伝
子には、かかる開始コドンと終止コドンとが必須となる
。

上記開始コドン等の付与された本発明遺伝子によりコー
ドされるアミノ酸配列の例は、下記式（２）、（３）及
び（６）で表わされる。

式（２）： ％式％ ＡＳｐ−王ｙｒ−１１ｅ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−１
１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−）ｉｅｔ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｈｉ　ｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｕ−八５ｐ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇｌｕ−１１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＬｅｔＪ−Ａｌａ−ＰｒＯ−Ｔｌ／ｒ
−Ｇｌｙ−ＡＳｎ−丁ｙｒ−Ｔｙｒ−ＧＩ　ｎ−ｓｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒ旧ｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ 式（３）： ％式％ ］ 式（６）： Ｎｅｔ−３ｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−ｔｌｉｓ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−１ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａ　１ａ−Ａ　ｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−１１ｅ−丁ｈｒ−Ａｓｐ−ＧＩｙ−，Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−１１ｅ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−３ｅｒ−八ｒｇ−ｖａｌ　−Ｇｌｎ−旧ｓ−Ｌ
ｅｕ−ｔｌｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｕ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃ
ｙｓ−Ａｓｎ−３ｅｒ−八５ｐ−Ｔｙｒ−１１ｅ−１１
ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−ＡＳｐ−ＬｙＳ−旧ｓ−
Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｖ
ａｌ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−１
１ｅ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−へＩ”ｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇ
ＩＵ−３ｅｌ’−丁ｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３
ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−ＬｅＵ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−＾５ｎ−Ｇｌｎ
−１１ｅ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−
Ｇｉｕ−ＬｅｌＪ−ＬｙＳ−８８℃−Ｇｌｙ−Ｉ！ｅ−
１−１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−八５ｎ−Ｇｌｕ−，Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡＳｐ−３ｅｌ”−３ｅ
ｒ−八Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−
３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−八ｌａ−ＡＳｐ−Ｇｌｕ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−八ｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−旧５＝ＬｙＳ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−王ｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−八１
ａ−ＬｙＳ−Ｃ１，）Ｓ−Ａｒ（］−］Ｌｅｕ−３ｅｐ
−Ｐｒｏ−ＧｌｕＡｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕまた、前記式（５）に示されるマダイＧＨのＧＤＮ
Ａ配列中には、既に終止コドン（ＴＡＧ＞が存在してお
り、これは改めて終止コドンを導入することなく本発明
遺伝子として利用することができる。

本発明によれば特に、シグナルペプチドを用いてマダイ
ＧＨを宿主細胞から分泌発現、即ち該宿主細胞の細胞外
あるいは宿主細胞がダラム陰性細菌の場合はそのペリプ
ラズム空間内に、目的マダイＧＨをシグナルペプチドを
除去された成熟ポリペプチドとして発現させるマダイＧ
Ｈの製造法か提供される。従って本発明には、かかる分
泌発現のための、シグナルペプチドとマダイＧＨのアミ
ノ酸配列とが連結された融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む分泌発現ベクター４、
該ベクターを保有する宿主細胞等が包含される。

上記シグナルペプチドとマダイＧＨのアミノ酸配列とが
連結された融合ポリペプチドの具体例としては、前述し
た式（２）で表わされるアミノ酸配列、即ちマダイＧＨ
自体のシグナルペプチドを有するマダイＧＨ前駆体蛋白
質のアミノ酸配列を例示できる。また、該融合ポリペプ
チドを構成するシグナルペプチドは、上記マダイＧＨ自
体のシグナルペプチドには限定されず、利用する宿主細
胞の種類に応じて公知の各種のものであることができる
。その代表例としては、細菌の分泌蛋白質前駆体のそれ
らを例示できる。これには例えば宿主細胞がグラム陽性
細菌の場合は、大腸菌β−ラクタマーゼ（ｂｌａ　）　
、リン酸結合蛋白質（ｐｓｔｓ　）、アルカリフォスフ
１ターゼ（ｐｈｏＡ　）等が、グラム陽性細菌の場合は
、バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃ　ｉ　
Ｉ　Ｉｕｓ　ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃ　１ｅｎｓ
）の中性プロテアーゼ等がそれぞれ含まれる。更に、宿
主細胞が動物細胞の場合は、上記シグナルペプチドとし
て、例えば成長ホルモン、ＩＬ−２、プロインシュリン
等の前駆体蛋白質等を利用することもできる。

かかるマダイＧＨ自体のシグナルペプチド以外のシグナ
ルペプドを利用した具体例としては、前記式（６）に示
す大腸菌β−ラクタマーゼのシグナルペプチドをマダイ
ＧＨのアミノ酸配列に連結させた融合ポリペプチドのア
ミノ酸配列を例示できる。

２等シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、化学
合成することもできるし、天然のＤＮＡ配列を利用する
こともできる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列を含んでおり、本発明に有利に利用できるベクターの
具体例としては、本願人の別途出願に係わる特願昭６２
”−３６４９８号（特開昭６３−２０２３８７＠公報参
照）に記載のＤＫＴＮを例示できる。該ｐＫＴＮは、ｂ
ｌａシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで
おり、これを保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、微工研に
「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ＪＨ−１０３
，ｐにＴＮ−２−２Ｊなる表示で、微工研条奇第１３９
８号（ＦＥＲＭＢＰ−１３９８＞として寄託されている
。

上記シグナルペプチドとマダイＧＨのアミノ酸配列とが
連結された融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の
具体例としては、前記式（５）に示されたアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ配列（前記式（２）に示したもの）
、及び前記式（６）のアミノ酸配列をコードする下式（
７）のＤＮＡ配列を例示することができる。

式（７）： ％式％ 上記式（７）のＤＮＡ配列は、例えば前記ベクターｐＫ
ＴＮを制限酵素Ｎａｅ工で切断して得られるＤＮＡ断片
と前記式（５）に示したＤＮＡ配列を含む２重鎖ＤＮＡ
断片とを、下式（８）で表わされるＤＮＡ配列を介して
連結させることにより得られる。

式（８）： ％式％ 本発明遺伝子を利用したマダイＧＨ発現ベクターの構築
は、この種遺伝予相換え技術に慣用される通常の方法に
従い実施できる。該方法に用いられる各種操作乃至手法
は、一部前述した′通りであり、各種制限酵素による切
断処理、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いる連結処理、アガ
ロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法等の単離、精製処理、フェノール抽出法による回収
、精製処理等を包含する。またｊｑられるベクターの確
認も常法に従って、例えばそのＤＮＡ配列を前記マキサ
ム−ギルバート法で解析するか、ミニプレバレージョン
やマツピング法により遺伝子の挿入やその方向を確認す
る方法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔａｌ、、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　７．１５１３
−１５２３　（１９７９））等によることができる。

上記マダイＧＨ発現ベクターの構築に利用される起源ベ
クターしては、特に制限はなく、従来公知の種々のもの
でよく、これには例えばバタテリオファージ及び動物ウ
ィルスを含む各種ウィルスベクター、各種プラスミド、
コスミド等か包含される。之等の内では特にＤＢＲ３２
２又はこれに由来する各種の確立されたプラスミドベク
ターが好適である。

また、上記発現ベクターには、これが宿主細胞内に導入
されて目的とするマダイＧＨを実際に発現するために、
本発明遺伝子の外に、その発現に必要な各種の遺伝情報
、例えばプロモーター、転写終結信号、ポリＡ鎖付加信
号（真核細胞を宿主とする場合）等の転写のための情報
やりボゾーム結合部位（シャイン・ダルガルノ配列、Ｓ
Ｄ配列）等の翻訳のための情報等が必要でおる。かかる
情報は、宿主細胞に応じてそれぞれよく知られてあり、
例えばプロモーターとしては、大腸菌に対するｔｒｐプ
ロモーター、ｒｅｃプロモーター、ＡＰＬプロモーター
、Ｉｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等、枯草菌
に対する５ｐｏｉプロモーター、５ＰＯ２プロモーター
、ｐｅｎプロモーター等、酵母その他の真核細胞に対す
るＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＳＶ４０由来プロ
モーター等を例示できる。之等の遺伝情報は、目的とす
るマダイＧＨ発現ベクターの構築に当たって、之等を含
むプラスミド等を選択して起源ベクターとして用いるこ
とにより、又は之等を含むプラスミド等より常法に従い
単離するか、化学合成した後、適当なベクターに組込む
ことにより、それぞれ所望ベクターに導入存在ざぜるこ
とかできる。

かくして所望のマダイＧＨ発現ベクターを収得できる。

本発明のマダイＧＨ発現ベクターは、上記のように本発
明遺伝子の上流にプロモーター及びリボゾーム結合部位
を、また下流に転写終結信号を、それぞ連結されてなる
一組のマダイＧＨ発現情報単位を有することにより特徴
付けられる。

かかるマダイＧＨ発現ベクターの具体例としては、後記
実施例に詳述する方法により得られる分泌発現ベクター
ｐＴＧＨ１１０１を挙げることかできる。該ｐＴＧＨ１
１０１は約５　、　ＯＯｋｂｔ）の大きざのプラスミド
で必り、前記式（６）のアミノ酸配列をコードする前記
式（７）のＤＮＡ配列（マダイＧＨ遺伝子）を有してお
り、該遺伝子の上流に＋ａＣＺ遺伝子のりポゾーム結合
部位とその上流に位置するｔａｃプロモーターが存在し
てあり、上記マダイＧＨ遺伝子のＤＮＡ配列の下流には
β−ラクタマーゼ遺伝子の転写終結信号が含まれている
。更に該ｐＴＧＨ１１０１はテトラサイクリン耐性遺伝
子を有してあり、これを保有する宿主細胞はテトラサイ
タリン耐性となる。該ｐＴＧＨ１１０１を保有させた大
腸菌）−１８１０１株は、微工研にｒＨＢｌｏｌ　［ｐ
ＴＧＨ１１０１］Ｊなる表示にて寄託されており、その
寄託番号は「微工研条奇第２０４４号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２０４４＞である。

また、本発明者らの研究によれば、同一ベクター内に上
記マダイＧＨ発現情報単位の二組以上を保有させたベク
ターによれば、所望のマダイＧＨの生産性が高められる
場合のめることが見出された。従って、本発明はかかる
マダイＧＨ発現情報単位の複数個を保有するベクターを
も提供するものでおる。

本発明マダイ発現ベクターは、これを適当な宿主細胞に
導入（形質転換）させることによって、該宿主細胞に所
望のマダイＧＨ産生能を付与できる。ここで用いられる
宿主細胞は、上記したように大腸菌由来のものであるの
が好適でおるが、特にこれに限定されるものではなく、
大腸菌以外のグラム陽性細菌や枯草菌等のグラム陽性細
菌、放線菌等の原核細胞、酵母、動植物細胞等の真核細
胞のいずれでもよい。

上記宿主細胞への本発明マダイＧＨ発現ベクターの導入
及びこれによる形質転換の方法は、一般に用いられてい
る各種の方法に従うことができ、例えば宿主細胞を低温
で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し、該溶液中に
ベクターを添加する方法（Ｅ、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　ａ
ｎｄ　Ｓ、Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１１９．１０７２　（１９７４））等によることができ
る。

かくして、本発明ベクターを導入されて形質転換された
細胞を収得できる。本発明は、かかるマダイＧＨ発現ベ
クターを保有し、マダイＧＨ産生能を有する形質転換細
胞をも提供するものである。

上記形質転換細胞は、これを通常の細胞培養用培地で培
養することにより、マダイＧＨを生産、蓄積できる。該
細胞の培養に利用できる培地としては、例えばＬ培地、
Ｅ培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地等の各種のものをいずれ
も使用できる。また２等培地には更に通常知られている
各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天然物抽
出物、生理活性物質等を添加存在させることができる。

形質転換細胞の培養は、該細胞の生育に適したｐＨ１温
度、通気、撹拌等の条件を採用した各種方法により実施
できる。例えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５〜Ｂの範囲
、特にｐＨ７付近が適当であり、約２０〜４３℃の温度
で、通気撹拌条件下で培養するのが望ましく、培養のス
ケールは特に限定はない。上記培養により、通常約５〜
９０Ｒ間で培養懸濁液中に、所望のマダイＧＨが蓄積さ
れる。

かくして蓄積されるマダイＧＨは、通常の操作により分
離採取できる。該操作としては、例えば細胞の超音波破
砕、機械的破砕、凍結融解、浸透圧ショック等による抽
出操作や培養上清の分離操作等を例示できる。

更に上記により分離される目的のマダイＧＨは、その物
理学的性質や化学的性質を利用した各種の精製操作によ
り精製することができる。該精製操作としては、例えば
通常の蛋白沈澱剤を利用する沈澱処理、限外濾過処理、
ゲル済過処理、吸着クロマトグラフィー処理、イオン交
換クロマトグラフィー処理、アフィニティクロマトグラ
フィー処理、高速液体クロマトグラフィー処理等及び之
等各処理の組合せ等を採用できる。

上記により、工業的規模で、容易に、しかも高純度、高
収率で本発明のマダイＧＨを製造できる。

得られるマダイＧＨは、通常の方法、例えば５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Ｒ，Ｆ。

５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｐ、Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎに、　
”Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ＨｅｔｈＯｄＳｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　１３ｉｏ１ｏｇｙ”　、　Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８１＞）にかり、クマーシーブ
リリアントブルー等で染色することにより検出できる。

また、得られるマダイＧＨの生物活性は、例えばセキネ
ら（Ｓ、５ｅｋｉｎｅ　ｅｔ　ａｔ）の文献（ＰｒＯＣ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　ＩＪＳＡ、旦２．
４３０６−４３１０（１９８５））やダウンら（Ｎ、Ｅ
、　（Ｔｅｄ）　Ｄｏｗｎ　ｅｔａｌ）の文献（Ａｑｕ
ａＣＵＩｔｕｒｅ、　６旦、１４’１−１５５（１９８
８＞）等に記載された方法に準じて確認できる。より具
体的には、例えばマダイ幼魚に筋注、腹腔的投与等の方
法により、魚体重１ｇ当たり約０．１．１又は１０μｑ
程度のマダイＧＨを７日毎に投与し、その体重及び体長
の増加を対照とするＧＨ非投与魚のそれらと比較するこ
とにより容易に実施できる。本発明マダイＧＨは上記生
物活性試験により、顕著なＧＨ活性を有することが明ら
かにされた。

かかる優れたマダイＧＨ活性を有する本発明のマ弘イＧ
Ｈは、マダイ及びマダイの近縁の魚類の成長ホルモンと
して、殊に２等魚類の養殖産業分野で非常に有用である
。

友−一厘一一１ 以下、本発明遺伝子、これを含むベクター及び。

該ベクターで形質転換した宿主細胞のそれぞれの製造例
並びに上記形質転換体の培養による本発明マダイＧＨの
製造例を実施例として挙げ、本発明を更に詳）ホする。

実施例　１ マダイ脳下垂体からのポリ（Ａ＞ＲＮＡの調製平均魚体
重９００Ｃ１の養殖マグ４８０尾から摘出し、瞬時凍結
した脳下垂体を調製用材料とした。

この脳下垂体の全湿重量は約５００ｍ１ｌｌであった。

また、ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製は、チオシアン酸グアニ
ジン−塩化セシウム法（Ｃｈｉｒ＋；＋ｗｉｎ　ｅｔａ
ｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ、　１８．５２９
４　（１９７９）　）に従い、以下の通り行なった。

即ち、上記脳下垂体を、６Ｍチオシアン酸グアニジン、
５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウロイルザ
Ｊレコシン酸ナトリウム及び０．　ＩＭ　β−メルカプ
トエタノールからなる溶液の７．５鵬中で、テフロンホ
モジナイザーにて破砕（１０ストローク）して可溶化さ
せた。この可溶化物を１８Ｇ注射針に数回通してＤＮＡ
を分断し、日立ＲＰＲ２０−２０−ターにて１００００
ｒｐＩＩＩで１Ｑ分間遠心して組織片、蛋白を除き、上
清を回収した。

回収された上清約８＋ｎＱを、ベックマン５Ｗ４０Ｔｉ
用ポリアロマ−チューブ中に予め入れておいた５、７Ｍ
塩化セシウム−０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ溶液３ｍｌ上に重
層し、ベックマン５Ｗ４０Ｔｉローターにて３５００　
Ｏｒｐｍで１８時間超遠心後、ＲＮＡを沈澱として回収
した。上清をアスピレータ−を用いて完全に除去した後
、ＲＮＡの沈澱を１０ｍＭトリス塩１（ｐＨ７，５＞及
び１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液（以下「丁Ｅ」と略記す
る）０、９ｒｒＩｆＪに溶解させ、５Ｍ　　ＮａＣＱ　
０．１ｍ１２を加えて、６５°Ｃで５分間インキュベー
トし、水中で急冷した。この混合液１戒を、予め０．５
ＭＮａＣＱを含むＴＥで平衡化してあいた第１ノゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラム（ベーリンガーマンハイム山之内
社製、カラム容積０．３５１ｒｌｉ２）にかけ、吸着さ
れたＲＮＡをＴＥにて溶出させた。この溶出液５．５＋
ｎＱに、５Ｍ　　Ｎａ（、Ｑ　Ｏ，６１ｍＧを加えて、
６５°Ｃの水浴中で５分間加熱し、水中で急冷した後、
この混合液６，１１ｍ１２を、再度オリゴ（ｄＴ＞セル
ロースカラムにかけた。吸着されたＲＮＡをＴＥにて溶
出させて、０．８μｑのボリ（Ａ＞ＲＮＡを得た。

ＣＤＮＡの合成 ＣＤＮＡの合成を、ＣＤＮＡ合成キット（アマジャム社
製）を用い、該キットに添附されたプロトコールに従っ
て、以下の通り行なった。

ポリ（Ａ）ＲＮＡの０．８μｑを含む水溶液６．８μＱ
に、上記キットに含まれる５×フア一ストストランド合
成用バッファー４μＱ１ピロリン酸ナトリウム溶液１μ
Ｑ、２５単位／戒ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビタ
ー１μＱ、デオキシヌクレオシド三リン酸混液（ｄＡＴ
ＰＳｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ各々１０．１０．１
０．５ｍＭ）４１１Ｑ、２ｍＭｍＱオリゴ（ｄＴ　　　
　）プライマー１μＱ及び１８単位／戒逆転写酵素２．
２μＱをそれぞれ加えて全量を２０μＱとし、４２°Ｃ
で４０分間反応させて、ＲＮＡに相補的なりＮＡを合成
させた。

次に、得られた反応液２０μＱに、上記キットに含まれ
るセカンドストランド合成用バッファー３７．５μ９１
大腸菌リボヌクレアーゼＨ０，８単位、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩ２３単位及び蒸留水を加えて全量を９９μ
Ｑとし、−これをまず１２℃で６０分間、次に２２℃で
６０分間、最後に７０’Ｃで１０分間それぞれインキュ
ベートした。

水冷後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ４単位（１μＱ）を加
えて３７°Ｃで１０分間反応させた。この反応によりＲ
ＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換され、
完全な二本鎖ＣＤＮＡが得られた。

上記反応液に、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ＩＩ８．０
）１０μＱ及び１０％５ＤＳ１０μＱを加えて反応を停
止させ、該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、
エタノール沈澱により、二本鎖ＣＤＮＡ６０μｑを回収
した。

組　えベクターの調製 上記で合成されたＣＤＮＡを、ベクターλΩ↑１０　（
Ｔ、Ｖ、Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ、、　　”ＤＮＡ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：　Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａ
ｃｈ”　、　　Ｇｌｏｖｅｒ編、４９−７８゜ＩＲＬ　
Ｐｒｅｓｓ　　（１９８４）　）に挿入する操作を、Ｃ
ＤＮＡクローニングシステム（アマジャム社製）に添附
のプロトコールに従って、以下の通り行なった。

上記で合成したＣＤＮＡの全量を含む水溶液１３μＱに
、上記キットに含まれる５ＸＥＣＯＲＩメチラ一ゼ反応
液４μＱ、０．８ｍＭアデノシルメチオニン液２μＱ、
ＥｃｏＲＩメチラーゼ１μＱ（２０単位）を加えて全量
を２０１１２とし、混合物を３７℃で６０分間インキュ
ベートして、上記ＣＤＮＡ中に含まれているＥＣ０ＲＩ
サイトをメチル化した後、７０’Ｃで１０分間加熱して
ＥＣＯＲエメチラーゼを不活性とした。

得られた反応液２０μＱに、上記キットに含まれる１　
０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバｙｌｙ　　３μＱ。

末端をリン酸化したＥＣ０ＲＩリンカ−［５’ｄ（ｐＧ
ＧＡＡＴＴＣＣ）］　２μＱ　（１μｇ）、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ２μＱ及び蒸留水３μＱを加えて３０μＱとし
た後、１５°Ｃで１６時間反応させてＣＤ−ＮＡ末端に
ＥＣ０ＲＩリンカ−を付加し、７０″Ｃで１０分間反応
させてＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性とした。

得られた反応液３０μＱに、上記キットに含まれる１０
ＸＥｃｏＲＩバツフアー１０μＱ、制限酵素ＥＣ０ＲＩ
２μＱ及び蒸留水５８μＱを加えて１００μＱとし、３
７℃で５時間インキュベートして・、末端にＥＣ０ＲＩ
リンカ−由来のＥＣ０ＲＩ粘着末端を有するＣＤＮＡを
得た。

得られた反応液をＣＤＮＡクローニングシステムに添附
のカラムにかけ、１００ｍＭ　　ＮａＣＱを含むＴＥに
て溶出させた。これによりＥＣ０ＲＩリンカ−由来の低
分子量ＤＮＡが除去された。上記で溶出されたＥＣ０Ｒ
Ｉ粘着末端を有するＣＤＮＡをエタノール沈澱により回
収；・した。

上記で回収されたｃＤＮＡの半量３ｏｎａを含む水溶液
６μＱに、上記キットに含まれる１０Ｘリガーゼバツフ
アー１μＱ、λｃ［１０ＥｃｏＲＩアーム２μＱ（１μ
ｇ）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ　（２，５単位）を
加えて、全量を１０μＱとし、１２°Ｃで１夜インキユ
ベートし、ｃＤＮＡを含む組換えλＣ１ｔ　１０ＤＮＡ
を得た。この反応物をエタノール沈澱により回収し、Ｔ
ａ２．５μＱに溶解させた後、大腸菌ＢＨ３２６８８株
［Ｎ２Ｏ５ｒｅｃＡ−（λ　１ｍｍ４３４　ＣＩ　ｔｓ
　ｂ２ｒｅｄ３　Ｅ　ａｍ４　Ｓａｍ７　）　／λ］の
凍結融解抽出液１０ｕＱ及び大腸菌ＢＨ３２６９０株［
Ｎ２０５ｒｅｃＡ−（λ　１ｍｍ４３４　ｃｌｔｓ　ｂ
２　ｒｅｄ３Ｄａｍ１５Ｓａｍ７）／λ］の超音波破砕
抽出液１５μＱを加えて、２０’Ｃで２時間インキュベ
ートし、インビトロパッケージングを行なった。その後
、反応混合液に、１００ｍＭ　　ＮａＣＱ、５０ｍＭト
リス塩ｍ　（１）Ｎ７．５）　、８ｍＭ　　ＭｇＳＯ４
及び０．０１％ゼラチンからなる溶液Ｑ、５ｍ１２及び
クロロホルム２０ｔｌＱを加えた。

上記により、ｃＤＮＡを含む組換えλＣ］ｔ１０ＤＮＡ
がλフアージ粒子内に封入された。

マダイＧＨＣＤＮＡを　む粗換入ユ■へＬ１訳上記で得
た組換えファージの全量を、マニアティスらの方法（Ｔ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　）ｌｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣＩＯｎｉｎｇ、ｌ）　６３　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｖｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２））に従って調製された宿主細胞ＮＭ５１４（アマ
ジャム社製）の懸濁液１＋ｎＱ（１０９細胞／戒）に感
染させ、得られた約ｌＸ１０”個のファージプラークを
、ナイロンメンブレン　バイオダインＡ（日本ポール社
製）上に固定した。

次いでシロザケ成長ホルモンのＣＤＮＡ配列中、Ｌｅｕ
−Ｖａ１１７５の領域に相当する５０塩基のＤＮＡ、即
ち下記ＤＮＡを、ＤＮＡ合成機３８１Ａ型（アプライド
バイオシステムズ社製〉を用いて合成し、３２Ｐで標識
してプローブとした。

５°　　ＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＴＡＧＧＴＣＴＣＧＡＣ
ＣＴＴＧＴＧＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＴ丁ＧＡＡＧＣＡＴ
ＧＣＣＡ　　３’ ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）とデイビイス（Ｄａｖｉｓ）
の方法（前掲書、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”、　Ｄ３２０参照〕に従って、６５℃でプラークハ
イブリダイゼーションを行なった結果、約１×１０３個
のプラークが、３２Ｐ標識プローブと結合することが示
された。

そのうちの１２個のプラークをそれぞれ単離し、λＴＧ
Ｈ’ｌ〜λＴＧＨ１２と命名した。

マダイＧＨｃＤＮＡの塩基配列の決 上記で得られた１２個の粗換えファージから、フェノー
ル抽出及びエタノール沈澱を行なって、それぞファージ
ＤＮＡを調製した。

次に得られたＤＮＡの各々を、以下の通り、制限酵素Ｅ
Ｃ０ＲＩで切断し、該ＤＮＡ中に保持されているｃＤＮ
Ａを得た。即ち、ファージＤＮＡ５μｑを、１００ｍＭ
　　ＮａＣ９２，５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５＞、
１０ｍＭ　　ＭｇｃＱ２及び１ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を含む水溶液（以下「高塩濃度緩衝液Ｊとい
う〉に溶解させ、これにＥｃｏＲＩ（宝酒造社製＞５０
単位を加えて３００μＱとし、３７°Ｃで３時間反応さ
せた俊、エタノール沈澱により切断されたＤＮＡを回収
し、これをＴＥ２０ｔｌＱに溶解させた。

別に、プラスミドｐＵ　Ｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　、　３３．１０３
　（１９８５）　）の３μＱをＥｃｏＲＩ　　２０単位
を含む高塩濃度緩衝液１００μＱ中で、３７℃にて１２
時間反応させた後、エタノール沈澱を行なって回収した
ＤＮＡをＴＥ２０μＱに溶解させた溶液を調製した。

上記ファージＤＮＡのＥＣＯＲ工断片液２μＱ、ｐＵＣ
１９ＥｃｏＲＩ断片液１μＱ、１ＱＸリガーゼ緩衝液［
６６０ｍＭトリス塩１（ｐＮ１．５＞、６６ｍＭ　　Ｍ
ＣＩＣＧ！２及び１００ｍＭ　　ＤＴＴの水溶液］１μ
Ｑ、１０ｍＭ　　ＡＴＰ１μｌ蒸留水４μＱ及び丁４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１μＱ　（３５０単位）を
混合し、１２°Ｃで１６時間反応させた。

次いで、上記反応液を用いて大腸菌ＪＭＩ０９株（Ｙａ
ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、
　　３３．　１０３（１９８５））を形質転換させた。

この形質転換はり−デルベルブ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ　
）とコーエン（ｃｏｈｅｎ）の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、　１１９．１０７２（１９７４））に従って
、次の通り実施した。即ち、ＣａＣＱ２処理したＪＭ１
０９株の懸濁液２００μＱに、上記反応液１０μＱを加
えて６０分間氷冷した後、４２．５℃の水浴中で９０秒
間加温し、これにＬ−ブロス［１％バタトトリプトン、
０．５％酵母エキス及び０．５％　Ｎ　ａｃＱの水溶液
］２．８ｍＱを加え、３７℃で３０分間インキュベート
した。次いで得られた懸濁液を１０枚の選択プレートに
３００μＱづつ塗抹し、３７°Ｃにて一夜培養した。尚
、上記選択プレートとしては、アンピシリン５０ＬｔＣ
１／ｍＩ２、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド１
２，５μＱ／ｍＱ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトシド４０μＣ１／鵬を含む
Ｌ−ブロスに、寒天１．５％を添加して固めた平板培地
（２５ｍＱ／プレート）を用いた。

上記選択培地のプレートに生育する白色のコロニーを分
離し、該コロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。得
られたプラスミドは、その由来する組換えファージの名
と同一番号を付して、それぞれｒｐＴＧＨＥ１Ｊ〜ｒｐ
ＴＧＨＥ１２Ｊと命名した。

上記で得られた１２種のプラスミドを、各種の制限酵素
、例えばＢｇｌＩＩ、ＥＣ０ＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈ
ＤａＩ、ＰｓｔＩ、ＰＶｔＪＩＩ　（以上いずれも宝酒
造社製）　、Ｂａ１Ｉ　にッポンジーン社製）、Ｃ１ａ
Ｉにゴーイングランドバイオ９フ１社製）、ＳＳｔ■（
ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ社製）で切断して
、解析することにより、各プラスミドに含まれるＣＤＮ
Ａの制限酵素地図を作成した。

また、これと共にＣＤＮＡの長さを推定した。

その結果、ｐＴＧＨＥｌｌのＣＤＮＡが最も長く、約９
２０ｂｐｓからなってあり、Ｂａ１■、８ｇ１■、Ｃ１
ａＩ、）ｌｉｎｄｌｌ、ＨｐａＩ、ｐｓｔＩ、１）ｖＪ
、３ｓｔＩのそれぞれの制限酵素により切断される部位
を各１個ずつ有することが確認された。

上記１）ＴＧＨＥｌｌに含まれるＣＤＮＡの制限酵素地
図を第１図に示す。

また、上記ｐＴＧＨＥ１１以外の各プラスミドに含まれ
るｃＤＮＡについても上記と同様の制限酵素地図を有す
ることが確認された。

次に、ｐＴＧＨＥｌｌのｃＤＮＡの全塩基配列をＭ１３
ファージを用いたサンガー法（Ｙａｎ　ｉ　５ｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、　３３．１０３　
（１９８５）　）に従い、Ｍ１３シーケンスキット（東
洋紡社製〉を用いて決定した。

その結果は、前記式（５）に示した通りでおる。

法式（５）より、この塩基配列の一方の末端には、真核
生物の通常のｍＲＮＡに共通して存在するポリ（Ａ＞鎖
があり、且つその上流にはポリ（Ａ＞付加信号として知
られる（５°）ＡＡＴＡＡＡ（３’　）の塩基配列が存
在している。

また該塩基配列は、２０３個のアミノ酸配列をコードす
る翻訳領域を含んでいる。該アミノ酸配列は前記式（２
）に示すものでおり、そのうち−１７（Ｍｅｔ）から−
１（Ｓｅｐ）までのアミノ酸配列はハイネ（Ｈｅｉｊｎ
ｅ）の方法（ＮＵＣｌ、ＡＣｉｄＳ　Ｒｅｓ、　。

１４．４６８３　（１９８６））に従い、分泌タンパク
のシグナルペプチドであることが確認された。

このことは、本発明により得られるマダイＧＨが、ヒト
ＧＨ、シロザケＧＨ等と同様に、本来そのＮ末端にシグ
ナルペプチドを持った前駆体として産生細胞より合成さ
れるものでおることを明らかにしている。

更に、上記アミノ酸配列からシグナルペプチドのそれを
除いた１８６個のアミノ酸配列（マダイＧＨのアミノ酸
配列）を、既知の各種動物のＧＨのそれらと対比して相
同性を検討した結果、本マダイＧＨのアミノ酸配列は、
シロザケＧＨとは６８％、ヒトＧＨとは３３％共通して
いると認められた。因みに、シロザケＧＨとヒトＧＨと
は３６％の相同性が認められる。

更にまた、一般にＧＨとしての活性発現に重要でおると
考えられているＣｙｓ残基の数と位置を、上記各ＧＨに
ついて比較した所、３者の間で完全な一致が認められた
。

以上のことより、上記アミノ酸配列がマダイＧＨのアミ
ノ酸配列であると確認できた。

実施例　２ 表記マダイＧＨ発現プラスミドを構築するため、まずプ
ラスミドｐＴＧＨＭ１及びｐ丁ＧＨＥ１１Ｒを作成した
。

（１）プラスミドｐＴＧＨＭ１の作成 プラスミドＤＫＴＮ　　６μｑを１０ｍＭトリス塩ａ（
ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ　　Ｍ口ＣＱ２及び１ｍＭ　　
ＤＴＴを含む水溶液（以下「低塩濃度緩衝液」という）
に溶解し、これにＮａｅＩ（東洋紡社製）６単位を加え
て１００μＱとし、３７°Ｃで３時間反応させた。得ら
れたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ（宝酒造社裂）２４単位を
含む高塩濃度緩衝液１００μＱ中で３７℃で３時間反応
させた後、１％アガロースゲル電気泳動により、ｂｌａ
シグナルペプチドをコードする塩基配列及びｔａｃプロ
モーターを含む約８４０　ｂｐＳのＢａｍＨＩ−Ｎａｅ
Ｉ断片を得た。

別に、プラスミドｐＢＲ３２２４μ９を、Ｂａ１ｌｌＨ
Ｉ　　２４単位とＰｓｔＩ　（宝酒造社製＞３０単位と
を含む高塩濃度緩衝液１００μＱ中で３７℃で３時間反
応させた後、１％アガロースゲル電気泳動により、約３
２４０ｂｐｓのＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ■断片を得た。

また、下式に示される２種のＤＮＡ断片を、ＤＮＡシン
セサイザー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル
３８１Ａ）を用いて合成した。

Ｂａ１Ｉ　　　ＰｓｔＩ Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ５’　ＣＡＧ
　ＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧ　ＣＣＡＣＴＧ
ＣＡ　３’　３Ｂ−３３’　　ＧＴＣＧＧＣＴＡＧ　　
ＴＧＴ　　ＣＴＡ　　ＣＣＧＧＧＧ　　　　　　５’５
ｂ−４−２次いで、上記３Ｂ−３及び８Ｂ−４−２のそ
れぞれ１００ピコモル（ｐｆｆｌｏｌ）を、それぞれ１
０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）
を含む７０ｍＭｔ’リス塩酸（ｐＨ７，６）　、１０ｍ
Ｍ　　ＭＱＣＧ！２．５ｍＭ　　ＤＴＴ及び１ｍＭＡＴ
Ｐからなる水溶液３０μＱ中で３７°Ｃ下に４０分間反
応させて、ＤＮＡの５′末端をリン酸化した。

上記で得られたｐＫＴＮの１３ａｍＨＩ−ＮａｅＩ断片
（約８４０ｂｌ）Ｓ　）　０．３ｐ　ｍｏｌ　、ｐＢＲ
３２２のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（約３２４０ｂｐｓ
）０．２ｐｍｏ＋及び５′末端がリン酸化された３Ｂ＝
３及び５Ｂ−４−２の各々２５ｐｍｏｌを、６６ｍＭト
リス塩＠　（ｐＨ７，６）　、６．６ｍＭＭＱＣＱ２．
１０ｍＭ　　ＤＴＴ及び１ｍＭＡＴＰからなる水溶液１
９μＱに溶解し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）１μＱ（３５０単位）を加えて、１２℃で２４時間
反応させた。上記で得られた反応液を用いて、大腸菌Ｈ
８１０１株を形質転換し、テトラサイクリン耐性のコロ
ニーを得た。このコロニーからプラスミドＤＮＡを単離
して、プラスミドｐＴＧＨＭ１を得た。

上記１）ＴＧＨＭｌの構築の概略は第２図に示す通りで
あり、得られたＤＴＧＨＭＩは、該図に示される溝造を
有し、その大きさは約４１８０ｂｐｓであった。

尚、第２図において■はｔａＣプロモーターを、白恢き
の矢印はｂｌａシクナルベプチドを、ＴＣｒはテトラサ
イクリン耐性を、Ａｐｒはアンピシリン耐性をそれぞれ
示す。以下の図でも同様とする。

（２）プラスミドＩ）ＴＧＨＥ　１１　Ｒの作成実施例
１で得たｐＴＧＨｌｌ　　５μｑをＥＣＯＲ工（宝酒造
社製）２０単位を含む高塩濃度緩衝液１００μＱ中で３
７℃下に４時間反応させた後、ＤＮＡ断片の全量を１６
μＱの蒸留水に溶解させ、これに１０Ｘリガーゼ緩衝液
２ｔＩＱ、１０ｍＭＡＴＰ　　１μＱ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μＱ（３５０単位〉を加え１２°Ｃで１６時間
反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換し、アンピシリン耐性で且つイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド及び５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを添
加した培地上で白色を呈するコロニー１１個からプラス
ミドＤＮＡを単離した。

之等のプラスミドの内、４個はマダイＧＨをコードする
ＤＮＡを含むＥＣ０ＲＩ断片のベクターへの挿入方向が
、ｐＴＧＨｌｌに対して逆向きでめった。これらのプラ
スミドより１株を選び、該株をｐＴＧＨＥｌ　１Ｒと命
名した。

上記ｐＴＧＨＥ１１Ｒの構築の概略は、第３図に示す通
りであり、得られたｏＴＧＨＥｌ　１Ｒは、線図に示さ
れる構造を有しており、その大きさはｐＴＧＨＥｌｌと
同じく約３６２０ｂｐｓでＩＰ＞ッた。

（３）マダイＧＨ発現プラスミドｐＴＧＨ１１０１の造
成 このＩ）ＴＧＨＩ　１０１の構築の概略は第３図に併記
される通りであり、以下の通り行なわれた。

プラスミドＩ）ＴＧＨＭｌ　　５μＣ１をＢａ１Ｉ　に
ッポンジーン社製）１単位を含む低塩濃度緩衝液１００
μＱ中で、３７°Ｃ下に３時間反応させた後、得られた
ＤＮＡ断片を１００１１Ｑ１００１１Ｑ（７）５０１０
ｍＭトリス塩酸（１）Ｈ７，５）、１０ｍＭ　　ＭｇＣ
Ｑ２及び１ｍＭ　　ＤＴＴからなる溶液（以下これを「
生塩濃度緩衝液」という）に溶解させ、この溶液にＰｓ
ｔＩの１５単位を加えて３７°Ｃで３時間反応させ、１
％アガロースゲル電気泳動を行なって、約４２００ｂｐ
ｓの［３ａｌ■−ＰＳｔＩ断片を得た。

別に、プラスミド１）ＴＧＨＥｌｌＲ３μｑを０．５単
位のＢａ１Ｉを含む低塩濃度緩衝液１００μＱ中で３７
°Ｃ下に４時間反応させた後、得られる断片を更に１２
単位のＣＩａＩ　（宝酒造社製）を含む中温濃度緩衝液
１００μＱ中で３７°Ｃ下に４時間反応させて切断し、
６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、約２２
０ｂｐｓのＢａｌニーＣＩａＩ断片を得た。

また別に、ｐＴＧＨＥｌｌＲ２μｑを１２単位のＣ１ａ
Ｉ及び１５単位のＰＳｔＩを含む中温濃度緩衝液１００
μＱ中で３７°Ｃ下に４時間反応させた後、６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって、マダイＧＨをコー
ドするＤＮＡの３′端側及び３′非翻訳領域を含む約６
２０　ｂｐｓのＱｌａＩ’−ＰｓｔＩ断片を得た。

上記で得られたｐＴＧＨＭｌの１３ａｌＩ−ＰｓｔＩ断
片（約４２００ｂｐｓ　）Ｏ，ｌｐ　ｍｏｌ　、ＤＴＧ
ＨＥｌｌＲのＢａｔ　Ｉ　−ＣｌａＩ断片（約２２０ｂ
ｐｓ）０．３１）ｍ０１及びＣ１ａＩ−ＰｓｔＩ断片（
約６２０ｂｐｓ　）　０．２ｐ　ｍｏ＋を含む水溶液１
６μＱに、１０ｘリガーゼ緩衝液２ｔｌＱ、１０ｍＭ　
　ＡＴＰ１μＱ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＱ（３５０
単位）を加えて、１２℃で１６時間反応させ、得られた
反応液で大腸菌Ｈ８１０１株を形質転換し、テトラサイ
クリン耐性を示すコロニーを得た。

上記コロニーから１個を選び、そのプラスミドＤＮＡを
単離シテ、７ラスミトｐＴＧＨ１１０１を得た。

得られたＤＴＧＨｌｌｏｌの構造は第３図に示しており
、その大きさは約５０００　ｂｐｓで必った。

また該プラスミドはｐＫＴＮ由来のβ−ラクタマーゼシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ｐＴＧＨＥ
１１由来のマダイＧＨの構造遺伝子とが正しく連結され
た構造のＤＮＡ配列を有してあり、その上流にはｐＫＴ
Ｎ由来のｔａｃプロモーターが存在している。

実施例　３ （１）試薬添加培地による培養 プラスミドｐＴＧＨ１１０１を保有する大腸菌Ｈ８１０
１株を、１２．５μＱ／ｍ１２のテトラサイクリンを含
むし一ブロス５ｍｆ２に接種し、３７°Ｃで１２時間培
養後、培養液の１１ｎＩ２を下記第１表に示す試薬添加
Ｍ９培地１００ｍＧに加え、３７°Ｃで８時間培養した
。

また、対照として実施例２において本発明プラスミドの
原料として作成したプラスミドｐＴＧＨＭ１を保有する
大腸菌ＨＢ１０’１株を用い、同様にして培養を行なっ
た。

尚、第１表には後記するジャー培養用培地組成も併記す
る。

第１表 上記培養により得られた培養菌液１００鵬を、遠心分離
（７０００回転／分ＸＩＯ分間）して、菌体と上清とに
分離し、得られた上清を培養上清画分とした。

また上記菌体より浸透圧ショック法（Ｈ，Ｃ，ＮｅＷａ
ｎｄ　　八、ｌ１ｅｐｐｅｌ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、　　２４０．　３６８５−３６９２　（１９６
５））に従い、ペリプラズム両分を以下の通り抽出した
。即ち、菌体を２０％ショ糖を含む３０ｍＭ　トリス塩
酸緩衝液（１）Ｈ８，０）２０ｍＱに懸濁させ、これに
０．５ＭＥＤＴＡ水溶液（Ｉ）Ｈ８，０＞０．２ｍＱを
加えて１０分間撹拌した後、遠心分離（９０００回転／
分Ｘ１０分間）により菌体を集め、これを氷冷した水２
０ｍｆ２に再懸濁させ、水中に１０分間静置して時々撹
拌し、遠心分離（９０００回転／分×１０分間）により
菌体と上清とに分離した。かくして得られた上清をペリ
プラズム画分とした。

更に上記菌体を３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
１〜リス塩醒緩衝液（ｐＨ８，０＞で洗浄後、ＰＢＳ　
（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７，０＞１０戒に懸濁させ、超音波
破砕機（大岳製作所社製、５２０２型）にて、出力１０
０Ｗで各３０秒ずつ３回の破砕処理を行ない、次いで遠
心分離（１２０００回転／分Ｘ２０分間、４°Ｃ）して
上清を得た。この上清を菌体内画分とする。

上記で得られた各両分を用いて、シュライフらの方法（
Ｒ，Ｆ、５ｃｈｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｐ、Ｃ，Ｗｅｎｓｉ
ｎｋ。

Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　　１９　Ｆ３　’
ｌ　）に従って、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行ない、クマーシーブリリアントブルーを用いて
蛋白質の染色を行なった。

上記により、プラスミドｐＴＧＨ１１０１を保有する大
腸菌Ｈ８１０１株のペリプラズム画分に、分子間約２１
０００のポリペプチドが検出された。

しかし、対照とするプラスミドｐＴＧＨＭ１を保有する
大腸菌８８１０１株のペリプラズム画分には、何らの蛋
白も検出されなかった。培養上清画分及び菌体内画分に
おいては、いずれのプラスミドを保有する大腸菌株でも
、ポリペプチドは検出されなかった。

以上の結果より、プラスミドｐＴＧＨ１１０１を保有す
る大腸菌８８１０１株は、特異的に分子間約２１０００
のポリペプチドを発現し、特にこれはべりプラズム中に
分泌されることが確認された。

（２）ジャー培養培地による培養 プラスミドｐＴＧ）−１１１０１を保有する大腸菌Ｈ８
１０１株を４００１１１ＱのＬ−ブロス（１２，５μｃ
ｒ／ｍＱのテトラサイクリン含有）にて３５°Ｃ下に１
２時間培養し、培養液全量を、前記第１表に示したジャ
ー培養用培地２０Ｑに植菌し、３０９のジャー（）ｌＡ
ＲＵ［３Ｉｓ旧社製、モデルＨ３Ｊυ３Ｗ）にて３５°
Ｃ下に１２時間培養した。その後上記（１）と同様にし
て浸透圧ショック法にて、培養液２０Ｑよりペリプラズ
ム画分を抽出した。

得られたペリプラズム画分を、ブチル・トヨパール６５
００カラム（東ソー社′ｆＡ）　、ＤＥＡＥ・トヨパー
ル６５０Ｍカラム（東ソー社製〉、ブチル・トヨパール
６５０Ｍ−ＨＰＬＣカラム（東ンー社製）及び逆相ＨＰ
ＬＣ５ｃ８カラム（東ソー社製）を用いて精製して、分
子間約２１０００のポリペプチド約４０１１１（］を単
離した。

このポリペプチドは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、単一のバンドであることが確認された
。

上記電気泳動結果を第４図に示す。図においてレーン■
は標準分子量マーカー（ＢＲＬ社製着色済み分子量マー
カー、分子量３０００〜４３０００、ロット８１１０１
）の泳動パターンを、レーン■は上記で得た本発明ポリ
ペプチド（精製マダイＧＨ）の泳動パターンを示し、図
の左に矢印を付して示した数値は分子量を示す。

また、上記で単離した分子間約２１０００のポリペプチ
ド約５μｑを用い、これを６Ｎ塩酸中、１３０’Ｃ下に
４時間加水分解後、アミノ酸自動分析機（ベックマン社
製、システム６３００Ｅ）を用いて、ニンヒドリン法に
てそのアミノ酸組成を分析した。

測定された各アミノ酸含有を、１−ｅｕを基準（２６モ
ル）としてモル比で示せば、下記第２表の通りである。

尚、表にはマダイＧＨのアミノ酸組成の理論値を併記す
る。また表中Ｎ、Ｄ、は検出されないことを示す。

第２表 上記第２表より、プラスミドｐＴＧＨ１１０１を保有す
る大腸菌Ｈ８１０１株がペリプラズムに分泌した分子間
約２１０００のポリペプチドは、そのアミン酸組成が、
プラスミドｐＴＧＨＥ１１の有するマダイＧＨをコード
するＣＤＮＡの配列から推定される成熟型マダイＧＨの
アミノ酸組成とほぼ一致しており、本発明によって、ペ
リプラズムに成熟型マダイＧＨが分泌発現されたことが
確認された。

更に、養殖マダイの脳下垂体から粗精製したＧＨリッチ
な画分中には上記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果、上記で得られた本発明のマダイＧＨと推定
されるポリペプチドが主成分として含まれていることが
確認され、このことから本発明のマダイＧＨは、マダイ
脳下垂体中に含まれている天然マダイＧＨと同一構造を
有するものであることが確認された。

次に、上記で単離されたマダイＧＨの成長促進効果を、
生後約３ケ月のマダイ稚魚を用いて以下の通り調べた。

即ち、魚体重１０当たり１０μｑのマダイＧＨを、７日
毎に試験魚に腹腔内注射し、ＰＢＳのみを腹腔内注射し
た対照魚と同一条件で養殖して、容態の成長を比較観察
した。その結果、本発明マダイＧＨを投与した試験魚は
、対照魚と対比して顕著な魚体重増加が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明プラスミドｐＴＧＨＥ１１に含まれるＣ
ＤＮＡの制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドＤＫＴＮ、同ｐＢＲ３２２、合成り
ＮＡ　　５Ｂ−３及び同５Ｂ−４−２からプラスミドｐ
ＴＧＨＭ１を構築する工程を示す概略図でおる。 第３図はプラスミドｐＴＧＨＥ１１からプラスミドＩ）
ＴＧＨＥｌｌＲを構築する工程とプラスミドｐＴＧＨＭ
１とプラスミドＤＴＧＨＥ１１Ｒとから発現プラスミド
ｐＴＧＨ１１０’ｌを構築する工程を示す概略図でおる
。 第４図は精製マダイＧＨと、分子量マーカーを５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を示す
図でおる。 （以　上） 、、：′）：ｑＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記式（１）の魚類成長ホルモンポリペプチドを
   含むアミノ酸配列をコードする魚類成長ホルモン遺伝子
   。 【遺伝子配列があります。】 ［２］下記式（２）及び（３）のいずれかのアミノ酸配
   列のポリペプチドをコードする請求項［１］記載の遺伝
   子。 【遺伝子配列があります。】 ［３］３′末端に更にＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡのいず
   れかの終止コドンが付加された請求項１記載の遺伝子。 ［４］魚類成長ホルモン産生能を有する組織乃至細胞か
   ら調製されたポリ（Ａ）ＲＮＡに対応するｃＤＮＡとし
   て単離された請求項［１］記載の遺伝子。 ［５］請求項［１］記載の遺伝子を含む魚類成長ホルモ
   ン発現ベクター。 ［６］請求項［１］記載の式（１）のアミノ酸配列のア
   ミノ末端に更に５０個以下のアミノ酸配列が付加された
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む請求項［５
   ］記載のベクタ−。 ［７］請求項［１］記載の式（１）のアミノ酸配列のア
   ミノ末端に付加されたアミノ酸配列がシグナルペプチド
   である請求項［６］記載のベクター。 ［８］シグナルペプチドが細菌の分泌蛋白質前駆体のそ
   れである請求項［７］記載のベクター。 ［９］シグナルペプチドがプラスミドｐＫＴＮ由来のβ
   −ラクタマーゼのそれである請求項［８］記載のベクタ
   ー。 ［１０］ｐＴＧＨ１１０１である請求項［９］記載のベ
   クター。 ［１１］請求項［１］記載の式（１）のアミノ酸配列を
   コードするＤＮＡ配列の５′側上流にリボゾーム結合部
   位及びプロモーターＤＮＡ配列が連結され、３′末端に
   終止コドンが付加され、且つ該終止コドンの下流に転写
   終結信号が含まれる請求項［５］〜［１０］のいずれか
   に記載のベクター。 ［１２］請求項［５］記載のベクターを保有する組換え
   体細胞。 ［１３］大腸菌Ｋ１２株由来のグラム陰性細菌である請
   求項［１２］記載の組換え体細胞。 ［１４］請求項［１２］記載の組換え体細胞を培養増殖
   させ、生成する魚類成長ホルモンを含む画分を採取、精
   製する魚類成長ホルモンの製造法。 ［１５］魚類成長ホルモンを含む画分がグラム陰性細菌
   のペリブラズム画分である請求項［１４］記載の製造法
   。 ［１６］請求項［１］記載の式（１）のアミノ酸配列を
   有する魚類成長ホルモン。 ［１７］請求項［１６］記載の魚類成長ホルモンを含み
   、魚類由来の他の成分を含まない魚類成長ホルモン組成
   物。