JPH0579310B2

JPH0579310B2 -

Info

Publication number: JPH0579310B2
Application number: JP61074061A
Authority: JP
Inventors: Akiko Saito; Susumu Sekine; Moryuki Sato; Seiga Ito
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-03-31
Filing date: 1986-03-31
Publication date: 1993-11-02
Also published as: JPS62230799A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え体
DNAおよび該組換え体DNAを含む細菌に関す
る。魚類の成長ホルモンは魚類の養殖産業分にお
いて広い用途が期待される。従来の技術哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産
されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、ユ
ー・ジエイ・レビイス（U.J.Lewis）らによつて
ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエテイ（J.Am.Chem.Soc.）、80、4429（1958）
に、エイ・エス・ハートリー（A.S.Hartree）に
よつてバイオケミカル・ジヤーナル（Biochem.
J.）、100、754（1966）に、シー・エイチ・リー
（C.H.Li）らによつてアーチブス・オブ・バイオ
ケミストリイ・アンド・バイオフイジクス・（サ
プルメント）〔Arch.Biochem.Biophys.
（Suppl.）〕、１、327（1962）に報告されている。魚類の成長ホルモンについては、単離された報
告は下記の例がある。テイラピアよりの単離例：エス・ダブリユ・フ
アーマー（S.W.Farmer）ら、ジエネラル・アン
ド・コンパラテイブ・エンドクリノロジイ
（Gen.Comp.Endocrin.）、30、91（1976）．チヨウザメよりの単離例：エス・ダブリユ・フ
アーマー（S.W.Farmer）ら、エンドクリノロジ
イ（Endocrinology）、108、377（1981）．コイよりの単離例：エイ・エフ・クツク（A.
F.Cook）ら、ジエネラル・アンド・コンパラテ
イブ・エンドクリノロジイ（Gen.Comp.
Endocrin.）、50、335（1983）．シロサケよりの単離例：特開昭60−214798 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子については
ラツト成長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シー
バーグ（P.H.Seeburg）ら：ネイチヤー
（Nature）270 486（1977）〕、ウシおよびブタの
成長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ
（P.H.Seeburg）ら：デイー・エヌ・エイ
（DNA）、２、37（1983）〕、ヒト成長ホルモン遺伝
子〔ジエイ・エイ・マーシヤル（J.A.Martial）
ら：サイエンス（Science）、205、602（1979）〕な
どがすでに知られており、魚類の成長ホルモン遺
伝子についてもシロサケ成長ホルモンの遺伝子が
本発明者らにより既に単離されている（特開昭61
−15699）。発明が解決しようとする問題点魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有
するので、養魚用餌料の組成物として有用である
が、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が限られ
ている。従つて魚類の成長ホルモンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。問題点を解決するための手段本発明者らは、組換えDNA技法により魚類の
成長ホルモンを製造する方法について研究を行つ
た。その結果、魚類の成長ホルモン製造に使用す
ることができる、魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドに相補的なDNAの採取ならびにこれを含む組
換え体DNAおよび該組換え体DNAを含む細菌の
製造に成功した。即ちウナギ脳下垂体からメツセ
ンジヤーRNA（mRAN）を抽出し、これと相補
的なDNA（cDNA）を合成し、次いでウナギの成
長ホルモンのＮ末端付近のアミノ酸配列に対応す
るDNAプローブを合成し、このDNAとハイブリ
ダイズするcDNAを選択することにより、ウナギ
成長ホルモン遺伝子をクローン化し、そのcDNA
の全塩基配列を決定した。本発明者らはさらに研
究を進め、ウナギの成長ホルモンをコードする
DNAを組み込んだ組換え体DNAを含む細菌を培
養することにより、培養物中にウナギ成長ホルモ
ンポリペプチドが著量蓄積することを見い出し、
本発明を完成するに至つた。以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチドを
コードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え体
DNAおよび該組換え体DNAを含む細菌を提供す
る。本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記の
一般的手法で調製される。ウナギ脳下垂体より全RANを調製し、これを
オリゴdTセルロース（oligo dT cellulose）カ
ラムを通すことによりポリアデニル酸を有する
RNA〔ポリ(A)RAN〕を分離する。このポリ(A)
RNAを鋳型とし、逆転写酵素により二重鎖DNA
を合成する。組換え際は試験管内DNA組換え技
法を用い、大腸菌のプラスミドDNAのようなベ
クターDNAに該合成DNAを挿入して得られる。次に本発明のDNAおよび組換え体プラスミド
の製法について具体的に説明する。捕獲されたウナギより脳下垂体を摘出し、即座
に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体に
チオシアン酸グアニジンを加え破砕し、可溶化す
る。次いでLiClを加えて、遠心後、沈殿物として
全細胞質RNAを得る。また、チオシアン酸グア
ニジン可溶化物をCsCl溶液層に重層し、超遠心
後、沈殿物としてRNAを得ることもできる。抽出したRNAをNaClまたはKClの高塩濃度
（たとえば0.5M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）
セルロースのカラムに通塔してポリ(A)を有する
mRNAをカラムに吸着させる。水、10ｍＭトリ
ス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶
出し、ポリ(A)を有するmRNAを単離する。以下、オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）
の方法〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama
＆Berg）；モレキユラー・アンド・セルラー・バ
イオロジイ（Mol.Cell.Biol.）２、161（1982）〕に
従い、cDNAの合成および、そのベクターへの組
み込みを行う。まずベクタープライマーを合成する。ベクター
としてはたとえばpCDV1を適当な溶液、たとえ
ばトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5、10ｍ
Ｍ）、MgCl₂（たとえば６ｍＭ）、NaCl（たとえば
10ｍＭ）を含む溶液中でKpnで処理し、
pCDV1のKpn部位を切断する。このDNAをト
リス−HCl緩衝液（たとえばPH6.8、30ｍＭ）、カ
コジル酸ナトリウム（たとえば140ｍＭ）、CoCl₂
（たとえば１ｍＭ）、ジチオスレイトール（たとえ
ば0.1ｍＭ）およびdTTP（たとえば0.25ｍＭ）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼとともに一定温度（たとえば37℃）で一定
時間（たとえば20分間）インキユベートし、ベク
ターDNAの両3′末端に60個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのDNAをトリス−HCl緩
衝液（例えばPH7.5、10ｍＭ）、MgCl₂（たとえば
６ｍＭ）、NaCl（たとえば100ｍＭ）を含む溶液中
EcoRIで切断後、低融点アガロースゲル電気永動
法〔ラルス・ウイスランダー（Lars
Wieslander）、アナリテイカル・バイオケミスト
リイ（Analytical Biochemistry）、98、305
（1979）、以下LGT法という〕にて分画し、約3.1
キロベースの断片を回収する。次いで該DNAを
NaClまたはKClの高塩濃度（たとえば0.5M）溶
液に溶解し、ポリ（dA）セルロースカラムに通
塔してポリ(T)を有するベクタープライマー分子の
みをカラムに吸着させる。水、10ｍＭトリス−
HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出
し、ポリ(T)の付加したベクタープライマー分子の
みを単離する。次にリンカーDNAを合成する。たとえば
pL1DNAを適当な溶液、たとえばトリス−HCl
緩衝液（たとえばPH7.5、10ｍＭ）、MgCl₂（たと
えば６ｍＭ）、NaCl（たとえば50ｍＭ）を含む溶
液中でPstIで処理し、pL1のPstI部位を切断する。
このDNAを、dTTPの代わりにdGTPを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、15個前後のオリゴ（dG）鎖を付加する。
該DNAを適当な溶液たとえばトリス−HCl緩衝
液（たとえばPH7.5、10ｍＭ）、MgCl₂（たとえば
６ｍＭ）、NaCl（たとえば60ｍＭ）を含む溶液中
Hindにて切断する。アガロースゲル電気泳動
にて約0.5キロベースのDNA断片を分画し、
DEAEペーパーにて回収する。このようにしてリ
ンカーDNAを得る。以上のようにして得たポリ(A)RNA、ベクター
プライマー、リンカーDNAを用い、cDNA合成
を行う。ポリ(A)DNA、ベクタープライマーDNA
をトリス−HCl緩衝液（たとえばPH8.3、50ｍ
Ｍ）、MgCl₂（たとえば８ｍＭ）、KCl（たとえば30
ｍＭ）、ジチオシレイトール（たとえば0.3ｍＭ）、
dATP、dTTP、dCTP、dGTP（たとえば各々２
ｍＭ）を含む溶液中、逆転写酵素を一定温度（た
とえば37℃）、一定時間（たとえば40分間）反応
させる。こうして得たRNA−DNA二重鎖の3′末
端に、dTTPがdCTPに変わる以外ベクタープラ
イマーに（dT）鎖を付加した条件と同様の操作
でオリゴ（dC）鎖を15個前後付加する。この
DNAをトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5、10
ｍＭ）、MgCl₂（たとえば６ｍＭ）、NaCl（たとえ
ば60ｍＭ）を含む溶液中Hindで切断する。こ
のDNAに、先に調製したリンカーDNAを混合
し、トリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5、20ｍ
Ｍ）、MgCl₂（たとえば４ｍＭ）、（NH₄）₂SO₄（た
とえば10ｍＭ）、KCl（たとえば0.1M）、β−ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（β−NAD）
（たとえば0.1ｍＭ）を含む溶液中、大腸菌DNA
リガーゼとともに一定時間（たとえば16時間）、
一定温度（たとえば12℃）でインキユベートす
る。こうしてcDNAとリンカーDNAとの環状化
が行われる。この反応液にdATP、dTTP、
dGTP、dCTPを各々、終濃度40μMとなるよう
加え、大腸菌DNAリガーゼ、大腸菌DNAポリメ
ラーゼ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加え、
RNA部分をDNAに変換することにより、完全な
二重鎖cDNAを含む組換えプラスミドを得る。こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、
たとえば大腸菌c600SF8株を、たとえばスコツト
（Scott）らの方法〔重定勝哉：細胞工学２、616
（1983）〕により形質転換する。上記で得た組換え
体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存
在するため、形質転換した大腸菌はアンピシリン
耐性を示す。以下の手法はこれらアンピリシン耐
性（Ap^R）菌株から魚類の成長ホルモンmRNA
に相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラス
ミドDNAを保有する菌株を選択するのに一般的
に用いられる。すなわち、上記で得られた形質転
換株をニトロセルロースフイルター上に固定し、
既知のウナギ成長ホルモンのアミノ酸配列より予
想されるDNA配列を有する合成DNAプローブと
会合させ、強く会合するものを選択する〔グルン
ステイン−、ホグネス（Grunstein−Hogness）
の方法、プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.）、USA.、72、3961（1975）〕。プローブ
DNAは通常のトリエステル法〔ジヤーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ（J.
Am.Chem.Soc.）、97、7327（1975）〕で合成され
る。合成DNAプローブによる選択はサザーン
（Southern）らの方法〔ジヤーナル・オブ・モレ
キユラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.）、98、
503（1975）〕によつてさらに確実にでき、この方
法でウナギ成長ホルモンmRNAに相補性を示す
遺伝子を有する組換え体プラスミドDNAを同定
できる。このようにして得られる組換え体プラスミドの
一例がpEGH15である。このプラスミドをウナギ
成長ホルモンをコードするDNAの供給源として
用いることができる。ウナギ成長ホルモンとして、GH−、GH−
の２種類があり、両者のアミノ酸配列を比較す
ると、GH−はGH−のＮ末端からアミノ酸
の３残基が欠けている〔特願昭60−151847（特開
昭62−12723）〕。上記で得られたpEGH15は、
GH−をコードするDNAを含むプラスミドで
ある。従つて、pEGH15からGH−をコードす
るDNAを切り出し、組換えDNA技法により、
GH−をコードするDNAを含むプラスミドを
作製することもできる。ウナギ成長ホルモンをコードするDNAを含む
プラスミドから該DNAを切り出し、これをベク
ターDNAに組み込み、得られる組換え体DNAを
微生物に導入し、得られる形質転換体を培養する
ことによつてウナギ成長ホルモンポリペプチドを
培養物中に生成蓄積させ、これを採取することに
よつてウナギ成長をホルモンポリペプチドを製造
することができる。ウナギ成長ホルモンをコードするDNAを含む
プラスミドとしては、上記pEGH15が好適な例と
してあげられる。ベクターDNAとしては、挿入したDNAを微生
物中で発現させることができるものならば、いか
なるものでも用いることができる。好ましくは、
適当なプロモーター、たとえばトリプトンフアン
（trp）系、ラクトース（lac）系、PL系などのプ
ロモーターを持ち、その下流にDNAを挿入でき、
しかも内在するシヤインダルガーノ配列（以下
SD配列と略記する）と翻訳開始コドン（ATG）
との間を適当な距離たとえば６〜18塩基対に調節
したベクターDNAが用いられる。具体的に好適
なベクターDNAとしては、プラスミドpGLM1を
あげることができる。pGLM1は第３図に示した
プラスミドで、それを含む大腸菌はEscherichia
coli EGRM1（FERM BP−823）として昭和60年
７月２日付で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコ
ードするDNAとベクターDNAとの組換えは、制
限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガ
ーゼを用いて結合する一般的組換えDNA手法を
用いて行うことができる。具体的として示したpEGH15とpGLM1の場合
は次のごとく造成を行う。すなわちpEGH15より
ウナギ成長ホルモン成熟ペプチドをコードする
cDNA部分およびベクター部分を含むBan−
BamH消化断片を得、pGLM1からはP_Lプロモ
ーターとc1857遺伝子を含むBamH−Ban消
化断片を得る。一方、以下のような合成DNAリ
ンカーを作製する。【表】上記両DNA断片と合成DNAリンカーとを
T4DNAリガーゼで結合し、第３図に示した組換
え対プラスミドpUPA1を得る。本プラスミドは
P_Lプロモーター下流に、成熟ウナギ成長ホルモ
ン（GH−）をコードする領域が連結した形を
有する。上記組換え技法における反応の条件は、一般的
に下記の通りである。 DNAの制限酵素による消化反応は、通常0.1〜
20μｇのDNAを２〜200ｍＭ（好ましくは10〜40
ｍＭ）のトリス−HCl（PH6.0〜9.5好ましくはPH
7.0〜8.0）、０〜200ｍＭのNaCl、２〜30ｍＭ（好
ましくは５〜10ｍＭ）のMgCl₂を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位（好ましくは1μｇの
DNAに対して１〜３単位）を用い、20〜70℃
（至適温度は用いる制限酵素により異なる）にお
いて、15分間〜24時間行う。反応の停止は、通常
55〜75℃で、５〜30分間加熱することによるが、
フエノールまたはジエチルピロカーボネートなど
の試験により制限酵素を失活させる方法も用いる
ことができる。制限酵素消化によつて生じたDNA断片の精製
は、LGT法やポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などによつて行う。 DNA断片の結合反応は、２〜200ｍＭ（好まし
くは10〜40ｍＭ）のトリス−HCl（PH6.1〜9.5、好
ましくはPH7.0〜8.0）、２〜20ｍＭ（好ましくは５
〜10ｍＭ）のMgCl₂、0.1〜10ｍＭ（好ましくは0.5
〜2.0ｍＭ）のATP、１〜50ｍＭ（好ましくは５
〜10ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中
で、T4DNAリガーゼ0.3〜10単位を用い、１〜
37℃（好ましくは３〜20℃）で15分間〜72時間
（好ましくは２〜20時間）行う。結合反応によつて生じた組換え体プラスミド
DNAは、必要によりCohenらの形質転換法〔エ
ス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら：プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、
USA、69、2110（1972）〕によつて、大腸菌に導
入する。組換え体プラスミドDNAを持つ大腸菌から該
DNAの単離は、セシウム・クロライド−エチジ
ウム・ブロミド密度勾配超遠心法〔デイー・ビー
クレウエル〔D.B.Clewell）ら：プロシーデイン
グ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、62、
1159（1969）〕あるいはバーンボイム（Birnboim）
らの方法〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.
Birnboim）ら：ヌクレイツク・アシド・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）７、1513（1979）〕な
どを用いて行う。プラスミドDNAを１〜10種類の制限酵素で消
化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。
さらにDNAの塩基配列を決定する必要がある時
はマキシム・ギルバード法〔プロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、74、560（1977）〕
またはM13フアージを用いたサンガー（Sanger）
法〔サンガー（Sanger）ら：プロシーデイン
グ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、74、
5463（1977）；アマーシヤム（Amersham）社
M13クローニング・アンド・シークエンシング・
ハンドブツク（cloning and sequencing
handbook）〕によつて決定する。本発明のウナギ成長ホルモンポリペプチドは以
下のとおりに製造できる。すなわち、プラスミド（例えばpUPA1）を用
いて大腸菌Ｋ−12 c600を形質転換させ、アンピ
シリン耐性のコロニーの中からpUA1を有する大
腸菌を選びだす。pUPA1を有する大腸菌を培地
に培養することにより培養物中にウナギ成長ホル
モンポリペプチドを生成させることができる。ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならび
にウナギ成長ホルモンポリペプチドの生産に好適
なものならば合成培地、天然培地のいずれも使用
できる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
ラクトース、グリセロース、マンニトール、ソル
ビトールなどが、窒素源としては、NH₄Cl、
（NH₄）₂SO₄、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バクトトリプトン、コーン・
ステイープ・リカーなどが、その他の栄養源とし
ては、K₂HPO₄、KH₂PO、NaCl、MgSO₄、ビ
タミンB₁、MgCl₂などが使用できる。培養はPH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気撹拌培
養により行われる。培養５〜90時間で培養菌体中にウナギ成長ホル
モンポリペプチドが蓄積するので、培養物から菌
体を集菌し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融
解を繰り返して菌体を破砕し、遠心して得られる
上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従つて
ポリペプチドを採取する。また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レ
ムリ（Laemmli）のサンプルバツフアー〔レム
リ（Laemmli）、ネイチヤー（Nature）、227、
680（1970）〕に加熱、溶解後、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル〔レムリ（Laemmli）の方法：同
上文献〕にかけ、ウエスタン・ブロツテイング
〔トービン（Towbin）ら：プロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、76、4350
（1979）〕をした後、ワサビペルオキシダーゼで標
識した二次抗体〔ダコー（DAKO）社製〕を用
いた酵素抗体染色体〔田部一史：細胞工学、２、
1061（1983）〕により行つた。以下に本発明の実施例を示す。実施例１ウナギ脳下垂体よりのポリ(A)RANの調製ウナギ脳下垂体よりチオシアン酸グアニジン−
塩化リチウム法〔カサラ（Cathala）ら、デイー
エヌエイ（DNA）、２、329（1983）〕に従いポリ
(A)を有するRANを下記のごとく調製した。ウナギの凍結脳下垂体0.5ｇ（約1000個体分）
を5Mチオシアン酸グアニジン、10ｍＭ
EDTA、50ｍＭトリス−HCl（PH７）および８％
（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノールからなる溶
液10ml中でテフロンホモゲナイザー（5rpm）に
て破砕し可溶化した。この可溶化物を遠心管に移
し、4M LiCl溶液70mlを加えて撹拌した後、４℃
20時間静置した。Hitachi RPR10ローターにて
900rpm、90分間遠心後、RANを沈殿として回収
した。RANの沈殿を4M尿素および2M塩化リチ
ウムからなる溶液100mlに懸濁し、Hitachi
RPR10ローターにて9000rpm、60分間遠心後、
再びRNAを沈殿として回収した。RNAの沈殿を
0.1％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭ EDTA、
10ｍＭトリス・HCl（PH7.5）からなる溶液10mlに
溶解し、フエノール−クロロホルムで抽出後、エ
タノール沈殿により回収した。得られたRAN約
１mgを10ｍＭトリス−HCl（PH8.0）および１ｍＭ
EDTAからなる溶液１mlに溶かした。65℃、
５分間インキユベートし、0.1mlの5M NaClを加
えた。混合物をオリゴ（dT）セルロース・カラ
ム〔ピー・エル・バイオケミカル（Ｐ−Ｌ
Biochemical）社製〕クロマトグラフイー（カラ
ム体積0.5ml）にかけた。吸着したポリ(A)を有す
るmRNAを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）および１
ｍＭ EDTAからなる溶液で溶出し、ポリ(A)を
有するmRNA約7μｇを得た。実施例２ cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入：オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）の方法〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジ
イ（Mol.Cell.Biol.）、２、161（1982）〕に従い、
cDNAの合成とそれを組み込んだ組換え体プラス
ミドの造成を行つた。その工程の概略を第１図に
示す。 pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ
（Okayama＆Berg）：モレキユラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.）、３、
280（1983）〕400μｇを10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）、６ｍＭ MgCl₂および10ｍＭ NaClから
なる溶液300μに加え、さらに500単位のKpnI
（宝酒造社製、以下特記しない限り制限酵素はす
べて宝酒造社製）を加えて、37℃、６時間反応さ
せ、プラスミド中のKpn部位で切断した。フエ
ノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿に
よりDNAを回収した。Kpn切断した該DNA約
200μｇを140ｍＭカコジル酸ナトリウム、30ｍＭ
トリス−Hcl（PH6.8）、１ｍＭ CoCl₂および0.1ｍ
Ｍジチオスレイトール（以下DTTと略記する）
からなる緩衝液（以下TdT緩衝液と略記する）
にdTTPを0.25ｍＭとなるよう加えた溶液200μ
に加え、さらに81単位のターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフエラーゼ（以下TdTと略
記する）（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）を加え
て、37℃、11分間反応させた。ここで、pCDV1
のKpn切断部位の3′末端にポリ（dT）鎖が約
67個付加された。該溶液からフエノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ（dT）
鎖の付加したpCDV1DNA約100μｇを回収した。
該DNAを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、６ｍＭ
MgCl₂、100ｍＭ NaClからなる緩衝液150μに
加え、さらに360単位のEcoRを加え、37℃２時
間反応させた。該反応物をLGT法で処理後、約
3.1KbのDNA断片を回収し、約60μｇのポリ
（dT）鎖付加pCDV1を得た。該DNAを10ｍＭト
リス−HCl（PH8.0）および１ｍＭ EDTAからな
る溶液500μに溶解し、65℃５分間インキユベ
ート後、氷冷して50μの5M NaClを加えた。混
合物をオリゴ（dA）セルロースカラム（コラボ
ラテイブリサーチ社製）クロマトグラフイーにか
けた。ポリ（dT）鎖長が充分なものはカラムに
吸着し、これを10ｍＭトリス−HCl（PH8.0）およ
び１ｍＭ EDTAからなる溶液で溶出し、ポリ
（dT）鎖の付加したpCDV1（以下ベクタープライ
マーと略記する）27μｇを得た。次にリンカーDNAの調製を行つた。 pL1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama＆
Berg）：モレキユラー・アンド・セルラー・バイ
オロジイ（Mol.Cell.Biol.）、３、280（1983）〕約
14μｇを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、６ｍＭ
MgCl₂および50ｍＭ NaClからなる緩衝液200μ
に加え、さらに50単位のPstを加え、37℃４
時間反応させ、pL1DNA中のPst部位で切断さ
せた。該反応物をフエノール−クロロホルム抽出
後、エタノール沈殿を行い、Pstで切断した
pL1DNA約13μｇを回収した。該DNA約13μｇを
TdT緩衝液に終濃度0.25ｍＭのdGTPを含む溶液
50μに加え、さらにTdT（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）54単位を加えて37℃13分間
インキユベートし、pL1のPst切断部位3′末端
に（dG）鎖を約14個付加した。フエノール−ク
ロロホルム抽出後エタノール沈殿にてDNAを回
収した。該DNAを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、
６ｍＭ MgCl₂および60ｍＭ NaClからなる緩
衝液100μに加え、さらに80単位のHindを加
えて37℃３時間インキユベートし、pL1DNAの
Hind電気泳動にて分画し、約0.5KbのDNA断
片をDEAペーバー法〔ドレツエン（Dretzen）
ら、アナリテイカル・バイオケミストリイ
（Anal.Biochem.）、112、295（1981）〕にて回収
し、オリゴ（dG）鎖付きのリンカーDNA（以下
単にリンカーDNAと略記する）を得た。上記で調製したポリ(A)RAN約2μｇ、ベクター
プライマー約1.4μｇを50ｍＭトリス−HCl（PH
8.3）、８ｍＭ MgCl₂、300ｍＭ KCl、0.3ｍＭ
DTT、２ｍＭ dNTP（dATP、dTTP、
dGTPおよびdCTP）および10単位のリボヌクレ
アーゼインヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製）からなる溶液22.3μに溶解し、10単位の逆
転写酵素（生化学工業社製）を加え、37℃40分間
インキユベートし、mRNAに相補的なDNAを合
成させた。該反応物をウエノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈殿を行い、RNA−DNA二重
鎖の付加したベクタープライマーDNAを回収し
た。該DNAを66μM dCTPおよび0.2μｇポリ(A)
を含むTdT緩衝液20μに溶かし、14単位のTdT
（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）を加えて37℃８分
間インキユベートし、cDNA3′末端に12個の
（dC）鎖を付加した。該反応物をフエノール−ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈殿により（dC）
鎖の付加したcDNA−ベクタープライマーDNA
を回収した。該DNAを10ｍＭトリス−HCl（PH
7.5）、６ｍＭ MgCl₂および60ｍＭ NaClから
なる液400μに溶かし、20単位のHindを加え、
37℃２時間インキユベートし、Hind部位で切
断した。該反応物をフエノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿して0.5pmoleの（dC）鎖付
加cDNA−ベクタープライマーDNAを得た。該
DNA0.08pmoleおよび前記のリンカー
DNA0.16pmoleを10ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、
0.1M NaClおよび１ｍＭ EDTAからなる溶液
40μに溶かし、65℃、42℃、０℃でそれぞれ10
分、25分、30分間インキユベートした。20ｍＭト
リス−HCl（PH7.5）、４ｍＭ MgCl₂、10ｍＭ
（NH₄）₂SO₄、0.1M KClおよび0.1ｍMβ−NAD
の組成で、全量400μとなるよう反応液を調製
した。該反応液に10単位の大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabs社製）を加え、11℃一
夜インキユベートした。該反応液を各40μMの
dNTP、0.15ｍＭ β−NADとなるよう成分を
追加調製し、５単位の大腸菌DNAリガーゼ、７
単位の大腸菌DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌ
Bio−chemicals社製）および２単位の大腸菌リ
ボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）
を加え、12℃、25℃で順次１時間ずつインキユベ
ートした。上記反応で、cDNAを含む組換え
DNAの環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部
分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換
えプラスミドが生成した。実施例３ウナギ成長ホルモンcDNAを含む組換えDNA
の選択：実施例２で得た組換えプラスミドを用い、大腸
菌c600SF株〔カメロン（Cameron）：プロシーデ
イング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
72、3416（1975）〕をScottらの方法〔重定勝哉：
細胞工学、２、616（1983）〕に従い形質転換した。
得られた約2400個のコロニーをニトロセルロース
上に固定した。ウナギ成長ホルモンのＮ末端から
27番目−32番目のアミノ酸配列に対応する合成
DNA、すなわち【表】（３番目の塩基はＡ、Ｔ、Ｇのいずれか６番目の塩基はＡまたはＧ、９番目の塩基はＴまたはＣ、 12番目の塩基はＴまたはＣ、 15番目の塩基はＡまたはＧであり、組み合わせて48通りの合成DNAの混合物とな
る。）【表】（３番目の塩基はＴまたはＣ、６番目の塩基はＡまたはＧ、９番目の塩基はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか、 12番目の塩基はＡまたはＧであり、組み合せて32通りの合成DNAの混合物とな
る。）とも会合が確認された。これらのプラスミドは
pEGH8、９、15と命名したが、いずれもウナギ
成長ホルモンのアミノ酸内列から予測される
DNA配列を有することから、ウナギ成長ホルモ
ンcDNAを含んでいるものと考えられた。実施例４プラスミドpEGH15の塩基配列：上記で得られたプラスミド３種につき、種々の
制限酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定
した。プラスミドpEGH15中のcDNA制限酵素地
図を第２図に示す。次に実施例３で行つた合成DNAプローブと強
い会合を示し、かつほぼ完全長のcDNAを含むと
考えられるpEGH15についてその翻訳領域の全ヌ
クレオチド配列をM13フアージを用いたサンガー
（Sanger）法〔サンガー（Sanger）ら：プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）、
USA、74、5463（1977）：アマーシヤム
（Amersham）社 M13クローニング・アンド・
シークエンシング・ハンドブツク（cloning and
sequncing handbook）〕に従つて決定した。ヌ
クレオチド配列を第一表に示す。第一表中、塩基
数１−57がシグナルペプチドを、58−627がウナ
ギ成長ホルモンの成熟ペプチドをコードする。
pEGH15に含まれるcDNA配列から予想されるア
ミノ酸配列は、天然のウナギ成長ホルモンから決
定されているアミノ酸配列の一部と完全に一致
し、該cDNAはウナギ成長ホルモン（GH−）
をコードしていることが確認された。【表】【表】 pEGH15を含む大腸菌は、Escherichia
coliEEGH15（FERM BP−824）として微工研に
昭和60年７月２日付で寄託してある。実施例５ウナギ成長ホルモン（GH−）をコードする
組換え体プラスミドpUPA1の造成：ウナギ成長ホルモンをコードするDNAを含む
プラスミドpEGH15 3μｇを10ｍＭトリス−HCl
（PH7.5）、７ｍＭ MgCl₂および100ｍＭ NaCl
を含む溶液（以下Ｙ−100緩衝液と略す）30μ
に溶かし、制限酵素Ban（東洋紡績社製）８単
位および制限酵素BamH（東洋紡績社製）８
単位を加え、37℃、２時間消化反応を行つた。該
反応液からLGT法により、pEGH15でコードさ
れる成熟ウナギ成長ホルモン翻訳領域、3′−非翻
訳領域およびベクター部分を含む約850bpの
DNA断片約0.1μｇを得た。別にpGLM1 2μｇを30μのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素Ban（東洋紡績社製）８単位
および制限酵素BamH８単位を加え、37℃、
２時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法
によりP_LプロモーターおよびcI857遺伝子を含む
約4.0KbのDNA断片約1μｇを得た。一方成熟ウナギ成長ホルモンをコードする
DNAの発現に必要な翻訳開始コドンATGを付加
し、さらにベクターDNAと上記DNAを連結する
目的で下記のDNAリンカーを合成した。【表】まず一本鎖DNA21merと15merを通常のトリ
エステル法〔アール・クレア（R.Crea）ら：プ
ロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.
Sci.）、USA、75、5765（1978）〕により合成した。
21merおよび15merの一本鎖DNA各々30pmoleを
50ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、10ｍＭ MgCl₂、
10ｍＭ DTTおよび１ｍＭ ATPを含む溶液
30μに溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造社製）３単位を加え、37℃、40分間リン
酸化反応を行つた。上記で得たpEGH15のBan−BamH断片
（約850bp）0.03pmole、pGLM1のBamH−
Ban断片（約4.0Kb）0.006pmoleを50ｍＭトリ
ス−HCl（PH7.5）、10ｍＭ MgCl₂、10ｍＭ
DTTおよび１ｍＭ ATPを含む溶液30μに溶
かし、これに上記の合成DNAリン酸化反応液1μ
を加えた。この混合液にT4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）３単位を加え、４℃、18時間結合反応
を行つた。該反応液を用いて大腸菌K294株を形
質転換し、Ap^Rのコロニーを得、このコロニーよ
りプラスミドDNAを回収し、第３図に示した
pUPA1を得た。pUPA1の構造は、EcoR、
Ban、Hind、Ban、Hpa、BamH、
Bgl、Pst、Xhoで切断して、アガロース
ゲル電気泳動にて確認した。実施例６ pUPA1を含む大腸菌によるウナギ成長ホルモ
ン（GH−）ペプチドの生産実施例５で得た組換え体プラスミドpUPA1を
用い常法により大腸菌C600株を形質転換した。
得られたAP^Rコロニを10mlのMCG培地〔0.6％
Na₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄、0.5％NaCl、0.1％
NH₄Cl、0.5％グルコース、0.5％カザミノ酸、１
ｍＭ MgSO₄、4μｇ／mlビタミンB₁、PH7.2〕に
接種し、30℃で７時間培養した。得られた培養液
を50mlのMCG培地に接種し、30℃で18時間培養
した。得られた培養液を１のMCG培地に接種
し、30℃で５時間培養後、42℃で２時間培養し、
さらに37℃で41時間培養した。得られた培養液を
8000rpm、10分間遠心して菌体を回収した。この
菌体をレムリ（Laemmli）のサンプルバツフア
ーに懸濁後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、ウエスタンブロツテイング〔トービ
ン（Towbin）ら：プロシーデイング・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci）、USA、75、4350（1979）〕
後、ペルオキシダーゼ染色法〔田部一史：細胞工
学、２、1061（1983）〕により、分子量約26000の
部位にポリペプチドバンドを検出した。このバン
ドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合
には存在しなかつた。この結果、pUPA1を保有
する大腸菌はウナギ成長ホルモンポリペプチドを
大量に生産していることがわかつた。 pUPA1を含む大腸菌は、Escherichia coli
EUPA1（FERM BP−825）として、微工研に昭
和60年７月２日付で寄託してある。実施例７実施例６に従つてウナギ成長ホルモン生産菌を
培養後、8000rpm、10分間遠心して集菌し、30ｍ
Ｍ NaClおよび30ｍＭトリス−HClを含む緩
衝液（PH7.5）で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝
液５mlに懸濁し、０℃で超音波破砕〔プランソ
ン・ソニツク・パワー・カンパニイ（Branson
Sonic Power Company）社、ソニフアイアー・
セル・デイスラプター（Sonifier cell
disruptor）200、アウトプツトコントロール
（output control）２、10分間処理〕した。これ
を15000rpm、30分間遠心して菌体残渣を得た。
この菌体残渣からマーストンらの方法〔エフ・エ
ー・オー・マーストン（F.A.O.Marston）ら：バ
イオテクノロジイ（Biotechnology）２、800
（1984）〕によりウナギ成長ホルモンポリペプチド
を抽出、精製、可溶化、再生を行い、以下の方法
でウナギ成長ホルモンポリペプチドの成長促進活
性を測定した。魚類成長ホルモン活性の測定ニジマスの稚魚（平均体重13ｇ）を一群15尾ず
つに分け、水温15℃の循環式タンクで飼育した。
餌は配合原料（ます4C、日本配合飼料社製）を
はじめの９日間は１日に体重の４％、その後は３
％を２回に分けて与えた。ウナギ成長ホルモンポ
リペプチドを少量の0.01N水酸化ナトリウム水溶
液で溶解後、0.9％塩化ナトリウム水溶液を加え
て1μｇ／5μとなるようにした。これを体重１
ｇあたり1μｇ腹腔内に注射した。対照群には0.9
％塩化ナトリウム水溶液のみを投与した。注射は
５日ごとに５回行い同時に体重を測定した。この
結果、本発明の成長ホルモンがニジマスの成長を
促進することが明らかになつた。実施例８ウナギ成長ホルモン（GH−）をコードする
組換え体プラスミドpUPJ24の造成 GH−をコードする組換え体プラスミドを以
下のように造成した。実施例５で得られたウナギ成長ホルモン（GH
−）をコードする組換え体プラスミドpUPA1
2μｇを30μのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵
素Ban（東洋紡績社製）６単位で37℃、２時間
消化反応を行つた。該反応液に、終濃度0.5ｍＭ
になるようにdATPおよびdTTPを加え、続いて
大腸菌DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）４単
位を加え、16℃、30分間反応を行つた。この反応
によりBan消化によつて生じた末端は、DNA
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によつ
てさらに１塩基削られた平坦末端に変わり、GH
−の４番目のle残基をコードするコドンが露
出する。フエノールおよびクロロホルム抽出とエ
タノール沈殿の後、DNA断片をＹ−100緩衝液
30μに溶解し、制限酵素Pst16単位で37℃、２
時間消化反応を行つた。該反応液から、LGT法
により、成熟ウナギ成長ホルモン翻訳領域、3′−
非翻訳領域、大腸菌リポプロテインターミネータ
ーを含む約2.5Kbの断片約0.5μｇを得た。一方、P_Lプロモーターおよびリボソーム結合
部位の下流に翻訳開始信号ATGおよびSph切
断部位を有するプラスミドベクターpPAC1
（pPAC1の造成については参考例１を参照）2μｇ
を30μのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素Sph
（ベーリンガー・マンハイム社製）６単位を加
え、37℃、２時間消化反応を行つた。該反応液に
終濃度0.5ｍＭになるようにdATP、dCTP、
dGTP、dTTPをそれぞれ加え、続いて大腸菌
DNAポリメラーゼ・Klenow断片（宝酒造社
製）４単位を加えて16℃、90分間反応を行つた。
この反応によりSph消化によつて生じた3′−突
出末端は、DNAポリメラーゼ・Klenow断片
の持つ3′→5′エキソヌクレアーゼ活性および5′−
3′修復合成活性により、削られて平担末端に変わ
り、翻訳開始信号ATGが末端に露出する。65℃、
20分間の熱処理によつて、DNAポリメラーゼ
・Klenow断片を失活させた後、制限酵素
Pst16単位を加え、37℃、２時間消化反応を行つ
た。該反応液から、LGT法により、ｃ857遺伝
子、P_Lプロモーター、翻訳開始信号ATGを含む
約2.2Kbの断片約0.5μｇを得た。このようにして得たこれらのDNA断片それぞ
れ0.2μｇずつを50ｍＭトリス−HCl（PH7.5）、10ｍ
Ｍ MgCl₂、10ｍＭ DTTおよび１ｍＭ ATP
を含む溶液30μに溶かし、T4DNAリガーゼ
（宝酒造社製）30単位を加え、４℃、16時間結合
反応を行つた。該反応液を用いて大腸菌K294株
を形質転換し、Ap^Rのコロニーを得、このコロニ
ーよりプラスミドDNAを回収し、第４図に示し
たpUPJ24を得た。pUPJ24の構造は、制限酵素
Pst、Ban、Nsi、Bgl、BamHで切断
して、アガロースゲル電気泳動にて確認した。ま
た、pUPJ24が翻訳開始信号ATGの後にGH−
の４番目のアミノ酸残基以降、すなわちGH−
をコードしていることは、M13フアージを用いた
サンガー（Sanger）法、〔サンガー（Sanger）
ら：プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・
アカデミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.）、USA、74、5463（1977）；アマーシ
ヤム（Amersham）社M13クローニング・アン
ド・シークエンシング・ハンドブツク（Cloning
and sequencing handbook）〕によつて確認し
た。実施例９ pUPJ24を含む大腸菌によるウナギ成長ホルモ
ン（GH−）ペプチドの生産実施例８で得た組換え体プラスミドpUPJ24を
用い常法により大腸菌K294株を形質転換した。
得られたAp^Rコロニーを５mlのMCG培地に接種
し、30℃で16時間培養した。得られた培養液のう
ち100μを５mlのMCG培地に接種し、30℃で２
時間培養後、42℃で２時間培養した。得られた培
養液を8000rpm、10分間遠心して菌体を回収し
た。この菌体をレムリ（Laemmli）のサンプル
バツフアーに懸濁後、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行い、クマジ−ブリリアントブル
ーにて染色して、分子量約25000の部位にポリペ
プチドバンドを検出した。このバンドは該プラス
ミドを含まない大腸菌を用いた場合には存在しな
かつた。また同様に、回収した菌体をレムリ
（Laemmli）のサンプルバツフアーに懸濁後、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
ウエスタンブロツテイング〔トービン
（Towbin）ら；プロシーデイング・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA76、4350（1979）〕
後、ペルオキシダーゼ染色法〔田部一史：細胞工
学、２、1061、（1983）〕により、やはり分子量約
25000の部位にポリペプチドバンドを検出した。
このバンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用
いた場合には存在しなかつた。この結果、
pUPJ24を保有する大腸菌はウナギ成長ホルモン
ポリペプチドを大量に生産していることがわかつ
た。参考例１ P_Lプロモーターおよびリボソーム結合部位の
下流に翻訳開始信号ATGおよびSph切断部
位を有するプラスミドベクターpPAC1の造
成：本発明に述べるウナギ成長ホルモン（GH−
）をコードする組換え体プラスミドを造成する
ためにpPAC1を造成した。 trpプロモーターおよびリボソーム結合部位の
下流に翻訳開始信号ATGおよびSph切断部位
を有するプラスミドベクターpTrS3（特開昭59−
67297）2μｇを30μのＹ−100緩衝液に溶かし、
制限酵素Ban（東洋紡績社製）４単位および制
限酵素Pst４単位を加え、37℃、２時間消化反
応を行つた。該反応液からLGT法により翻訳開
始信号ATGおよびSph切断部位を含む約2.9Kb
のDNA断片約1μｇを得た。一方、pGLM1 2μｇを30μのＹ−100緩衝液
に溶かし、制限酵素Ban（東洋紡績社製）４単
位および制限酵素Pst４単位を加え、37℃、２
時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法に
よりP_Lプロモーターおよびｃ857遺伝子を含む
約4.0KbのDNA断片約1μｇを得た。これらの
DNA断片それぞれ0.1μｇずつを50ｍＭトリス−
HCl（PH7.5）、10ｍＭ MgCl₂、10ｍＭ DTTお
よび１ｍＭ ATPを含む溶液30μに溶かし、
T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）30単位を加え、
４℃、16時間結合反応を行つた。該反応液を用い
て大腸菌K294株を形質転換し、Ap^Rのコロニー
を得、このコロニーよりプラスミドDNAを回収
し、第５図に示したpPAC1を得た。pPAC1の構
造はPst、Sph、Ban、Salで切断して、
アガロースゲル電気泳動にて確認した。発明の効果本発明によれば、ウナギの成長ホルモンポリペ
プチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体
DNA、該組換え体DNAを含む細菌が得られ、こ
れらはウナギの成長ホルモンポリペプチドの大量
生産に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図１および２はオカヤマ・バーグ法による
cDNA合成と該DNAを含む組換え体プラスミド
の造成過程の概略を示す。第２図はpEGH15に含
まれるウナギ成長ホルモンをコードするcDNAの
制限酵素地図を示す。第３図は組換え体プラスミ
ドpUPA1の造成過程を示す。第４図は組換え体
プラスミドpUPJ24の造成過程を示す。第５図は
組換え体プラスミドpPAC1の造成過程を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記式に示された魚類の成長ホルモンポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードするDNA。【表】２下記式に示された魚類の成長ホルモンポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードするDNAを組み
込んだ組換え体DNA。【表】３プラスミドpEGH15と名づけた特許請求の範
囲第２項の組換え体DNA。４下記式に示された魚類の成長ホルモンポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードするDNAを組み
込んだ組換え体DNAを含む細菌。【表】５該細菌がエツシエリヒア・コリに属する特許
請求の範囲第４項の細菌。