FR2677362A1 - Neuropeptides de la famille des tachykinines. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un peptide caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement d'acides aminés suivant: a1 Pro a2 Pro a3 a4 Phe Tyr Gly Leu Met dans lequel an avec n égal à 1, 2, 3 ou 4 représente un acide aminé quelconque et notamment en ce qu'il s'agit de la ranakinine ayant la formule suivante: Lys Pro Asn Pro Glu Arg Phe Tyr Gly Leu Met L'invention vise aussi l'utilisation de ce peptide dans des applications pharmacologiques.

Description

Neuropeptides de la famille des tachykinines Les neuropeptides sont des

messagers très importants de la communication nerveuse chez les animaux Parmi ces neuropeptides on connaît notamment la famille des tachykinines qui comporte des polypeptides multi-fonctionnels présentant une

homologie de structure au niveau de leur partie COOH-

terminale Ces polypeptides possèdent en commun la séquence d'acides aminés suivante au niveau de leur extrémité COOH-terminale: Phe-X-Gly- Leu-Met NH 2 dans laquelle X est un acide aminé variable aliphatique

ramifié ou aromatique.

Plusieurs polypeptides de la famille des tachykinines ont été isolés et caractérisés jusqu'à présent, à partir de la peau des grenouilles (ERSPAMER et al 1981, Trends Neurosci 4, 267-269) D'autres travaux ont permis d'isoler plusieurs polypeptides de la famille des tachykinines à partir d'espèces

vertébrées différentes.

Les tachykinines chez les amphibiens peuvent être regroupées dans des sous-familles établies en fonction de la nature du résidu d'acide aminé X variable au niveau de la région COOH-terminale On connaît ainsi la sous-famille de la physalaemine dans laquelle X dans la formule donnée précédemment est un résidu tyrosine (Tyr), la sous-famille de l'élédoisine dans laquelle X est un résidu isoleucine (Ile) et la sous- famille de la

kassinine dans laquelle X est un résidu valine (Val).

Une tachykinine particulière connue indépendamment de sa présence chez les grenouilles est la substance P décrite par CHANG et LEEMAN (J Biol Chem 245, 4784-4790, 1970) Des études réalisées jusqu'à présent chez la grenouille Rana esculenta, et notamment à partir du cerveau de cette grenouille, ont démontré grâce à des examens en immunohistochimie la présence d'un réseau nerveux dans le cerveau de cette grenouille en utilisant des antisera contre la substance P

(GAUDINO et al 1980, Cell Tissue Res 211, 241-250).

Une autre molécule de la famille des tackykinines est la neurokinine B décrite par KANGAWA et al

(Biochem Biophys Res Commun 114, 533-540, 1983).

Malgré les résultats obtenus avec des anticorps dirigés contre la substance P au niveau du cerveau de la grenouille, les inventeurs de la présente demande ont montré que la substance P n'existe pas au niveau du cerveau de grenouille En revanche les inventeurs ont mis en évidence et caractérisé un nouveau peptide de la famille des tachykinines appartenant à la sous-famille de la physalaemine, à partir du cerveau de la

grenouille Rana ridibunda.

A partir de ce nouveau peptide appelé ranakinine, ils ont défini un nouveau groupe de peptides ayant en commun une structure en acides aminés déterminée à

partir de la structure de la ranakinine.

L'invention vise également la préparation des peptides définis dans les pages suivantes ainsi que leur utilisation par exemple dans des applications pharmacologiques. Les peptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à l'enchaînement d'acides aminés suivant: a 1 Pro a 2 Pro a 3 a 4 Phe Tyr Gly Leu Met dans lequel an avec N égal à 1, 2, 3 ou 4 représente un

acide aminé quelconque.

La liste des acides aminés variables an pouvant entrer dans la composition de ce peptide est présentée ci-après avec l'abréviation correspondant à chaque

acide aminé sous forme du code à trois lettres.

Acide aminé Code à trois lettres Alanine Ala Arginine Arg Asparagine Asn Acide Aspartique Asp Asparigine ou acide Aspartique Asx Cystéine Cys Glutamine Gln Acide Glutamique Glu Glutamine ou acide Glutamique Glx Glycine Gly Histidine His Isoleucine Ile Leucine Leu Lysine Lys Méthionine Met Phénylalanine Phe Proline Pro Sérine Ser Thréonine Thr Tryptophane Trp Tyrosine Tyr Valine Val Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention a 1 est un acide aminé de type basique et par exemple l'arginine, l'acide glutamique et de

préférence la lysine.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention a 2 est la lysine, l'acide aspartique ou de

préférence l'asparagine.

Dans un autre de mode de réalisation particulier de l'invention, a 3 est la glutamine, la lysine ou de

préférence l'arginine.

Avantageusement a 4 peut être sélectionné parmi les acides aminés suivants: la glutamine, la lysine ou de

préférence l'arginine.

Il est entendu que les différents sous-groupes de peptides définis par le choix d'acides aminés particuliers pour a 1, a 2, a 3 et a 4 peuvent être combinés entre eux et par conséquent que toutes les combinaisons entre les différents acides aminés cités pour a 1, a 2, a 3 et a 4 dans le cadre de l'enchaînement d'acides aminés

ci-dessus donné, font partie de l'invention.

Un peptide particulièrement préféré dans le cadre de la réalisation de l'invention est celui qui correspond à l'enchaînement d'acides aminés suivants Lys Pro Asn Pro Glu Arg Phe Tyr Gly Leu Met Avantageusement le squelette peptidique ci-dessus est sous forme amidée à son extrémité COOH-terminale et correspond dans ce cas à la ranakinine telle qu'isolée

à partir du cerveau de grenouille Rana ridibunda.

Compte tenu de leur appartenance à la famille des tachykinines, les peptides selon l'invention et en particulier la ranakinine, sont susceptibles d'intervenir in vivo dans la transmission d'informations nociceptives mais peuvent également, comme les autres tachykinines intervenir dans la tension artérielle, l'inflammation, la salivation, la contraction des muscles lisses et la régulation de la transmission dopaminergique au niveau du complexe nigro-striatal. Ces interactions fonctionnelles des tachykinines, sont réalisées par l'intermédiaire d'une liaison à un récepteur Les peptides selon l'invention sont capables de se lier à des récepteurs du type NK-1 décrit par LAVIELLE et al (Fondam Clin Pharmacol 1990, 4, 257-268) Ils se comportent donc comme des agonistes NK-1. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un peptide tel qu'obtenu à l'issue des étapes suivantes: centrifugation d'un extrait tissulaire de cerveau de grenouille, à 1600 g pendant 1 heure à 4 C, séparation de la fraction peptidique, sélection de la fraction peptidique réagissant avec un antisérum dont les anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissent la partie COOH-terminale de la substance P, cet antisérum présentant en outre une réactivité inférieure à 0,5 % avec la neurokinine A, la neurokinine B et la substance P non amidée, purification par HPLC sur une colonne équilibrée avec un mélange acétonitrile/eau/acide trifluoroacétique ( 17,5/82,4/ 0,1, vol/vol/vol) avec un débit de 1,5 ml/min, la concentration en acétonitrile dans le solvant d'élution étant portée à 31,5 % pendant 60 mn, selon un gradient linéaire,

récupération du peptide ainsi purifié.

Différentes modifications de la structure peptidique des enchaînements d'acides aminés décrits ci-dessus peuvent être envisagées dans le cadre de l'invention On peut notamment prévoir de modifier un peptide répondant à l'une des formules ci-dessus par élimination d'acides aminés de sa partie NH 2-terminale dès lors que le peptide ainsi formé conserve sa capacité à être reconnu par des anticorps dirigés contre la ranakinine et de préférence reste protégé contre les amino-peptidases présentes en milieu

cellulaire, lorsqu'il est utilisé in vitro ou in vivo.

Entre également dans le cadre de l'invention un polypeptide contenant un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40, de préférence 30, caractérisé en ce qu'il comprend l'un des peptides décrits précédemment et notamment en ce qu'il comporte en outre

à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-

Terminale de ce peptide des acides aminés de préférence

basiques, et permettant l'amidation de la structure C-

terminale ainsi formée du polypeptide.

A titre d'exemple le polypeptide ci-dessus peut correspondre à l'un des peptides précédemment décrits auxquels on aurait ajouté à l'extrémité NH 2-terminale des acides aminés tels que la lysine ou l'arginine ou encore la glycine A l'extrémité COOH du polypeptide on peut insérer un acide aminé tel que la glycine capable d'entraîner 1 'amidation du polypeptide et la lysine ou

1 'arginine.

Une autre modification envisageable consiste à synthétiser des analogues cycliques des peptides décrits ci-dessus en introduisant par exemple des résidus cystéine dans le peptide choisi, éventuellement obtenu par synthèse, de façon à rigidifier la structure

peptidique selon une conformation spatiale déterminée.

Dans ce cas l'enchaînement d'acides aminés dont la séquence a été décrite ci-dessus peut par exemple être modifié par introduction de résidus cystéine introduits en position 2 et 5 ou en position 3 et 6 dans la séquence. Une autre modification envisageable, dans le but

d'éviter l'oxydation du résidu méthionine COOH-

terminal, consisterait à le remplacer par un résidu N Leucine. Un polypeptide selon l'invention peut encore être caractérisé en ce qu'il s'agit d'un oligomère ou d'un polymère de l'un des peptides précédents ou d'un oligomère formé par différents peptides parmi ceux

définis précédemment, lié par des liaisons peptidiques.

On peut avoir recours, pour réaliser l'oligomérisation, à toute technique de polymérisation couramment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisation étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère contenant le nombre de motifs monomères requis (le monomère étant en l'occurrence constitué par le peptide répondant à la formule précédente) pour l'acquisition de l'antigénicité ou de

l'immunogénicité désirée.

Une méthode d'oligomérisation ou de polymérisation du monomère consiste dans la réaction de celui-ci avec

un agent de réticulation tel que le glutaraldéhyde.

On peut également avoir recours à d'autres méthodes d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à celles mettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par l'intermédiaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine en présence

d'agents de couplage homo ou hétéro-bifonctionnels.

On peut également pour la production de molécules comportant un ou plusieurs motifs peptidiques tels que définis ci-dessus, avoir recours à des techniques du génie génétique mettant en oeuvre des micro-organismes transformés par un acide nucléique déterminé comprenant

des séquences nucléotidiques appropriées corres-

pondantes. En fonction des applications visées des peptides selon l'invention, il est également envisageable d'intercaler entre plusieurs acides aminés voire entre tous les acides aminés des peptides précédemment définis, des acides aminés dextrogyres et notamment la phénylalanine ou le tryptophane dextrogyres, suceptibles d'empêcher l'action des enzymes de dégradation dans le milieu cellulaire et ainsi d'en augmenter l'activité Une autre modification dans ce sens consiste à remplacer certains acides aminés par

exemple de type proline par le D-tryptophane.

Il est par ailleurs entendu que le groupement amidé de la ranakinine peut être substitué par exemple monosubstitué par des groupements alkyl, aralkyl, ou aryl, ou totalement substitué par un radical ester ou nitrile. Les modifications apportées aux peptides de l'invention peuvent être réalisées de manière telle que les peptides ou polypeptides ainsi produits sont reconnus par des anticorps polyclonaux ou monoclonaux

reconnaissant la ranakinine.

La ranakinine ayant une activité dite substance P-like dans la mesure o elle est reconnue par des anticorps dirigés contre la partie COOHterminale de la substance P, on peut également définir un groupe de peptides, polypeptides ou oligomères de ces derniers, modifiés par rapport à la ranakinine, et définis par leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre la partie COOH-terminale de la substance P. Dans le cadre ainsi déterminé, les différentes substitutions ou modifications des peptides et polypeptides de l'invention doivent être envisagées selon les applications que l'on souhaite en faire En effet lorsqu'un peptide ayant le squelette peptidique de la ranakinine est allongé à son extrémité N ou à son extrémité C-terminale, ce peptide peut devenir moins accessible à un récepteur in vivo De même sa viscosité peut augmenter et par conséquent entraîner

une diminution de sa bio-disponibilité.

En revanche si l'on cherche à obtenir un antagoniste du peptide l'invention ou à diminuer son activité de liaison à un récepteur tout en augmentant son antigénicité, on aura tout à fait intérêt à réaliser des substitutions sur le peptide de base ou à

greffer des résidus d'acides aminés aux extrémités NH 2-

et/ou COOH-terminales.

Un problème particulier lié à l'utilisation des neuropeptides notamment en tant qu'agents thérapeutiques, résulte de leur inaptitude à passer la

barrière hémato-encéphalique.

Les peptides de l'invention peuvent donc être utilisés comme outil de recherche dans des modèles pharmacologiques afin de déterminer quelles pourraient être les conformations susceptibles de mimer la structure des peptides de l'invention et capables de passer la barrière hématoencéphalique du cerveau A cet égard l'invention concerne une molécule peptidique ou non, synthétique ou naturelle ayant une conformation en solution aqueuse analogue à celle de la ranakinine dans sa forme naturelle ou analogue à celle de ses dérivés répondant aux définitions de l'invention, cette molécule étant de structure rigide, non hydrolysable et

capable de traverser la barrière hémato-encéphalique.

Entrent également dans le cadre de l'invention les peptides ci-dessus définis, marqués de façon radioactive par exemple par substitution des atomes de carbone et/ou d'hydrogène par des atomes radioactifs, ou encore par addition d'un bras tel que le réactif de Bolton Hunter, greffé sur une fonction amine libre

(BOLTON et HUNTER Biochem J 133, 529-538, 1973).

L'invention se rapporte également à des anticorps polyclonaux ou monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement un peptide ou un polypeptide selon l'une quelconque des définitions précédentes Un anticorps présente la capacité de reconnaître spécifiquement l'un des peptides ou polypeptides de l'invention, dès lors qu'il permet la réalisation d'une réaction de type antigène-anticorps et la formation d'un complexe avec ces peptides et polypeptides Un sous-groupe d'anticorps répondant aux conditions précédentes est encore défini en ce que ces anticorps ne reconnaissent ni la partie NH 2-terminale de la substance P ni la partie NH 2- terminale de la neurokinine B. L'invention concerne également le complexe antigène-anticorps dont l'antigène correspond à un peptide selon l'invention, l'anticorps étant spécifique de ce peptide ou du groupe des peptides selon l'invention. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par les techniques conventionnelles de préparation d'anticorps monoclonaux On aura de façon générale recours à la technique de fusion de cellules de myélomes avec des cellules spléniques d'un animal (par exemple une souris) préalablement immunisé avec la ranakinine ou un dérivé de ce peptide tel que défini ci-dessus Les hybridomes résultant de la fusion des cellules précédentes, sont cultivés et les anticorps qu'ils produisent sont testés pour sélectionner ceux qui reconnaissent la ranakinine et le cas échéant dans ce groupe ceux qui lui sont spécifiques dans les

conditions répondant à la définition ci-dessus.

Selon une variante ces anticorps monoclonaux peuvent être également produits dans des ascites chez

des animaux.

Différentes applications des peptides décrits précédemment peuvent être envisagées, découlant du fait il qu'ils peuvent être utilisés comme analogue de certaines molécules neuropeptidiques et notamment dans le cas de la ranakinine, comme analogue de la substance P. L'invention vise en outre un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour un peptide ou un polypeptide répondant aux définitions données dans les pages précédentes et en particulier un acide nucléique répondant à la séquence suivante:

AMA CCU AAU CCU GAA CGU UUU UAU GGU CUI AUG

G C C C G A C C C C U C

A A A A A

G G G G G

Entre également dans le cadre de l'invention un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il est modifié en un site non essentiel pour sa réplication, par un acide nucléique défini ci-dessus, cet acide nucléique étant placé sous le contrôle d'éléments de régulation et notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire chez lequel on souhaite le cloner ou l'exprimer L'invention concerne aussi un hôte cellulaire caractérisé en ce

qu'il est transformé par un vecteur ci-dessus décrit.

A titre d'exemple des hôtes cellulaires particulièrement avantageux pour la mise en oeuvre de

l'invention sont E coli, les cellules eucaryotes.

On peut notamment utiliser le vecteur de clonage AZAP qui réunit à lui seul beaucoup des avantages présentés par les autres vecteurs d'insertion, modifié par la séquence de l'invention: outre la propriété d'être converti in vivo en plasmide bluescript SK, il permet le séquençage rapide de l'acide nucléique, la production de ribosonde, la mutagénèse dirigée et l'expression de protéines de fusion La souche E coli BB 4 est particulièrement recommandée pour la propagation de XZAP D'autres vecteurs de clonage et cellules hôtes présentant un intérêt dans le cadre de l'invention sont répertoriés dans l'ouvrage Molecular

Cloning de Maniatis et coll ( 1989).

L'invention vise également de façon avantageuse les cellules eucaryotes transfectées par la séquence nucléotidique définie ci-dessus sous le contrôle d'un promoteur de gène eucaryote (par exemple le promoteur du gène de la métallothionine inductible par le cadmium). Les peptides selon l'invention peuvent être purifiés à partir d'extraits de cerveau de grenouille telle que Rana ridibunda ou encore être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides Cette synthèse peut être

réalisée en solution homogène ou en phase solide.

Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBENWEIL dans l'ouvrage intitulé "Methode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E.

Wunsch, Vol 15-I et II, THIEME, Stuggart 1974.

Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à- deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type

carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-( 3-

diméthyl-aminoprospyl)-carbodiimide Lorsque l'amino-

acyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple

protégées, par des groupes t-butylester.

Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'aminoacide Cterminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R D MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J Am Soc,

, 2149-2154).

Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée,

par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.

Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine

avec un acide.

Dans le cas o le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe tbutyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique. On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la

fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-

terminal fixé sur la chaîne De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction

amine est protégée par exemple par le t-

butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acides aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du

deuxième acide aminé C-terminal.

On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et

qui est rattachée à la résine.

Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par

exemple à l'aide d'acide fluorydrique.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent également dans les exemples et dans les figures qui suivent dans lesquelles: Fiqure 1: résultats d'une électrophorèse HPLC en phase inverse une colonne semi-préparative Vydac C-18 avec un extrait de cerveau de grenouille après purification partielle sur des cartouches Sep-Pack Les, fractions marquées par les plages en blanc contenaient l'immunoréactivité à la susbtance P-like (SP-LI) et les fractions marquées par des régions hachurées contenaient l'immunoréactivité neurokinine B-like (NKB-LI) La ligne en pointillé montre la concentration

d'acétonitrile dans le solvant d'élution.

Figure 2: purification jusqu'à homogénéité apparente de la ranakinine par chromatographie sur (A) une colonne analytique Vydac C-4 et (B) une colonne analytique C-18 Le pic souligné d'un trait correspond à l'immunoréactivité de la substance P-like La flèche indique le temps de rétention de la susbtance P. Figure 3: purification jusqu'à homogénéité apparente de la neurokinine B de grenouille par chromatographie sur (A) une colonne analytique Vydac C-4 et (B) une colonne analytique Vydac C- 18 Le trait montre les

fractions contenant l'immunoréactivité neurokinine B-

like La flèche donne le temps de rétention de la neurokinine B.

EXEMPLES

MATERIELS ET METHODES

Les peptides synthétiques proviennent de Peninsula Laboratories, Inc (Belmont CA, USA) Les colonnes de chromatographie ont été fournies par Separations Group (Hesperia, CA, USA) La technique FAB (Fast Atom Bombardment) couplée à la spectrométrie de masse a été mise en oeuvre par le Mid-West Center pour la spectrographie de masse, Département de Chimie,

Université de Nebraska, Lincoln, Nebraska USA.

Extraction tissulaire Des grenouilles adultes (Rana ridibunda) ont été achetées auprès de la société Couetard, Saint-Hilaire de Riez, France Les cerveaux complets ont été extraits à partir d'environ 600 spécimen et congelés immédiatement dans de la carboglace Le tissu ( 46,7 g) a été extrait, alors qu'il était déjà congelé, avec 8 volumes d'éthanol/0,7 M HC 1 ( 3:1, vol/vol) comme décrit par CONLON et al 1986 (FEBS Lett 200, 111-116) Après agitation pendant 3 heures à 4 C, l'extrait a été centrifugé ( 1600 g pendant 1 heure à 4 C) et l'éthanol a été repris à partir du surnageant dans des conditions de pression réduite Le matériel peptidique a été isolé par passage en flux de 1 ml/min à travers dix cartouches Sep-Pack C-18 (Waters Associates, Milford, MA USA), reliées en séries Le matériel lié a été

récupéré par élution avec 70 % (vol/vol) d'acétoni-

trile/eau et lyophilisé.

Protocoles de radioimmunoessai (RIA) L'immunoréactivité de la substance P-like (SP-LI) a été mesurée en utilisant un antisérum P-4 dirigé contre la région COOH-terminale de la substance P qui présentait une réactivité inférieure à 0,5 % avec la neurokinine A, la neurokinine B et la forme non amidée de la substance P La limite de détection du test est 4 fmol/tube SP-LI a également été mesurée en utilisant

un antisérum SPG-1 dirigé contre la région NH 2-

terminale de la substance P qui ne présentait pas de réactivité avec les autres tachykinines La limite de détection du test est 0,9 fmol/tube L'immunoréactivité de la neurokinine B-like (NKB-LI) a été mesurée en

utilisant un antisérum R 5 dirigé contre la région NH 2-

terminale de la neurokinine B qui ne présente pas de réactivité avec les autres tachykinines La limite de détection du test est 6 fmol/tube Des détails complets des protocoles de radioimmunoessai ont été décrits dans plusieurs articles récents (CONLON, 1991 a, Methods in Neurosciences 6, 207-221; CONLON, 1991 b, Methods in

Neurosciences 6, 221-231).

Purification de la ranakinine et de la neurokinine B par HPLC L'extrait de cerveau, après purification partielle sur des cartouches Sep-Pak a été injecté sur une colonne Vydac 218 TP 510 (C-18) ( 25 x 1 cm) équilibrée avec 0,1 % (vol/vol) d'acide trifluoroacétique/eau et avec un flux de 2 ml/min La concentration d'acétonitrile a été élevée jusqu'à 21 % (vol/vol) pendant 10 min, maintenue à cette concentration pendant min et augmentée jusqu'à 49 % (vol/vol) pendant 60 minutes en utilisant un gradient linéaire L'absorption a été mesurée à 214 et 280 nm et les fractions ( 1 min) ont été collectées Les activités SP-LI et NKB-LI dans ces fractions ont été mesurées par des

radioimmunoessais à une dilution appropriée.

Les fractions contenant la substance P-like (SP-

LI) (figure 1) ont été rassemblées et injectées sur une colonne Vydac 214 TP 54 (C-4) ( 25 x 0,46 cm), équilibrée avec 0,1 % (vol/vol) d'acide trifluoroacétique/eau avec un débit de 1,5 ml/min La concentration d'acétonitrile dans le solvant d'élution a été augmentée jusqu'à 14,5 % (vol/vol) pendant 10 minutes et jusqu'à 35 % (vol/vol) pendant 60 minutes en utilisant des gradients linéaires La ranakinine a été purifiée jusqu'à l'homogénéité apparente sur une colonne Vydac 218 TP 54 (C-18) ( 25 x 0,46 cm), équilibrée avec de l'acétonitrile/eau/acide trifluoroacétique ( 17,5/82,4/0,1, vol/vol/vol) avec un débit de 1,5 ml/min La concentration d'acétonitrile dans le solvant d'élution a été augmentée jusqu'à 31,5 % pendant 60 minutes en utilisant un gradient linéaire.

Les fractions contenant NKB-LI (figure 1) ont été collectées et injectées sur une colonne Vydac 214 TP 54 ( 25 x 0,46 cm) équilibrée avec 0,1 % (vol/vol) d'acide trifluoroacétique avec un débit de 1,5 ml/min La concentration d'acétonitrile dans le solvant d'élution a été ajustée jusqu'à 24,5 % (vol/vol) pendant 10 minutes et 38,5 % (vol/vol) pendant 60 minutes La neurokinine B de grenouille a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente sur une colonne Vydac 218 TP 54 ( 25 x 0, 46 cm) comme décrit précédemment, excepté le fait que la concentration d'acétonitrile a été élevée de

24,5 % (vol/vol) à 35 % (vol/vol) pendant 60 minutes.

Caractérisation structurale La structure primaire des peptides a été déterminée par dégradation automatisée de Edman en utilisant un séquenceur 471 A de Applied Biosystems, modifié pour réaliser une détection en continu des acides aminés phénylthiohydantoine dans des conditions de gradient d'élution La limite de détection était 0,5 pmol Les compositions en acides aminés ont été déterminées après hydrolyse en phase gazeuse ( 6 M H Cl) par dérivation en sortie de colonne avec le phénylisothiocyanate (BIDLINGMEYER et al, 1984, J. Chromatog 336, 93-104) en utilisant un dériveur 420 A de Applied Biosystems Les dérivés phenylthiocarbamyle des acides aminés ont été identifiés par HPLC en utilisant le système de séparation 130 A de Applied Biosystems La spectrométrie de masse par désorption de plasma Californium 252 a été effectuée en utilisant un instrument "time-of-flight" de BIO-ION Nordic BIN-20 K. Les spectres ont été enregistrés à 16 k V pendant 106 évènements primaires de fission La précision des déterminations de masse est de 0,1 % Synthèse de ranakinine La ranakinine a été synthétisée ( 0,4 mmol échelle) sur une résine de paraméthylbenzhydrylamine en utilisant un synthétiseur de peptide 430 A de Applied Biosystems Des dérivés d'acides aminés protégés par le tert-butyloxycarbonyle ont été couplés au niveau de leurs esters actifs hydroxybenzotriazole, en suivant les protocoles standard du fabricant Le peptide a été clivé de la résine en utilisant un mélange d'acide

trifluorométhane sulfonique et d'acide trifluoro-

acétique ( 1:9 vol/ vol) et a été purifié par HPLC en phase inverse La concentration finale de peptide purifié était 19 % de la quantité théorique L'identité du peptide a été confirmée par analyse des acides aminés (trouvé: Asx 1,0, Glx 1,0, Gly 1,0, Arg 1,0, Pro 2,1, Tyr 0,9, Met 1,0, Leu 1,0, Phe 0,9, Lys 1,1 résidus/mol peptide), et par spectrométrie de masse à faible résolution (masse observée 1353; masse calculée

pour la forme diprotonée 1353).

RESULTATS

Immunoréactivité tachykinine-like dans le cerveau de grenouille La concentration de SP-LI dans l'extrait de cerveau de grenouille, mesurée avec un antisérum dirigé contre la partie COOH-terminale de la substance P, était de 236 pmol/g par poids de tissu frais SP-LI n'était pas détectable dans l'extrait en utilisant un antisérum dirigé contre la partie NH 2-terminale de la substance P NKB-LI dans l'extrait, mesuré avec un antisérum dirigé contre l'extrémité NH 2-terminale de la neurokinine B était de 164 pmol/g de tissu frais Les courbes de déplacement observées avec les extraits de cerveau sont parallèles aux courbes standard obtenues respectivement avec la substance P synthétique et la

neurokinine B dans les radioimmunoessais.

Purification de la ranakinine et de la neurokinine B Le profil d'élution sur colonne HPLC en phase inverse C-18 semi-préparative de l'extrait de cerveau de grenouille est présenté à la figure 1 La substance P-like mesurée avec un antisérum dirigé contre la partie COOH-terminale a été éluée sous forme d'un pic unique dans les fractions et représentée par une plage blanche La neurokinine B-like, mesurée avec un antisérum dirigé contre la partie NH 2-terminale a été éluée sous forme d'un unique pic dans les fractions représentées par une région hachurée Les fractions contenant SP-LI ont été rassemblées et rechromatographiées sur une colonne C-4 analytique (figure 2 A) La substance P-like a été éluée sous forme du pic principal marqué par un trait La ranakinine a été purifiée jusqu'à homogénéité apparente sur une colonne analytique C-18 (figure 2 B) Le peptide a été élué sous forme d'un pic aigu et symétrique avec un temps de rétention nettement plus faible que celui de la substance P La concentration finale de matériel pur

était d'envion 5 nmol.

Les fractions contenant NKB-LI ont été rassemblées et rechromatographiées sur colonne analytique C-4 (figure 3 A) L'immunoréactivité a été associée avec un épaulement du pic d'élution qui élue plus tôt que le

pic majeur d'absorption en UV comme le montre le trait.

Après rechromatographie de cette fraction sur une colonne analytique C- 18 (figure 3 B), le peptide a été élué sous forme d'un pic sans épaulement avec le même temps de rétention que la neurokinine B La concentration finale de neurokinine B purifiée chez la

grenouille était approximativement de 2 nmol.

Analyse structurale L'analyse en acides aminés de la ranakinine a révélé la composition suivante: Asx 1,1, Glx 1,4, Gly 1,0, Arg 1,1, Pro 1,8, Tyr 0,8, Met 0,8, Leu 1, 1, Phe 0,9, Lys 0,9 (résidus/mol peptide) La séquence obtenue par dégradation de Edman est donnée dans le tableau 1 suivant: Tableau i: dégradation automatisée de Edman, de la ranakinine et de la neurokinine B de grenouille Ranakinine Cycle N Acide aminé Quantité Lys Pro Asn Pro Glu Arg Phe Tyr Gly Leu Met Neurokinine B Acide aminé Quantité Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met Les acides aminés phénylthiohydantoine ont été repérés sans ambiguité au cours de 11 cycles de réaction La séquence proposée en acides aminés était en accord avec les données sur la composition en acides aminés démontrant que la séquence complète du peptide avait été obtenue La masse moléculaire observée du peptide, déterminée par spectrométrie de masse par désorption de plasma était 1366,6 1,4 comparée avec

la masse calculée pour la séquence proposée de 1350,6.

La différence de 16 a m u suggère que le résidu méthionine COOH- terminal était oxydé dans sa forme sulfoxyde Dans une étude précédente (CONLON et al 1991), la masse observée de la tachykinine de poisson, la carassine était aussi de 16 a m u plus forte que la masse calculée La présence d'un résidu COOH-terminal a amidé dans la ranakinine a été suggérée par la forte réactivité du peptide avec l'antisérum dirigé contre la partie COOH-terminale de la substance P et a été confirmée par la synthèse totale Un mélange de ranakinine endogène et de peptide synthétique a amidé a été élué de la colonne HPLC en phase inverse dans les conditions d'élutions présentées à la figure 2 b sous

forme d'un pic unique sans épaulement.

L'analyse des acides aminés de la neurokinine B de grenouille a révélé la composition suivante: Asx 2,1, Gly 1,3, His 0,9, Val 1,0, Met 1,1, Leu 1,0, Phe 1,7 (résidus/mol peptide) A l'exception de la faible valeur de la composition en méthionine, la composition du peptide de grenouille est la même que celle attendue pour la neurokinine B de mammifère L'identité de la neurokinine B de grenouille avec la neurokinine B de mammifère a été confirmée par dégradation de Edman (Tableau 1) et un mélange du peptide endogène et de la neurokinine B synthétique éluée au niveau de la colonne

C-18 d'HPLC en phase inverse sous forme d'un seul pic.

La masse moléculaire observée de la neurokinine B de grenouille était 1209,7 1,2 ce qui est en accord avec la masse calculée de 1210,4 pour la forme a amidée de

la séquence proposée.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 Peptide caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement d'acides aminés suivant: a 1 Pro a 2 Pro a 3 a 4 Phe Tyr Gly Leu Met dans lequel an avec N égal à 1, 2, 3 ou 4 représente un

acide aminé quelconque.

2 Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que a 1 est un acide aminé de type basique et par exemple l'arginine, l'acide glutamique et de préférence

la lysine.

3 Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que a 2 est la lysine, l'acide aspartique ou de préférence l'asparagine. 4 Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 3, caractérisé en ce que a 3 est la

glutamine, l'asparagine ou de préférence l'acide glutamique. Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 4, caractérisé en ce que a 4 est la

glutamine, la lysine ou de préférence l'arginine.

6 Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il répond à

l'enchaînement d'acides aminés suivant: Lys Pro Asn Pro Glu Arg Phe Tyr Gly Leu Met 7 Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 6, caractérisé en ce que son

extrémité COOH-terminale est amidée.

8 Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est modifié par élimination des acides aminés de sa partie NH 2-terminale dès lors que le

peptide ainsi formé est protégé contre les amino-

peptidases présentes dans le milieu cellulaire.

9 Polypeptide contenant un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40 de préférence 30, caractérisé en ce qu'il comprend le peptide selon l'une

quelconque des revendications 1 à 6 ou 8, et notamment

en ce qu'il comporte en outre à l'extrémité N-terminale et/ou à l'extrémité C-Terminale de ce peptide des

acides aminés basiques, dès lors que la structure C-

terminale ainsi obtenue permet l'amidation du polypeptide. Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 7, tel qu'obtenu par:

centrifugation d'un extrait tissulaire de cerveau de grenouille, à 1600 g pendant 1 heure à 4 C, séparation de la fraction peptidique, sélection de la fraction peptidique réagissant avec un antisérum dont les anticorps polyclonaux ou monoclonaux reconnaissent la partie COOH-terminale de la substance P, cet antisérum présentant en outre une réactivité inférieure à 0,5 % avec la neurokinine A, la neurokinine B et la substance P non amidée, purification par HPLC sur une colonne équilibrée avec un mélange acétonitrile/eau/acide trifluoroacétique ( 17, 5/82,4/ 0,1, vol/vol/vol) avec un débit de 1,5 ml/min, la concentration en acétonitrile dans le solvant d'élution étant portée à 31,5 % pendant 60 mn, selon un gradient linéaire,

récupération du peptide purifié.

11 Peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend,

intercalés entre plusieurs voire entre tous les acides aminés du peptide, des acides aminés dextrogyres et notamment D-Phe ou D-Trp susceptibles d'empêcher

l'action des enzymes de dégradation dans l'organisme.

12 Peptide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupement NH 2 est substitué par exemple

un groupement alkyl, aralkyl, aryl, ester ou nitrile.

13 Acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour un peptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 7.

14 Acide nucléique caractérisé en ce qu'il répond à la séquence suivante:

AAA CCU AAU CCU GAA CGU UUU UAU GGU CUU AUG

G C C C G A C C C C U C

A A A A A

G G G G G

Vecteur de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il est modifié en un site non essentiel pour sa réplication, par un acide nucléique

selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, cet

acide nucléique étant placé sous le contrôle d'éléments de régulation et notamment d'un promoteur reconnu par les polymérases d'un hôte cellulaire chez lequel on

souhaite l'exprimer.

16 Hôte cellulaire caractérisé en ce qu'il est

transformé par un vecteur selon la revendication 15.

17 Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement un peptide ou un polypeptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 12.