KR100225511B1 - 소 성장호르몬의 대량 생산 방법 - Google Patents
소 성장호르몬의 대량 생산 방법Info
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Abstract
본 발명은 5'-말단부분의 염기서열이 그에 코드되는 아미노산 서열의 변화없이 변형된 소 성장호르몬 유전자와 상기 유전자의 3'-말단에 연결된 trpA 전이 터미네이터를 포함함을 특징으로 하는 소 성장호르몬 발현 벡터, 이에 의해 형질전환된 대장균 및 이를 이용하여 높은 수율로 소 성장호르몬을 제조하는 방법을 관한 것이다.
Description
제1도는 소 성장호르몬 유전자의 5'말단 부분과 이를 변형시킨 염기서열을 비교한 것이다.
제2도는 소 성장호르몬 유전자의 5'말단에 변형된 유전자 염기서열을, 3' 말단뒤에 trpA 전이 터미네이터를 접합하는 전략 및 이를 포함하는 발현 벡터의 제조과정을 도시한 것이다.
제3도는 5' 말단에 변형된 유전자 및 3' 말단뒤에 trpA 전이 터미네이터를 접합한 후 소 성장 호르몬 유전자를 발현시켜 SDS 폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동한 결과를 도시한 것이다.
제4도는 소 성장호르몬의 발현율을 덴시토미터로 측정한 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 소 성장호르몬의 5'-말단 유전자의 일부를 아미노산 변화없이 변형시키고 또한 소 성장 호르몬의 3'-말단뒤에 trpA 전이 터미네이터 유전자를 결합시킴으로써 소 성장호르몬만을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 기존에 선출원(대한민국 특허출원 제86-11712호)된 소 성장호르몬 유전자의 염기서열을 이용하여 유전자의 5'-말단 부분에 코드되는 아미노산 서열의 변환없이 그 염기서열만을 무작위로 변화시키는 시발체(primer)를 합성한 뒤 이를 이용하여 소 성장호르몬 유전자를 대량 증폭시키고, 또한 소 성장호르몬 유전자의 3'-말단에 trpA 전이 터미네이터를 연결시켜 얻어지는 소 성장호르몬 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 소 성장호르몬 단백질을 대량 제조하여 값싸게 제공함으로써 소 성장을 촉진시키고, 우유분비를 증가시키며, 사료효율을 높이는 등의 목적에 용이하게 사용하게 하는 것에 관한 것이다.
현재 주로 사용되고 있는 동물성장 촉진제들은 스테로이드(steroid) 계통 제품들(예 : Estradiol-Compudose by Eli Lilly, Estradiol Benzoate-Synovax by Syntax Agribusiness Inc., Zeramol-Ralgro by International Minerals and Chemicals)인데, 이들은 지용성(fet-soluble) 물질들로서 사용 후 체내에 잔류하게 되어, 인체에 영향을 미치는 것이 밝혀져, 미국을 위시한 선진 각국에서는 사용을 금지시키고 있다.
한편, 동물의 뇌하수체에서 생산분비되는 성장호르몬은 불지용성이며, 종특이성(Species-Specific)을 나타내고 동물에 사용시 성장촉진, 젖소 우유 분비 증가 및 사료 효율을 높이는 등의 영향이 있음이 밝혀지고 있다(참고문헌 : Bauman, D. E. et al., Journal of Animal Sciencs 60, 583(1985); Hart, I. C. et al., Journal of Endocrinology 105, 189(1985); Newswatch, June 17, 1985; Wall Street Journal, July 22, 1986). 그러나 1940년이래 근래까지 이러한 연구는 직접 동물의 뇌하수체에서 추출, 정제하여 사용하였기 때문에 그 양이 크게 제한을 받아 직접 가축업에 응용할 수 없었으나, 유전공학 기술의 발달로 이러한 동물 성장호르몬을 대장균에서 대량 생산할 수 있게 되었다.
시버그(Seeburg)등은 소의 뇌하수체로부터 소 성장호르몬을 코딩하는 cDNA를 분리하여 염기서열 및 아미노산 서열을 밝히고 이 유전자를 trp 프로모터를 이용한 대장균 발현 벡터에 클로닝하여 발현시킨 바 있다(Seeburg, P.H. et al., DNA 2, 37(1983)). 그 이후 많은 연구 그룹에서 소 성장호르몬의 발현율을 높이려는 시도를 하여 왔는데 조오지(George) 등은 리보솜 결합부위(ribosome binding site)와 소 성장호르몬 유전자의 번역 시작 코오돈인 ATG 간의 염기배열 및 염기길이에 따라 발현율에 많은 차이가 존재함을 밝히고 이를 통해 대장균 전 단백질 대비 15%의 소 성장호르몬을 발현시켰다(George H.J., et al., DNA 4, 273(1985)). 올슨(Olsen)등은 리보솜 결합부위와 소 성장호르몬 유전자의 번역 시작 코오돈인 ATG 간의 염기배열을 A-T 다발(rich) 염기서열로하고 trp 프로모터를 이용한 대장균 발현 벡터에서 소 성장호르몬 유전자를 발현시킨 결과 대장균 전 단백질 대비 15~20%의 소 성장호르몬이 생산되었음을 보고한 바 있다(Olsen, M.K., et al., J. Biotechnol. 9, 179(1989)). 왓슨(Watson) 등은 소 성장호르몬 유전자가 클로닝된 플라스미드를 무작위 돌연변이(random mutation)시킨 결과 소 성장호르몬의 N말단 4개 아미노산을 코딩하는 염기서열 중 1개 염기가 치환된 돌연변이체에서 대장균 전 단백질 대비 20%의 소 성장호르몬이 발현되었음을 보고하였다(Watson et al., Gene 86, 137(1990)). 본 발명자들도 소 성장호르몬의 유전자를 대장균이 선호하는 유전자로 합성한 뒤 이를 연어 성장호르몬이 발현될 수 있는 trp 프로모터를 지닌 대장균 발현 벡터 운반체에 클로닝시키고 또한 리보소옴 결합부위와 시작 코오돈인 ATG 사이에 mRAN 2차 구조가 생기지 않도록 합성링커를 연결하여 소 성장호르몬 발현 운반체를 만든 뒤 이를 대장균에서 발현시켰을 때 대장균 전단백질 대비 27%의 소 성장호르몬이 발현되었음을 보고하였다(대한민국 특허출원 제86-11712호).
한편 trpA 전이 터미네이터는 매우 효율적인 rho-비의존성(rho-independent) 터미네이터로서(Christie, G.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78, 4180(1981)), 발현시키고자 하는 유전자의 3'-말단 뒤에 trpA 전이 터미네이터를 삽입함으로써 불필요한 전이과정을 차단시키고 플라스미드 유래의 불필요한 단백질 생산을 억제하면서 원하는 단백질만을 대량 생산할 수 있는 유전자로 알려져 있다(Gentz, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78, 4936(1981)). 실제로 마츠키(Matsuki)등은 쥐의 칼모듈린(Calmodulin) 유전자를 대장균에서 trp 프로모터 및 trpA 전이 터미네이터를 이용하여 발현시킨 결과 대장균 전 단백질 대비 30%의 쥐 칼로듈린이 발현되었음을 보고하였고(Matsuki, S. et al., Biotech. Appl. Biochem. 12, 284(1990)), 사토(Sato) 등은 인터루킨-2 유전자를 trp 프로모터 하에 대장균에서 발현시켰을 때 trpA 전이 터미네이터를 삽입한 경우 삽입하지 않은 대조군에 비해 발현율이 약 5배 증가하였음을 보고한 바 있다(Sato, et al., J. Biochem. 101, 525(1987)).
그러나 상기의 방법으로 대장균 전단백질 대비 최고 30%의 소 성장호르몬 밖에 얻을 수 없으므로 보다 경제적이고 수율이 높은 소 성장호르몬을 얻기에는 한계가 있기 때문에 본 발명자들은 보다 더 높은 소 성장호르몬 발현율을 얻을 수 있는 발현 벡터 제조에 노력하던 중 소 성장호르몬 유전자의 5'말단 부분에 코딩되는 아미노산 서열의 변화없이 염기서열만을 무작위로 변이시킬 수 있는 무작위 시발체로 소 성장호르몬 유전자를 합성하여 mRNA의 2차 구조의 생성을 최소화하는 염기서열을 찾아내고 또한 소 성장호르몬 유전자의 번역 종료 코오돈 뒤에 trpA 전이 터미네이터 유전자를 삽입함으로써 불필요한 전이를 차단시킨 결과 대장균 전 단백질 대비 50% 이상으로 소 성장호르몬을 대량 발현시키는 발현벡터를 제조 완성하게 되었다.
그러므로 본 발명의 목적은 소 성장호르몬 유전자의 5'말단의 유전자 염기서열을 변형시켜 mRNA의 2차 구조를 최소화하고 3'말단 뒤에 trpA 전이 터미네이터를 삽입함으로써 대장균에서 전 단백질 대비 50% 이상의 소 성장호르몬 발현을 유도할 수 있는 발현벡터 및 그의 제조방법을 제공하고, 아울러 이러한 발현 벡터에 의해 제조되는 소 성장호르몬을 값싸게 대량 공급하는 데에 있다.
본 발명에 따라 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열이 그에 코딩되는 아미노산 서열 변화없이 변형된 소 성장호르몬 유전자 및 상기 유전자의 3'-말단에 연결된 trpA 전이 터미네이터 유전자가 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 대장균 및 이를 이용하여 소 성장호르몬을 제조하는 방법이 제공된다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 발현벡터는 소 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 부분의 염기서열이 mRNA의 2차 구조를 비안정화시켜 유전자의 발현율을 높이도록 변형된 소 성장호르몬 유전자를 포함하며, 바람직하게는 하기와 같은 염기서열을 갖는 5'-말단 부분을 포함한다 :
5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA
TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT
CAT CAG CTG GCT-3'
또한 본 발명의 발현벡터는 소 성장호르몬 유전자의 3'-말단 뒤에 trpA 전이 터미네이터를 포함하며, trpA 전이 터미네이터는 바람직하게는 다음의 염기 서열을 갖는다 :
5'-AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTT-3'
이러한 본 발명의 발현벡터는 공지된 유전자 재조합 또는 합성방법을 이용하여 여러가지 방법으로 제조할 수 있으며, 예를들면 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
먼저 소 성장호르몬을 코딩하는 염기서열 정보(본 출원인이 선출원한 한국특허 출원 제86-11712호 : 공고번호 제92-3665호)로부터 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열을 변형시키기 위해 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 무작위 시발체(random primer)를 고안합성한다. 이 무작위 시발체에는 소 성장호르몬 유전자내에 제한효소 Sac I의 인지부위가 존재하도록 고안되어 있으며 아미노산 변화없이 염기서열만이 무작위로 변형되도록 설계되어 있다. 또한 소 성장호르몬 유전자가 클로닝된 재조합 벡터 ptrphs BGH 1-13(대한민국 특허출원 제86-11712호; ATCC 68975 (1992. 5. 6 기탁))내의 유일한 제한효소인 Pvu I 인지부위가 존재하도록 시발체를 합성한 후 이 시발체와 무작위 시발체를 시발체를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단의 염기서열이 변형된 돌연변이 유전자를 증폭하고, 이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 ptrphs BGH 1-13 재조합 벡터 내 제한효소 PvuI과 SacI으로 절단한 단편과 접합한 후 대장균을 형질전환시켜 ptrphs BGHRAN 플라스미드를 얻는다.
또한 trpA 전이 터미네이터를 소 성장호르몬 발현벡터에 삽입하고자 trpA 전이 터미네이터 유전자 및 제한효소 SalI 인지부위가 존재하도록 시발체를 합성하고 이에 대응되는 시발체는 ptrphs BGHRAN 재조합 벡터내 유일한 제한효소 PvuI 인지부위가 존재하도록 시발체를 합성한 뒤 이들 시발체들을 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 유전자를 증폭한 뒤 이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편과 ptrphs BGHRAN 플라스미드를 플라스미드내 제한효소인 PvuI과 SalI으로 절단한 단편을 접합한 후 대장균을 형질전환시켜 ptrp3H BGHRAN 플라스미드를 얻는다.
이러한 본 발명의 발현 백터로 상기 백터내의 소 성장호르몬 유전자를 발현시키기에 적절한 대장균을 형질전환시켜 대장균 형질 전환체를 제조할 수 있으며, 상기 대장균 형질 전환체를 적합한 배지에서 배양한 후 발현된 소 성장호르몬을 분리·정제할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예 들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 발명의 범위를 제한하지 않는다.
[실시예 1 : 5' 말단에 변형된 염기서열을 갖는 소 성장호르몬 유전자의 증폭 및 변형된 소 성장 호르몬의 발현벡터 제조]
(단계 1)
기존에 클로닝된 소 성장 호르몬 유전자의 염기서열(대한민국 특허출원 제86-11712호) 정보로부터 다음과 같은 무작위 시발체를 합성하였다. 시발체 PBGHRAN(5'- TGCTGAGCTCGNAGNACNGC(G/A)TTNGC(A/G)AANAGNCCNGANAGNGACATNGCNGG(A/G)AANGCCATTTATAATTCCTCCA-3')은 소 성장호르몬 유전자내 제한효소인 Sac I 인지부위를 가지고 있으며 소성장호르몬 유전자의 5'-말단 부분이 코드하는 16개 아미노산 서열의 변화없이 염기서열만이 변형된 것이다. 시발체 PPBR3720(5'-TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA-3')는 소 성장호르몬 발현벡터인 ptrphs BGH 1-13의 Ampr유전자에 위치하여 제한효소 PvuI 인지부위를 포함하고 있다.
(단계 2)
반응튜브에 소성장 호르몬 발현벡터인 ptrphs BGH 1-13(대한민국 특허출원 제86-11712호 참조, ATCC 68975) 1ng을 주형으로 넣고 단계 1에서 만든 시발체 PBGHRAN 2㎍ 및 시발체 PPBR3720 2㎍을 넣은 다음 10㎕의 10배 중합 완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dATP, 2mM dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(denaturation), 55℃에서 40초(annealing), 72℃에 2분(polymerization)의 조건으로 중합연쇄반응을 40회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 분리한 결과 약 990 염기쌍의 DNA가 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 폴리아크릴 아마이드 젤로부터 분리정제하였다. 이하 이 단편을 단편 BGHRAN이라 칭한다.
(단계 3)
플라스미드 ptrphs BGH 1-13 2㎍을 제한효소 Sac I으로 NEB(New England Biolab. 사) 완충용액 1(10mM Bis Tris propane-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.0)의 조건하에서 완전절단한 뒤 제한효소 PvuI으로 NEB 완충용액 3(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.9)의 조건하에서 완전절단하였으며 이를 0.7% 아가로오스 젤로 분리하여 약 2Kb 단편을 분리정제하였다. 이하 이 단편을 단편 PBGH-T/P라 한다. 한편 (단계 2)에서 얻은 단편 BGHRAN을 제한효소 Sac I으로 NEB 완충용액 1의 조건하에서 완전절단한 뒤 제한효소 Pvu I으로 NEB 완충용액 1의 조건하에서 완전절단한 후 이들을 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존하였다. 이를 단편 BGHRAN-T/P라 한다. 상기에서 얻은 단편들을 이용하여 다음과 같이 접합반응을 실시하였다.
접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 단편 BGHRAN-T/P와 100ng의 단편 PBGH-T/P, 2㎕의 10배 접합완충 용액, 10단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 접합 반응물로 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질전환시켜 단편 BGHRAN을 함유한 플라스미드 ptrphs BGHRAN을 얻었다(제2도).
실시예 2 : 5'-말단에 변형된 염기서열을 갖는 소 성장호르몬 유전자의 발현유도 및 그 염기서열 확인
(단계 1)
상기 실시예 1에서 얻은 재조합 대장균 100여개의 콜로니를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. Bl, 40㎍/m1 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간 동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종 농도 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA 첨가한지 약 4시간 후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포침전물들을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에 15% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기영동하여 발현을 확인한 결과 대조군에 비해 40% 발현이 증가된 클론이 선별되었으며 이를 ptrphs BGHRAN #5라 명명하였다(제3도).
(단계 2)
상기 단계 1에서 선별된 ptrphs BGHRAN #5 클론의 염기서열을 확인하기 위해 생거(Sanger)등의 방법에 따라 다음과 같이 행하였다. 먼저 플라스미드 ptrphs BGHRAN #5 2㎍을 제한효소 Sac I으로 NEB 완충용액 1의 조건하에서 완전절단한 뒤 제한효소 EcoRI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전 절단하였으며 이를 10% 아크릴 아마이드 젤을 이용하여 분리하여 약 187 염기쌍의 핵산 절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산 절편을 단편 BGHRAN-T/R이라 한다. 한편 플라스미드 M13mp18 2㎍을 제한효소 Sac I으로 NEB 완충용액 1의 조건하에서 완전 절단하여 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 7Kb의 핵산 절편을 분리하였다. 이하 이 핵산절편을 단편 M13-T/R이라 칭한다. 접합반응 용기에 상기에서 얻은 100ng의 단편 BGHRAN-T/R, 100ng의 단편 M13-T/R, 2㎕의 10배 접합 완충용액 및 10 단위체의 4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 접합 반응물 10㎕와 대장균 JM105(ATCC 47016) 컴피턴트 세포 200㎕를 혼합한 다음 8㎕의 0.2M IPTG 용액, 미리 배양된 헬퍼세포(대장균 JM105) 100㎕, 3㎖의 2XYT 상층아가 (연성아가 : 16g 박토트립톤, 10g 효모 추출물, 5g NaCl, 5g 박토아가/Liter)와 25㎕의 4% X-gal 용액을 혼합하고 Min A 플레이트(10.5g KH2PO4, 1g(NH4)2SO4, 0.5g Na 시트레이트, 12g 박토아가, 1ml 20% MgSO4, 0.5ml 1% Vit B, 10ml의 50% 글루코스/ Liter) 위에 고르게 도포한 후 37℃에서 12시간 배양하여 생성된 투명한 플라크(plaque)를 이쑤시게로 찍어서 2ml의 2XYT 액체배지에서 37℃, 5시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상층액에 1/4 부피의 PEG/NaCl(20% polyethylene glycol, 2.5M NaCl)을 넣은 다음 M13 파아지(phage)를 수거해서 단일가닥 핵산을 추출한 후 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 염기서열의 변형을 확인하였다(제1도).
[실시예 3 : trpA 전이 터미네이터 유전자를 갖는 발현벡터 제조]
(단계 1)
trpA 터미네이터 유전자를 상기 실시예 2에서 제조한 소 성장 호르몬 발현벡터에 삽입하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다. 시발체 PTRPATER(5'-GCTTTGTCGACTAATTAAAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCCTCGCGCGTTTCGGT-3')는 제한효소 Sal I 인지부위를 가지고 있으며 23번째 염기부터 50번째 염기는 trpA 전이 터미네이터 유전자를 나타내며 51번째 염기부터 67번째 염기까지는 소 성장호르몬 유전자 3'-말단 뒤의 발현벡터내 염기서열을 포함하고 있다. 시발체 PPBR3740(5'-TGACAACGATCGGAGGA CCGAAGGA-3')는 소 성장호르몬 발현벡터인 ptrphs BGH 1-13의 Ampr 유전자에 위치하며 제한효소 Pvu I 인지부위를 포함하고 있다.
(단계 2)
반응튜브에 소 성장호르몬 발현벡터인 ptrphs BGH 1-13 1ng을 주형으로 넣고 단계 1에서 만든 시발체 PTRPATER 2㎍ 및 시발체 PPBR3740 2㎍을 넣은 다음 10㎕의 10배 중합완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dTTP) 및 2.5 단위체 Taq 중합효소를 넣고 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한후 95℃에서 1분, 55℃에서 40초, 72℃에서 2분의 조건으로 중합연쇄반응을 25회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 1% 아가로오스 젤에서 분리한 결과 약 1.5Kb 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 동일조건의 아가로스 젤로부터 분리정제하였다. 이하 이 핵산단편을 단편 PBR 이라 한다.
(단계 3)
플라스미드 ptrphs BGH 1-13(ATCC 68975) 2㎍을 제한 효소 Sal I과 Pvu I으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전 절단하였고 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 1.5Kb의 핵산절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산절편을 단편 PBGH-P/L이라 한다. 상기 실시예 2의 단계 1에서 얻은 플라스미드 ptrphs BGHRAN #5 2㎍을 제한효소 Sal I과 Pvu I으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단하고 이를 0.7% 아가로스 젤로 분리하여 약 1.5Kb의 핵산 절편을 분리정제하였다. 이하 이 핵산절편을 단편 PBGHRAN-P/L이라 한다. 한편 상기 (단계 2)에서 얻은 단편 PBR을 제한효소 Sal I과 Pvu I으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단한 후 이를 페놀/클로로포름으로 추출하여 20㎕의 TE 용액에 용존한 후 이를 단편 PBR-P/L이라 한다.
상기에서 얻은 단편으로 다음과 같이 접합반응을 실시하였다. 접합반응 튜브 A에 단편 PBGH-P/L 100ng, 접합 반응 튜브 B에 단편 PBGHRAN-P/L 100ng을 각각 넣고 양쪽에 100ng의 단편 PBR-P/L, 2㎕의 10배 접합반응 용액, 및 10단위체의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 접합 반응물로 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질전환시켜 반응튜브 A로부터 trpA 전이 터미네이터를 함유한 ptrp3H BGH 1-13을, 반응 튜브 B로부터 trpA 전이 터미네이터를 함유한 ptrp 3H BGHRAN을 얻었다(제2도 참조).
[실시예 4]
trpA 전이 터미네이터를 함유한 소 성장호르몬 발현 벡터로부터 소 성장 호르몬 발현 유도
상기 실시예 3에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/ml의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박트트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml 씩을 각기 300ml의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당 0.1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, 0.4% 카사미노산, 10㎍/ml Vit. Bl, 40㎍/ml 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3정도가 될 때 인돌아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/ml이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간 후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포침전물을 수거하였다. 수거한 세포침전물들을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기용동하여 발현을 확인한 결과를 제3도에 나타내었다.
제3도에서 알 수 있듯이, 플라스미드 ptrp3H BGH 1-13으로 형질 전환된 대장균으로부터 발현된 소 성장 호르몬은 대장균 전 단백질 대비 39.9%의 발현율을 보였으며 플라스미드 ptrp3H BGHRAN로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 소 성장호르몬은 대장균 전 단백질 대비 57.3%의 발현율을 보여 플라스미드 ptrphs BGH 1-13으로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 소 성장호르몬의 경우 대장균 전 단백질 대비 26.3%의 발현율을 보인것과 플라스미드 ptrphs BGHRAN #5로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 소 성장호르몬의 경우 대장균 전 단백질 대비 39.9%의 발현을 보인 것에 비해 40~50% 발현율 상승을 보여줌을 알 수 있었다(제4도 참조). 플라스미드 ptrp 3H BGHRAN에 의해 형질전환된 대장균 W3110은 1994년 12월 26일자로 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0143BP로 기탁되어 있다.
상기에서 보듯이, 소 성장 호르몬 유전자의 5'-말단 부분의 염기서열 변환에 따른 mRNA 2차 구조 비안정화와 3'-말단 뒤의 불필요한 전이과정을 억제하는 trpA 전이 터미네이터를 삽입함으로써 대장균 전 단백질 대비 57.3%의 소 성장호르몬을 생산하게 되었으며 이로 인해 값싸고 수율이 높은 소 성장호르몬을 대량 생산할 수 있는 길이 열리게 되었다.
Claims (7)
- (1) 프로모터와 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 서열 사이에 연어 성장호르몬 또는 그 일부가 암호화하는 코돈이 위치하고, (2) 소 성장호르몬 유전자의 3'-말단에 trpA 전사 터미네이터가 연결되며, (3) 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 부위에 사일런트 체인지가 도입됨을 특징으로 하는 소 성장호르몬의 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 소 성장호르몬 유전자의 5'-말단 부분이 다음의 염기 서열을 가짐을 특징으로 하는 발현 벡터 :5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTATTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTTCAT CAG CTG GCT-3'(상기에서, ATG는 소 성장호르몬 유전자의 번역 개시 코돈을 가리킨다.)
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 trp A 전사 터미네이터가 하기 염기 서열을 가짐을 특징으로 하는 발현 벡터 :5'-AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTT-3'
- 제3항에 있어서, 발현 벡터 ptrp 3H BGHRAN.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균.
- 제5항에 있어서, 벡터 ptrp 3H BGHRAN에 의해 형질전환된 대장균 W3110 (KCTC 0143BP).
- 제5항 또는 제6항의 대장균을 배양한 다음, 소 성장호르몬을 분리함을 특징으로 하는 소 성장호르몬의 제조 방법.
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