DK156072B - Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted - Google Patents
Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted Download PDFInfo
- Publication number
- DK156072B DK156072B DK152585A DK152585A DK156072B DK 156072 B DK156072 B DK 156072B DK 152585 A DK152585 A DK 152585A DK 152585 A DK152585 A DK 152585A DK 156072 B DK156072 B DK 156072B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- sequence
- hgh
- dna sequence
- binding site
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010013127 Met-human growth hormone Proteins 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(azetidin-3-yloxy)-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(OC2CNC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
i
DK 156072 B
Den foreliggende opfindelse angår en syntetisk DNA-sekvens, indeholdende et ribosombindingssted. DNA-sekven-sen er bestemt til indsætning i et plasmid eller et andet replicerbart kloningsmedium, der koder for et 5 ønsket polypeptid, såsom insulin eller humant væksthormon , hGH.
Ved biosyntetiske metoder til fremstilling af ønskede polypeptider eller proteiner er det kendt at anvende mikroorganismer, som er transformeret med et plasmid 10 eller en lignende udtrykkelsesvektor, der koder for det ønskede polypeptid eller protein, således at mikroorganismen ved dyrkning på et egnet substrat producerer det ønskede polypeptid eller protein, der så kan isoleres fra fermenteringsvæsken på i og for sig kendt måde.
15 En til dette formål velegnet mikroorganisme er E. coli.
Plasmidet eller en lignende udtrykkelsesvektor kan være fremstillet syntetisk eller semisyntetisk, f.eks. ud fra et i den pågældende mikroorganisme funktionsdygtigt plasmid, der spaltes enzymatisk, hvorefter den DNA-sekvens, 20 som koder for det ønskede polypeptid, indsættes i plasmidet ved kendt rekombinant-teknik.
Et funktionsdygtigt plasmid skal, udover den for det ønskede polypeptid kodende DNA-sekvens, også indeholde et promotor-område, hvortil RNA-polymerasen kan hæfte 25 sig og starte transkriptionen af den kodende DNA-sekvens til dannelse af mRNA, der ved translation på ribosomerne oversættes til det ønskede polypeptid.
Promotor-området er efterfulgt af et ribosombindingssted, der ofte betegnes en Shine-Dalgarno-region, hvori der 30 indgår en SD-sekvens, som hensigtsmæssigt kan omfatte nucleotidsekvensen AGGA.
For at muliggøre dannelsen af plasmidet ved kendt rekom- 2
DK 156072 B
binant-teknik bør der i promotor-området findes restriktionsenzymsspaltningssteder, som tillader enzymatisk spaltning og indsætning af de aktuelle DNA-sekvenser.
Endvidere er det almindelig praksis at indsætte et gen, 5 som gør mikroorganismen resistent overfor et specifikt antibiotikum. Eksempler herpå er ampicillin-resistente eller streptomycin-resistente gener. Ved hjælp af de pågældende antibiotiske stoffer kan de resistente, transformerede mikroorganismer isoleres fra ikke-transformere-10 de mikroorganismer.
For at opnå høj ydelse eller produktion af det ønskede protein er det vigtigt, at følgende betingelser er opfyldt: 1. Polymerase-bindingsstedet i promotoren skal have 15 en struktur, som favoriserer en optimal binding af RNA-polymerasen,, 2. Ribosombindingsstedet skal have en optimal struktur, således at der kan dannes komplementært mRNA, der effektivt hæfter sig til ribosomet.
20 Den foreliggende opfindelse har til formål at tilveje bringe en DNA-sekvens, der ved indsætning i et replicer-bart kloningsmedium koder for et ribosombindingssted, der sikrer en god binding af mRNA'en til ribosomet og dermed en effektiv translation til opnåelse af det ønskede 25 protein.
Endvidere har opfindelsen til formål at give ribosombindingsstedet i plasmider eller andre transfer-vektorer, der benyttes til udtrykkelse af det ønskede protein, en sådan ændret sammensætning, at udbyttet ved transla-30 tionen optimeres.
Der er tidligere foretaget undersøgelser over DNA-struktu- 3
DK 156072 B
ren i ribosombindingsstedet i forskellige mikroorganismer (Nucleic Acids Res. (1982) Π), 6319-6329), og virkningen på translationseffekten ved forskellige ændringer af strukturen er bestemt.
5 Ribosombindingsstedet omfatter en SD-sekvens, der ofte er sammensat af nucleotiderne AGGA. Mellem denne sekvens og startkodonen ATG, der koder for methionin, findes et antal nucleotider eller et "spacer"-område, hvis sammensætning og størrelse har betydning for effektivi- 10 teten af translationen.
Den foreliggende opfindelse er udviklet i forbindelse med en undersøgelse over betydningen af dette spacer-områdes sammensætning og størrelse. Det har således ifølge opfindelsen overraskende vist sig, at der opnås 15 optimal translation, hvis spacer-områdét mellem SD-sek- vensen og startkodonen indeholder 5-10 af nucleotiderne A eller T, deraf mindst 3 af nucleotidet A.
DNA-sekvensen ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at tstrengen omfatter en nucleo-20 tidsekvens med formlen: TAAGGAGGTX-, Xn . . . X (CG) ATG - 12 n p- hvor hvert X er A eller T, idet mindst tre af disse er A, n er 5-10, og p er 0 eller 1.
Fra EPO publikation nr. 0 134 673 kendes en plasmid-vektor 25 med en Shine-Dalgarno-sekvens, som kan have formlen CTAGGAGGT, med efterfølgende spacer-område, hvori der indgår et antal af nucleotiderne A, T, G og C. Efter de erfaringer, som ligger til grund for den foreliggende opfindelse, opnås dog optimalt udbytte såfremt spacerområ-30 det har den i krav 1 angivne sammensætning.
DK 156072 B
4
Ifølge foretrukne udførelsesformer for opfindelsen har den omhandlede DNA-sekvens en sammensætning, som angivet i kravene 2 eller 3f hvorved der opnås optimal translationshastighed og udbytte.
5 En sådan effekt har ikke kunnet forudses på basis af tidligere undersøgelser, såsom den ovenfor citerede rapport i Nucleic Acids. Res. (1982) eller det nævnte EPO-patentskrift.
Den hidtil ukendte DNA-sekvens ifølge opfindelsen lader 10 sig sammen med det gen, der skal udtrykkes, ved i og for sig kendt rekombinant-teknik indsætte i de sædvanlige replicerbare kloningsmedier, såsom et plasmid, der på kendt måde kan overføres til en mikroorganisme, som ved dyrkning på et substrat producerer det ønskede protein.
15 Den omhandlede DNA-sekvens kan benyttes i forbindelse med et vilkårligt replicerbart kloningsmedium, uanset hvilket protein man ønsker at fremstille. Således kan sekvensen benyttes i forbindelse med plasmider, som koder for insulin, humant væksthormon, interferon eller 20 ethvert andet ønsket polypeptid eller protein, og i alle tilfælde opnås overraskende en forøgelse af Udbyttet ved fremstillingen af disse proteiner.
Det er uden betydning for ribosombindingsstedets effektivitet, hvilken sammensætning det replicerbare klonings-25 medium iøvrigt har. Hvis man ønsker at indsætte et antibiotikum-resistent gen i kloningsmediet, kan arten heraf således vælges frit til opnåelse af en effektiv adskillelse af den transformerede mikroorganisme fra ikke-transfor-merede celler.
30 Sammensætningen af promotoren vælges under hensyn til opnåelse af optimal transkription. Eksempler på egnede promotorer er følgende DNA-sekvenser: 5
DK 156072B
BamHI SacI
A) GGATCCTGTTGACAATTAATCATAGAGCTCGTATAATGTG
EcorI
GAATTCTGCAGATCTAACAATTAAGCTT Bglll Hindlll
EcorI SacI
B) CGAATTCGATCCTGTTGACAATTAATCATAGAGCTCGTATAATGTGGAATTGTG-
Bglll Hindlll
CAGATCTAACAATTAAGCTT
5 I disse og efterfølgende formler er kun +strengen vist, med mindre andet er angivet.
Opfindelsen skal i det følgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler.
EKSEMPEL 1: Sammenligning af SD-sekvensen AGGA og 10 SD-sekvensen TAAGGAGGT
Et plasmid, der udtrykker Met-hGH under styring af en syntetisk promotor, blev konstrueret som beskrevet i det efterfølgende.
Et fragment indeholdende Met-hGH-kodesekvensen og trans-15 lationsstopsignalet samt 2 baser 5' for og 6 utransla-terede baser 3' for hGH-sekvensen blev skåret ud af plasmidet pHD59-10 med restriktionsenzymerne Cla I/Sma I og isoleret ved gelelektroforese.
Der blev konstrueret et syntetisk DNA-fragment, bl.a.
20 indeholdende EcoRI-center, RNA-polymerasebindingscenter, ribosom-bindingscenter og Cla I center.
Denne promotor SP3 har nucleotidsekvensen:
CGAATTCGATCCTGTTGACAATTAATCATAGAGCTCGTA TAATGTGGAATTGTGCAGATCTAACAATTAAGCTT 25 AGGATCTAGAAATCGAT
6
DK 156072B
Fra litteraturen er det kendt, at en transkriptions-terminator indsat efter translationsstopsignalet i det gen, der ønskes'udtrykt, er en fordel, da terminatoren ved at stoppe transkriptionen vil forhindre aflæsning 5 af og dermed forstyrrelse fra andre gener, reguleringsområder og startområdet for DNA-replikation. En sådan terminator kan f.eks. være terminatoren fra fagen fd (R. Gentz et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78,
No. 8, pp. 4936-4940, 1981).
10 Et ca. 375 bp HindiIl-fragment indeholdende fd-termina-toren blev isoleret og gjort stumpendet ved hjælp af Klenow-polymerase +dNTP. Fragmentet blev derefter skåret med restriktionsenzymet BamHI, og et ca. 365 bp fragment med stump 5'-ende og et BamHI-overhæng i 3'-enden blev 15 isoleret.
Ovennævnte tre isolerede fragmenter blev derefter ligeret ind i plasmidet pATl53, der var skåret med EcoRI/BamHI. Herved blev hGH-produktionen underlagt den syntetiske promotor. Det således konstruerede plasmid blev betegnet 20 pHD67SP3.
Ligeringsblandingen blev på kendt måde transformeret ind i E. coli MC1061. Klonen pHD6711SP3 blev udvalgt og opdyrket i 10 ml LB-medium tilsat ampicillin. Efter 8 timers vækst blev cellerne indhøstet, lyseret ved 25 ultralydbehandling og analyseret for indhold af hGH- immunoreagerende peptider ved hjælp af ELISA (B. Dinesen og H. Dalbøge Andersen: Analytica Chimica Acta, 163 (1984)) 119-125) og RIA.
En sammenligning af RIA- og ELISA-resultaterne mellem 30 hypofysært hGH, Nanormon og det ved dyrkning af HD67-11 SP3 fremstillede Met-hGH viste, at de fortyndede parallelt. På cellelysat fra HD6711SP3 blev der udført HPLC, dels som rent cellelysat, og dels som cellelysat iblandet 7
DK 15607 2 B
Nanormon'-/, I begge tilfælde fremkom en top karakteristisk for hGH. De første 15 aminosyrer blev efter oprensning af produktet bestemt ved automatisk Edman-degradation (P. Edman og G. Begg: Eur. J. Biochem. ir 1967, side 5 80-91) og fundet at være identiske med aminosyresekvensen for Met-hGH.
Den biologiske aktivitet af det fremstillede bakterielle Met-hGH blev undersøgt ved tibia test og fundet at svare til aktiviteten af Nanormon®.
10 For at undersøge effekten af en ændret SD-sekvens blev plasmidet pHD6711SP3 skåret med restriktionsenzymerne HindIII/Cla I, hvorved dets oprindelige SD-område kunne fjernes. I stedet blev nu indsat et syntetisk DNA fragment med følgende sekvens:
15 AGCTTAAGGAGGTTAAAAT
ATTCCTCCAATTTTAGC
til opnåelse af plasmidet pHD6711SP14.
Det opnåede plasmid blev på kendt måde transformeret ind i E. coli MC1061. Klonen pHD6711SP14-l blev udvalgt og opdyrket i 10 ml LB-medie tilsat ampicillin. Efter 20 8 timers vækst blev cellerne indhøstet, lyseret ved ultralydbehandling og analyseret som beskrevet for HD6711SP3.
Ekspressionsniveauerne for HD6711SP3 og HD6711SP14-1 blev målt, tabel I, og fundet at være ca. 10 gange højere 25 for HD6711SP14 sammenlignet med HD6711SP3.
TABEL I
Promotor SD-ATG Sekvens_mg hGH/Ι ODl SP3 11 AGCTTAGGATCTAGAAATCGATG 0,8 SP14-1 11 AGCTTAAGGAGGTTAAAATCGATG 10 8
DK 156072B
Promotor-Shine-Dalgarno-områderne blev som kontrol bestemt ved DNA sekvensanalyse.
EKSEMPEL 2; Undersøgelse af SD-ATG afstandens indflydelse på ekspressionen af Met-hGH
5 Plasmidet pHD6711SP14 blev benyttet som udgangsmateriale i en undersøgelse af, hvad der er den optimale afstand mellem AGGA og ATG, idet SD-området blev ændret ved indsættelse af syntetiske DNA-fragmenter med forskellig længde, se tabel II, men således at SD-sekvensen TAAGGAGGT 10 forblev uændret. Plasmidet HD6711SP14 blev skåret med restriktionsenzymerne HindIII/Cla I, hvorefter plasmid-fragmentet blev oprenset på gel.
Syv syntetiske DNA-fragmenter ifølge opfindelsen og fem fragmenter, som ikke omfattes af opfindelsen, men 15 er medtaget som sammenligningseksempler, blev som vist i tabel II herefter ligeret ind i plasmidet til opnåelse af de viste konstruktioner.
Efter transformation ind i E. coli MC1061 og udvælgelse af klonerne, blev disse opdyrket i LB tilsat ampicillin.
20 Efter 16 timers vækst blev cellerne høstet, lyseret ved ultralydbehandling og analyseret for indhold af hGH ved hjælp af ELISA. Som det ses af Tabel II og fig.
1 opnås den største ekspression af Met-hGH, når SD-ATG afstanden er mellem 10 og 12 baser, og når der er mindst 25 tre A-baser.
Alle konstruktionerne blev DNA sekvensbestemt og fundet at være som forventet.
9
DK 156072 B
iH
o o V£>
P
0
iH
r-ι oomoomcNc\ir"C\icoco^DO
I 1 *·,*.**,·**.*·*·***
Xtfl Or—IOOOOOOOOOO
κ fti +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 > Λ ιΗνοΓ^οοΓοσιοισ'ιΐη^η'^' g
tro hinior'^^^«3is^'iO
S
i-I
o o «5
Q -P
0 tn
X
x! æ >
rH rH
1 0) o
rH-Η lO IC Kl ».OJOOt^'VDCNr^'i’CN
4J »·.**»«. rH
XG O O O i—IOOOOOOO
KG +|+| +| +l +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 η CJ 0 vo ΓΊ ^θ(σΐιΗσι··ηοοιησιΐηπΗη
jxj O
-, θΐ(ϋ ιηιΟ'ίΗ'ΦίοιηηοιοίΓΊΟ w e m
C
11 i i i i SI IIII a , 11 li 11 lu HHH^rlnrlbrnnn SSScjubocDQcjcjø . gillllllllll s § ggggsgggssss ® I g i 8 i i i i i i i i i | x 0) tn 0 21 ^ *3
«C H
1 13, q ηοΐιΗΓΗΟοσισισιίΧ)'^'«? &i
Ui i—I i—I i—I i—I rH i—I Ή
tH
G
0) O t^· <->*** * 1 +J O.H N Η * N >i IC ti o ldhi^ldi i i—i i i i i 'tn g I Ι-ςΤρΗΐνΟΟίηΟιΗ!^·
O VØ LO rH 1—4 00 i—I ΟΊ 0*1 rH rH i—I rH
G KCLiPPPAPPPPPP " cu cncocncocncowwcowww ** 10
DK 156072B
EKSEMPEL 3; Ekspression af MAE-hGH, MAEAE-hGH og MAEE-hGH
For at undersøge, om promotorerne også kunne benyttes til ekspression af andre gener end Met-hGH, blev generne for met-ala-glu-hGH, met-ala-glu-ala-glu-hGH og met-5 ala-glu-glu-hGH ved brug af kendte DNA teknologiske metoder indført i et plasmid indeholdende promotoren SP14.
Efter transformation af plasmiderne ind i E. coli MC1061 blev klonerne dyrket og lyseret som beskrevet i eksempel 10 2, og hGH produktionen blev målt ved ELISA. De fundne udbytter er angivet i tabel III.
TABEL III
Klon_mg hGH/Ι ODI
MAE-hGH 10 15 MAEAE-hGH 8 MAEE-hGH 8,5 EKSEMPEL 4:
Den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde blev gentaget med den ændring , at der benyttedes kloner med en sammen-20 sætning svarende til de i efterfølgende tabel IV viste sekvenser.
Det fremgår af disse forsøg, at der opnås gode resultater, når spacer-området omfatter 5-10 af nucleotidet A, samt at udbytterne i det væsentlige er uafhængige 25 af, om der yderligere er en sekvens CG til stede.
DK 156072 B
11
rH
o o vo
Q
0
K
i—I
rH
i-H'tfCOC'OCT>rHOLnr''inrH
X -P
cn cMOCMCMiHcnoocMmcM
0 "fB +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 fj ^
CM’^O'^O'^r—I CO LO rH CD
gO rr-cor,~r‘'['~oocoinr'-cocD
i—I
o o co
Q
0 +>
CO
X X
æ rH >
1 rH
i—I 0) •H no^rn^LDCN^o^^m
tø _P
C Οι—IOOOOOOOOO
ø G +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 -C o O, i—loor^CMoococo’^corHco
tn X
g m οηΓθ(ΝηίΝηηη·^Γ«^ιΗ >
H
w
" g u o g o «i i I I I I
ti g 1 g I °o 8 8 8 S
r-ι ch oo r· ci> in rH jb ^r- Fj
Eh EhE-iEhEhEhEhEhEhEh Eh S8SSS8||||| I i i I i i i i i 1 I i g
Cli
S
CD
CO
ø X
En < “ 1 S’
q noorHoo^oom^rmcNcn G
0 iH iH rH rH i—1 i—I i—I i—I Ή
G
Claims (3)
1. Syntetisk DNA-sekvens, indeholdende et ribosombindingssted med SD-sekvensen AGGA og startkodonen ATG, kendetegnet ved, at tstrengen omfatter en 5 nucleotidsekvens med formlen: TAAGGAGGTX,...X (CG) ATG - 1 Z n p- hvor hvert X er A eller T, idét mindst tre af disse er A, n er 5-10, og p er 0 eller 1.
2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at tstrengen omfatter en nucleotidsekvens med form len: TAAGGAGGTAAAAAAAAATG
3. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tstrengen omfatter en nucleotidsekvens med form- 15 len: TÅÅGGAGGTTAAAATCGATG
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK152585A DK156072C (da) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
| DE86902346T DE3688816T2 (de) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | Dns-sequenz. |
| EP86902346A EP0218652B1 (en) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | A dna sequence |
| AU56976/86A AU5697686A (en) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | A dna sequence |
| PCT/DK1986/000030 WO1986005805A1 (en) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | A dna sequence |
| JP61502186A JP2545377B2 (ja) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | Ｄｎａ配列体 |
| AT86902346T ATE92529T1 (de) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | Dns-sequenz. |
| US07/470,396 US5017493A (en) | 1985-04-03 | 1990-01-25 | DNA sequence |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK152585A DK156072C (da) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
| DK152585 | 1985-04-03 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK152585D0 DK152585D0 (da) | 1985-04-03 |
| DK152585A DK152585A (da) | 1986-10-04 |
| DK156072B true DK156072B (da) | 1989-06-19 |
| DK156072C DK156072C (da) | 1989-11-06 |
Family
ID=8105738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK152585A DK156072C (da) | 1985-04-03 | 1985-04-03 | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5017493A (da) |
| EP (1) | EP0218652B1 (da) |
| JP (1) | JP2545377B2 (da) |
| AT (1) | ATE92529T1 (da) |
| AU (1) | AU5697686A (da) |
| DE (1) | DE3688816T2 (da) |
| DK (1) | DK156072C (da) |
| WO (1) | WO1986005805A1 (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK156072C (da) * | 1985-04-03 | 1989-11-06 | Nordisk Gentofte | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| CA1307482C (en) * | 1987-11-09 | 1992-09-15 | Ronald G. Schoner | Vectors and expression sequences for production of polypeptides |
| US6593120B1 (en) * | 1994-04-01 | 2003-07-15 | Gen-Probe Incorporated | Recombinant DNA encoding a reverse transcriptase derived from moloney murine leukemia virus |
| AUPN283195A0 (en) * | 1995-05-05 | 1995-06-01 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for the detection of viable cryptosporidium parvum cells |
| JP6640226B2 (ja) * | 2014-12-29 | 2020-02-05 | アグリカルチュラル テクノロジー リサーチ インスティテュート | 発現エレメント、発現カセット、及びそれらを含むベクター |
| CN116200416B (zh) * | 2023-02-15 | 2024-03-12 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种基于Tac启动子的质粒表达载体构建及其用途 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58110600A (ja) * | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| JP2551746B2 (ja) * | 1983-07-19 | 1996-11-06 | サントリー株式会社 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| JPS6068217A (ja) * | 1983-09-13 | 1985-04-18 | 日本たばこ産業株式会社 | 包装容器形成のための包装紙の受取、折込み装置 |
| DK156072C (da) * | 1985-04-03 | 1989-11-06 | Nordisk Gentofte | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
-
1985
- 1985-04-03 DK DK152585A patent/DK156072C/da not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-04-03 AU AU56976/86A patent/AU5697686A/en not_active Abandoned
- 1986-04-03 WO PCT/DK1986/000030 patent/WO1986005805A1/en active IP Right Grant
- 1986-04-03 AT AT86902346T patent/ATE92529T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-04-03 DE DE86902346T patent/DE3688816T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-04-03 EP EP86902346A patent/EP0218652B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-03 JP JP61502186A patent/JP2545377B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-01-25 US US07/470,396 patent/US5017493A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2545377B2 (ja) | 1996-10-16 |
| DK152585A (da) | 1986-10-04 |
| WO1986005805A1 (en) | 1986-10-09 |
| EP0218652B1 (en) | 1993-08-04 |
| EP0218652A1 (en) | 1987-04-22 |
| JPS62502656A (ja) | 1987-10-15 |
| US5017493A (en) | 1991-05-21 |
| AU5697686A (en) | 1986-10-23 |
| DE3688816D1 (de) | 1993-09-09 |
| DK152585D0 (da) | 1985-04-03 |
| DE3688816T2 (de) | 1993-11-18 |
| DK156072C (da) | 1989-11-06 |
| ATE92529T1 (de) | 1993-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2766781B2 (ja) | ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 | |
| IE53311B1 (en) | Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence | |
| PT871718E (pt) | Produção de carboxipeptidase b recombinante, activa sob o ponto de vista enzimático. | |
| PT97081B (pt) | Processo para a preparacao de vectores bacterianos | |
| JPH0687788B2 (ja) | システイン残基を含有する生理活性ペプチドの製造方法 | |
| US20080233614A1 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
| Patil et al. | Cloning, nucleotide sequence, overexpression, and inactivation of the Escherichia coli 2-keto-4-hydroxyglutarate aldolase gene | |
| WO2007049829A1 (en) | Method for preparing soluble and active recombinant proteins using pdi as a fusion partner | |
| DK156072B (da) | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| CA1339464C (en) | ¬leu13| motilin, dnas coding for same and methods for producing same | |
| CA2000309A1 (en) | Recombinant pdgf and methods for production | |
| FI93125C (fi) | Kasvuhormonia vapauttavan tekijän sekvenssin sisältävien hybridipolypeptidien ilmentäminen E. colissa | |
| Field et al. | Cloning, sequencing, and demonstration of polymorphism in trypanothione reductase from Crithidia fasciculata | |
| EP0218651B1 (en) | A dna sequence | |
| KR900001014B1 (ko) | 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 | |
| EP0134673B1 (en) | Improved plasmid vector and use thereof | |
| TWI283246B (en) | Removal of N-terminal methionine from proteins by engineered methionine aminopeptidase | |
| JPS6034915A (ja) | ポリペプチド | |
| EP0361956A2 (en) | Increased expression of small molecular weight recombinant proteins | |
| US5420113A (en) | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| Tojo et al. | Production of human protein disulfide isomerase by Bacillus brevis | |
| NO851308L (no) | Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid | |
| KR101970471B1 (ko) | Ｃｔｘ 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주 | |
| JPH08103278A (ja) | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |