FR2550800A1 - Vecteur plasmide ameliore et son utilisation - Google Patents
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Abstract
VECTEURS PLASMIDES D'ESCHERICHIA COLI PRESENTANT UNE REGION TERMINALE 5 NON TRANSLATEE (Y COMPRIS LA REGION DU PROMOTEUR ET DE LA SEQUENCE SHINE-DALGARNO) DU GENE LIPOPROTEINE D'ESCHERICHIA COLI, LADITE REGION ETANT AMELIOREE DE MANIERE A PERMETTRE UNE PRODUCTION DIRECTE DE POLYPEPTIDES UTILES SOUS FORME SENSIBLEMENT COMPLETE.
Description
Vecteur plasmide amélioré et son utilisation L'invention se rapporte à des
vecteurs plasmides d'Escherichia coli améliorés de façon qu'ils conviennent à la production de polypeptides utiles, ainsi qu'à l'utilisation de ces vecteurs Elle se rapporte plus particulièrement à des vecteurs plasmides améliorés présentant une région terminale ' non déplacée par translation, ou non translatée, de gène lipoprotéine d'Escherichia coli, région qui est améliorée en ce sens qu'un codage génétique pour un polypeptide utile puisse être inséré facilement et simplement, et que ledit polypeptide utile puisse être produit sous une forme sensiblement complète, ainsi qu'à la production de polypeptides utiles, utilisant des composés de transformation dits "'transformants" de l'Escherichia coli, transformés avec lesdits plasmides.
La technique dite de "reeombinaison DNA" (désignée ciaprès en abrégé sous le terme de technique "r DNA") a jusqu'à présent permis de produire une variété de polypeptides utiles en utilisant des cellules microbiennes ou des cellules d'animaux supérieurs, de sorte qu'on peut dire que des techniques génerales de ce genre sont déjà bien établies Toutefois, des techniques et des méthodes de production économique des polypeptides individuels offrent encore matière à des perfectionnements.
Dans la production d'un polypeptide utile déterminé ayant recours à la technique r DNA, divers facteurs exercent une influence sur la productivité Parmi ces facteurs, il est connu que le promoteur impliqué dans la promotion de la transcription d'un codage génétique exogène pour le polypeptide utile inséré, ainsi que la séquence dite de "ShineDalgarno" (séquence SD) intervenant dans la liaison de complémentarité de m RNA à la séquence terminale 3 ' du ribosome 16 S RNA, ont une grande influence sur la production dudit peptide utile Toutefois, il n'existe aucune règle établie entre la région du promoteur de séquence SD et la productivité de chaque polypeptide individuel.
C'est ainsi par exemple que le fait qu'un promoteur ou une séquence SD déterminé entraîne une expression élevée d'un certain gène hétérologue, ne doit pas toujours signifier que ce promoteur ou cette séquence permet également une expression élevée d'un autre gène hétérologue.
Bien que la présence d'une région terminale 3 ' non translatée dudit gène soit également un facteur provoquant une expression élevée d'un gène exogène, et soit importante principalement pour l'expression d'un gène hétérologue dans des cellules eucaryotes, il n'en sera pas fait mention dans la présente description, du fait que l'invention n'est pas directement liée à cette présence Il est également connu que certaines cellules hôtes conviennent pour l'expression d'un gène qu'on désire obtenir, alors que d'autres ne conviennent pas Aucune mention ne sera faite non plus à cet égard.
Pour l'expression d'un gène hétérologue inséré, divers promoteurs sont utilisés en fonction des cellules hôtes.
Lorsque l'hôte est l'Escherichia coli, par exemple, on a recours, entre autres, à des promoteurs tels que promoteur de gène par synthèse tryptophanne Escherichia coli, promoteur de gène P-galactosidase, promoteur de gène phosphatase alcaline et promoteur lipoprotéine et promoteur phage PL lambda (A) De façon générale, des polypeptides hétérologues sont produits selon deux procédés Dans le premier procédé, le peptide que l'on cherche à obtenir est produit sous la forme d'une protéine hybride avec une certaine protéine, tandis que dans le second procédé, le polypeptide désiré est produit directement, avec un résidu méthionine ajouté au N terminal dans certains cas C'est ainsi par exemple qu'une protéine hybride provenant d'un peptide désiré et d'une certaine protéine reliés mutuellement par la méthionine, est produite puis traitée par du bromure de cyanogène (CN Br) pour le clivage du reste méthionine, le peptide voulu résultant étant ensuite isolé Dans ce-cas, l'emploi du promoteur de gène p-galactosidase pour la production du peptide recherché, sous forme d'une protéine hybride avec une protéine phosphatase alcaline, est avantageux au point de vue productivité
du peptide voulu et purification de celui-ci (demande de brevet japonais No 107 474/1982) Pour la production de polypeptides, tels que des interférons, par expression directe, on utilise par exemple, le promoteur de gène tryptophanne, le promoteur de gène P -galactosidase et le promoteur phage PL X (voir par exemple, P.W Gray et al, Nature, 295: 503, 1982; D Goeddel et al, Nature, 287: 411, 1980; T Taniguchi et al, Proc Natl Acad. Sci, 77: 5230, 1980; R Derynck et al, Nature, 287: 193, 1980).
D'autre part, l'un des facteurs requis pour une production rentable d'un polypeptide hétérologue dans l'Escherichia coli, est la séquence SD qui est en amont du codon d'amorçage de la translation (ATG) La complémentarité de cette séquence SD et de la séquence au terminal 3 ' du 16 S ribosome RNA, la distance entre la séquence SD et le codon de départ de la translation, et la structure secondaire de m RNA, au point de départ et à proximité de la translation, sont supposées, entre autres, contribuer au démarrage efficace de la translation On peut donc admettre que la productivité du polypeptide à fabriquer dépend de la séquence amino-acide de la portion dudit peptide qui est voisine du N terminal ou, en d'autres termes, de la séquence DNA correspondant à ladite portion.
Compte tenu des points précités, les inventeurs ont de différentes manières modifié la séquence nucleotide de la région terminale 5 ' non translatée du gène lipoprotéine d'Escherichia coli, et sont ainsi parvenus à construire des plasmides d'Escherichia coli dans lesquels des gènes exogènes peuvent être insérés en vue d'une expression très efficace de-ceux-ci, et qui permettent une production rentable des polypeptides désirés, sous forme sensiblement complète, réalisant ainsi la présente invention En outre, l'emploi de vecteurs plasmides selon l'invention conduit à une production efficace d'un polypeptide ayant la séquence amino-acide de l'interféron immun humain (désigné ci-après en abrégé par "h INF-y"), permettant ainsi d'obtenir des compositions pour cultures contenant ledit polypeptide à des concentrations élevées.
X -
La présente invention a en conséquence pour objet des vecteurs plasmides d'Escherichia coli, caractérisés en ce qu'ils pré ntent une région terminale 5 ' non translatée (y compris la région du promoteur et de la séquence Shine-Dalgarno) du gène lipoprotéine d'Escherichia coli, ladite région étant améliorée de manière à permettre une production directe d'un polypeptide utile sous forme sensiblement complète.
La lipoprotéine d'Escherichia coli est une protéine qui constitue la membrane externe d'Escherichia coli, la teneur étant de 4,8 x 105 molécules par cellule ("Bacterial Outermembrane, Biogenesis and Functions", édité par -Masayori Inouye, page 8, Wiley-Interscience Publication, Toronto, 1979) Il est également connu que le gène de lipoprotéine correspondant présente un pouvoir promoteur dans l'activité de transcription.
Le gène recouvrant la région du promoteur lipoprotéine
(région non translatée terminale 5 ') vers le gène de structure pour ladite protéine a déjà été cloné dans p BR 322, et une série de plasmides modifiés de manière à permettre l'expression des gènes exogènes insérés a été réalisée (voir Kagaku to Seibutsu, 20, No 1, 47-58, 1982) Une publication de brevet, ouverte à la consultation du public, fait état d'une production de polypeptide hétérologue en utilisant la région précitée du promoteur (Japanese Kokai Tokkyo Joho No 140,800/1982).
Toutefois, le vecteur de clonage décrit dans ce qui précède, présente de sérieux inconvénients, tels que mentionnés ci-après Le site de clonage (site pour l'insertion de gènes d'ehcodage de polypeptide exogène, dans ledit vecteur, le site de clivage Eco RI) dudit vecteur est de 10 à 11 bases en aval à partir du point de départ de la translation et, de ce fait, les produits polypeptides désirés possèdent un peptide additionné supplémentaire sur le côté N terminal Ceci pose un problème d'antigénicité par administration au corps humain, même si les produits polypeptides sont physiologiquement actifs De tels polypeptides ne sont jamais préférés, du fait qu'ils ont une structure différente de l'originale.
Conformément à l'invention, de nouveaux vecteurs de haute expression, exempts des inconvénients du vecteur connu précité, sont construits, entre autres, par modification de la rquence SD du gène lipoprote ine, modification de la distance entre la séquence SD et le point de départ de la translation, et insertion du site de clonage en un nouveau site Des exemplestypes ont démontré leur utilité.
On décrira el-après plus en détail les vecteurs plasmides conformes à l'invention, ainsi que leur utilisation.
La séquence de base comprenant la région du promoteur de
lipoprotéine d'Escherichia coli et la partie (portion amont) du gène de structure pour ladite protéine sur p INIA 2, lequel est l'un des plasmides reconstitués pour permettre l'expression desgènes exogènes est représentée à la figure 1 Ce plasmide présente les inconvénients mentionnés précédemment, du fait que le site de clonage (Eco RI à la figure 1) pour l'insertion des gènes exogènes qui doivent âtre exprimés, se trouve dans le gène de structure lipoprotéine (dans le codage de séquence DNA pour le signal peptide) La séquence de base à partir de la région du promoteur vers une portion amont du gène de structure (vers le site de clivage Eco RI), comme représenté à la figure 1, est identique à celle de l'un des vecteurs d'expression décrits dans la publication japonaise précitée Kokai Tokkyo Koho No 140 800/ 1982.
En conséquence, pour éviter une addition supplémentaire peptidique au N terminal des polypeptides hétérologues désirés, les inventeurs ont remplacé le fragment Xba I-Eco RI représenté à la figure 1, par un fragment oligonucléotide synthétisé chimiquement (présentant des terminaux cohésifs aux extrémités respectives et contenant la séquence SD) , ceci étant suivi d'une connexion du codage génétique pour un polypeptide utile désiré (par exemple, un polypeptide ayant la séquence aminoacide de h IFN y) en aval dudit site Eco RI Le plasmide p IN 4 GIF 54 ainsi édifié a été utilisé pour la transformation de l'Escherichia coli Le transformant (W 3110/p IN 4 GIF 54), sous 6 -
contrôle du promoteur de gène lipoprotéine, peut produire h IFN-y sans peptide supplémentaire additionné à son N terminal.
Dans la description précitée, h IFN-y a été indiqué, pour une meilleure compréhension, comme exemple de polypeptide utile hétérologue Il est évident que le principe précité peut également être appliqué à la production d'autres polypeptides.
La figure 2 illustre schématiquement la construction de
p IN 4 GIF 54 Sur cette figure, p GIF 54 est essentiellement le même plasmide que le p GIF 4 décrit dans la demande de brevet japonais No 86 180/1982 Un transformant d'Escherichia coli, WA 802/p GIF 4, obtenu par transformation avec ledit plasmide contenant le codage génétique synthétisé chimiquement pour la séquence amino-acide de h IFN-y, comme représenté à la figure 6, a été désigné par SBMG 105 et déposé au "Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology"lDépôt No: FERM P-6522; Dépôt international No (sous le traité de Budapest): FERM BP-282 l Le plasmide p INI-A 2 est un don de M Inoue du New York State University Une souche hôte d'Escherichia coli, obtenue par transformation avec ledit plasmide a été désignée par JA 221/PINIA 2 et déposé au "Fermentation Research Institute" sous le No FERM BP-320.
La figure 3 illustre la séquence nucléotide de la région terminale 5 ' non translatée du gène lipoprotéine, modifiée conformément à l'invention sur une portion amont du gène h IFN-Y inséré La séquence SD représentée à la figure 3 est la même que celle du gène lipoprotéine, et la distance entre la séquence SD et le codon d'amorçage de la translation demeure inchangée.
Alors que la souche d'Escherichia coli transformée avec p IN 4 GIF 54 construit de la manière représentée à la figure 2, W 3110/p IN 4 GIF 54, produisait également h INF-Y (comme décrit ultérieurement plus en détail), les inventeurs ont essayé une autre modification de la séquence SD en vue d'accroître la productivité (voir figure 4) Ils ont ainsi conçu la séquence SD oligonucléotide de manière à la rendre complémentaire à la séquence terminale 3 ' d'Eacherichia coli 16 S ribosome RNA, et ont synthetisa chimiquement le fragment de DNA représenté à la figure 4, à savoir:
C T A G G A G G T A G
III l I I I
C T C C A T C T T A A.
Ensuite, p IN 5 GIF 54 a été construit en remplaçant le fragment Xba IEco RI de p IN 4 GIF 54 par le fragment DNA précité L'Escherichi coli transformé avec ce plasmide, W 3110/p INSGIF 54, s'est avéré produire h IFN-Y en une quantité 4 fois plus grande comparativement au cas de W 3110/p IN 4 GIF 54 (voir tableau 2), ce qui indique que la modification de la séquence SD selon l'invention est efficace En outre, des compositions de culture contenant h IFN-y à des concentrations élevées pourraient être obtenues à partir des cellules cultivées dudit transformant.
Dans l'exemple de l'invention, un gène résistant à l'ampicilline est inséré, en tant que gène résistant à un médica,lent, dans le plasmide de l'invention (voir figure 2 et '4); toutefois, le gène résistant aux médicaments n'est pas limité à cet exemple, et d'autres gènes connus résistants aux médicaments peuvent être employés Par exemple, un gène bien connu résistant à la tétracycline ou à la kanamycine peut être utilisé à la place du gène résistant à l'ampicilline sans nuire au caractère essentiel de l'invention.
Les figures du dessin annexé seront maintenant brièvement décrites.
La figure 1 illustre la séquence de base de la région terminale 5 ' non translatée du gène lipoprotéine d'Escherichia coli, laquelle comprend la région du promoteur et la séquence SD, sur le plasmide p INIA 2 et la partie (portion amont) du gène de structure pour ladite protéine.
La figure 2 illustre schématiquement la construction du vecteur plasmide p IN 4 GIF 45 expression du gène h IFN-Y.
La figure 3 illustre la séquence de base couvrant la région améliorée terminale 5 ' non translatée du gène lipoprotéine sur le plasmide p IN 4 GIF 54.
La figure 4 illustre schématiquement la construction du vecteur plasmide p INSGIF 54 expression du gène h IFN-.
La figure 5 illustre la séquence de base couvrant la région améliorée terminale 5 ' du gène lipoprotéine sur le plasmide p IN 5 GIF 54.
La figure 6 représente la séquence de base d'un gène h IFN-Y synthétisée chimiquement et la séquence amino-acide correspondante.
Les figures 7 et 8 illustrent schématiquement la construction des plasmides, respectivement PIN 5 T 4 et PIN 5 T 5.
Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail. Exemples 1 Construction de p IN 4 GIF 54 Le plasmide p IN 4 GIF 54 est construit, comme représenté à la figure 2, à partir de ( 1) un fragment de DNA contenant la région de promoteur de gène lipoprotéine (désignée par lpp sur la figure) obtenu par digestion du-plasmide p INIA 2 avec les enzymes de restriction Xba I et Pst I, ( 2) un oligonueléotide présentant des extrémités cohésives Xba I et Eco RI, et ( 3) un fragment de DNA contenant le gène h INF 'obtenu par digestion du plasmide
p GIF 54 avec Eco RI et Pst I La méthode suivie est telle que décrite ciaprès Les enzymes de restriction utilisés sont tous des produits de Takara Shuzo KK.
A) Préparation du fragment Xba I-Pst I DNA de p INAI 2
Le p INIA 2 DNA ( 3 Mg) est mis à digérer avec 15 unités chacune de Xba I et Pst I dans 150 tl de solution 1 X TA ( 33 m 4 de tampon Tris acétate, p H 7,6, 66 m M d'acétate de potassium, 10 m M d'acétate de magnésium et 0,5 m M de dithiothréitol) à 370 C pendant 37 minutes Le mélange réactionnel est soumis à une électrophorèse de gel d'agar-agar à 1,0 % et une portion du gel localisée en la position correspondant à environ 980 b p (paires de base) est sectionnée et placée dans un tube de dialyse, puis le fragment Xba I-Pst I DNA est élué par électrophorèse. Après séparation du bromure d'éthidium de l'éluat par addition d'une quantité égale de phénol, on ajoute 2,5 volumes d'éthanol. On laisse reposer a -80 C pendant 30 minutes, puis on centrifuge le mélange à 10 000 t/min pendant 10 minutes, ce qui permet d'obtenir le fragment de DNA sous la forme d'un précipité éthanolique A ce précipité éthanolique, on ajoute 10 Ml d'eau distillée en vue de dissoudre le fragment de DNA.
B) Préparation du fragment Eco RI-Pst I DNA de p GIF 54
Le p GIF 54 DNA ( 3 g) est mis à digérer avec 15 unités,respectivementde Eco RI et Pst I dans 30 M 11 de solution 1 X TA à 37 O C pendant 60 minutes, cette opération étant suivie d'une électrophorèse sur gel d'agaragar à 0,7 %, de manière à éluer à partir de ce gel un fragment Eeo RIPst I DNA d'environ 3,4 Kb. L'éluat est soumis à un traitement au phénol et à une précipita1 tion par l'éthanol de la même manière que précédemment Au précipité éthanolique, on ajoute 10 F&l d'eau distillée en vue de la dissolution du fragment de DNA.
C) Préparation d'un oligonucléotide présentant des extrémités cohésives Xba I et Eco RI
Pour l'expression d'une protéine complète h INF-Y, un oli-
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gonucléotide présentant la séquence Shine-Dalgarno (SD) en aval du site de clivage Xba I de p INIA 2 et présentant par ailleurs une extrémité cohésive Eco RI, à savoir l'oligonucléotide S D
C T A G A G G T A G 3
____ 3,T C C A T C T T A A 5,
l'extrémité cohésive Xba I et l'extrémité cohésive Eco RI, sont synthétisés par la méthode en phase solide La méthode de synthèse a été décrite en détail dans la demande de brevet japonais No 86 180/1982.
L'oligonucléotide précité ( 100 picomoles) est phosphorylé au 5 '-OH dans 30 1 l d'une solution réactionnelle de kinase ( 50 m M de tampon de Tris chlorhydrate, p H 8,0, 10 m M Mg C 12, 10 m M de dithiothréitol) avec 2 unités de T 4 polynucléotide kinase (Takara Shuzo KK) ajoutés, à 37 C pendant 60 minutes.
D) Construction de p IN 4 GIF 54 Le plasmide p IN 4 GIF 54 est construit par ligation desfrois fragments de DNA préparés précédemment, conformément au processus suivant A un mélange renfermant 5 l d'une solution de fragment Xba I-Pst I DNA de p INIA 2 (solution du précipité éthanolique dans 10 yl d'eau distillée), 5 r 1 d'une solution de fragment Eco RI-Pst I DNA de p GIF 54 (solution du précipité éthanolique-dans 10 r 1 d'eau distillée) et 3 1 l d'une solution d'oligonucleotide phosphorylé ( 10 picomoles), on ajoute 2 pl d'un milieu réactionnel de ligation de concentration 10 fois supérieure ( 20 m M de tampon de Tris ctorhydrate, p H 7,6, 10 m M de Mg C 12),
2 rl de 4 m M ATP et i Ml d'une solution de ligase T 4 DNA (Boehringer Mannheim) ( 5 unités), et l'on effectue la ligation à 16 C pendant une nuit.
II Transformation de l'Escherichia coli
A Transformation d'Escherichia coli WA 802 L'Escherichia coli WA 802 est mis en culture dans 2,0 ml d'un bouillon L à 370 C pendant une nuit; on ajoute 0,3 ml du bouillon de culture à 30 ml de bouillon L et l'agitation de la culture est effectuée à 37 C pendant 2 heures, après quoi on procède à une centrifugation à 3 000 t/min pendant 10 minutes. Aux cellules ainsi obtenues, on ajoute 10 ml de Ca C 12 50 m M pour la mise en suspension des cellules et l'on effectue une centrifugation à 3 000 t/min pendant 10 minutes Aux cellules ainsi obtenues, on ajoute 1,0 ml d'une solution de Ca C 12 50 m 4 et on laisse reposer le mélange dans un bain de glace pendant 60 minutes A 0,2 ml de cette suspension de cellules traitées par Ca, on ajoute 10 t 1 du mélange réactionnel de ligation obtenu dans l'exemple I-D (contenant les trois fragments liés de DNA précités), on laisse reposer le mélange au bain de glace pendant 60 minutes, puis on ajoute 2 ml de bouillon L et l'on effectue l'incubation à 37 C pendant 60 minutes Le bouillon de culture est utilisé pour une application sur un milieu nutritif d'agaragar (BBL) contenant 40 Mg/ml d'ampicilline Après incubation à 370 C pendant une nuit, les transformants résistant à l'ampicilline sont sélectionnés L'un des transformants obtenus est utilisé pour la séparation de plasmide DNA selon la méthode conventionnelle (méthode au lysat clarifié) La séquence de base du DNA à la région Xba I-Eco RI insérée et au voisinage de cette région est déterminée par la méthode Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65: 499-560, 1980) ce qui confirme que le DNA présente la séquence de base DNA désirée Ce plasmide est désigné par pl N 4 GIF 54 et la souche de transformant d'Escherichia coli porteuse dudit plasmide est désignée par WA 802/p IN 4 GIF 54.
La séquence de base du p IN 4 GIF 54 au promoteur et à proximité de ce promoteur est représentée à la figure 4 Dans ce p IN 4 GIF 54, la séquence Shine-Dalgarno (SD) est la même que celle dans le p INIA 2 et la distance entre la séquence SD et le codon d'amor-
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çage de translation ATG pour h IFN Yest de 9 b p, distance qui est la même que dans p INIA 2 Néanmoins, en raison du site de clivage Eco RI introduit entre la séquence SD et le codon de démariage de translation ATG, la modification de la séquence SD et de la distance entre cette séquence SD et le codon de démarrage de translation peut s'effectuer aisément, de sorte que ce vecteur est considéré comme un vecteur avantageux dans la construction de vecteurs d'expression élevée, non seulement pour le gène h IFN, mais également pour d'autres gènes.
B) Transformation d'Escherichia coli W 3110
a Le plasmide p IN 4 GIF 54 obtenu est utilisé pour la transformation de l'Escherichia coli suivant la méthode précitée. Des souches résistant à i'ampicilline sont isolées et l'un des transformants est désigné par W 3110/p IN 4 GIF 54 Ce transformant est testé en ce qui concerne son activité antivirale.
III Test de l'activité antivirale du transformant W 3110/p IN 4 GIF 54 Pour examiner la quantité de h IFN Yexprimé, le W 3110/
p IN 4 GIF 54 et, à titre de comparaison, le W 3110/p GIF 54 (essentiellement la même souche que le transformant décrit dans la demande de brevet japonais No 86 180/1982 et déposée au "Fermentation Research Institute" sous le numéro 6552) sont cultivés de la manière indiquée ci-après et les produits surnageants de la culture sont essayés quant à leur activité antivirale. La souche hôte W 3110 est utilisée comme témoin.
Les souches W 3110/p IN 4 GIF 54 et W 3110 sont cultivées dans 2,0 ml d'un bouillon L contenant 40 1 g/ml d'ampicilline à 370 C pendant une nuit; on utilise 0,1 ml du bouillon de culture pour l'inoculation de 5 ml de bouillon L)et l'incubation est effectuée à 37 C pendant 4 heures Avec W 3110/p GIF 54, on utilise 0,1 ml d'un bouillon de pré-culture pour l'inoculation de 5 ml du même bouillon L comme précédemment, l'incubation est effectuée à 37 C pendant 2 heures, après quoi on ajoute de l'isopropyl -D-thiogalactopyranoside (ci-après désigné en abrégé par IPTG)
à une concentration finale de 1 m M, et l'incubation est poursuivie pendant encore 2 heures.
Les cellules sont récoltées en centrifugeant 4 ml de chaque bouillon de culture à 3 000 o t/min pendant 15 minutes On ajoute, aux cellules obtenues, 200 1 l d'un tampon au phosphate de sodium 0,15 M, 50 m M de Na Cl, p H 7,2, contenant 1 mg/ml de lysozyme (Sigma, USA) (désigné ci-après en abrégé par 1 x PBS). On laisse reposer le mélange sur un bain de glace pendant 30 minutes de manière à réaliser une bactériolyse Le lysat est ensuite congelé rapidement avec de la neige carbonique et du méthanol, puis liquéfié rapidement dans un bain à température constante maintenue à 37 C Après désintégration des cellules réalisée en répétant trois fois un tel traitement de congélation et de liquéfaction, le lysat est centrifugé à 10 000 t/min. pendant 10 minutes et le surnageant est testé- quant à son activité antivirale, selon la méthode décrite dans la demande de brevet japonais No 86 180/1982.
Les résultats obtenus sont indiqués au tableau I
Tableau 1
Activité antivirale des transformants Souche Activité antivirale I u /ml
W 3110 O
W 3110/p GIF 54 400 W 3110/p IN 4 GIF 54 -1000
L'aetivité antivirale disparaît complètement à p H 2 Une neutralisation avec un anticorps spécifique h IFN Y se traduit également par une inactivation complète, alors que des anticorps spécifiques aux interférons de type et de type 3 n'entraînent pratiquement pas d'inactivation.
Comme on le voit au tableau 1, W 3110/p IN 4 GIF 54 présente une activité antivirale 2,5 fois plus grande par rapport à W 3110/p GIF 54 Toutefois, le degré d'expression ne peut être considéré comme satisfaisant On a donc modifié la séquence SD lipoprotéine La séquence SD lipoprotéine est GAGG ( 4 bp) et cette séquence est complémentaire de la séquence CUCC (indiquée ci-après par - *-*-àa) du terminal 3 ' de AUUCC ACCAG 5 de
l'Escherichia coli 16 S ribosome RNA.
Les inventeurs ont pensé que la transformation de la séquence SD lipoprotéine, complémentairement audit 16 S ribosome RNA, en AGGAGGT qui est utilisé dans le R 17 A ou la séquence SD M 52 A protéine, entraînerait un accroissement de complémentarité avec le 16 S ribosome RNA, et par conséquent une activité de translation, de sorte que l'expression de h IFN-t protéine pourrait être augmentée.
Ils ont donc essayé d'insérer la séquence SD AGGAGGT entre les sites Xba I-Eco RI du plasmide p IN 4 GIF 54 A cet effet, un oligonucléotide ayant la séquence précitée ainsi que les extrémités cohésives Xba I et Eco RI aux extrémités 5 ', à savoir: C T A G G A G G T A G
CTAGGAGGTAG
CT C CA T C T TAA
a été inséré entre Xba I-Eco RI de p IN 4 GIF 54, ce qui a permis de construire le plasmide p INSGIF 54 (voir figure 4).
Les détails de ces opérations sont donnés ci-après.
IV Construction du plasmide p IN 5 GIF 54 (voir figure 4) A) Préparation d'un oligonucléotide ayant des extrémités cohésives Xba I et Eco RI L'oligonuécléotide ayant la séquence SD AGGAGGT et des extrémités cohésives Xba I et Eco RI aux extrémités 5 ', à savoir:
'C T A G G A G G T A G 3
3 C T C C A T C T T A A 5
est synthétisé par la méthode en phase solide déjà mentionnée (voir demande de brevet japonais No 86 180/1982) L'oligonucléotide précité ( 100 picomoles) est phosphorylé en 5 '-OH, à
370 C pendant 60 minutes, dans 5 Q m 1 de la solution réactionnelle de kinase (décrite en détail dans l'exemple I-C) avec 2 unités de T 4 polynucléotide kinase ( Takara Shuzo) ajoutée comme précédemment mentionne.
B) Préparation d'un fragment Xba I-Eco RI DNA de p IN 4 GIF 54 Le p IN 4 GIF 54 ( 2,5 mg) est mis à digérer avec 5 unités, respectivement de Xba I et Eco RI dans 30 1 d'une solution
1 X TA à 37 C pendant 60 minutes pour le clivage de DNA. Après clivage, on effectue une électrophorèse sur gel d'agaragar à 0,7 %, et un fragment Xba I-Eco RI DNA d'environ 4,3 Kb (fragment plus long exempt de séquence SD) est élue à partir du gel, par électrophorèse, comme précédemmentmentionné. L'éluat est soumis à un traitement phénolique et à une précipitation à l'éthanol, comme déjà mentionné, et l'on ajoute au précipité éthanolique, 10 i 1 d'eau distillée, pour la dissolution du fragment DNA.
C) Construction de p INSGIF 54 Le plasmide p IN 5 GIF 54 est construit par ligation des deux fragnments DNA précités, de la manière suivante A 5 1 l d'une solution d'oligonucléotide phosphorylé ( 10 picomoles), on ajoute 3 1 de la solution réactionnelle de ligation, de concentration 10 fois supérieure (mentionnée précédemment), 10 '1 de DTT 100 m M et 4 m M ATP dans l'eau distillée, et 1 m 1 ( 5 unités) de ligase T 4 DNA (Boehringer Mannheim) Le mélange est incubé à 16 C pendant une nuit V Transformation de l'Escherichia coli A) Transformation d'Escherichia coli WA 802 De la même façon que précédemment (exemple II-A), des cellules d'Escherichia coli WA 802, cultivées dans un bouillon L, sont traitées par Ca C 12, et 0,2 ml de suspension de cellules est mélangé avec le mélange réactionnel de ligation obtenu dans l'exemple IV-C, en vue d'effectuer la transformation de l'Escherichia coli WA 802 La sélection du transformant est effectuée en utilisant un milieu nutritif d'agar-agar (BBL) contenant 40 Mg/ml d'ampicilline En utilisant l'une des souches de transformant ainsi obtenues, la séparation de plasmide est effectuée par la méthode conventionnelle (voir exemple II-A),
et la séquence de base DNA à la région d'insertion et à proximité de celle-ci, à savoir la région Xba I-Eco RI, est analysée.
Comme représenté à la figure 5, p INSGIF 54 doit être exempt du site de clivage Xba I initialement présent dans p IN 4 GIF 54 (figure 3) En conséquence, le plasmide séparé est traité par Xba I, ce traitement étant suivi d'une électrophorèse sur gel d'agar-agar à 0,7 % et d'une détermination, pour le plasmide DNA demeurant non clivé avec Xba I, de la séquence DNA au fragment d'oligonucléotide, et à proximité de celui-ci, inséré selon la méthode de Maxam-Gilbert Les résultats obtenus ont
confirmé la présence de la séquence de base DNA recherchée.
Ce plasmide fut désigné par p IN 5 GIF 54, et la souche WA 802 transformée avec celui-ci a été désignée par WA 802/p INSGIF 54.
B) Transformation d'Escherichia coli W 3110 Le plasmide p IN 5 GIF 54 obtenu précédemment est utilisé pour la transformation d'Escherichia coli W 3110 de la même manière que ci-dessus Un transformant résistant à l'ampicilline est
isolé et désigné par W 3110/p INSGIF 54 Ce transformant est comparé au W 3110/p IN 4 GIF 54 quant à son activité antivirale.
VI Test d'activité antivirale pour W 3110/p IN 4 GIF 54 et W 3110/ p IN 5 GIF 54 Le W 3110/p IN 4 GIF 54, le W 3110/p IN 5 GIF 54 et le W 3110, à titre de témoin, sont cultivés chacun dans 2,0 ml de bouillon L (contenant 40 Ag/ml d'ampicilline) à 37 C pendant une nuit, et l'on utilise 0,1 ml de chaque bouillon de culture pour l'inoculation de 5 ml de bouillon L (contenant 40 fg/ml d'ampicilline), après quoi on poursuit la culture pendant 2 heures Une portion de 2 ml de chaque bouillon de culture est centrifugée à 3 000 t/min
pendant 15 minutes Aux cellules ainsi obtenues, on ajoute 1,0 ml de 1 X PBS contenant 1 mg/ml de lysozyme, puis on laisse reposer le mélange pendant 30 minutes pour effectuer la bactériolyse Les cellules sont ensuite désintégrées en répétant trois fois le traitement de congélation rapide à la neige carbonique-méthanol et liquéfaction rapide à 37 C, le surnageant obtenu par centrifugation à 10 000 t/min pendant 10 minutes étant ensuite testé quant à son activité antivirale, suivant la méthode décrite dans la demande de brevet japonais No 86 180/1982. Les résultats obtenus sont indiqués au tableau 2.
Tableau 2
Mesure de l'activité antivirale Souche I u /ml
W 3110 O
W 3110/p IN 4 GIF 54 1000 W 3110/p INSGIF 54 4000
Comme cela ressort du tableau 2, le W 3110/p IN 5 GIF 54 présente une activité antivirale 4 fois plus grande que celle de W 3 l 10/p IN 4 GIF 54, ce qui indique que l'amélioration de la séquence SD a été efficace quant à l'accroissement du rendement d'expression de h IFN Y protéine.
L'Escherichia coli W 311 D transformé par les plasmides
PIN 5 T 4 et PIN 5 T 5, dans lesquels un gène résistant à la tétracycline (Tor) est inséré à la place du gène résistant à l'ampicilline (Apr) sur PIN 5 GIF 54, présente la même activité antivirale que W 3110/PIN 5 GIF 54 déjà mentionné.
Le PINST 4 est préparé par ligation du fragment de DNA contenant un gène h IFN Y et du fragment de DNA contenant un gène Tcr, avec une ligase T 4 DNA, après avoir rendu unies les extrémités cohésives au moyen de polymérase T 4 DNA et de d NTP. Le premier fragment de DNA est obtenu par clivage de PIN 5 GIF 54 au moyen d'enzymes de restriction Aat II et Sal I, et le second par clivage de p Br 322 avec Eco RI et Aha III (figure 7).
Le PIN 5 T 5 a pu être préparé selon le même processus que
précédemment, excepté que le clivage de p BR 322 s'effectua avec Eco RI et Pst I (figure 8).
L'activité antivirale disparaît par traitement à p H 2 et neutralisation avec un anticorps spécifique de h IFN Ces faits indiquent clairement que ces transformants sont des souches produisant h IFN Y
19 2550800
Claims (13)
1 Vecteur plasmide d'Escherichia coli, caractérisé en ce qu'il contient une région terminale 5 ' non translatée (y compris la région du promoteur et de la séquence Shine-Dalgarno) du gène lipoprotéine d'Escherichia coli, ladite région étant améliorée de manière à permettre une production directe d'un polypeptide utile sous forme sensiblement complète.
2 Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient une séquence améliorée en ce sens qu'elle permet une liaison stable et complémentaire de la séquence Shine-Dalgarno au terminal 3 ' de l'Escherichia coli 16 S ribosome RNA.
3 Vecteur plasmide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il contient une séquence appropriée de clivage d'enzyme de restriction entre la séquence Shine-Dalgarno et le codon de démarrage de la translation ATG.
4 Vecteur plasmide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le site de clivage d'enzyme de restriction est une séquence clivable avec Eco RI.
Vecteur plasmide selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence Shine-Dalgarno renferme la séquence AGGAGGT -
6 Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un codage génétique pour le polypeptide utile est inséré en aval de la région terminale 5 ' non translatée (y compris de la région du promoteur et de la séquence Shine-Dalgarno).
7 Vecteur plasmide selon la revendication 6, caractérisé en ce que le peptide utile présente la séquence amino-acide de l'interféron immun humain.
8 Vecteur plasmide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le codage génétique pour la séquence amino-acide de l'interféron immun humain est un gène synthétisé chimiquement ou un gène produit à l'aide d'un interféron immun purifié m RNA provenant des tissus du pancreas humain ou des lymphocytes périphériques du sang.
9 Vecteur plasmide selon la revendication 8, caractérisé en ce que le gène synthétisé chimiquement renferme la séquence de base représentée à la figure 6.
Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasmide est choisi dans le groupe comprenant p IN 4 GIF 54 et p IN 5 GIF 54.
11 Vecteur plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il renferme la séquence de base représentée à la figure 3.
12 Vecteur plasmide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il renferme la séquence de base représentée à la figure 5.
13 Transformant d'Escherichia coli obtenu par transformation avec un plasmide selon l'une des revendications 7 à 12.
21 2550800
14 Transformant selon la revendication 13, choisi dans le
groupe comprenant WA 802/p IN 4 GIF 54, WA 802/p INSGIF 54, W 3110/p IN 4 GIF 554 et W 3110/p IN 5 GIF 54.
Culture contenant un polypeptide présentant la séquence amino-acide de l'interféron immun humain, ladite culture étant obtenue en cultivant un transformant selon la revendication 13 ou 14.
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