EP0624194A1 - Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation - Google Patents

Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation

Info

Publication number
EP0624194A1
EP0624194A1 EP93904117A EP93904117A EP0624194A1 EP 0624194 A1 EP0624194 A1 EP 0624194A1 EP 93904117 A EP93904117 A EP 93904117A EP 93904117 A EP93904117 A EP 93904117A EP 0624194 A1 EP0624194 A1 EP 0624194A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
vector
sequence
polypeptides
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP93904117A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrice Denefle
Françoise GUINET
Martine Latta
Anne Résidence Le Renouveau MURRY-BRELIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP0624194A1 publication Critical patent/EP0624194A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides derived from human apolipoprotein AIV (apoAI), the nucleotide sequences encoding these polypeptides, their preparation and their use.
  • apoAI apolipoprotein AIV
  • Apolipoprotein AIV is a protein made up of 376 amino acids, with a molecular weight of 46,000 daltons. The peptide and nucleotide sequences of apoAIV, as well as the position of the helices are shown on sequences SEQ ID No. 1 and 2. ApoAIV is a major component of the chylomicrons secreted in the lymph, but it has the particularity of be predominantly in a form not associated with lipoproteins in the plasma (RB Weinberg et al., 1983, J. Lipid. Research, 24: 52-59). Furthermore, plasma apoAIV is polymorphic, although the nature of this polymorphism is still unknown (G. Utermann et al., 1982, J.
  • the present invention results from the choice of the applicant to use apolipoprotein AIV as a target molecule for the study of factors influencing the reverse transport of cholesterol.
  • the present invention is based more precisely on the use of apoAIV for the preparation of new products, making it possible, by new therapies, to combat hypercholesterolaemia and the effects which are associated with it, such as atherosclerosis.
  • the present invention provides polypeptides derived from apoAIV, and thus makes it possible to pharmacologically exploit the properties of this protein.
  • the present invention therefore relates to polypeptides derived from human apolipoprotein AIV. They may in particular be polypeptides having an increased plasma stability compared to the native protein (lower sensitivity to physiological mechanisms of elimination or degradation), and therefore longer service life. It may also be polypeptides having an activity stimulating the efflux of cellular cholesterol, and therefore promoting the reverse transport of cholesterol, leading to discharge the cells having accumulated cholesterol in the context of the formation of a plaque. atheroma. They can also be polypeptides having only one or more of the properties of apoAIV.
  • polypeptides capable of binding cellular receptors, but lacking the activity stimulating the efflux of cellular cholesterol.
  • they may also be polypeptides lacking the activities of apoAIV.
  • Such polypeptides can indeed have therapeutic utility (generation of antibodies, structure-function studies, etc.).
  • polypeptides of the invention are capable of binding the HDL receptor.
  • the polypeptides are capable of binding the HDL receptor and of stimulating an eff lux of cholesterol.
  • polypeptides according to the invention can be of several types. In relation to human apoAIV, these may be mutation or substitution derivatives, deletion derivatives or addition derivatives. It is understood that the present invention also covers the polypeptides comprising several types of modifications, such as for example mutation and deletion derivatives, deletion and addition derivatives, etc.
  • the subject of the invention is non-natural polypeptides derived from human apolipoprotein AIV comprising, with respect to the sequence of human apolipoprotein ATV SEQ ID No. 2, at least one of the following modifications: (a) a point mutation relating to a functional residue, and / or,
  • polypeptides of the invention comprise at least one modification according to (a) and (b).
  • polypeptides of the invention comprise at least one modification according to (a) and (c).
  • polypeptides of the invention comprise a modification according to (a), (b) or (c) associated with a modification according to (d).
  • Mutation derivatives generally include a point mutation (deletion of one amino acid, or modification of one amino acid, or replacement of one amino acid with another), or double (modification of a pair of amino acids) .
  • the mutations chosen take account of the position of the mutated residues in their respective helices, and tend a priori to modify the functional groups without disturbing too much the structure of the helix concerned, and therefore of the polypeptide.
  • the term “functional residue” is understood to mean the residues capable of being involved in the activity of apoAIV, either at the level of the interaction with the receptor, or at the level of the transmission of a signal (such as for example stimulating the efflux of cholesterol).
  • Preferred residues are generally charged residues, which have a potential effect in the interaction of the polypeptide with its receptor. Such residues can be replaced by others, apolar, or chemically modified by removing or adding a charge. Other preferred residues are glycosylated residues and residues involved in the formation of disulfide (cysteine) bridges.
  • the polypeptides of the invention have, with respect to human apoAIV as represented in the sequence SEQ ID No. 2, at least one mutation on one of the following residues: aspartic acid in position 5, 44, 106, 153 ; glutamine in position 37, 194; asparagine in position 39; lysine at position 73, 84, 103, 169, 178; glutamic acid in position 76, 81, 87, 99, 131, 164, 187, 230; alanine at position 22; proline at position 139, 161; and serine in position 154.
  • aspartic acid can be replaced by a residue S, K, A, F or G; glutamine with a T, K or F residue; asparagine with a residue A or D; lysine by a residue G, E, T, D, A, Y, H or F; glutamic acid with a residue S, R, F, K, A, G, N, or Q; alanine by R or E residue wine; proline with an R or G residue; and serine by an E or R residue (the letters correspond to an amino acid according to the recognized code).
  • the polypeptides of the invention can be deletion derivatives.
  • the deletion (s) may relate to one end of the protein (C-terminal or N-terminal).
  • certain polypeptides of the invention are fragments of apoAIV, obtained by deletion of important parts of the protein.
  • the polypeptides of the invention have, relative to apoAIV human terminal deletions of at least 10 amino acids.
  • the deletion (s) may also relate to internal regions of rapoAIV, and in particular to whole helices or to pairs of helices.
  • polypeptides comprising all or part of rapoATV and an additional element such as a marker, a targeting agent, a stabilizer or another active element.
  • an additional element such as a marker, a targeting agent, a stabilizer or another active element.
  • a purification marker there may be mentioned by way of example the decapeptide tag of sequence MRGS (H) 6 described by Hochuli et al (Bio / technol. (1988) 1321).
  • this decapeptide can be fused into the N-terminal of rapoATV or of a derivative as defined above, thus allowing very rapid purification in one step, without affecting the production capacities of said polypeptide.
  • polypeptide P ( ⁇ N13, R93G): polypeptide having a deletion of the 13 N-terminal amino acids ( ⁇ N13) and a glycine instead of 'an arginine in position 93 (R93G).
  • - P polypeptides ( ⁇ N13): polypeptide having a deletion of the 13 N-terminal amino acids, and its tag P version (tag ⁇ N13).
  • polypeptide P ( ⁇ C194): polypeptide having a deletion of the last 194 amino acids.
  • polypeptide P ( ⁇ N182): polypeptide having a deletion of the first 182 amino acids.
  • - P polypeptides ( ⁇ hl-2): polypeptide having a deletion of helices 1 and 2 as shown in SEQ -D n ° 2 (residues D14 to V62), and its tag version.
  • - P polypeptides ( ⁇ h9-10) polypeptide having a deletion of helices 9 and 10 as presented in SEQ ID No. 2 (residues P206 to A249), and its tag version.
  • polypeptides ( ⁇ hll-12): polypeptide having a deletion of helices 11 and 12 as presented in SEQ ID No. 2 (residues P250 to E289), and its tag version.
  • - polypeptide P ( ⁇ hll-12, L87M): polypeptide having a deletion of helices 11 and 12 as shown in SEQ ID No. 2 ( ⁇ hll-12), and a methionine instead of a leucine in position 87 (L87M ).
  • - P polypeptides ( ⁇ hl3-14): polypeptide having a deletion of the helices
  • polypeptides ( ⁇ h5-6): polypeptide having a deletion of helices 5 and 6 as shown in SEQ ID No. 2 (residues P118 to R161), and its tag version.
  • D44F polypeptide having a phenylalanine instead of an aspartic acid in position 44.
  • polypeptide P (D44A) polypeptide having an alanine instead of an aspartic acid in position 44.
  • - polypeptide P (D5S) polypeptide having a serine instead of an aspartic acid in position 5.
  • polypeptide P (D5K): polypeptide having a lysine instead of an aspartic acid in position 5.
  • K178Y polypeptide having a tyrosine instead of a lysine in position 178.
  • K178A polypeptide having an alanine instead of a lysine in position 178.
  • E230K polypeptide having a lysine instead of a glutamic acid in position 230.
  • Atherosclerosis is a disease which is characterized by the formation of lipid or fibro-lipid plaques in the intima of the aorta, the coronary arteries and the carotid essentially. These plaques, more or less calcified depending on the progress of the process, can be combined with lesions, and are created by the accumulation in the arteries of fatty deposits consisting essentially of cholesterol esters. These plaques then cause a thickening of the arterial wall, with enlargement of the smooth muscle, appearance of foam cells and accumulation of fibrous tissue.
  • the atheromatous plaque is very clearly in relief on the wall, which gives it a stenosing character responsible for vascular occlusions by atheroma, thrombosis or embolism, which occur in the most affected patients.
  • an atheroma plaque therefore results from the combination of different factors, (i) an excess of plasma cholesterol, from which arterial deposits originate, and (ii) a defect in regulation between cholesterol influx and efflux at the level of peripheral tissues, in favor of an intracellular accumulation.
  • polypeptides according to the invention can in particular make it possible to slow down the formation of atheroma plaques, to induce the regression of atheroma plaques, and to reduce the risk of incidence of coronary accidents.
  • polypeptides of the invention can be obtained in various ways, and in particular by chemical and / or genetic means.
  • the polypeptides of the invention can be obtained either entirely by chemical synthesis, or by chemical or enzymatic modifications of the native protein. In the latter case, different chemical or enzymatic agents can be used, making it possible to modify residues (mutation derivatives), to mark residues (addition derivatives) or to fragment the protein (deletion derivatives).
  • sulfo-NHS-acetate which allows the acylation of primary amines and especially of lysine
  • tetranitromethane which introduces a nitrate group on tyrosines
  • N-bromo-succinimide which oxidizes tryptophan residues.
  • chemical and enzymatic agents making it possible to cut peptide bonds there may be mentioned more particularly cyanogen bromide, iodosobenzoate, trypsin, chymotrypsin, thermolysin or even proendopeptidase.
  • these treatments can be applied both to the polypeptide produced from a chemical synthesis and to the native polypeptide.
  • these treatments can also be applied to polypeptides obtained by genetic means, and therefore already comprising certain modifications.
  • the polypeptides of the invention are obtained by modification at the level of the coding nucleotide sequences, and expression of said sequences in a cellular host.
  • the present invention also relates to the nucleotide sequences coding for the polypeptides described above. They can be DNA sequences, RNA sequences, synthetic, semi-synthetic, hybrid sequences, etc. These sequences can be used:
  • the nucleotide sequences of the invention can be obtained from a sequence coding for apoAIV, by different techniques such as in particular by genetic cutting, mutagenesis, or any other treatment altering the structure of nucleic acids. The techniques best known to those skilled in the art are mentioned below in general cloning techniques. The detail of the synthesis of the nucleotide sequences of the invention is given in part B / of the examples.
  • the human apoAIV sequence used in the invention was obtained from a genomic clone containing the Kpnl-HindlII fragment of the human apoAIV gene sequence, which contains the end of intron 2, the all of exon 3 as well as the 3 'untranslated sequence.
  • This clone therefore did not contain, in particular, the first two exons of the human apoAIV gene (Elshourbagy et al. JBC (1987) 262: 7973).
  • the complete sequence was obtained by: - chemical synthesis of the 5 'end of the rapoAIV sequence, so that this synthetic fragment contains the codons corresponding to the part of the mature protein encoded by the first two exons of the human gene, and also the first nucleotides of the 5 ′ region of exon 3 extending to the BstEII site; then, - The binding of this synthetic fragment to a DNA fragment containing the remainder of the apolipoprotein AIV gene sequence located after the BstEII site, used to make the junction to the nearest nucleotide.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of the polypeptides of the invention described above. This process consists of carrying out the following steps:
  • a nucleotide sequence as defined above coding for a polypeptide of the invention is introduced into a cell, - in a second step, the cell thus obtained is cultured under conditions of expression of said nucleotide sequence and,
  • the nucleotide sequence can be introduced into the cell by different techniques.
  • the introduction can be carried out by transformation, conjugation, or electroporation.
  • the choice of one or the other of these methods is established in particular according to the chosen host.
  • eukaryotic hosts which can be used in the process of the invention, mention may be made of animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces. Kluyveromyces. Pichia pastoris. Schwanniomy these. or Hansenula.
  • animal cells mention may be made of COS, CHO, C127 cells, etc.
  • the fungi likely to be used in the present invention there may be mentioned more particularly Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp.
  • prokaryotic hosts which can be used in the context of the present invention, mention may be made of the following bacteria E.coli. Bacillus. or Streptomyces.
  • the method is implemented using a prokaryotic cell as the host cell.
  • the method of the invention is implemented using the E. coli bacterium as the host cell.
  • the nucleotide sequence used is a genomic sequence, a cDNA sequence, a hybrid sequence sequence, etc.
  • this nucleotide sequence generally comprises a region for initiating transcription and translation joined to the 5 ′ terminal end of the coding sequence, so as to direct and regulate the transcription and translation of said sequence.
  • the choice of these regions may vary depending on the host used. In particular, in bacteria such as E. coli. we can use the promoter of the tryptophan operon (Ptrp), or the left and right promoters of bacteriophage lambda (PL, PR) OR the promoter of gene 10 of bacteriophage T7.
  • the nucleotide sequence preferably forms part of a vector, which can be autonomously replicating or integrative. More particularly, autonomously replicating vectors can be prepared using autonomously replicating sequences in the chosen host. For example, in yeast, it may be replication origins derived from plasmids: pKDl (EP 241 435) or else chromosomal sequences (ARS) and in bacteria, it may be origins of replication derived from plasmids (pBR322, pET3, etc.). As regards integrative vectors, these can be prepared for example by using sequences homologous to certain regions of the host genome, allowing, by homologous recombination, the integration of the vector. In this regard, the use of rDNA allows multiple integration of exogenous DNA, and therefore its presence in greater number of copies per cell.
  • the nucleotide sequence comprises, upstream of the coding sequence, or, where appropriate, between the region for starting transcription and translation and the coding sequence, a "leader” sequence directing the polypeptide originating in the secretion pathways of the host used.
  • This “leader” sequence may be the “leader” sequence of apoAIV, but it may also be a heterologous sequence (originating from a gene coding for another protein) or even artificial. The choice of one of these sequences is notably guided by the host used.
  • polypeptides of the present invention can then be isolated from the culture medium by any technique known to those skilled in the art. More particularly, part C / of the examples describes a process allowing the polypeptides of the invention to be purified under native conditions, that is to say without any denaturation step.
  • compositions comprising one or more polypeptides according to the invention or one or more nucleotide sequences according to the invention.
  • compositions are intended for the treatment or prevention of conditions linked to hypercholesterolaemia.
  • the subject of the invention is pharmaceutical compositions comprising one or more polypeptides according to the invention, or one or more nucleotide sequences according to the invention, intended for slowing down the formation of atheroma plaques, and or for regression of atheroma plaques and / or a reduction in the risk of coronary accidents.
  • the present invention also relates to the use of the polypeptides described above for the production of molecules of non-peptide or non-exclusively peptide structure having the same type of activity.
  • the invention relates to the use of a polypeptide of the invention as described above for the preparation of non-peptide, or not exclusively peptide, molecules pharmacologically active on plasma cholesterol levels, by determination structural elements of this polypeptide which are important for its activity, and reproduction of these elements by non-peptide or non-exclusively peptide structures.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more molecules thus prepared.
  • Figure 1 Structure and construction of the plasmid pXL1697.
  • Figure 2 Structure of plasmids pXL1872 and pXL1867.
  • Figure 3 Structure of plasmids pXL1696 and pXL2051.
  • the buffer used for the ligations has the following composition: 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 15 mM DTT, 1 mM ATP, pH 7.5.
  • the oligonucleotide phosphorylation buffer has the following composition: 5 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl, 0.6 mM DTT, pH 7.5. Mutagenesis directed in vitro by oligodeoxynucleotides is carried out according to the method developed by Taylor et al. (Nucleic Acids Res. ⁇ (1985) 8749-8764) using the kit distributed by Amersham.
  • the nucleotide sequence of the apolipoprotein AIV gene described in the present invention differs from the previously published cDNA sequences (see in particular the list of cDNA sequences published by CY. Yang, ZW. Gu, I. Chong, W. Xiong, M Rosseneue, H. Yang, B. Lee, AM Gotto and L. Chan, 1989, BBA, 1002: 231-237).
  • the sequence coding for the signal peptide of the protein is absent, and, upstream of the first codon of the mature protein, a start codon for ATG translation has been placed.
  • this nucleotide sequence of the apolipoprotein AIV was obtained in an original way by the assembly of four oligonucleotides which have been synthesized chemically and whose size is between 86 and 107 mer (SEQ ID n ° 3-6).
  • SEQ ID n ° 3-6 the sequence of the oligonucleotides that cohesive ends Xbal and EcoRI have been defined in order to allow a two-step assembly of the complete sequence of the apolipoprotein AIV.
  • the four oligodeoxynucleotides which were used to assemble the apolipoprotein ATV gene were synthesized by the phosphoramidite method (LJ. Bride and MH Caruthers (1983) Tetrahedron Lett. 24: 245) using the Bioresearch synthesizer. (Model 8600) according to the manufacturers' advice.
  • the oligonucleotides were purified on acrylamide gel 15. Their sequence is given on sequences SEQ ID No. 3-6.
  • oligonucleotides were phosphorylated by treatment with T4 DNA kinase. Oligonucleotides A and C were paired with oligonucleotides B and D respectively under stoichiometric conditions. The hybridization of the oligonucleotides was carried out in Eppendorf tubes immersed in a beaker containing approximately 100 ml of water brought to 80 ° C. which is left to return to laboratory temperature.
  • the A-B and C-D fragments were ligated in the presence of T4 DNA ligase with the replicative form of the phage M13mpl0 previously digested with the enzymes Xbal and EcoRI.
  • the replicative form of the recombinant bacteriophage obtained called pXL1695 was used to transfect TG1 bacteria made competent by the CaC ⁇ method.
  • This replicon pXL1695 was purified, either in its form of single-stranded DNA and its sequence was verified, or in its form of replicative double-stranded DNA for the continuation of the constructions.
  • pXL1695 M13mplOABCD
  • pXL1694 a plasmid carrying a KnpI-HindIII fragment of approximately 3 kb containing all of the third exon of the apoAIV gene
  • Xbal and BstEII on the one hand
  • EcoRI and BstEII on the other hand, respectively.
  • pXL1695 a 167 base pair fragment was purified on acrylamide gel.
  • the replicative form of the vector M13mpl8amIV was digested with Xbal and EcoRI and a fragment of approximately 7 kb was purified on agarose gel.
  • the three fragments were pooled and ligated in the presence of T4 DNA ligase.
  • pXL1696 After transfection of TG1, clones containing the replicative form called pXL1696 were obtained. The complete coding sequence of the Xbal-EcoRI fragment thus cloned in pXL1 696 was checked. This fragment was then re-extracted from pXL1696 and ligated in the presence of an EcoRI-Hind ⁇ l fragment, of approximately 3 kb originating from pXL1694 and bearing in particular the end of exon 3 of the human apoAIV gene, and in the presence also of the vector M13mpl9, cut by the enzymes Xbal and HindIII.
  • the recombinant vector thus obtained, pXL1697 carries the entire coding sequence of apoAIV (1132 bp) as well as a genomic fragment of approximately 2 kb corresponding to intron 3 of the apoAIV gene (FIG. 1). .
  • 5'-GCCCCTTTGGAGAGCTGAGGATCCCCTGGTGCACTGGCCCCA-3 * made it possible to introduce a BamHI site on pXL1697 immediately after the stop codon (TGA) of the apoAIV gene.
  • the vector obtained was designated pXL1866.
  • the vector pXL1866 described above was cut by the enzymes Xbal and bamHI, and a 1.15 kb fragment containing the entire coding sequence of apoAIV was purified on agarose gel and religated in M13mpl8amIV to give the vector pXL1872 ( Figure 2).
  • the vector pXL1866 was cut with NdeI and BamHI and a 1.2 kb fragment was purified and then inserted into pET3-a, itself cut with BamHI and NdeI.
  • the resulting expression vector, pXL1867 therefore contains the coding sequence of apolipoprotein AIV without any residual fragment of intron 3 originating from the genomic sequence of apolipoprotein AIV (FIG. 2).
  • the 570 bp Xbal-EcoRI fragment containing the 5 ′ part of the apoAIV coding sequence was excised from the vector pXL1872, purified on agarose gel and religated in M13mpl0 to give the vector pXL1696 ( figure 3).
  • the 577 bp EcoRI-BamHI fragment containing the 3 'part of the apoAIV coding sequence was excised from the vector pXL1872, purified on agarose gel and religated in M13mpl9 to give the vector pXL2051 ( figure 3).
  • This mutation has the effect of changing an arginine codon to glycine in the protein. From the clone pXL1799 and another clone not carrying the additional mutation (C-> G), an NdeI-BamHI fragment of 1097 bp was purified and ligated with the vector pET3-a (AMS Biotechnology), itself cut by the enzymes NdeI and BamHI.
  • the vector pXL1775 which makes it possible to express at a very high level a polypeptide possessing a deletion of the 13 N-terminal amino acids ( ⁇ N13) and a glycine instead of an arginine in position 93 (R93G ); and the vector pXL1869, which makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a deletion of the 13 N-terminal amino acids ( ⁇ N13).
  • the vector pXL2168 was constructed, in which the sequence coding for the polypeptide P ( ⁇ N13) was fused in 5 ′ to a sequence coding for the decapeptide tag MRGS (H) 6.
  • the following 2 oligodeoxynucleotides were synthesized, using a Biosearch 8600 DNA synthesizer: Oligo A: 5'-TAATGCGTGGATCGCACCATCACCATCACCA-3 'Oligo B: 5'-TATGGTGATGGTGATGGTGCGGATCCACigotides Byn and and the hybridization product was ligated with the vector pXL1869, previously digested with the enzyme NdeI.
  • the vector thus obtained, designated pXL2168 codes for the polypeptide P ( ⁇ N13) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce a BamHI site as well as a TGA codon into the coding sequence of apoAIV at the respective positions 1000 and 997, causing a deletion of the 44 C-terminal amino acids.
  • the vector pXL2182 was constructed from the vector pXL1766.
  • the vector pXL2182 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ C44) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce a BamHI site as well as a TGA codon into the coding sequence of apoAIV at the respective positions 553 and 550, causing a deletion of 194 amino acids on the C-terminal side.
  • the recombinant vector pXL1774 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a deletion of the last 194 amino acids ( ⁇ C194).
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations .
  • This mutagenesis made it possible to introduce an NdeI site as well as an ATG codon in the coding sequence of apoAIV at the respective positions 544 and 547, causing a deletion of 182 amino acids on the N-terminal side.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 40 and 186, causing a deletion of 49 amino acids, from residue D14 to residue V62.
  • Ndel-BamHI fragment of 990 bp was purified and ligated with the vector pET3-a, itself cut by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL1981 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a deletion of helices 1 and 2 ( ⁇ hl-2).
  • the vector pXL2183 was constructed from the vector pXL1981.
  • the vector pXL2183 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ hl-2) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 484 and 615 causing a deletion of 44 amino acids, from residue P162 to residue A205.
  • the vector pXL2184 was constructed from the vector pXL1943.
  • the vector pXL2184 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ h7-8) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 616 and 747, causing a deletion of 44 amino acids, from residue P206 to residue A249.
  • Ndel-BamHI fragment of 1005 bp was purified and ligated with the vector pET3-a, itself cut by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL1982 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a deletion of helices 9 and 10 ( ⁇ h9-10).
  • the vector pXL2215 was constructed from the vector pXL1982.
  • the vector pXL2215 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ h9-10) fused in N-terminal to the decapeptide MRGS (H) 6.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 748 and 867, causing a deletion of 40 amino acids, from residue P250 to residue E289. Furthermore, during the sequence verification of the derivatives obtained, certain clones carried an additional point mutation on the sequence. This mutation (L-> M) has the effect of changing the codon leucine 87 to methionine in the protein.
  • NdeI-BamHI fragment of 1017 bp was purified and ligated with the vector pET3-a, itself cut , by the enzymes NdeI and BamHI.
  • Two recombinant vectors were thus obtained, including the vector pXL1986 which makes it possible to express at very high level a polypeptide having a deletion of helices 11 and 12 ( ⁇ hll-12) and a methionine instead of a leucine in position 87 (L87M ).
  • the vector pXL2186 was constructed from the vector obtained above, coding for the polypeptide P ( ⁇ hll-12).
  • the vector pXL2186 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ hll-12) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1872 described above was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 868 and 999, causing a deletion of 44 amino acids, from residue P290 to residue N333.
  • Ndel-BamHI fragment of 1005 bp was purified and ligated with the vector pET3-a, itself cut by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL1987 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a deletion of helices 13 and 14 ( ⁇ hl3-14).
  • the vector pXL2217 was constructed from the vector pXL1987.
  • the vector pXL2217 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ hl3-14) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • B2 Mutants produced from the plasmid pXL1696
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1696 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to delete the part of the coding sequence of apoAIV lying between positions 352 and 483, causing a deletion of 44 amino acids, from residue P118 to residue R161.
  • the vector pXL2185 was constructed from the vector pXL2071.
  • the vector pXL2185 thus obtained makes it possible to express at high level the polypeptide P ( ⁇ h5-6) fused in N-terminal with the decapeptide MRGS (H) 6.
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1696 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce an AGC codon into the coding sequence of apoAIV, causing the replacement of aspartic acid by a serine at position 5.
  • Ndel-EcoRI fragment of 564 bp was purified, then ligated with the EcoRI-BamHI fragment isolated from the plasmid pXL2051 and the vector pET3-a opened by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL2073 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a serine in position 5. 3. Generation of the vector pXL2069 and preparation of the polypeptide P (D5K).
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1696 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce an AAA codon into the coding sequence of apoAIV, causing the replacement of aspartic acid by a lysine at position 5.
  • Ndel-EcoRI fragment of 564 bp was purified, then ligated with the EcoRI-BamHI fragment isolated from the plasmid pXL2051 and the vector pET3-a opened by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL2069 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a lysine in position 5.
  • Ndel-EcoRI fragment of 564 bp was purified, then ligated with the EcoRI-BamHI fragment isolated from the plasmid pXL2051 and the vector pET3-a opened by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL2062 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a phenylalanine in position 44.
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL1696 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis allowed to introduce a GCG codon into the coding sequence of apoAIV, causing the replacement of aspartic acid by an alanine at position 44.
  • Ndel-EcoRI fragment of 564 bp was purified, then ligated with the EcoRI-BamHI fragment isolated from the plasmid pXL2051 and the vector pET3-a opened by the enzymes Ndel and BamHI.
  • the recombinant vector pXL2074 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having an alanine in position 44.
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL2051 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce a GCG codon into the coding sequence of apoAIV, causing the replacement of lysine by an alanine at position 178.
  • the recombinant vector pXL2073 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having an alanine in position 178.
  • a mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL2051 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce a TAT codon into the coding sequence of apoAIV, causing the replacement of lysine by a tyrosine at position 178.
  • the recombinant vector pXL2070 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a tyrosine in position 178.
  • mutagenesis directed on the single-stranded form of the plasmid pXL2051 was carried out using the Amersham kit according to the manufacturer's recommendations. This mutagenesis made it possible to introduce an AAA codon into the coding sequence of rapoAIV, causing the replacement of glutamic acid by a lysine at position 230.
  • the recombinant vector pXL2072 thus obtained makes it possible to express at a very high level a polypeptide having a lysine in position 230.
  • strain BL21 DE3 containing an expression plasmid of a polypeptide of the invention is used as described in parts B1-B3.
  • this polypeptide can be stabilized by adding rifampicin during the production phase.
  • the only mRNAs that can then be neosynthesized are those that do not depend on E. coli RNA polymerase.
  • the cells which then produce only the single mRNA of the desired polypeptide with the exception of all the others are incubated between 90 and 180 min at 37 ° C.
  • the recombinant polypeptide produced can represent from 20 to 30% of the total proteins produced by the bacteria.
  • the polypeptide is thus accumulated without degradation in the bacteria in soluble form.
  • the production was extrapolated in a fermenter, by high density culture of E.coli in Fed-Batch mode. This production was carried out in a 2 liter fermenter (Setric) in 2 phases: a growth phase of the microorganism up to an OD600 of 30 to 40 (duration: approximately 5 hours). This phase is carried out in the fermentation medium defined by Jung et al. (Ann.Inst.Pasteur / Microbiol. 122 (1988) 129-146); then a phase of induction of production, by adding dTPTG and rifampicin, and increasing the rate of supply of carbon and nitrogenous substrates (duration: approximately 1 hour 30 minutes).
  • the cells are collected and then lysed, for example by sonication.
  • a Branson sonicator (model B30, Proscience, France) was used after concentrating the cells 30 times in PBS buffer (KC1 0.2 g / 1, KH2PO4 0.2 g 1, NaCl 8 g / 1, Na2HPO4 1.25 g / 1).
  • the cells are broken at 4 ° C in continuous mode (2 pulses of 5 minutes).
  • the concentrated cell suspension can also be pretreated in the presence of Triton X-100 at room temperature before sonication.
  • the polypeptides P (R93G), P ( ⁇ C44) and P ( ⁇ N13) were purified according to the following protocol, which takes place under native conditions and does not require any affinity step for the lipids.
  • the cell culture is centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes and the pellet is taken up at the rate of 3 ml per gram of wet cells in buffer A (Na 2 HPO 4 81 mM, NaH 2 PO 4 19 mM; EDTA, 2 mM ; PMSF, I mM; pH 7.5; ⁇ -mercaptoethanol 10 mM).
  • the suspension is treated by 8 cycles of 3 minutes of ultrasound (BRANSON model set to 250W) at 4 ° C.
  • the extracts are centrifuged for 30 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C.
  • the supernatant SI is stored and the pellet is washed in the same volume of buffer A and recentrifuged under the same conditions.
  • the corresponding supernatant SI ' is added to the supernatant SI.
  • an aqueous solution of streptomycin sulfate is added an aqueous solution of streptomycin sulfate at 10% at the rate of 10 ml of solution per gram of protein.
  • the suspension is centrifuged for 30 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C.
  • the supernatant (S2) is recovered.
  • the dialysate is injected onto a QFF type ion exchange column (Pharmacia) and eluted with a NaCl gradient.
  • the determination of the fractions containing the polypeptides of the invention is carried out according to an Elisa test described below.
  • the interesting fractions are combined and concentrated by precipitation with ammonium sulfate (final concentration: 80% saturation). After 15 minutes of incubation at 4 ° C with shaking, the suspension is centrifuged for 30 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C. The pellet (C80) is recovered and taken up in buffer B and dialysis against 21 of buffer B.
  • the dialysate is injected on an ion exchange column of Mono Q type
  • buffer D ammonium sulfate, 1.7 M; Na 2 HPO 4 8.1 mM, NaH 2 PO 4 1.9 mM ; EDTA, 2 mM; pH 7.4
  • the dialysate is injected onto a hydrophobic phenyl-sepharose interaction chromatography column (Pharmacia) and eluted with buffer E (8.1 mM Na 2 HPO 4 ; 1.9 mM NaHgPO; 2 mM EDTA; pH 7.4) .
  • buffer E 8.1 mM Na 2 HPO 4 ; 1.9 mM NaHgPO; 2 mM EDTA; pH 7.4
  • the ELISA test developed consists of adsorbing on a plate with a polyclonal rabbit serum directed against human apoAIV (diluted to l / 1000th), saturating this plate with gelatin, incubating the test sample and finally, react an equimolar mixture of two monoclonal antibodies directed against apoAIV (MO3 and MO5, SERLIA, Institut Pasteur de Lille), followed by an immunoenzymatic revelation using a polyclonal anti-mouse serum coupled with peroxidase.
  • This test is easily calibrated with a range of dilutions of plasma apoAIV.
  • buffer F ammonium sulfate, 40% saturation; Na 2 HPO 4 8.1 mM; NaH 2 PO 4 1.9 mM; EDTA, 2 mM; pH 7.4
  • the fraction S2 is directly injected on a QFF type column (without fractional precipitation with ammonium sulfate) equilibrated in buffer B.
  • the polypeptide is excluded ⁇ ° ( ⁇ N182)) or eluted with a plateau at 250 mM NaCl in buffer B (P ( ⁇ hl-2)).
  • the polypeptide is then concentrated by precipitation in ammonium sulfate (final concentration 50% of saturation for P ( ⁇ hl-2), 10% for P ( ⁇ N182)).
  • the purification of P ( ⁇ hl-2) is terminated by centrifugation (30 min., 4 ° C, 10,000 g).
  • the pellet is recovered, taken up in PBS buffer, desalted on a gel of filtration PD10 QPharmacia) and dried at -20 ° C.
  • the polypeptide P ( ⁇ N182) precipitated with ammonium sulphate is injected onto a chromatography column for hydrophobic phenyl-sepharose interactions (Pharmacia) and eluted with buffer B.
  • the polypeptide is identified by polyacrylamide gel SDS, and the fractions of interest are collected and dialyzed against buffer B and stored at 4 ° C.
  • polypeptides P (tag ⁇ N13), P (tag ⁇ C44), P (tag ⁇ hl-2), P (tag ⁇ h7-8), P (tag ⁇ h9-10), P (tag ⁇ hll-12), P (tag ⁇ hl3-14) and P (tag ⁇ h5 -6) were purified according to the following protocol, which comprises only one step.
  • the cell culture is centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes and the pellet is taken up at the rate of 3 ml per gram of wet cells in buffer A (Na 2 HPO 4 81 mM, NaH 2 PO 4 19 mM; EDTA, 2 mM ; PMSF, 1 mM; pH 7.5; ⁇ -mercaptoethanol 10 mM).
  • buffer A Na 2 HPO 4 81 mM, NaH 2 PO 4 19 mM
  • EDTA 2 mM
  • PMSF 1 mM
  • pH 7.5 pH ⁇ -mercaptoethanol 10 mM
  • the suspension is treated by 3 cycles of 5 minutes of ultrasound (BRANSON model set at 250W) at 4 ° C.
  • the extracts are centrifuged for 1 hour at 11,000 g at 4 ° C.
  • the nucleic acids present in the supernatant were precipitated by the addition of 10% (w / v) of streptomycin sulfate (10 ml / g protein), incubation for 30 min. at 4 ° C, then recentrifuged under the same conditions as above.
  • the recombinant proteins present in the supernatant were purified by affinity chromatography on a chelated metal ion. The purification was carried out on agarose-nitrilotriacetic acid-nickel (NTA-Ni) resin according to the manufacturer's recommendations, with the following modifications:
  • the protein solution is desalted on a Tris-Acryl GF-05 column balanced with a 100 mM phosphate buffer pH 8.
  • the harvested protein fractions are combined, diluted in the same phosphate buffer to a final concentration of 4 mg / ml, and supplemented with Hecameg (powder), final concentration 25 mM.
  • the mixture was then loaded onto a balanced Ni-NTA column, with the same phosphate buffer containing 25 mM Hecameg. No fixed protein was eluted by washing the column with the same buffer.
  • the weakly bound proteins were eluted with a phosphate / citrate buffer pH 6, and the recombinant proteins, with a phosphate / citrate buffer pH 5.
  • the protein fractions obtained at pH 5 were neutralized by addition of 1M sodium hydroxide (30 ⁇ l / ml ) and supplemented with 2 protease inhibitors: EDTA 0.1M and PMSF 0.2M.
  • the fractions were then analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel (SDS-PAGE) containing 15% acrylamide / bis-acrylamide, according to Laemmli (Nature 227 (1970) 680), then grouped according to purity and quantity.
  • the pooled fractions were incubated in the presence of L (-) - histidine powder (final concentration 50 mM), for 1 h at 4 ° C, in order to destroy the Ni-poly-His-protein bond.
  • the liberated nickel and histidine were then removed by desalting on a Tris-Acryl GF-05 column equilibrated with a pH 7.4 phosphate buffer containing 2 mM EDTA.
  • the recombinant proteins thus purified were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and immunoblotting.
  • the immunoblotting was carried out with a mixture of anti-ApoAIV monoclonal antibodies conjugated to peroxidase, and goat anti-mouse antibodies conjugated to peroxidase. Bound peroxidase activity was revealed by incubation with a solution of 4-Chloro-1-Naphtol as a substrate.
  • the biological activity of the polypeptides of the invention was evaluated mainly on the basis of 2 parameters: their affinity for the HDL receptor and their effect on the efflux of cholesterol. These 2 parameters account for the cholesterol-lowering pharmacological potential of the polypeptides of the invention.
  • the protocol for determining these parameters is given below as well as the results obtained.
  • the purified polypeptides are used initially to reconstitute proteoliposomes with DMPC, the structure of which appears identical, in view of the behavior in exclusion chromatography, to that of the proteoliposomes reconstituted with native apoAIV. These reconstituted proteoliposomes are then tested for their capacity to bind to murine adipocytes (line Obl77) according to a protocol already described.
  • NAME RHONE-POULENC RORER S.A.
  • RUE 20, avenue Raymond ARON
  • CAG CTC AGG CAG AAA CTG GGC CCC CAT.GCG GGG GAC GTG GAA GGC CAC 960

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne des polypeptides dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine (apoAIV), les séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides, leur préparation et leur utilisation.

Description

POLYPEPTIDES DERIVES DE L' APOLIPOPROTEINE AIV HUMAINE, LEUR PREPARATION ET
La présente invention concerne des polypeptides dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine (apoAI), les séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides, leur préparation et leur utilisation.
L'apolipoprotéine AIV (apoAIV) est une protéine constituée de 376 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 46 000 daltons. Les séquences peptidiques et nucléotidiques de l'apoAIV, ainsi que la position des hélices sont représentées sur les séquences SEQ ID n° 1 et 2. L'apoAIV est un composant majeur des chylomicrons sécrétés dans la lymphe, mais elle présente la particularité d'être majoritairement sous forme non associée avec des lipoprotéines dans le plasma (R.B. Weinberg et Coll., 1983, J. Lipid. Research, 24 : 52-59). Par ailleurs, l'apoAIV plasmatique est polymorphe, bien que la nature de ce polymorphisme soit encore inconnue (G. Utermann et Coll., 1982, J. Biol. Chem. 257 : 501-507). Le rôle physiologique de l'apoAIV demeure également assez peu connu. On sait qu'elle peut activer in vitro la lécithin-cholestérol-acyltransférase (LCAT) (Steinmetz et Coll., 1985, J. Biol. Chem., 260 : 2258-2264) et qu'elle peut, comme l'apolipoprotéine AI, interférer avec la fixation des particules de HDL sur les cellules endothéliales aortiques bovines (Savion et Coll., 1987, Eur. J. Biochem., 257 : 4171-4178). Ces deux activités semblent indiquer que l'apoAIV intervient très vraisemblablement comme médiateur du transport inverse du cholestérol.
La présente invention résulte du choix de la demanderesse d'utiliser l'apolipoprotéine AIV comme molécule cible pour l'étude des facteurs influençant le transport inverse du cholestérol. La présente invention repose plus précisément sur l'utilisation de l'apoAIV pour la préparation de produits nouveaux, permettant, par de nouvelles thérapies, de lutter contre les hypercholestérolémies et les effets qui y sont associés, tels que l'athérosclérose.
Plus précisément, la présente invention fournit des polypeptides dérivés de l'apoAIV, et permet ainsi d'exploiter pharmacologiquement les propriétés de cette protéine. La présente invention a donc pour objet des polypeptides dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine. Il peut s'agir en particulier de polypeptides ayant une stabilité plasmatique accrue par rapport à la protéine native (sensibilité plus faible aux mécanismes physiologiques d'élimination ou de dégradation), et par conséquent une durée de vie plus longue. Il peut également s'agir de polypeptides ayant une activité stimulatrice de l'efflux du cholestérol cellulaire, et donc favorisant le transport inverse du cholestérol, conduisant à décharger les cellules ayant accumulé du cholestérol dans le contexte de la formation d'une plaque d'athérome. Il peut également s'agir de polypeptides possédant seulement une ou plusieurs des propriétés de l'apoAIV. En particulier, il peut s'agir par exemple de polypeptides capables de lier les récepteurs cellulaires, mais ne possédant pas l'activité stimulatrice de l'efflux du cholestérol cellulaire. En outre, il peut également s'agir de polypeptides dépourvus des activités de l'apoAIV. De tels polypeptides peuvent en effet présenter des utilités thérapeutiques (génération d'anticorps, études structure-fonction, etc).
Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont capables de lier le récepteur HDL.
Encore plus préférentiellement, les polypeptides sont capables de lier le récepteur HDL et de stimuler un eff lux de cholestérol.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être de plusieurs types. Il peut s'agir, par rapport à l'apoAIV humaine, de dérivés de mutation ou de substitution, de dérivés de délétion ou de dérivés d'addition. Il est entendu que la présente invention couvre également les polypeptides comportant plusieurs types de modifications, tels que par exemple des dérivés de mutation et de délétion, des dérivés de délétion et d'addition, etc.
Plus préférentiellement, l'invention a pour objet des polypeptides non- naturels dérivés de l'apolipoprotéine AIV humaine comprenant, par rapport à la séquence de l'apolipoprotéine ATV humaine SEQ ID n° 2, au moins une des modifications suivantes : (a) une mutation ponctuelle portant sur un résidu fonctionnel, et/ou,
(b) une délétion d'une extrémité terminale d'au moins 10 acides aminés, et/ou,
(c) une délétion d'une hélice ou d'une paire d'hélices, et/ou,
(d) une partie additionnelle hétérologue possédant une activité biologique différente ou complémentaire de celle de l'apoAIV, ou une propriété de marqueur, de cibleur ou de stabilisateur.
Dans un mode particulier, les polypeptides de l'invention comprennent au moins une modification selon (a) et (b).
Dans un autre mode particulier, les polypeptides de l'invention comprennent au moins une modification selon (a) et (c). Dans un autre mode particulier, les polypeptides de l'invention comprennent une modification selon (a), (b) ou (c) associée à une modification selon (d).
Les dérivés de mutation comprennent généralement une mutation ponctuelle (suppression d'un acide aminé, ou modification d'un acide aminé, ou remplacement d'un acide aminé par un autre), ou double (modification d'une paire d'acides aminés). Les mutations choisies tiennent compte de la position des résidus mutés dans leurs hélices respectives, et tendent a priori à modifier les groupements fonctionnels sans trop perturber la structure de l'hélice concernée, et donc du polypeptide. Au sens de la présente invention, on entend par résidu fonctionnel les résidus susceptibles d'être impliqués dans l'activité de l'apoAIV, soit au niveau de l'interaction avec le récepteur, soit au niveau de la transmission d'un signal (tel que par exemple la stimulation de l'efflux du cholestérol). Les résidus préférés sont généralement les résidus chargés, qui possèdent un effet potentiel dans l'interaction du polypeptide avec son récepteur. De tels résidus peuvent être remplacés par d'autres, apolaires, ou modifiés chimiquement par suppression ou ajout d'une charge. Les résidus glycosylés et les résidus impliqués dans la formation de ponts disulfure (cystéine) constituent d'autres résidus préférés.
Préférentiellement, les polypeptides de l'invention possèdent par rapport à l'apoAIV humaine telle que représentée sur la séquence SEQ ID n° 2 au moins une mutation sur l'un des résidus suivants : acide aspartique en position 5, 44, 106, 153 ; glutamine en position 37, 194 ; asparagine en position 39 ; lysine en position 73, 84, 103, 169, 178 ; acide glutamique en position 76, 81, 87, 99, 131, 164, 187, 230 ; alanine en position 22 ; proline en position 139, 161 ; et serine en position 154.
Plus préférentiellement, l'acide aspartique peut être remplacé par un résidu S, K, A, F ou G ; la glutamine par un résidu T, K ou F ; l'asparagine par un résidu A ou D ; la lysine par un résidu G, E, T, D, A, Y, H ou F ; l'acide glutamique par un résidu S, R, F, K, A, G, N, ou Q ; l'alanine par vin résidu R ou E ; la proline par un résidu R ou G ; et la serine par un résidu E ou R (les lettres correspondent à un acide aminé selon le code reconnu).
Les polypeptides de l'invention peuvent être des dérivés de délétion. Dans ce cas, la ou les délétions peuvent porter sur une extrémité de la protéine (C- terminale ou N-terminale). A cet égard, certains polypeptides de l'invention sont des fragments d'apoAIV, obtenus par délétion de parties importantes de la protéine. Préférentiellement, les polypeptides de l'invention possèdent par rapport à l'apoAIV humaine des délétions terminales d'au moins 10 acides aminés. La ou les délétions peuvent également porter sur des régions internes de rapoAIV, et notamment sur des hélices entières ou sur des paires d'hélices.
Un autre type de polypeptides selon l'invention est représenté par des dérivés d'addition. En particulier, l'invention concerne les polypeptides comprenant tout ou partie de rapoATV et un élément supplémentaire tel qu'un marqueur, un cibleur, un stabilisant ou un autre élément actif. Comme marqueur de purification, on peut citer à titre d'exemple le décapeptide tag de séquence MRGS(H)6 décrit par Hochuli et al (Bio/technol. (1988) 1321). Comme illustré dans les exemples, ce décapeptide peut être fusionné en N-terminal de rapoATV ou d'un dérivé tel que défini ci-avant, permettant ainsi une purification très rapide en une étape, sans affecter les capacités de production dudit polypeptide.
A titre d'exemples spécifiques de polypeptides selon l'invention, on peut citer préférentiellement les polypeptides suivants : - polypeptide P(ΔN13,R93G) : polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux (ΔN13) et une glycine au lieu d'une arginine en position 93 (R93G).
- polypeptides P(ΔN13) : polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux, et sa version tag P(tagΔN13). - polypeptide P(R93G) : polypeptide possédant une glycine au lieu d'une arginine en position 93.
- polypeptides P(ΔC44) : polypeptide possédant une délétion des 44 acides aminés C-terminaux, et sa version tag.
- polypeptide P(ΔC194) : polypeptide possédant une délétion des 194 derniers acides aminés.
- polypeptide P(ΔN182) : polypeptide possédant une délétion des 182 premiers acides aminés.
- polypeptides P(Δhl-2) : polypeptide possédant une délétion des hélices 1 et 2 telles que représentées sur la SEQ -D n° 2 (résidus D14 à V62), et sa version tag. - polypeptides P(Δh7-8) : polypeptide possédant une délétion des hélices 7 et 8 telles que présentées sur la SEQ ID n° 2 (résidus P162 à A205), et sa version tag. - polypeptides P(Δh9-10) : polypeptide possédant une délétion des hélices 9 et 10 telles que présentées sur la SEQ ID n° 2 (résidus P206 à A249), et sa version tag.
- polypeptides P(Δhll-12) : polypeptide possédant une délétion des hélices 11 et 12 telles que présentées sur la SEQ ID n° 2 (résidus P250 à E289), et sa version tag.
- polypeptide P(Δhll-12,L87M) : polypeptide possédant une délétion des hélices 11 et 12 telles que représentées sur la SEQ ID n° 2 (Δhll-12), et une methionine au lieu d'une leucine en position 87 (L87M). - polypeptides P(Δhl3-14) : polypeptide possédant une délétion des hélices
13 et 14 telles que présentées sur la SEQ ID n° 2 (résidus P290 à N333), et sa version tag.
- polypeptides P(Δh5-6) : polypeptide possédant une délétion des hélices 5 et 6 telles que représentées sur la SEQ ID n° 2 (résidus P118 à R161), et sa version tag.
- polypeptide P(D44F) : polypeptide possédant une phénylalanine au lieu d'un acide aspartique en position 44.
- polypeptide P(D44A) : polypeptide possédant une alanine au lieu d'un acide aspartique en position 44. - polypeptide P(D5S) : polypeptide possédant une serine au lieu d'un acide aspartique en position 5.
- polypeptide P(D5K) : polypeptide possédant une lysine au lieu d'un acide aspartique en position 5.
- polypeptide P(K178Y) : polypeptide possédant une tyrosine au lieu d'une lysine en position 178.
- polypeptide P(K178A) : polypeptide possédant une alanine au lieu d'une lysine en position 178.
- polypeptide P(E230K) : polypeptide possédant une lysine au lieu d'un acide glutamique en position 230.
De tels polypeptides selon l'invention présentent un intérêt pharmaceutique important, notamment dans le traitement el/ou la prévention de l'athérosclérose. L'athérosclérose est une maladie qui se caractérise par la formation de plaques lipidiques ou fibro-lipidiques dans l'intima de l'aorte, des artères coronaires et de la carotide essentiellement. Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions, et sont créées par l'accumulation dans les artères de dépôts graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques provoquent alors un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par atherome, thrombose ou embolie, qui surviennent chez les patients les plus atteints.
La formation d'une plaque d'athérome résulte donc de la conjugaison de différents facteurs, (i) un excès de cholestérol plasmatique, dont proviennent les dépôts artériels, et (ii) un défaut de régulation entre influx et efflux de cholestérol au niveau des tissus périphériques, en faveur d'une accumulation intracellulaire.
Compte tenu de leur propriétés, les polypeptides selon l'invention peuvent notamment permettre de ralentir la formation des plaques d'athérome, d'induire la régression des plaques d'athérome, et de diminuer le risque d'incidence d'accidents coronariens.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus de différentes façons, et notamment par voie chimique et/ou génétique.
Dans le cas de la préparation par voie chimique, les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus soit entièrement par synthèse chimique, soit par modifications chimique ou enzymatique de la protéine native. Dans ce dernier cas, différents agents chimiques ou enzymatiques peuvent être utilisés, permettant de modifier des résidus (dérivés de mutation), de marquer des résidus (dérivés d'addition) ou de fragmenter la protéine (dérivés de délétion). Parmi les agents chimiques permettant de modifier ou marquer des acides aminés, on peut citer plus particulièrement le sulfo-NHS-acétate, qui permet l'acylation des aminés primaires et surtout des lysine ; le tétranitrométhane qui introduit un groupement nitrate sur les tyrosines, ou encore le N-bromo-succinimide qui oxyde les résidus tryptophane. Parmi les agents chimiques et enzymatiques permettant de couper des liaisons peptidiques, on peut citer plus particulièrement le bromure de cyanogène, le iodosobenzoate, la trypsine, la chymotrypsine, la thermolysine ou encore la proendopeptidase.
Comme indiqué plus haut, ces traitements peuvent être appliqués aussi bien sur le polypeptide produit d'une synthèse chimique que sur le polypeptide natif. De plus, ces traitements peuvent également être appliqués aux polypeptides obtenus par vois génétique, et de ce fait, comportant déjà certaines modifications. Dans le cas de la préparation par voie génétique, les polypeptides de l'invention sont obtenus par modification au niveau des séquences nucléotidiques codantes, et expression desdites séquences dans un hôte cellulaire.
A cet égard, la présente invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides décrits plus haut. Il peut s'agir de séquences d'ADN, de séquences d'ARN, de séquences synthétiques, semi- synthétiques, hybrides, etc. Ces séquences peuvent être utilisées :
- pour la production des polypeptides de l'invention par expression dans un hôte cellulaire, - comme composition pour des thérapies géniques,
- pour la réalisation de sondes marquées permettant l'identification de polypeptides apparentés ou la mise en évidence d'une expression des polypeptides de l'invention,
- pour la préparation de nouveaux vecteurs de clonage ou d'expression comportant ces séquences, ou encore,
- pour la préparation de nouvelles cellules eucaryotes ou procaryotes recombinantes ou d'animaux transgéniques contenant ces séquences ou ces vecteurs.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être obtenues à partir d'une séquence codant pour apoAIV, par différentes techniques telles que notamment par découpage génétique, mutagenèse, ou tout autre traitement altérant la structure des acides nucléiques. Les techniques les plus connues de l'homme du métier sont mentionnées ci-après dans les techniques générales de clonage. Le détail de la synthèse des séquences nucléotidiques de l'invention est donné dans la partie B/ des exemples. La séquence de l'apoAIV humaine utilisée dans l'invention a été obtenue à partir d'un clone génomique contenant le fragment Kpnl-HindlII de la séquence du gène humain de l'apoAIV, qui contient la fin de l'intron 2, la totalité de l'exon 3 ainsi que la séquence 3' non traduite. Ce clone ne contenait donc pas, en particulier, les deux premiers exons du gène de l'apoAIV humaine (Elshourbagy et coll. J.B.C. (1987) 262:7973). La séquence complète a été obtenue par : - synthèse chimique de l'extrémité 5' de la séquence de rapoAIV, de sorte que ce fragment synthétique contienne les codons correspondant à la partie de la protéine mature codée par les deux premiers exons du gène humain, et également les premiers nucléotides de la région 5' de l'exon 3 s'étendant jusqu'au site BstEII ; puis, - la liaison de ce fragment synthétique à un fragment d'ADN contenant le restant de la séquence du gène de l'apolipoprotéine AIV située après le site BstEII, utilisé pour effectuer la jonction au nucléotide près.
Le détail de ces étapes est donné dans la partie A/ des exemples.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des polypeptides de l'invention décrits plus haut. Ce procédé consiste à réaliser les étapes suivantes :
- dans une première étape, on introduit dans une cellule une séquence nucléotidique telle que définie plus haut codant pour un polypeptide de l'invention, - dans une deuxième étape, on cultive la cellule ainsi obtenue dans des conditions d'expression de ladite séquence nucléotidique et,
- dans une troisième étape, on récupère le polypeptide produit.
Plus particulièrement, lors de la première étape du procédé de l'invention, la séquence nucléotidique peut être introduite dans la cellule par différentes techniques. Notamment, rintroduction peut être effectuée par transformation, conjugaison, ou électroporation.
S'agissant de la transformation, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, elle peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulf oxyde selon la technique de Durrens et al. (Curr. Genêt. !£ (1990) 7). La transformation peut encore être effectuée selon la technique décrite par Dagert at al. (Gène £ (1979) 23-28) par traitement avec une solution de CaCl2 puis choc thermique. Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet EP 361 991.
S'agissant d'électroporation, la technique décrite par Karube et al. (FEBS Letters 182 (1985) 90) peut avantageusement être utilisée.
Le choix de l'une ou de l'autre de ces méthodes est établi notamment en fonction de l'hôte choisi. Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le procédé de l'invention, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces. Kluyveromyces. Pichia pastoris. Schwanniomy ces . ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc. Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.
Parmi les hôtes procaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les bactéries suivantes E.coli. Bacillus. ou Streptomyces.
Dans un mode préféré de l'invention, le procédé est mis en oeuvre en utilisant comme cellule hôte une cellule procaryote.
Encore plus préférentiellement, le procédé de l'invention est mis en oeuvre en utilisant comme cellule hôte la bactérie E.coli.
Généralement, la séquence nucléotidique utilisée est une séquence génomique, une séquence d'ADNc, une séquence séquence hybride, etc. Pour une meilleure mise en oeuvre de l'invention, on préfère cependant utiliser un ADNc (Cf exemple A/). Par ailleurs, cette séquence nucléotidique comprend généralement une région de démarrage de la transcription et de la traduction jointe à l'extrémité 5' terminale de la séquence codante, de façon à diriger et à réguler la transcription et la traduction de ladite séquence. Le choix de ces régions peut varier en fonction de l'hôte utilisé. En particulier, chez les bactéries telles que E.coli. on peut utiliser le promoteur de l'opéron tryptophane (Ptrp), ou les promoteurs gauche et droit du bactériophage lambda (PL, PR) OU encore le promoteur du gène 10 du bactériophage T7. Par ailleurs, la séquence nucléotidique fait préférentiellement partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif . Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. A titre d'exemple, chez la levure, il peut s'agir d'origines de réplication dérivées de plasmides : pKDl (EP 241 435) ou bien de séquences chromosomiques (ARS) et chez la bactérie, il peut s'agir d'origines de réplication dérivées de plasmides (pBR322, pET3, etc). S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. A cet égard, l'utilisation d'ADNr permet une intégration multiple de l'ADN exogène, et donc sa présence en plus grand nombre de copies par cellules.
Dans un mode préféré, la séquence nucléotidique comprend, en amont de la séquence codante, ou, le cas échéant, entre la région de démarrage de la transcription et de la traduction et la séquence codante, une séquence "leader" dirigeant le polypeptide naissant dans les voies de sécrétion de l'hôte utilisé. Cette séquence "leader" peut être la séquence "leader" de l'apoAIV, mais il peut également s'agir d'une séquence hétérologue (issue d'un gène codant pour une autre protéine) ou même artificielle. Le choix de l'une de ces séquences est notamment guidé par l'hôte utilisé.
Les polypeptides de la présente invention peuvent ensuite être isolés du milieu de culture par toute technique connue de l'homme du métier. Plus particulièrement, la partie C/ des exemples décrit un procédé permettant de purifier dans les conditions natives, c'est-à-dire sans aucune étape de dénaturation, les polypeptides de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne des compositions pharmaceutiques comportant un ou plusieurs polypeptides selon l'invention ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'invention.
Préférentiellement, de telles compositions sont destinées au traitement ou à la prévention des affections liées aux hypercholestérolémies.
Encore plus préférentiellement, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comportant un ou plusieurs polypeptides selon l'invention, ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'invention, destinées au ralentissement de la formation de plaques d'athérome, et ou à la régression des plaques d'athérome et/ou à la diminution des risques d'accidents coronariens.
De plus, la présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides décrits ci-avant pour la réalisation de molécules de structure non- peptidique ou non exclusivement peptidique possédant le même type d'activité. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention tel que décrit ci-avant pour la préparation de molécules non-peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement sur les niveaux plasmatiques de cholestérol, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité, et reproduction de ces éléments par des structures non- peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples suivants, qui doivent être considérés comme illustratif s et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Structure et construction du plasmide pXL1697. Figure 2 : Structure des plasmides pXL1872 et pXL1867. Figure 3 : Structure des plasmides pXL1696 et pXL2051.
TECHNIQUESGENERALESDECLONAGE
Les techniques classiques de purification de plasmides, de préparation des cellules compétentes pour la transformation par la méthode au CaCl2, sont décrites dans le manuel de laboratoire : T. Maniatis et Coll., Molecular cloning, 1982, Cold
Spring Harbor Laboratory. es séquences d'ADN ont été déterminées par la méthode de Sanger (Smith AJ.H., 1980, Methods in Enzymol. 65 : 499-559). Les protocoles de clonage dans M13 sont décrits (Messing et Coll. 1981, Nucleic Acid Res. 9 :
309-321). Les endonucléases de restriction (New England Biolabs) ont été utilisées selon les conseils du fabricant. Le tampon utilisé pour les ligatures a la composition suivante : Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 15 mM, ATP 1 mM, pH 7,5. Le tampon de phosphorylation des oligonucléotides a la composition suivante : Tris-HCl 5 mM, MgCl 1 mM, DTT 0,6 mM, pH 7,5. La mutagenèse dirigée in vitro par oligodésoxynucléotides est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. (Nucleic Acids Res. ϋ (1985) 8749-8764) en utilisant le kit distribué par Amersham.
A - SYNTHESE ET ASSEMBLAGE DE LA SEOUENCE CODANTE DE L'APOLIPOPROTEINE AIV ET PREPARATION DES VECTEURS-
AÏ - Synthèse et assemblage de la séquence codante de l'ApoAIV.
La séquence nucléotidique du gène de l'apolipoprotéine AIV décrite dans la présente invention diffère des séquences de cDNA publiées précédemment (voir en particulier la liste des séquences cDNA publiée par C-Y. Yang, Z-W. Gu, I. Chong, W. Xiong, M. Rosseneue, H. Yang, B. Lee, A.M. Gotto et L. Chan, 1989, B.B.A., 1002 : 231-237). Notamment, la séquence codant pour le peptide signal de la protéine est absente, et, en amont du premier codon de la protéine mature a été placé un codon de démarrage de la traduction ATG. Celui-ci introduit donc une méthionine surnumé- raire en amont de la séquence de la protéine mature, et permet ainsi d'exprimer le gène codant uniquement pour la partie mature de la protéine. D'autre part, cette séquence nucléotidique de l'apolipoprotéine AIV a été obtenue d'une manière originale par l'assemblage de quatre oligonucléotides qui ont été synthétisés par voie chimique et dont la taille est comprise entre 86 et 107 mer (SEQ ID n° 3-6). De plus, on peut remarquer sur la séquence des oligonucléotides que des extrémités cohésives Xbal et EcoRI ont été définies afin de permettre un assemblage en deux étapes de la séquence complète de l'apolipoprotéine AIV.
1. Synthèse des oligonucléotides
Les quatre oligodéoxynucléotides qui ont servi à l'assemblage du gène de l'apolipoprotéine ATV, ont été synthétisés par la méthode des phosphoramidites (LJ. Bride et M.H. Caruthers (1983) Tetrahedron Lett. 24 : 245) au moyen du synthé¬ tiseur Bioresearch (Modèle 8600) selon les conseils des fabricants. Les oligonucléo¬ tides ont été purifiés sur gel d'acrylamide 15 . Leur séquence est donnée sur les séquences SEQ ID n° 3-6.
2. Première étape d'assemblage
Les oligonucléotides ont été phosphorylés par traitement avec la T4 DNA kinase. Les oligonucléotides A et C ont été appariés respectivement avec les oligonucléotides B et D dans des conditions stoechiométriques. L'hybridation des oligonucléotides a été réalisée dans des tubes Eppendorf immergés dans un bêcher contenant environ 100 ml d'eau portée à 80°C que l'on laisse revenir à la température du laboratoire.
Les fragments A-B et C-D ont été ligaturés en présence de T4 DNA ligase avec la forme réplicative du phage M13mpl0 au préalable digérée par les enzymes Xbal et EcoRI.
La forme réplicative du bactériophage recombinant obtenu appelé pXL1695 (M13mpl0ABCD) a servi à transfecter des bactéries TGl rendues compétentes par la méthode au CaC^.
Ce réplicon pXL1695 a été purifié, soit sous sa forme d'ADN simple brin et sa séquence a été vérifiée, soit sous sa forme d'ADN double brin réplicative pour la suite des constructions.
3. Deuxième étape d'assemblage
La forme réplicative de pXL1695 (M13mplOABCD) et un plasmide appelé pXL1694 portant un fragment KnpI-HindIII d'environ 3 kb contenant la totalité du troisième exon du gène de l'apoAIV (N.A. Elhourbagy, J. Biol. Chem., 1987, 262 : 7973-7981) ont été respectivement digérés par Xbal et BstEII d'une part et EcoRI et BstEII d'autre part. Dans le cas de pXL1695, un fragment de 167 paires de bases a été purifié sur gel d'acrylamide. La forme réplicative du vecteur M13mpl8amIV a été digérée par Xbal et EcoRI et un fragment d'environ 7 kb a été purifié sur gel d'agarose.
Les trois fragments on été rassemblés et ligaturés en présence de T4 DNA ligase.
Après transfection de TGl, des clones contenant la forme réplicative appelée pXL1696 ont été obtenus. La séquence codante complète du fragment Xbal-EcoRI ainsi clone dans pXLl 696 a été vérifiée. Ce fragment a ensuite été re-extrait de pXL1696 et ligaturé en présence d'un fragment EcoRI-Hindϋl, d'environ 3 kb provenant de pXL1694 et portant en particulier la fin de l'exon 3 du gène de l'apoAIV humaine, et en présence également du vecteur M13mpl9, coupé par les enzymes Xbal et HindIII.
Le vecteur recombinant ainsi obtenu, pXL1697, porte la totalité de la séquence codante de l'apoAIV (1132 bp) ainsi qu'un fragment génomique d'environ 2 kb correspondant à l'intron 3 du gène de l'apoAIV (figure 1).
Une mutagenèse dirigée effectuée avec le kit de mutagenèse Amersham (RPN 1523) à l'aide de roligodeoxynucléotide synthétique Sql087 :
5'-GCCCCTTTGGAGAGCTGAGGATCCCCTGGTGCACTGGCCCCA-3* a permis d'introduire sur pXL1697 un site BamHI immédiatement après le codon Stop (TGA) du gène de l'apoAIV. Le vecteur obtenu a été dénommé pXL1866.
A2 - Préparation des vecteurs portant la séquence de l'apoAIV.
1. Préparation du vecteur pXL1872.
Le vecteur pXL1866 décrit ci-dessus a été coupé par les enzymes Xbal et bamHI, et un fragment de 1,15 kb contenant la totalité de la séquence codante de l'apoAIV a été purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mpl8amIV pour donner le vecteur pXL1872 (figure 2).
2. Préparation du vecteur pXL1867.
Le vecteur pXL1866 a été coupé par Ndel et BamHI et un fragment de 1,2 kb a été purifié puis inséré dans pET3-a, lui même coupé par BamHI et Ndel. Le vecteur d'expression résultant, pXL1867, contient donc la séquence codante de l'apolipoprotéine AIV sans aucun fragment résiduel de l'intron 3 provenant de la séquence génomique de l'apolipoprotéine AIV (figure 2).
3. Préparation du vecteur pXL1696.
Le fragment Xbal-EcoRI de 570 pb contenant la partie 5' de la séquence codante de l'apoAIV (résidus 1 à 189) a été excisé du vecteur pXL1872, purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mpl0 pour donner le vecteur pXL1696 (figure 3).
4.- Préparation du vecteur pXL2051.
Le fragment EcoRI-BamHI de 577 pb contenant la partie 3' de la séquence codante de l'apoAIV (résidus 188 à 377) a été excisé du vecteur pXL1872, purifié sur gel d'agarose et religaturé dans M13mpl9 pour donner le vecteur pXL2051 (figure 3).
B - GENERATION DES SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LES POLYPEPTIDES DE L'INVENTION ET PRODUCTION DE CES POLYPEPTIDES.
Bl : Mutants réalisés à partir du vecteur pXLl 872
1. Génération des vecteurs pXL1775, pXL1869 et pXL2168, et préparation des polypeptides P(ΔN13,R93G), P(ΔN13) etP(tagΔN13).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé suivant :
5*-GACCAGGTGGCCACAGTGCATATGGACTACTTCAGCCAGCTG-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du vecteur pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un site Ndel ainsi qu'un codon ATG dans la séquence codante de rapoATV aux positions respectives 40 et 43, provoquant une délétion des 13 premiers acides aminés N-terminaux. Par ailleurs, lors de la vérification de séquence des dérivés obtenus, certains clones dont le clone pXL1799 portaient une mutation ponctuelle supplémentaire en position 280 sur la séquence. Cette mutation (C->G) a pour effet de changer un codon arginine en glycine dans la protéine. A partir du clone pXL1799 et d'un autre clone ne portant pas la mutation (C->G) supplémentaire, un fragment Ndel-BamHI de 1097 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a (AMS Biotechnology), lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI. Deux vecteurs recombinants ont ainsi été obtenus : Le vecteur pXL1775, qui permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux (ΔN13) et une glycine au lieu d'une arginine en position 93 (R93G); et le vecteur pXL1869, qui permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 13 acides aminés N-terminaux (ΔN13).
A partir du vecteur pXL1869, le vecteur pXL2168 a été construit, dans lequel la séquence codant pour le polypeptide P(ΔN13) a été fusionnée en 5' à une séquence codant pour le décapeptide tag MRGS(H)6. Pour cela, les 2 oligodéoxynucléotides suivants ont été synthétisés, en utilisant un synthétiseur d'ADN Biosearch 8600 : Oligo A : 5'-TAATGCGTGGATCGCACCATCACCATCACCA-3' Oligo B : 5'-TATGGTGATGGTGATGGTGCGGATCCACGCAT-3' Les oligodéoxynucléotides A et B ont été hybrides, et le produit d'hybridation a été ligaturé avec le vecteur pXL1869, préalablement digéré par l'enzyme Ndel. Le vecteur ainsi obtenu, désigné pXL2168, code pour le polypeptide P(ΔN13) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
2. Génération des vecteurs pXL1766 et pXL2182, et préparation du polypeptide P(ΔC44) et de sa version tag.
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylé suivant : 5'-CTGAGGGACAAGGTCAACTGAGGATCCAGCACCTTCAAGGAGAAAG-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci- dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un site BamHI ainsi qu'un codon TGA dans la séquence codante de l'apoAIV aux positions respectives 1000 et 997, provoquant une délétion des 44 acides aminés C-terminaux. A partir d'un clone mutant (pXL1765) dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 1004 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI. Le vecteur recombinant pXL1766 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 44 acides aminés C-terminaux (ΔC44).
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2182 a été construit à partir du vecteur pXL1766. Le vecteur pXL2182 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(ΔC44) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
3. Génération du vecteur pXL1774 et préparation du polypeptide P(ΔC194).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-CTCAAGGGACGCCTTACGTGAGGATCCGACGAATTCCAAAGTC-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un site BamHI ainsi qu'un codon TGA dans la séquence codante de l'apoAIV aux positions respectives 553 et 550, provoquant une délétion de 194 acides aminés du coté C-terminal.
A partir d'un clone mutant (pXL1798) dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 555 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1774 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 194 derniers acides aminés (ΔC194).
4. Génération du vecteur pXL1817 et préparation du polypeptide P(ΔN182).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GAGCTCAAGGGACGCCATATGCCCTACGCTGACGAATTC-3', une muta- genèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un site Ndel ainsi qu'un codon ATG dans la séquence codante de l'apoAIV aux positions respectives 544 et 547, provoquant une délétion de 182 acides aminés du coté N-terminal. A partir d'un clone mutant (pXL1765) dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 579 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI. Le vecteur recombinant pXL1817 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des 182 premiers acides aminés (ΔN182).
5. Génération des vecteurs pXL1981 et pXL2183, et préparation des polypeptides P(Δhl-2) et P(tagΔhl-2).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GCCACAGTGATGTGGCCCTTTGCCACCGAG-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 40 et 186, provoquant une délétion de 49 acides aminés, du résidu D14 au résidu V62.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 990 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1981 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 1 et 2 (Δhl-2).
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2183 a été construit à partir du vecteur pXL1981. Le vecteur pXL2183 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P (Δhl-2) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
6. Génération des vecteurs pXL1943 et pXL2184, et préparation des polypeptides P(Δh7-8) et P(tagΔh7-8).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5*-CAGGCCTCGCTGAGGCCCTATGCTCAGGAC-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 484 et 615 provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P162 au résidu A205.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 1005 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui-même coupé par les enzymes Ndel et BamHI. Le vecteur recombinant pXL1943 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 7 et 8 (Δh7-8).
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2184 a été construit à partir du vecteur pXL1943. Le vecteur pXL2184 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(Δh7-8) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
7. Génération des vecteurs pXL1982 et pXL2215, et préparation des polypeptides P(Δh9-10) etP(tagΔh9-10).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : S'-CGCCGCAGCCTGGCTCCCTTGGCCGAGGAC-S', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 616 et 747, provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P206 au résidu A249.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 1005 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui-même coupé par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1982 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 9 et 10 (Δh9-10) .
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2215 a été construit à partir du vecteur pXL1982. Le vecteur pXL2215 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(Δh9-10) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
8. Génération du vecteur pXL1986 et préparation du polypeptide P(Δhll-12,L87M).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-CGGCAGAGGCTGGCGCCCTACGGGGAAAAC-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 748 et 867, provoquant une délétion de 40 acides aminés, du résidu P250 au résidu E289. Par ailleurs, lors de la vérification de séquence des dérivés obtenus, certains clones portaient une mutation ponctuelle supplémentaire sur la séquence. Cette mutation (L->M) a pour effet de changer le codon leucine 87 en methionine dans la protéine.
A partir de ce clone et d'un autre clone ne portant pas la mutation (L->M) supplémentaire, un fragment Ndel-BamHI de 1017 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé, par les enzymes Ndel et BamHI.
Deux vecteurs recombinants ont ainsi été obtenus, dont le vecteur pXL1986 qui permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 11 et 12 (Δhll-12) et une methionine au lieu d'une leucine en position 87 (L87M). En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2186 a été construit à partir du vecteur obtenu ci-dessus, codant pour le polypeptide P(Δhll-12). Le vecteur pXL2186 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(Δhll-12) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
9. Génération des vecteurs pXL1987 et pXL2217, et préparation des polypeptides P(Δhl3-14) et P(tagΔhl3-14).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-CGACGCCGGGTGGAGTCCπCTTCAGCACC-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1872 décrit ci-dessus a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 868 et 999, provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P290 au résidu N333.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-BamHI de 1005 pb a été purifié et ligaturé avec le vecteur pET3-a, lui même coupé par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL1987 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 13 et 14 (Δhl3-14).
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2217 a été construit à partir du vecteur pXL1987. Le vecteur pXL2217 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(Δhl3-14) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6. B2 : Mutants réalisés à partir du plasmide pXL1696
1. Génération des vecteurs pXL2071 et pXL2185, et préparation des polypeptides P(Δh5-6) et P(tagΔh5-6).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-CAGCAGCGCCTGGAGCCCCACGCCGACGAG-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis de déléter la partie de la séquence codante de l'apoAIV comprise entre les positions 352 et 483, provoquant une délétion de 44 acides aminés, du résidu P118 au résidu R161.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-EcoRI de 432 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI- BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI. Le vecteur recombinant pXL2071 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une délétion des hélices 5 et 6 (Δh5-6).
En suivant le protocole décrit en Bl.l), le vecteur pXL2185 a été construit à partir du vecteur pXL2071. Le vecteur pXL2185 ainsi obtenu permet d'exprimer à haut niveau le polypeptide P(Δh5-6) fusionné en N-terminal au décapeptide MRGS(H)6.
2. Génération du vecteur pXL2063 et préparation du polypeptide P(D5S).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GAGGTCAGTGCTAGCCAGGTGGCCACA-3'. une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon AGC dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une serine en position 5.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-EcoRI de 564 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI- BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2073 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une serine en position 5. 3. Génération du vecteur pXL2069 et préparation du polypeptide P(D5K).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GAGGTCAGTGCTAAACAGGTGGCCACA-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon AAA dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une lysine en position 5.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-EcoRI de 564 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI- BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2069 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une lysine en position 5.
4. Génération du vecteur pXL2062 et préparation du polypeptide P(D44F).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant :
5'-GCCCTCTTCCAGTTCAAACTTGGAGAA-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon TTC dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une phénylalanine en position 44.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-EcoRI de 564 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI- BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2062 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une phénylalanine en position 44.
5. Génération du vecteur pXL2074 et préparation du polypeptide P(D44A).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GCCCTCTTCCAGGCGAAACTTGGAGAA-3'. une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL1696 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon GCG dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de l'acide aspartique par une alanine en position 44.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment Ndel-EcoRI de 564 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment EcoRI- BamHI isolé du plasmide pXL2051 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2074 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une alanine en position 44.
B3 : Mutants réalisés à partir du plasmide pXL2051
1. Génération du vecteur pXL2073 et préparation du polypeptide P(K178A).
A l'aide de lOligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GTGGAGGAGCTCGCGGGACGCCTTACG-3'. une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL2051 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon GCG dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de la lysine par une alanine en position 178.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment EcoRI-BamHI de 572 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment Ndel- EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2073 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une alanine en position 178.
2. Génération du vecteur pXL2070 et préparation du polypeptide P(K178Y).
A l'aide de roligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-GTGGAGGAGCTCTATGGACGCCTTACG-3'. une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL2051 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon TAT dans la séquence codante de l'apoAIV, provoquant le remplacement de la lysine par une tyrosine en position 178. A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment EcoRI-BamHI de 572 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment Ndel-EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2070 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une tyrosine en position 178.
3. Génération du vecteur pXL2072 et préparation du polypeptide P(E230K).
A l'aide de l'oligodésoxynucléotide synthétique phosphorylê suivant : 5'-AAGAAGAACGCCAAAGAGCTCAAGGCCAG-3', une mutagenèse dirigée sur la forme simple brin du plasmide pXL2051 (Cf exemple A2) a été réalisée en utilisant le kit Amersham selon les recommandations du fabricant. Cette mutagenèse a permis d'introduire un codon AAA dans la séquence codante de rapoAIV, provoquant le remplacement de l'acide glutamique par une lysine en position 230.
A partir d'un clone mutant dont la séquence a été vérifiée intégralement, un fragment EcoRI-BamHI de 572 pb a été purifié, puis ligaturé avec le fragment Ndel- EcoRI isolé du plasmide pXL1696 et le vecteur pET3-a ouvert par les enzymes Ndel et BamHI.
Le vecteur recombinant pXL2072 ainsi obtenu permet d'exprimer à très haut niveau un polypeptide possédant une lysine en position 230.
B4 : Production des polypeptides décrits dans les parties B1-B3.
1. Production : On utilise par exemple la souche BL21 DE3 (pLysS) contenant un plasmide d'expression d'un polypeptide de l'invention tel que décrit dans les parties B1-B3.
Une préculture de nuit en milieu LB contenant de l'ampicilline (100 μg ml) et du chloramphénicol (50 μg/ml), LBApCm, à 37°C, sert à inoculer au l/100ème la culture de production (même milieu). La culture est agitée à 37°C jusqu'à une densité optique (mesurée à 610 nm) de 0,5. On ajoute alors de l'IPTG à la concentration finale de 1 mM et les cellules induites pour l'expression de l'ARN polymérase de T7 sont incubées pendant 90 ou 180 min. L'analyse des extraits bactériens par gel d'électrophorèse coloré au bleu de coomassie permet de révéler une accumulation dans les extraits des cultures de 90 min du polypeptide de l'invention. Par ailleurs, ce polypeptide peut être stabilisé par ajout de rifampicine durant la phase de production. Les seuls ARNm pouvant alors être néosynthétisés sont ceux qui ne dépendent pas de l'ARN polymérase d'E.coli. On peut ajouter par exemple 20 min après l'ajout de l'IPTG de la rifampicine à des concentrations qui peuvent être comprises entre 50 et 200 μg/ml. Les cellules qui ne produisent alors plus que le seul ARNm du polypeptide désiré à l'exception de tous les autres sont incubées entre 90 et 180 min à 37°C.
Dans ce cas, le polypeptide recombinant produit peut représenter de 20 à 30 % des protéines totales produites par la bactérie. De plus le polypeptide est ainsi accumulé sans dégradation dans la bactérie sous forme soluble.
La production a été extrapolée en fermenteur, par culture haute densité de E.coli en mode Fed-Batch. Cette production a été réalisée dans un fermenteur de 2 litres (Setric) en 2 phases : une phase de croissance du microorganisme jusqu'à une DO600 de 30 à 40 (durée : 5 heures environ). Cette phase est réalisée dans le milieu de fermentation défini par Jung et al. (Ann.Inst.Pasteur/Microbiol. 122 (1988) 129-146) ; puis une phase d'induction de la production, par addition dTPTG et de rifampicine, et augmentation du débit d'alimentation en substrats carboné et azoté (durée : 1 heure 30 minutes environ).
2. Lyse des cellules et récupération du polypeptide recombinant.
Après la culture de production, les cellules sont collectées puis lysées, par exemple par sonication. A l'échelle du laboratoire, il a été utilisé un sonicateur Branson (modèle B30, Proscience, France) après avoir concentré 30 fois les cellules dans le tampon PBS (KC1 0,2 g/1, KH2PO4 0,2 g 1, NaCl 8 g/1, Na2HPO4 1,25 g/1). Le cassage des cellules est effectué à 4°C en mode continu (2 impulsions de 5 minutes). On peut également prétraiter la suspension cellulaire concentrée en présence de Triton X-100 à la température ambiante avant la sonication.
C/ PURIFICATION DES POLYPEPTIDES DE L'INVENTION.
Cl. Les polypeptides P(R93G), P(ΔC44) et P(ΔN13) ont été purifiés selon le protocole suivant, qui se déroule en conditions natives et ne requiert aucune étape d'affinité pour les lipides. La culture cellulaire est centrifugée à 6.000 tr/min pendant 30 minutes et le culot est repris à raison de 3 ml par gramme de cellules humides dans le tampon A (Na2HPO4 81 mM, NaH2PO4 19 mM ; EDTA, 2mM ; PMSF, I mM ; pH 7,5 ; β-mercaptoéthanol 10 mM). La suspension est traitée par 8 cycles de 3 minutes d'ultrasons (modèle BRANSON réglé à 250W) à 4°C. Les extraits sont centrifugés pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4°C. Le surnageant SI est conservé et le culot est lavé dans le même volume de tampon A et recentrifugé dans les mêmes conditions. Le surnageant correspondant SI' est ajouté au surnageant SI. Après un dosage des protéines de la fraction (SI + SI') est ajoutée une solution aqueuse de sulfate de streptomycine à 10 % à raison de 10 ml de solution par gramme de protéine. Après 15 minutes d'incubation à 4°C sous agitation douce, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4°C. Le surnageant (S2) est récupéré. A cette fraction S2 est ajouté du sulfate d'ammonium (concentration finale : 25 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 4°C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4°C. Au surnageant S25 est ajouté du sulfate d'ammonium (concentration finale : 50 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 4°C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 min à 15.000 tr/min à 4°C. Le culot (C50) est récupéré et repris dans le tampon B (Tris-HCl, 10 mM ; EDTA, 2 mM ; pH8.8) et dialyse contre 2 1 de tampon B que l'on change 5 fois durant 48 heures.
Le dialysat est injecté sur une colonne échangeuse d'ions de type QFF (Pharmacia) et élue avec un gradient de NaCl. La détermination des fractions conte¬ nant les polypeptides de l'invention est effectuée selon un test en Elisa décrit ci-après. Les fractions intéressantes sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale : 80 % de saturation). Après 15 minutes d'incubation à 4°C sous agitation, la suspension est centrifugée pendant 30 minutes à 15.000 tr/min à 4°C. Le culot (C80) est récupéré et repris dans le tampon B et dialyse contre 21 de tampon B. Le dialysat est injecté sur une colonne échangeuse d'ions de type Mono Q
(Pharmacia) et élue avec un gradient de NaCl. Les fractions intéressantes, identifiées par le test Elisa ci-après décrit et gel SDS 15 %, sont rassemblées et concentrées par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale : 80 % de saturation). Après
15 minutes d'incubation à 4°C sous agitation, la suspension est centrifugée et reprise dans le tampon D (sulfate d'ammonium, 1,7 M ; Na2HPO4 8,1 mM, NaH2PO4 1,9 mM ; EDTA, 2 mM ; pH 7.4) et dialysée contre 2 1 de tampon D.
Le dialysat est injecté sur une colonne de chromatographie d'interactions hydrophobes Phényl-sépharose (Pharmacia) et élue avec le tampon E (Na2HPO4 8,1 mM ; NaHgPO . 1,9 mM ; EDTA, 2 mM ; pH 7.4). Les fractions intéressantes sont identifiées par test Elisa et gel de polyacrylamide SDS. Brièvement, le test ELISA mis au point consiste à adsorber sur une plaque avec un sérum polyclonal de lapin dirigé contre l'apoAIV humaine (dilué au l/1000ème), saturer cette plaque à la gélatine, incuber l'échantillon à tester et enfin, faire réagir un mélange équimolaire de deux anticorps monoclonaux dirigés contre l'apoAIV (MO3 et MO5, SERLIA, Institut Pasteur de Lille), suivi d'une révélation immunoenzymatique à l'aide d'un sérum polyclonal anti-souris couplé à la peroxydase.
Ce test est facilement étalonné avec une gamme de dilutions de l'apoAIV plasmatique.
Ces fractions sont rassemblées et dialysées contre le tampon F (sulfate d'ammonium, 40 % de saturation ; Na2HPO4 8,1 mM ; NaH2PO4 1,9 mM ; EDTA, 2 mM ; pH7.4) et conservées à 4°C.
C2. Pour les polypeptides P(Δhl-2), P(Δh5-6), P(Δhl3-14) et P(ΔN182), la fraction S2 est directement injectée sur colonne de type QFF (sans précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium) équilibrée en tampon B. Le polypeptide est exclu Û°(ΔN182)) ou élue avec un palier à 250 mM NaCl en tampon B (P(Δhl-2)). Le polypeptide est ensuite concentré par précipitation en sulfate d'ammonium (concentration finale 50 % de la saturation pour P(Δhl-2), 10 % pour P(ΔN182)). La purification de P(Δhl-2) est terminée par une centrifugation (30 min., 4°C, 10 000 g). Le culot est récupéré, repris en tampon PBS, désalé sur colonne de gel-f iltration PD10 QPharmacia) et séché à - 20°C. Le polypeptide P(ΔN182) précipité au sulfate d'ammonium est injecté sur une colonne de chromatographie d'interactions hydrophobes phényl-sépharose (Pharmacia) et élue avec le tampon B. Le polypeptide est identifié par gel de polyacrylamide SDS, et les fractions intéressantes sont rassemblées et dialysées contre le tampon B et conservées à 4°C.
C3. Les polypeptides P(tagΔN13), P(tagΔC44), P(tagΔhl-2), P(tagΔh7-8), P(tagΔh9-10), P(tagΔhll-12), P(tagΔhl3-14) et P(tagΔh5-6) ont été purifiés selon le protocole suivant, qui ne comprend qu'une seule étape.
La culture cellulaire est centrifugée à 6.000 tr/min pendant 30 minutes et le culot est repris à raison de 3 ml par gramme de cellules humides dans le tampon A (Na2HPO4 81 mM, NaH2PO4 19 mM ; EDTA, 2mM ; PMSF, 1 mM ; pH 7,5 ; β-mercaptoéthanol 10 mM). La suspension est traitée par 3 cycles de 5 minutes d'ul¬ trasons (modèle BRANSON réglé à 250W) à 4°C. Les extraits sont centrifugés pen¬ dant lh à 11.000 g à 4°C. Les acides nucléiques présents dans le surnageant ont été précipités par addition de 10% (w/v) de sulfate de streptomycine (10 ml/g protein), incubation 30 min. à 4°C, puis recentrifugé dans les mêmes conditions que précédemment. Les protéines recombinantes présentes dans le surnageant ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur ion métallique chélaté. La purification a été effectuée sur résine agarose-acide nitrilotriacétique-nickel (NTA-Ni) selon les recommandations du fabricant, avec les modifications suivantes : La solution protéique est désalée sur une colonne Tris-Acryl GF-05 équilibrée avec un tampon phosphate 100 mM pH 8. Les fractions protéiques récoltées sont réunies, diluées dans le même tampon phosphate jusqu'à une concentration finale de 4 mg/ml, et supplémentées de Hecameg (poudre), concentration finale 25 mM. Le mélange a ensuite été chargé sur une colonne Ni-NTA équilibrée, avec le même tampon phosphate contenant 25 mM de Hecameg. Aucune protéine fixée n'a été éluée par lavage de la colonne avec le même tampon. Les protéines faiblement liées ont été éluées par un tampon phosphate/citrate pH 6, et les protéines recombinantes, par un tampon phosphate/citrate pH 5. Les fractions protéiques obtenues à pH 5 ont été neutralisées par addition de soude 1M (30 μl/ml) et supplémentées de 2 inhibiteurs de protéases : EDTA 0,1M et PMSF 0,2M. Les fractions ont ensuite été analysées par éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) contenant 15% d'acrylamide/bis-acrylamide, selon Laemmli (Nature 227 (1970) 680), puis regroupées selon la pureté et la quantité. Les fractions regroupées ont été incubées en présence de L(-)-histidine poudre (concentration finale 50 mM), pendant lh à 4°C, afin de détruire la liaison Ni-poly-His-protéine. Le nickel et l'histidine libérés ont ensuite été éliminés par desalage sur colonne Tris-Acryl GF-05 équilibrée avec un tampon phosphate pH 7,4 contenant 2mM EDTA.
Les protéines recombinantes ainsi purifiées ont été analysées par éléctrophorèse SDS-PAGE et immunoblotting.. L'immunoblotting a été réalisé avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti-ApoAIV conjugués à la peroxydase, et d'anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la peroxydase. L'activité peroxydase liée a été révélée par incubation avec une solution de 4-Chloro-l-Naphtol comme substrat.
Les différents chromatogrammes ont été suivis par détection UV à 280 nm. La concentration en protéine a été déterminée selon la technique de Bradford (Anal.Biochem. 72 (1976) 248). D/ CARACTERISATION BIOLOGIQUE DES POLYPEPTIDES DE L'INVENTION.
L'activité biologique des polypeptides de l'invention a été évaluée principalement sur la base de 2 paramètres : leur affinité pour le récepteur HDL et leur effet sur l'efflux du cholestérol. Ces 2 paramètres rendent comptent du potentiel pharmacologique hypocholestérolémiant des polypeptides de l'invention. Le protocole de détermination de ces paramètres est donné ci-après ainsi que les résultats obtenus.
1. Protocoles de mesure.
a) Affinité pour le récepteur HDL
Les polypeptides purifiés sont utilisés dans un premier temps pour reconstituer des protéoliposomes avec du DMPC, dont la structure apparaît identique, au vu du comportement en chromatographie d'exclusion, à celle des protéoliposomes reconstitués avec de l'apoAIV native. Ces protéoliposomes reconstitués sont ensuite testés pour leur capacité de se fixer à des adipocytes murins (lignée Obl77) selon un protocole déjà décrit.
b) Efflux du cholestérol
L'efflux du cholestérol à partir de cellules adipocytaires murines (lignée Obl77) provoqué par les protéoliposomes DMPC-polypeptides de l'invention est déterminé après 5 heures d'incubation. 2. Résultats
(*) Exprimé en % du cholestérol initial des cellules chargées, l'efflux de base obtenu en présence de DPMC seul après 5 heures est de 11%. (**) Réalisé sur trois expériences indépendantes. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A. (B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLYPEPΗDES, LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(v) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE: NUMERO DE DEPOT: EP 92402301.3
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1134 paires de bases
(B) TYPE: acide nucl.ique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: lin.aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Séquence nucléotidique de l'apolipoprotéine AIV
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..1134
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 40..120 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 121..186
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 187.285
(ix) CARACTERISΉQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 286..351 (ix) CARACTERISΉQUE ADDmONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 352..417
(ix) CARACTERISΉQUE ADDIΗONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 418..483
(ix) CARACTERISTIQUE ADDIΗONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 484..549
(ix) CARACTERISΉQUE ADDIΗONELLE: (A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 550..615
(ix) CARACTERISΉQUE ADDIΗONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 616..681 (ix) CARACTERISΉQUE ADDIΗONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 682..747
(ix) CARACTERISΉQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 748..801
(ix) CARACTERISΗQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 802..866
(ix) CARACTERISΗQUE ADDITIONELLE: (A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 867..933
(ix) CARACTERISΉQUE ADDIΗONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 934..999 (ix) CARACTERISΗQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: Boucle
(B) EMPLACEMENT: 1000..1131
(xi) DESCRIPTIONDELASEQUENCE:SEQIDNO: 1: ATG GAG GTC AGT GCT GAC CAG GTG GCC ACA GTG ATG TGG GAC TAC TTC 48 Met Glu Val Ser Ala Asp Gin Val Ala Thr Val Met Trp Asp Tyr Phe 1 5 10 15
AGC CAG CTG AGC AAC AAT GCC AAG GAG GCC GTG GAA CAT CTC CAG AAA 96 Ser Gin Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His Leu Gin Lys 20 25 30
TCT GAA CTC ACC CAG CAA CTC AAT GCC CTC TTC CAG GAC AAA CTT GGA 144 Ser Glu Leu Thr Gin Gin Leu Asn Ala Leu Phe Gin Asp Lys Leu Gly 35 40 45
GAA GTG AAC ACT TAC GCA GGT GAC CTG CAG AAG AAG CTG GTG CCC TTT 192 Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gin Lys Lys Leu Val Pro Phe 50 55 60
GCC ACC GAG CTG CAT GAA CGC CTG GCC AAG GAC TCG GAG AAA CTG AAG 240
Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu Lys Leu Lys
65 70 75 80 GAG GAG ATT GGG AAG GAG CTG GAG GAG CTG AGG GCC CGG CTG CTG CCC 288
Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Leu Pro
85 90 95
CAT GCC AAT GAG GTG AGC CAG AAG ATC GGG GAC AAC CTG CGA GAG CTT 336 His Ala Asn Glu Val Ser Gin Lys Ile Gly Asp Asn Leu Arg Glu Leu
100 105 110
CAG CAG CGC CTG GAG CCC TAC GCG GAC CAG CTG CGC ACC CAG GTC AAC 384
Gin Gin Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gin Leu Arg Thr Gin Val Asn 115 120 125
ACG CAG GCC GAG CAG CTG CGG CGC CAG CTG ACC CCC TAC GCA CAG CGC 432
Thr Gin Ala Glu Gin Leu Arg Arg Gin Leu Thr Pro Tyr Ala Gin Arg
130 135 140
ATG GAG AGA GTG CTG CGG GAG AAC GCC GAC AGC CTG CAG GCC TCG CTG 480
Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gin Ala Ser Leu
145 150 155 160 AGG CCC CAC GCC GAC GAG CTC AAG GCC AAG ATC GAC CAG AAC GTG GAG 528
Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gin Asn Val Glu
165 170 175
GAG CTC AAG GGA CGC CTT ACG CCC TAC GCT GAC GAA TTC AAA GTC AAG 576 Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Val Lys
180 185 190
ATT GAC CAG ACC GTG GAG GAG CTG CGC CGC AGC CTG GCT CCC TAT GCT 624 Ile Asp Gin Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Tyr Ala 195 200 205
CAG GAC ACG CAG GAG AAG CTC AAC CAC CAG CTT GAG GGC CTG ACC TTC 672
Gin Asp Thr Gin Glu Lys Leu Asn His Gin Leu Glu Gly Leu Thr Phe
210 215 220 CAG ATG AAG AAG AAC GCC GAG GAG CTC AAG GCC AGG ATC TCG GCC AGT 720 Gin Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ser 225 230 235 240 GCC GAG GAG CTG CGG CAG AGG CTG GCG CCC TTG GCC GAG GAC GTG CGT 768 Ala Glu Glu Leu Arg Gin Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu Asp Val Arg 245 250 255
GGC AAC CTG AGG GGC AAC ACC GAG GGG CTG CAG AAG TCA CTG GCA GAG 816 Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gin Lys Ser Leu Ala Glu 260 265 270
CTG GGT GGG CAC CTG GAC CAG CAG GTG GAG GAG TTC CGA CGC CGG GTG 864 Leu Gly Gly His Leu Asp Gin Gin Val Glu Glu Phe Arg Arg Arg Val 275 280 285
GAG CCC TAC GGG GAA AAC TTC AAC AAA GCC CTG GTG CAG CAG ATG GAA 912
Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gin Gin Met Glu 290 295 300
CAG CTC AGG CAG AAA CTG GGC CCC CAT.GCG GGG GAC GTG GAA GGC CAC 960
Gin Leu Arg Gin Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val Glu Gly His
305 310 315 320 TTG AGC TTC CTG GAG AAG GAC CTG AGG GAC AAG GTC AAC TCC TTC TTC 1008 Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn Ser Phe Phe 325 330 335
AGC ACC TTC AAG GAG AAA GAG AGC CAG GAC AAG ACT CTC TCC CTC CCT 1056 Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gin Asp Lys Thr Leu Ser Leu Pro 340 345 350
GAG CTG GAG CAA CAG CAG GAA CAG CAG CAG GAG CAG CAG CAG GAG CAG 1104 Glu Leu Glu Gin Gin Gin Glu Gin Gin Gin Glu Gin Gin Gin Glu Gin 355 360 365
GTG CAG ATG CTG GCC CCT TTG GAG AGC TG 1134
Val Gin Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 370 375
(2) INFQRMAΉON POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISΉQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 377 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin, (D) CONFIGURATION: lin.aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: prot,ine
(xi) DESCRIPΗON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Glu Val Ser Ala Asp Gin Val Ala Thr Val Met Trp Asp Tyr Phe 1 5 10 1 5
Ser Gin Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His Leu Gin Lys 20 25 30
Ser Glu Leu Thr Gin Gin Leu Asn Ala Leu Phe Gin Asp Lys Leu Gly 35 40 45 Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gin Lys Lys Leu Val Pro Phe 50 55 60
Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu Lys Leu Lys 65 70 75 80
Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Leu Leu Pro 85 90 95 His Ala Asn Glu Val Ser Gin Lys Ile Gly Asp Asn Leu Arg Glu Leu 100 105 110
Gin Gin Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gin Leu Arg Thr Gin Val Asn 115 120 125
Thr Gin Ala Glu Gin Leu Arg Arg Gin Leu Thr Pro Tyr Ala Gin Arg 130 135 140
Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gin Ala Ser Leu 145 150 155 160
Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gin Asn Val Glu 165 170 175 Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Val Lys 180 185 190
Ile Asp Gin Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala Pro Tyr Ala 195 200 205
Gin Asp Thr Gin Glu Lys Leu Asn His Gin Leu Glu Gly Leu Thr Phe 210 215 220
Gin Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ser 225 230 235 240
Ala Glu Glu Leu Arg Gin Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu Asp Val Arg 245 250 255 Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gin Lys Ser Leu Ala Glu 260 265 270
Leu Gly Gly His Leu Asp Gin Gin Val Glu Glu Phe Arg Arg Arg Val 275 280 285
Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gin Gin Met Glu 290 295 300
Gin Leu Arg Gin Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val Glu Gly His 305 310 315 320
Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn Ser Phe Phe 325 330 335 Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gin Asp Lys Thr Leu Ser Leu Pro 340 345 350
Glu Leu Glu Gin Gin Gin Glu Gin Gin Gin Glu Gin Gin Gin Glu Gin 355 360 ' 365
Val Gin Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 370 375 (2) INFQRMAΉON POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISΗQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 84 paires de bases
(B) TYPE: acide nucl.ique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin.aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHEΗQUE: NON (iii) ANΗ-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOΗDE A
(xi) DESCRIPΗON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CTAGACATAT GGAGGTCAGT GCTGACCAGG TGGCCACAGT GATGTGGGAC TACTTCAGCC 60
AGCTGAGCAA CAATGCCAAG GAGG 84
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISΗQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 94 paires de bases - (B) TYPE: acide nucl.ique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin.aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHEΗQUE: NON (iii) ANΗ-SENS: NON (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide B
(xi) DESCRIPΗON DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
CCGTGGAACA TCTCCAGAAA TCTGAACTCA CCCAGCAACT CAATGCCCTC TTCCAGGACA 60
AACTTGGAGA AGTGAACACT TACGCAGGTG ACCG 94 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISΗQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 86 paires de bases
(B) TYPE: acide nucl.ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: OLIGONUCLEOΗDE C
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CCACGGCCTC CTTGGCATTG TTGCTCAGCT GGCTGAAGTA GTCCCACATC ACTGTGGCCA 60
CCTGGTCAGC ACTGACCTCC ATATGT 86 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 92 paires de bases
(B) TYPE: acide nucl.ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONπσURAΗON: lin.aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: OLIGONUCLEOΗDE D
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: AATTCGGTCA CCTGCGTAAG TGTTCACTTC TCCAAGTTTG TCCTGGAAGA GGGCATTGAG 60
TTGCTGGGTG AGTTCAGATT TCTGGAGATG TT 92

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide dérivé de l'apolipoprotéine AIV humaine caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport à la séquence de l'apolipoprotéine AIV humaine SEQ ID n° 2, au moins une des modifications suivantes : (a) une mutation ponctuelle portant sur un résidu fonctionnel, et/ou,
(b) une délétion d'une extrémité terminale d'au moins 10 acides aminés, et/ou,
(c) une délétion d'une hélice ou d'une paire d'hélices, et/ou,
(d) une partie additionnelle hétérologue possédant une activité biologique différente ou complémentaire de celle de l'apoAIV, ou une propriété de marqueur, de cibleur ou de stabilisateur.
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une modification selon (a) et (b).
3. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une modification selon (a) et (c).
4. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une modification selon (a), (b) ou (c) associée à une modification selon (d).
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le résidu fonctionnel est choisi parmi les résidus chargés, les résidus sites de glycosylation et les résidus impliqués dans des ponts disulfure.
6. Polypeptide selon la revendication 5 caractérisé en ce que le résidu fonctionnel est choisi parmi les résidus suivants : acide aspartique en position 5, 44, 106, 153 ; glutamine en position 37, 194 ; asparagine en position 39 ; lysine en position 73, 84, 103, 169, 178 ; acide glutamique en position 76, 81, 87, 99, 131, 164, 187, 230 ; alanine en position 22 ; proline en position 139, 161 ; et serine en position 154.
7. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polypeptides suivants décrits dans les exemples : P(ΔN13,R93G),
P(ΔN13), P(tagΔN13), P(R93G), P(ΔC44), P(tagΔC44), P(ΔC194), P(ΔN182),
P(Δhl-2), P(tagΔhl-2), P(Δh7-8), P(tagΔh7-8), P(Δh9-10), P(tagΔh9-10), P(Δhll- 12), P(tagΔhll-12), P(Δhll-12,L87M), P(Δhl3-14), P(tagΔhl3-14), P(Δh5-6), P(tagΔh5-6), P(D44F), P(D44A), P(D5S), P(D5K), P(K178Y), P(K178A), et P(E230K).
8. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Séquence nucléotidique selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADNc, d'ADNg, d'ARN ou d'une séquence synthétique ou semi-synthétique.
10. Séquence nucléotidique selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADNc.
11. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 8 à 10.
12. Cellule recombinante contenant un vecteur selon la revendication 11.
13. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon la revendication 12 et on récupère le polypeptide produit.
14. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la préparation de molécules non peptidiques ou non exclusivement peptidiques actives pharmacologiquement sur les niveaux plasmatiques de cholestérol, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité, et reproduction de ces éléments par des structures non- peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
15. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou une ou plusieurs séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 10, ou une ou plusieurs molécules préparées selon la revendication 14.
16. Composition selon la revendication 15 destinée au traitement ou à la prévention des affections liées aux hypercholestérolémies.
17. Composition selon la revendication 16 destinée au ralentissement de la formation de plaques d'athérome, et/ou à la régression des plaques d'athérome el ou à la diminution des risques d'accidents coronariens.
EP93904117A 1992-01-27 1993-01-26 Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation Withdrawn EP0624194A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9200806 1992-01-27
FR9200806A FR2686605B1 (fr) 1992-01-27 1992-01-27 Nouveaux polypeptides, leur preparation et leur utilisation.
PCT/FR1993/000073 WO1993015198A1 (fr) 1992-01-27 1993-01-26 Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0624194A1 true EP0624194A1 (fr) 1994-11-17

Family

ID=9425980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP93904117A Withdrawn EP0624194A1 (fr) 1992-01-27 1993-01-26 Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0624194A1 (fr)
JP (1) JPH07503367A (fr)
CA (1) CA2125877A1 (fr)
FR (1) FR2686605B1 (fr)
WO (1) WO1993015198A1 (fr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1068239A2 (fr) * 1998-03-31 2001-01-17 University Of Cincinnati Peptides antioxydants
CA2368098A1 (fr) * 1999-06-25 2001-01-04 Genset S.A. Proteines codant des adn complementaires avec des peptides-signal
US7314762B2 (en) 2001-11-21 2008-01-01 Nanogen, Inc. Apolipoprotein biopolymer markers indicative of insulin resistance
US20030100014A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-29 George Jackowski Apolipoprotein biopolymer markers predictive of type II diabetes
US7125678B2 (en) * 2001-11-23 2006-10-24 Nanogen, Inc. Protein biopolymer markers predictive of type II diabetes
US20030113808A1 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 George Jackowski Apolipoprotein biopolymer markers predictive of alzheimers disease
FR2893136A1 (fr) * 2005-11-10 2007-05-11 Sanofi Aventis Sa Procedes de diagnostic de maladies hepatiques et de criblage de molecules pour le traitement de ces maladies
MX342020B (es) * 2011-01-19 2016-09-08 Univ Cincinnati Apolipoproteina a-iv como un peptido antidiabetico.
KR20140117565A (ko) * 2012-01-19 2014-10-07 유니버시티 오브 신시내티 비글리코실화 아포리포단백질 a-iv를 이용하여 당뇨병을 치료하는 방법
JP6033433B2 (ja) * 2012-07-25 2016-11-30 ユニバーシティ・オブ・シンシナティ アポリポタンパク質ａｉｖを用いて高血糖障害を治療する方法
CA2878695A1 (fr) * 2012-07-25 2014-01-30 University Of Cincinnati Procede de traitement du diabete de type i a l'aide de l'apolipoproteine aiv

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1229996B (it) * 1989-04-20 1991-09-20 Cesare Sirtori Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9315198A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2686605A1 (fr) 1993-07-30
JPH07503367A (ja) 1995-04-13
WO1993015198A1 (fr) 1993-08-05
FR2686605B1 (fr) 1994-03-11
CA2125877A1 (fr) 1993-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0293357B1 (fr) Expression de la proapolipoprotéine A-I humaine
EP0625199A1 (fr) Polypeptides antithrombotiques, antagonistes de la liaison du vwf aux plaquettes et/ou au sous-endothelium
EP0624200A1 (fr) Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
EP0797589A1 (fr) Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
WO1993015198A1 (fr) Polypeptides derives de l'apolipoproteine aiv humaine, leur preparation et leur utilisation
CA2218759A1 (fr) Nouveaux variants de l'apolipoproteine a-i
FR2677362A1 (fr) Neuropeptides de la famille des tachykinines.
JPH08503858A (ja) 生物活性ポリペプチド融合ダイマー
WO1995025786A1 (fr) Production d'apolipoproteine a1 d'origine humaine dans un systeme d'expression bacterien
EP0510018A1 (fr) Peptide a signal lipoproteique fusionne avec des polypeptides antigeniques
EP0252894A2 (fr) Polypeptides hybrides comprenant la somatocrinine et l'alpha1-antitrypsine, méthode pour leur production à partir de clones bactériens et leur utilisation pour la production de somatocrinine
JPWO2018181638A1 (ja) 長時間作用型アドレノメデュリン誘導体
RU2144957C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА
JP2769083B2 (ja) エラスターゼ阻害活性を有する新規ペプチドおよびその製造方法
WO1995030759A1 (fr) Polypeptides biologiquement actifs inseres dans une albumine
FR2716205A1 (fr) Récepteur galanine, acides nucléiques, cellules transformées et utilisations.
FR2550800A1 (fr) Vecteur plasmide ameliore et son utilisation
FR2642086A1 (fr) Gene recombinant codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes et ledit facteur
WO1994019469A1 (fr) Proteine de fusion multi-vip et procede de preparation de vip recombinant
EP0750675A1 (fr) ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LE FACTEUR DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES ACIDES (aFGF)
FR2632321A1 (fr) Sequence d'adn codant pour un polypeptide, cassette d'expression comprenant une telle sequence, cellule hote comprenant la cassette d'expression et procede pour produire un tel polypeptide
CA2166298A1 (fr) Famille de peptides appeles xenoxines
FR2656531A1 (fr) Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure.
EP0686194A1 (fr) Facteurs de croissance de la famille de l'harp, procede d'obtention et applications
JP3785602B2 (ja) 新規ホスホリパーゼ及びそれをコードするｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19940718

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LI LU NL PT SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 19990616

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20000406