JP2801079B2

JP2801079B2 - Ａｎｐ関連新規ペプチド

Info

Publication number: JP2801079B2
Application number: JP2307918A
Authority: JP
Inventors: 正治田中; 義春南竹; 安雄北島
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 1998-09-21
Anticipated expiration: 2013-09-21
Also published as: JPH04182496A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、強い血管弛緩活性と、cGMP産生活性、並び
に活性型ANP受容体に高い親和性を有する新規心房性ナ
トリウム利尿ホルモン（以下ANPと略す）に関する。

従来の技術ヒト心房性ナトリウム利尿ホルモンは、28個のアミノ
酸からなる環状ペプチドで、ナトリウム利尿、血管弛
緩、血圧降下、アルドステロン分泌抑制等の多様な生理
活性を有している。

ヒト以外にも、種々の動物、組織より、ナトリウム利
尿ホルモンが単離されている。図−１にそれらの一次構
造を示した。一方、臨床上の有用性から、特にヒト、ラ
ットのANPは興味がもたれており、前述した多様な生理
活性機構を明らかにするため、現在まで数多くのANP誘
導体が合成されてきた。しかしながら、ANP受容体が複
雑であることが原因し、従来のANP誘導体、例えば、断
片化誘導体、置換体、環状部修飾体等は、生理活性に直
接的には関与していないと考えられているＣ−受容体に
高い選択性を示し、かつ生理活性に直接関与していると
されるＢ−受容体に結合しなくなるものがほとんどであ
る。すなわち、ANP活性発現を明らかにするため、ある
いは高活性誘導体を作成するために重要な、Ｂ−受容体
選択的なANP誘導体は得られていないのが現状である。

本発明が解決しようとする課題従って、本発明の目的の一つは、Ｂ−レセプターに高
い親和性を有する新規α−hANP誘導体を作成することで
ある。さらには、第一の目的を通し、より高い活性のAN
P誘導体を作成することである。

課題を解決するための手段本発明者は、従来より指摘されている活性発現に重要
なアミノ酸残基を、１）疎水性が重要であると考えられ
る残基と、２）電荷が重要であると考えられる残基の２
つの分類し、それぞれに対して以下に述べるような種々
の修飾を加えた。

疎水性が重要だと考えられている残基には、８位フェ
ニルアラニン、12位メチオニンが挙げられる。

本発明者はこれらの残基の持つ、疎水性、水素結合
能、かさ高さ、あるいは脂肪族性等の科学的性質を変化
させた。電荷が重要であると考えられている残基には、
11位アルギニン、13位アスパラギン酸、14位アルギニ
ン、及び27位アルギニンが挙げられる。これらの残基に
対しては、荷電グループ（グアニシド基、カルボキシル
基）を残したまで、α−炭素とこれらの荷電グループと
の距離を変化させた。本発明で合成した新規α−hANP誘
導体の生理活性検定を、血管平滑筋培養細胞におけるレ
セプター結合能とcGMP産生能、及びラット摘出血管を用
いた血管弛緩活性を測定することにより行った。また新
規α−hANP誘導体のレセプター選択性を、既にSpearら
によって報告されている基準（Spear et al.J.Med.Che
m.,32 67,1989）に従って判定した。すなわち、Ｃ−レ
セプターの含有率が98％をこえるとされる、血管平滑筋
培養細胞におけるレセプター結合能をＣ−レセプター親
和性とし、Ｂ−レセプターによって引き起こされると考
えられている血管弛緩活性を、Ｂ−レセプター親和性と
見なし、その比をもってＢ、あるいはＣ−レセプターへ
の選択性とした。α−hANPは両レセプターに対して同程
度の親和性を有し、これらレセプターに対する選択性は
１である。また従来の構造活性相関研究により、ANPの
活性発現は、環状部とそれに続くＣ末部に支配され、環
外Ｎ末部を除いても活性が保持されることが明らかにな
っている（Nutt R.F.et al.,Endocrinology and Metabo
lism Clinics of North America,16巻,19−41 1987）。

本発明者は、α−hANPと同等の活性を有するα−hANP
（７−28）を基本とし、疎水性残基に関しては８位フェ
ニルアラニンをパラクロロフェニルアラニン、１′−ナ
フチルアラニン、２′−ナフチルアラニン、チロシン、
Ｏ−メチルチロシン、ホモフェニルアラニン、あるいは
フェニルグリシンにそれぞれ弛緩した誘導体、及び12位
メチオニンをＳ−メチルシステイン、エチオニン、ブチ
オニンに置換した誘導体を合成した。また荷電残基に関
しては、11位、14位、及び27位のアルギニン残基のうち
一残基、二残基、あるいは三残基ともホモアルギニンに
置換した誘導体、13位アスパラギン酸残基に関しては、
グルタミン酸、α−アミノアジピン酸で置換した誘導体
を作成した。これらの誘導体の活性を、前記の方法を用
いて測定した結果、疎水性アミノ酸修飾誘導体に関して
は［pClPhe⁸］−α−hANP（７−28）が標品の５倍のcGM
P産生活性、及び４倍の血管弛緩活性を持つこと、さら
にはＢ−レセプターに対する選択性が標品の4.4倍に上
昇することを見いだした。

一方、荷電残基の修飾誘導体に関しては、３ヶ所ある
アルギニン残基中、２残基をホモアルギニンに置換した
誘導体、［hArg^11,14］−体、［hArg^11,27］−体、及び
［hArg^14,27］−体、が評品と比べ、血管弛緩活性がそ
れぞれ、4.1倍、5.3倍、2.5倍に上昇し、一置換体では
［hArg²⁷］−体、［hArg¹⁴］−体がそれぞれ2.0倍、2.2
倍に上昇することを見いだした。また、Ｂ−レセプター
への選択性に関しては、［hArg^11,27］−体が標品の5.9
倍の値を示した。以上を小括すると、強い血管弛緩活性
を有する新規ANP誘導体として、ａ）［pCl−Phe⁸］−α
−hANP（７−28）,b）［Mpr⁷,pCl−Phe⁸］−α−hANP
（７−28），（ｃ）［hArg^11,14］−α−hANP（７−2
8）,d）［hArg^11,27］−α−hANP（７−28）,e）［hArg
^14,27］−α−hANP（７−28）,f）［hArg²⁷］−α−hAN
P（７−28）,g）［hArg¹⁴］−α−hANP（７−28）がい
ずれも２倍から５倍の活性を示すこと、及びＢ−レセプ
ターへの選択性に関しては、［pCl−Phe⁸］−α−hANP
（７−28），［hArg^11,27］−α−hANP（７−28）が各
々4.4,5.9倍の親和性を示すことを見いだし本発明を完
成した。これらの化合物は、従来にない強い弛緩活性、
すなわちＢ−レセプターへの高い親和性を有するもので
あり、血圧降下剤、あるいは活性発現機構の解明に非常
に有用な化合物である。

これらの化合物は、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン
酸、または有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク
酸、クエン酸等の酸付加塩に転換できる。なお、本発明
においては具体的実施例としてα−hANP（７−28）の誘
導体について記すが、本発明の知見からすれば、同様の
誘導体の作製は、すでに構造が明らかにされているα−
hANP様活性を示す他のペプチド（第１図に示すペプチ
ド）に適応できることは自明である。

本発明のペプチドは、標準的なペプチド合成法によっ
て製造できる。例えば一般的な総書として、「生化学実
験講座１、タンパク質の化学IV、第II部207−495頁」
（東京化学同人）「ペプチド合成の基礎と実験・泉屋信
夫他共著」（丸善）がある。また、ANP関連ペプチドに
関しては、「ペプチドケミストリー1984 229−234頁、2
35−240頁、及び241−246頁、泉屋編集」（蛋白研発
行）などに、その合成法が詳細に記載されている。本発
明ペプチドは、基本的には上記の文献に記載されている
合成法に準じて合成できるものである。本発明ペプチド
は、保護基のついたアミノ酸を固相法と称せられる方法
で縮合、延長させ、弗化水素で全保護基を除去した後、
ジスルフィド結合反応を経て製造されたものである。

本明細書において特に標記のないアミノ酸はＬ−体で
あり、試薬類を含め以下に示される略号を用いた。

Asp:L−アスパラギン酸 Asp（OcHex）：β−シクロヘキシルアスパラギン酸 Ser:L−セリン Ser（Bzl）:O−ベンジル−Ｌ−セリン Gln:L−グルタミン Gly:グリシン Ala:L−アラニン Cys:L−システイン Cys（4MeBzl）:4−メチルベンジル−Ｌ−システイン Met:L−メチオニン Ile:L−イソロイシン Leu:L−ロイシン Tyr:L−チロシン Tyr（BrZ）:0−２−ブロモベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−チロシン Phe:L−フェニルアラニン Arg:L−アルギニン Arg（Tos）:G−トシル−Ｌ−アルギニン Mpr:メルカプトプロピオニル pCl Phe:パラクロロ−Ｌ−フェニルアラニン（１）Nal:1−Ｌ−ナフチルアラニン（２）Nal:2−Ｌ−ナフチルアラニン hPhe:L−ホモフェニルアラニン Pgly:L−フェニルグリシン Tyr（OMe）:0−メチル−Ｌ−チロシン hARG:L−ホモアルギニン Cys（Me）:S−メチルシステイン Bt:L−ブチオニン Et:L−エチオニン Adp:α−アミノ−Ｌ−アジピン酸 Boc−:t−ブチルオキシカルボニル TFA:トリフルオロ酢酸 NMP:N−メチルピロリドン DMSO:ジメチルスルホキシド HOBt:N−ヒドロキシベンゾトリアゾール最終物の純度検定を、下に示す薄層クロマトグラフィ
ー、分析用高速液体クロマトグラフィー、及びアミノ酸
分析にて実施した。

薄層クロマトグラフィー担体：シリカゲル60 F−254（メルク）展開溶媒： Rf₁ n−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝4:1:1:2 Rf₂ n−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝30:20:6:24 分析用高速液体クロマトグラフィー機器：島津LC−6Aシステムカラム:YMC−Pack A−302 OD5 4.6φ×150mm 展開溶媒:18％ CH₃CN/0.1％ TFAから18％ CH₃CN/0.1
％ TFAまでの30分リニアグラジエントアミノ酸分析機器：日立アミノ酸分析機835型実施例1.ANP誘導体の合成本発明ペプチドは、すべてアプライドバイオシステム
社製ペプチド合成機431型を用いてペプチド樹脂を作成
した。

１−1:化合物番号1; Ｈ−Cys−pClPhe−Gly−Gly−Arg−Met−Asp−Ile−Gly
−Ala−Gln−Ser−Gly−Leu−Gly−Cys−Asn−Ser−Phe
−Arg−Tyr−OH （ジスルフィド型）の合成 0.7g（0.5mmol）のBoc−Tyr（Br−Ｚ）−Ｏ−CH₂−PA
M樹脂より出発し、50％TFAによる脱Boc、DIEAによる中
和、及びDCC/HOBtによる保護アミノ酸縮合を順次繰り返
し、約1.7gの対応する保護ペプチド樹脂を得た。このも
のをパラ・クレゾール（1.5ml）存在下、−２℃で60分
間、HF（8.5ml）処理した。得られた遊離ペプチドを30m
lのTFAで抽出後濃縮し、エーテルで沈澱とし、650mgの
粗ペプチドを得た。このものを32mlの8Mウレア水に溶か
し、フェリシアン化カリウム（147mg,44.8μmol）を含
む8Mウレア水（288ml,pH7.4）中に攪拌下、滴下した。
滴下終了後、反応液を酢酸でpH5とした後、1N AcOHで平
衡化したAG3−X4A（10ml,Cl−型）と、HP−20（150ml）
の連結カラムに添加した。1N AcOH（500ml）で洗浄後、
HP−20に吸着したペプチドを80％CH₃CN/1 N AcOHで溶出
した。ニンヒドリン陽性の画分を濃縮後、水（50ml）を
加え凍結乾燥し、粗環状ペプチド（600mg）を得た。

次に、水で平衡化したイオン交換カラム（CM−2SW,2
φ×15cm）に添加し、水から0.5M NH₄OAc（pH7.2）への
60分間のリニヤグラジエントをかけ、流速7ml/minでペ
プチドを溶出した。主画分を集め0.1％TFAで初期化した
逆相C₁₈カラム（YMC−Pack D−ODS 2φ×25cm）に添加
し、30％ CH₃CN/0.1％TFAから60％CH₃CN/0.1％TFAへの
60分間のリニヤグラジエントをかけ、流速10ml/minで溶
出させた。97％以上の純度をもつ画分を集め、凍結乾燥
し78mgの目的物を得た。本実施例に基づき、化合物番号
２から20までのANP誘導体（表−１に示した）を同様に
作成した。これらの物性値を表−２に示した。

実施例2.生理活性の測定２−1:レセプター結合能及びcGMP産生活性の測定本発明で合成した化合物の上記活性をHirataら（B.B.
R.C.128 538,1985）、及びScarboroughら（J.B.C.261 1
2960,1986）の方法に従って測定した。用いた細胞は、
ラット大動脈由来の血管平滑筋培養細胞（以下VSMCと略
す）をRossらの方法（J.Cell.Biol.,50 172,1971）に従
って培養した４〜15代目のものである。結合活性は¹²⁵I
ラベルしたα−hANPのIC₅₀と比較し、比活性を産生し
た。cGMP産生亢進活性は、10^-9〜10^-5Mのα−hANP、及
びペプチドをVSMCと共にインキュベートし、産生したcG
MP量を測定した。なお、α−hANPによる最大反応値を10
0％としたときの各ペプチドのEC₅₀を求め、活性の指標
とした。

２−2:血管弛緩活性の測定 Ishidaら（Life Sci.,36 1250,1985）の方法に準じ、
SD系雄ラット大動脈ラセン標本を２×10^-4Mノルエピネ
フィリンで収縮させ、収縮が一定となった後、本発明で
合成したペプチドをcumulativeに加え、弛緩活性を測定
した。なお、測定値はα−hANPによる弛緩を100％と
し、各ペプチドのEC₅₀を算出した。上記のアッセイ系に
おける測定結果を表−３に示した。

発明の効果本発明において、強い血管弛緩活性を有する化合物番
号1,2,14,15,16,18,19、Ｂ−レセプターに対して高い選
択性を有する化合物番号1,18を見いだした。これらは、
ANP活性発現機構を解明するための有用な誘導体であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種ANP様物質のアミノ酸配列を比較した図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者北島安雄大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献特開昭60−214797（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−185096（ＪＰ，Ａ) 特開平２−96594（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/58 ＣＡＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式のいずれかで表されるペプチド、
及びそれらの生理的に許容されうる酸付加物。［各式中、２つのCysはジスルフィド結合を介して結合
しており、（Ａ）はＨ−、Ｈ−Ser−、Ｈ−Ser−Ser
−、Ｈ−Arg−Ser−Ser−、Ｈ−Arg−Arg−Ser−Ser
−、Ｈ−Leu−Arg−Arg−Ser−Ser−、Ｈ−Ser−Leu−A
rg−Arg−Ser−Ser−で表される水素又は環外Ｎ末部ア
ミノ酸を示す。］