KR920003665B1

KR920003665B1 - 합성유전자에 의한 대장균으로부터 소성장호르몬의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR920003665B1
Application number: KR1019860011712A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 이태규; 이용범; 정현호; 이태호; 박영우; 한규범
Original assignee: 주식회사 럭키; 허신구
Priority date: 1986-12-31
Filing date: 1986-12-31
Publication date: 1992-05-06
Also published as: KR880007725A

Abstract

내용 없음.

Description

합성유전자에 의한 대장균으로부터 소성장호르몬의 대량 생산방법

제 1 도는 전체 소성장호르몬유전자에 해당되는 27종류의 합성 올리고 뉴클리오티드의 염기순서를 5'말단에서 3'말단순서로 나타낸 것이며,

제 2 도는 제 1 도의 올리고 뉴클리오티드의 접합전략을 도시한 것이고,

제 3 도는 합성된 올리고 뉴클리오티드의 접합을 위해 대장균 운반체로의 전체 소성장호르몬 유전자 재조합과정을 나타낸 것이고,

제 4 도는 확인된 소성장호르몬의 염기배열순서 및 아미노산 순서를 나타낸 것이고,

제 5 도는 재조합된 전체 소성장호르몬유전자를 대장균 발현 운반체로 재조합시키는 과정을 나타낸 것이고,

제 6 도는 대장균내에서 대량 생산된 소생장 호르몬을 SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동방법 및 웨스틴블라팅으로 확인한 결과이다.

본 발명은 합성유전자에 의한 대장균으로부터 소성장호르몬을 대량제조하는 방법에 관한 것으로서 소성장 촉진, 우유분비증가 및 사료효율을 높이는데 사용된다.

현재 주로 사용되고 있는 동물성장 촉진제들은 스테로이드(steroid)계통 제품들(예, Estradiol-Compudose by EliLililly, Estradiol Benzoate-Synovax by Syntax Agribusiness Inc., Zeramol-Ralgro by International minerals and Chemicals)로서, 이들은 지용성(Fat-soluble)물질들로서 사용후 체내에 잔류하게되어, 인체에 영향을 미치는 것이 밝혀져, 미국을 위시한 선진각국에서는 사용을 금지시키고 있다.

한편, 동물의 뇌하수체에서 생산분비되는 성장호르몬은 불지용성이며, 종특이성(Species-Specific)을 나타내므로 동물에 사용시 성장촉진, 젖소 우유분비증가 및 사료 효율을 높이는데 영향이 있음이 밝혀지고 있다(참고문헌 : Bauman, D.E.et al., Journal of Animal Sciences 60, 583, 1985 ; Hart, I.C.et al., Journal of Endocrinology 105, 189, 1985 ; Newswatch, Jun 17, 1985 ; Wall Street Journal, July, 22, 1986) 그러나, 1940년 이래 근래까지 이러한 연구는 직접 동물의 뇌하수체에서 추출, 정제하여 사용하였기 때문에, 그 양이 크게 제한을 받아, 직접 가축업에 응용할 수 없었으나, 유전공학 기술의 발달로 이러한 동물성장 호르몬을 대장균에서 대량생산할 수 있게 되었다.

본 발명자들은 소성장호르몬을 대장균에서 값싸게 대량생산하여, 가축업에 사용함을 그 목적으로 한다.

따라서, 본 발명자들은 대장균을 발현체로 이용함으로서 소성장호르몬을 대량 생산할 수 있음을 알게되어 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본발명은 소성장호르몬의 cDNA 유전자 염기 배열순서에 따라 Sac I, Pst I 및 Sa II의 인지부위가 존재하는 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 집합전략에 따라 집합시켜 대장균 운반체에 클로닝하여 소성장호르몬 유전자를 제조한 다음, 이 유전자를 인공합성링커와 함께 대장균 운반체에 클로닝하여 인공합성 링커가 접합된 소성장호르몬 전체 유전자를 제조하여 이를 연어성장호르몬이 발현될 수 있는 Trp프로모터를 지닌 대장균 발현 운반체에 재클로닝시킨 최종 발현 운반체를 대장균 내에서 발현시킴을 특징으로 하는 소 성장호르몬의 제조방법으로서, 상기 인공합성링커는 시작코돈 ATG 앞에 종료코돈 TAA와 독자적인 SD 순서로 되어있어 SD순서와 시작코돈 ATG 사이에서 m-RNA 2차 구조가 생기지 않도록 된 것으로서, 이는 윗가닥 73mer(5'-CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT-3')과 아랫가닥 65mer(3'-CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC-5')로 구성되었으며, 상기 인공합성링커가 접합된 소성장호르몬 유전자는 526 염기쌍으로 된소성장호르몬 유전자의 Sac I -Sal I 절편을 인공링커와 함께 제한효소 Nco I와 Sal I으로 처리한 운반체 pSOD[Hallewell, R.A.et al., Nucleic Acid Res, 13, 2017(1985)]에 클로닝 시켜서 제조된 것이며, 상기 최종 대장균 발현운반체는 상기 운반체(pSOD BGH)를 Nco I, Sal I 으로 처리하여 인공합성링커가 접합된 소성장 호르몬 유전자를 분리한 후 이를 XbaI, Sal I 으로 처리하여 연어 성장호르몬유전자의 일부가 제거된 대장균 발현운반체 {ptrp 322 H SGH[Pharmacia Picataway, N.J.08854, U.S.A.Russel, D.R. ＆ Bennet, G.N.Gene, 20,231(1981) pDR 720(Cat, 27-4930-01)]}에 재클로닝시킨 운반체(Ptrphs BGH 1-13)이며, 상기 대장균에서의 발현은 연어성장호르몬유전자 앞부분의 SD배열과 시작 코돈(ATG)을 이용한 것으로서 시작코돈에서 37bp 까지의 연어 성장호르몬유전자에 인공합성링커가 접합된 소성장호르몬유전자를 연결시켜 행함을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 지금가지 보고된 소성장호르몬의 cDNA를 바탕으로 [Mills W.L.et al(1980) J.Biol. Chem .255,7521] 본 발명자는 대장균과 효모에서 주로 쓰이는 코돈(Codon)을 선택하고 또한 유전자 내에 제한효소 Sac I 과 Pst I 부위가 생기도록 고안한 뒤 유전자 합성기(Applied Biosystem Model 38OB, U.S.A.)를 이용하여 포스포라미티트 올리고 뉴클리오티드를 제 2 도와 같은 전략으로 합성하였다. 이같이 합성된 올리고 뉴클리오티드를 제 2 도와 같은 전략으로 전체 유전자를 접합시키기 위하여, 제 3 도와 같은 방식으로 운반체 pUC18[Norrander 등 , Gene 36(1983)101]을 이용하여 전체 유전자 579 염기쌍중 526염기쌍의 제한효소 Sac I - Sal I절편을 얻었고, 이것을 특별히 고안한 링커(Linker)와 함께 운반체 pSOD의 제한효소 Nco I, Sal I 부위에 클로닝시켜, 소성장호르몬 전체 유전자를 포함하는 운반체(pSOD BGH)를 얻었다.

이어서 소성장호르몬을 대장균내에서 발현시키기 위해 대장균 발현운반체 (ptrp 322 H SGH)로 클로닝하여 즉, 연어성장호르몬이 대량 발현되는 발현운반체(ptrp 322 H SGH)를 이용한 폴리시스트론(Polycistron)방식을 특별히 채택하였는데, 이는 연어성장호르몬 유전자 앞부분의 SD배열(Shine-Dalgouno Sequence)과 시작코돈(ATG)을 그대로 이용하고 또한 시작코돈에서 37염기쌍 위치에 있는 Xba I 부위까지 그대로 둔뒤, 여기에 독자적인 SD배열과 일부 연어 성장호르몬 합성을 증가시키기 위한 종료코돈(TAA)그리고, 소성장호르몬 전체유전자를 연결시켜 소성장호르몬 발현을 극대화 시키고자 하였다.

이 방식의 특징은 대부분 대장균 내에서의 외부단백질발현의 경우 문제된다고 보고된 SD배열과 ATG사이에 형성될 수 있는 mRNA의 이차구조 형성으로 인한 발현억제효과를 기조에 발현율이 높은 유전자를 이용하여 그 효과를 줄이고자 하는데 있다. 이같이 하여 제조된 발현운반체 ptrphs BGH 1-13을 지닌 균주 E.coli W3110(ATCC 27325)을 선별한 뒤, 발현조건하에서 키워서 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔 전기 영동법으로 확인한 결과 대장균 전체단백질의 30% 이상이 발현됨을 확인하였고, 또한 웨스턴블라팅으로 이물질이 소성장호르몬임을 증명하였다.

[실시예 1]

[운반체 pUC을 이용한 합성 소성장호르몬 올리고 뉴클리오티드들의 접합반응(Ligation) 및 운반체 pSOD에로의 클로닝(Cloning)]

전체 소성장호르몬 유전자를 얻기 위해 제 1 도와 같은 방식으로 올리고 뉴클리오티드를 포스포라미티드 방법에 따라 유전자합성기(Applied Giosystem Model 308 B,U.S.A.))로 합성한 뒤 제 3 도와 같은 방법으로 이들 올리고머(Oligomer)들을 접합시켰다. 즉, 전체 유전자중 카복시쪽의 제한효소 Pst I-Ssl I 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들을 각각 260㎚에서의 흡광도가 0.05되게 취한뒤 각각 건조시켰고, 이어 올리고 뉴클리오티드의 5°-말단잔기를 인산화시키기 위해 T₄폴리 뉴클리오티드 키나제(Polynucleo-tideKinase)반응을 시켰다.

반응액조건은 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM ATP, 10mM MgCl₂, T₄폴리뉴클리오티드 키나제 4units 전체부피 30㎕, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어 이들 올리고 뉴클리오티드를 전부 모아 페놀, 클로로포름을 처리한 뒤 에탄올 침전 및 건조시킨 후 완충액 (60mM Tris HCl,Ph 7.5, 10mM DTT,10mM MGCL₂53㎕ 에 녹인후 95℃ 물탱크에서 온도가 서서히 내려가는 상태도 6시간 동안 방치한 뒤, 여기에 T₄DNA리가제 20units와 10mM ATP 5㎕를 가하여 상온에서 10분간 반응시켜 올리고머의 5'말단과 3'말단을 연결시킨 뒤 페놀과 클로로포름 처리후 에탄올 침전 및 건조시켰고, 건조시킨 이들 DNA를 60mM트리스 HCl (pH 7.6), 10mM MgCl₂,100mM NaCl 완충액 조건하에 제한효소 Pst I과 Ssl I 각각 10units 씩 가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 7% 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동을 시켰고 겔에서 280-330 염기쌍에 해당되는 부분을 도려내어 전기용출(electroelution)시킨 뒤 일루팁 디컬럼(elutip-dcolumn, Schleicher and Schuell U.S.A. )을 통과시킨 후 에탄올 침전 및 건조시켜서 20㎕ 증류수에 녹였다. 이 DNA 3㎕와 제한효소 Pst I 과 Sal I으로 절단된 운반체 pUC 18(10ng)을 접합반응조건(60mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM DTT, 10mM MgCl₂, 1mM ATP, 10units T₄DNA ligase)하에서 14℃에서 16시간 접합반응시켰다.

이어 하나한(Hanahan)의 방법에 따라 [J.Mol.Biol.(1983) 116,557 E.coli JM 103[BRL, U.S.A. Messing, J.(1983)101,99,20-78 Methods in Enzymology] 에 형질전환(Transformation)시킨 뒤 바른 보임과 돌리의 방법(Nucleic Acids Research(1979),7,1513)으로 제조합된 운반체 P3'-BGH 를 지닌 대장균주를 선별하였다.

한편 전체 소성장호르몬 유전자중 아미노쪽의 제한효소 Sac I- Pst I 절편에 해당되는 올리고 뉴클리오티드들도 상기 언급한 동일방식으로 접합시켜 제한효소 Sac I, Pst I으로 절단된 pUC 18 에 클로닝시켜 P5'-BGH를 지닌 대장균 클론을 찾아냈다. 이어서 위의 두 절편을 연결시키기 위해 제한효소 Sac I, Sal I으로 절단된 pUC 18에 제한효소 Sac I- Pst I 절편과 제한효소 Pst I- Sal I 절편을 같이 접합반응시켜서 526염기쌍의 제한효소 Sac I- Sal I 절편이 들어가 있는 pBGH를 제조하였다. 이어서 M13다이데옥시시퀴엔싱(dideoxy sequencing)방법으로 염기서열을 확인하였다.

이어서 제한효소 Sac I과 시작코돈 ATG사이에 대장균에서 주로 쓰이는 코돈을 선정하여 배열시켰고, 시작코돈 ATG 앞에 종료코돈 TAA와 독자적인 SD 순서를 특별히 고안한 뒤 SD 순서와 시작코돈 ATG 근처에 m-RNA 2차구조가 생기지 않도록 염기배열을 조절하여 유전자 합성기로 합성한 윗가닥 73mER(5'-CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT-3')과 아랫가닥 65mer(3'-CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC-5')를 pBGH 에서 얻은 526 염기쌍의 Sal I - Sal I 절편과 함께 제한효소 Nco I 과 Sal I으로 절단시킨 운반체 pSOD 에 클로닝시켜 소성장호르몬 전체유전자를 지닌 pSOD BGH클론을 얻었다.

[실시예 2]

소성장호르몬 전체유전자를 대장균 발현 운반체로 클로닝시키는 유전자 조작기술과정.

대장균에서 강력한 프로모터(promoter)중 하나인 trp프로모터를 이용하여 소성장호르몬을 대장균내에서 대량 발현시키기 위하여, 대장균내에서 대량발현되는 연어성장호르몬의 앞부분 유전자뒤에 소성장호르몬의 전체유전자를 배열시키는 폴리시스트론방식을 이용하여 제 4 도와 같은 방식으로 진행시켰다. 즉, 연어성장 호르몬이 대량 발현되는 발현운반체 ptrlp 322 H SGH DNA 5㎍을 제한효소 Xba I 10units로 완충액(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM MgCl₂, 50mM NaCl)하에서 37℃, 1시간 반응시킨 뒤 페놀, 클로로포름처리 후 에탄올 침전 및 건조 후 15.5㎕ 증류수에 녹였다.

이어 총 반응액 20㎕ 에서 dNTP(dGTP,dCTP,dATP,dTTP)를 최종농도 250㎛되게 첨가한 뒤 완충액(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM MgCl₂, 50mM NaCl) 조건하에서 2.5units의 클레나우 효소로 상온에서 20분간 반응시켜 제한효소 Xba I 으로 절단된 부위를 블런트엔드(blunt end)로 만들었다. 이어서 95℃에서 2분간 방치하여 클레나우효소활성을 죽인뒤, 10units의 제한효소 Sal I 및 1M NaCl 6.5㎕, 증류수20.5㎕ 를 첨가하여 총 반응액 50㎕ 을 37℃에서 시간 반응시켜준 뒤 1% 아가로스겔로 2.4kb의 DNA 절편분리 후 전기용출 및 일루팁디로 운반체 DNA를 얻어 15㎕ TE(10mM Tris-HCl pH 7.5 ,1mM EDTA)에 녹였다.

한편 소성장호르몬 전체 유전자와 독자적인 SD순서를 지닌 DNA 절편을 얻기 위해 pSOD BGH DNA 10㎍를 완충액 (150mM NaCl, 6mM Tris-HCl (pH 7.9), 6mM MgCl₂,) 조건하에서 12units의 제한효소 Nco I 으로 37℃, 1시간 반응시킨 뒤 페놀, 클로로포름 처리 및 에탄올침전 후 건조시켜 31.5㎕ 증류수에 녹인 후 dNTP(dGTP,dCTP,dATP,dTTP) 최종농도가 250μM이 되도록 첨가한 뒤 완충액 (50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM MgCl₂, 50mM NaCl) 조건하에서 2.5units의 클레나우 (Klenow) 효소로 상온에서 20분간 반응시킨 뒤 95℃에서 2분간 방치후 20units의 제한효소 Sal I 과 7㎕의 1M NaCl, 그리고 10㎕ 의 증류수를 첨가하여 총반응액 60㎕ 에서 37℃, 1시간 반응시킨 뒤 염기쌍 DNA 절편을 1% 아가로그겔 전기 영동 전기용출 및 일루팁디방법으로 얻은뒤 15㎕ TE에 녹였다.

이와 같이 하여 얻은 DNA를 접합반응시키기 위하여 10㎍의 운반체 DNA(Ptrp 322 H SGH DNA를 Xba I과 클레나우효소 및 Sal I 반응시켜 얻은 2.4kb DNA)를 전체 소성장호르몬 유전자가 들어있는 DNA 50ng과 완충액(60mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM DTT, 10mM MgCl₂)조건하에서 T₄DNA리가제 20units 로 14℃에서 16시간 접합반응시켰다.

이어 하나한(Hanahan)의 방법에 따라 대장균 HB 101[ATCC 33694] 에 형질전환(Transformation)시킨뒤 바른보임과 돌리의 방법에 따라 재조합된 발현운반체 ptrphs BGH 1-13을 얻은 뒤, 이것을 다시 대장균 W 3110(ATCC 27325)에 형질전환시켰다.

[실시예 3]

대장균 숙주W 3110에서 소성장호르몬 대량발현 및 SDS폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동 웨스턴블라팅으로 확인과정 발현운반체 ptrp hs BGH 1-13을 지닌 대장균 W 3110을 앰피실린이 40㎍/㎖로 포함된 LB배지에서 16시간, 37℃에서 흔들어 주면서 배양하여 650nm에서의 흡광도가 0.5되는 지점에서 IAA(Indole acrylic acid)를 60㎍/㎖되게 첨가한 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 흡광도 65㎚에서 1.0에 해당되는 균을 완성분리시킨 뒤 100㎕ 의 람리완충용액 [Lammli sample buffer ; Laemmil U.K.(1970)Nature 227,680] 에 녹인 뒤 100℃에서 5분간 가열후 10㎕를 12.5% SDS-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동시켰다. 그 결과 제 6 도에서 볼 수 있듯이 소성장호르몬 유전자가 들어있지 않은 ptrp 322 및 W 3110에서는 볼 수 없는 22,000달톤의 단백질 밴드가 Ptrp hs BGH1-13, W3110클론에서 대장균 전체단백질의 30% 정도로 발현됨을 확인하였고, 대장균에서 발현되는 소성장호르몬을 웨스턴블라팅(Western Blotting)으로 확인하기 위해 전술한 방식에 따라 준비된 시료를 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔을 건뒤 번네트(Bunette et al. Anal. Biocherm.(1981) 112,195)방법에 따라 호스레디쉬 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)가 붙어 있는 소성장호르몬에 대한 단일항체(Accurate Chemical Scientific Corp.U.S.A.)를 이용하여 면역활성을 분석한 결과 제 6 도에서 보듯이 분자량이 22,000dalton인 지점에서 나타나는 단백질밴드와 같은 위치에서 면역활성이 나타났다.

즉, 본 발명자는 대장균에서 다량의 소성장호르몬을 발현시킨 결과 얻어진 소성장호르몬은 면역활성을 지니고 있음을 확인하였다. M9배지는 40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8,5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1mM MgSO₄0.1mM CaCl₂, 10㎍/㎖ Vit B₁, 0.4% CAA(Casamino acid),1% 글루코즈, 40 ㎍/㎖ 암피실린의 조성으로 되어있다.

Claims

소성장호르몬의 아미노산 배열순서에 따라 Sac I, Pst I 및 Sal I의 인지부위가 존재하는 올리고 뉴클리오티드를 합성한 후 이를 접합전략에 따라 접합시켜 대장균 운반체에 클로닝하여 소성정호르몬유전자를 제도한 다음 이 유전자를 인공합성링커와 함께 대장균 운반체에 클로닝하여 인공합성 링커가 접합된 소성장호르몬 전체 유전자를 제조하여 이를 연어성장호르몬이 발현될 수 있는 trp프로모터를 지닌 대장균 발현 운반체에 재클로닝시킨 최종발현운반체를 대장균 내에서 발현시킴을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 인공합성링커는 시작코돈 ATG 앞에 종료코돈 TAA와 SD배열로 되어있어 SD배열과 시작코돈 ATG 사이에 m-RNA 2차구조가 생기지 않도록 한것임을 특징으로 하는 소성정호르몬의 제조방법.
제 1 항 또는 2 항에 있어서 인공합성링커는 윗가닥 73mer(5'-CATG GAG GAA TTA TAA ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT-3')과 아랫가닥 65mer(3°-CTC CTT AAT ATT TAC CGA AAA GGC GCA TAC AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTG CGA CAA GAA GC-5')로 구성된 것임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 인공합성링커가 접합된 소성장호르몬 전체 유전자는 526 염기쌍으로 된 소성장호흐몬 유전자의 Sac I-Sal I절편을 인공합성링커와 함께 제한 효소 Nco I 와 Sal I으로 처리한 운반체 pSOD에 클로닝시켜서 제조된 것임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 최종 대장균 발현운반체는 운반체(pSOD BGH)를 Nco I, Sal I으로 처리하여 인공합성링커와 접합된 소성장호르몬 전체 유전자를 분리한 이를 Xba I, Sal I으로 처리하여 연어성장호르몬유전자의 일부가 제거된 대장균 발현운반체(ptrp 322 H SGH)에 재크로닝시킨 운반체(ptrp hs BGH 1-13)임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 대장균에서의 발현은 연어성장호르몬유전자 앞부분의 SD배열과 시작코돈(ATG)을 이용한 것임을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.
제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, 대장균에서의 발현은 시작코돈에서 37염기쌍까지의 연어성정호르몬유전자에 SD배열 및 종료코돈(TAA)을 포함한 인공합성링커와 접합된 소성장호르몬 유전자를 연결시켜 행함을 특징으로 하는 소성장호르몬의 제조방법.