TW505694B - Process for the mass production of bovine growth hormone - Google Patents
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505694 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（i ) 發明領域 本發明是關於大量生産牛生長激素（BGH)的方法。詳 言之*它包括了 一種表現載體，其包含一修飾過的BGH基 因，其中在5 ’端區域之核苷酸序列被修飾但未改變其内編 碼之胺基酸序列，及一被插置於此一修飾過之BGH基因的 3’端之後的hpA轉錄終結子；一種被此表現載體轉形的大 腸桿菌細胞；以及一種大量生産BGH的方法，包含培養此 大腸捍菌轉形體及自培養基中分離BGH。 類固醇型之動物生長促進劑，如雌二醇——康普度斯 (Estradiol-Compudose; Eli Lilly)，雌二醇苯甲酸酯孕 烯二酬（Syntax Agribusiness Inc·)，以及査拉羅古 (Zeramol-Ralgro； International Minerals and Chem-i ca 1 s)已被用於家畜飼養以提昇飼料效率及家畜的體重增 長。但是，使用這些動物生長促進劑己有限制，因為它們 是脂溶性的，在家畜組織中殘留時間長，可能對消費者有 相反地，動物生長激素，其分泌自動物的腦下腺，不 為脂溶性，有品種專一性，且被報導可以增進家畜生長及 乳産量，亦可促進飼料效率（Bauman, D. E., et ai., J > of Animal Sciences· 60. 583 (1985) l Hart, I· C· et a 1., J> of Rndocrinologv. 105 · 189 (1995)； Newswatch, June 17, 1985;以及 Wall Street Journal， July 22, 1986))。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（2 ) 自1940年代起，從動物腦下腺分離純化的天然動物生 長激素己被用於促進動物的生長，唯其在家畜飼養上的應 用受限於激素有限的供應。但進來在遣傳技術上的發展’ 使得使用微生物，如大腸捍菌，大量生産動物生長激素成 為可能。 P . H . S e e b U r g e t a 1 .已自牛腦下腺分離出編碼B G Η 的cDNA;決定了此BGH cDNA的核苷酸序列及胺基酸序列； 並將此cDM選殖入含一 trp啓動子的大腸捍菌表現載體， 且在被此載體轉形的大腸捍菌表現BGH (ΜΑ, 37 (1983)) 〇 自此之後，人們即嘗試增進BGH在大腸捍菌中的表現 速率。 例如，H. J. George et a 1.掲露出其表現速率有賴 於核苷酸序列以及核醣體接合位和轉譯啓始密碼，ATG ， 問區域的長度；並在大腸桿菌中生産出相當於所有蛋白質 15¾的 BGH 〇m,生，273 (1985))。
Olsen et ai.使用含有修飾過之BGH基因的表現載體 ，在轉形大腸桿菌中生産出相當於所有蛋白質10¾至15¾的 BGH。該BGH基因之核醣體接合位和轉譯啓始密碼，ATG， 富含A-T，並控制於一 trp啓動子之下（i· Biotech。】—匕，9, 179(1989))。
Watson etal.亦使用含有修飾過之BGH基因的質體， 在轉形大腸桿菌中獲得相當於所有蛋白質10¾至15%的BGH 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 505694 A7 B7 五、發明説明（3 ) 産量。該BGH基因中編碼N端4個胺基酸的核苷酸之一被以 隨機突變轉變（Gene. a£，137 (1990))。 此外，也有文獻指出，使用以大腸桿菌喜愛的密碼修 飾之BGH基因；將該基因載入含有一受trp啓動子控制之鮭 魚生長激素（SGH)基因的大腸桿菌載體中 '其中BGH基因及 SGH基因以合成連接子相接；而在以該_1體轉形的大腸桿 鐘中表現出相當於所有蛋白質産量27¾的BGH (韓國專利 公開案第92-3665號）。 但在習知技術中，BGH在大腸桿鐘中的最高産量為30¾ Ο 另一方面，一種trp A轉錄終止子被指出為一有效率的 rho# 宗I tt 金冬 it (Proc . Ha 11 > Aoad . Sc i . U.S.A … II, 4180 (1981))。所以，將一 trpA轉錄終止子插入希望 生産的蛋白質基因的3 f端之後，抑制其他衍生自質體的 蛋白質的産生，或可有助於該蛋白質的大量生産dntz, R…et a 1 . > Proc. Hatl. Acad > Sc i, U.S, A . .7 8· 4938 (1981))。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ϋϋ*二=*_11 m· t^i— n·— K 4 ---......- ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) M a t s u k i e t a 1 ♦將一種含有一 t r p啓動子，一卡莫都 林（calmodulin)基因，及一 tr^A轉錄終止子的質體轉形入 大腸桿菌中，而生産出相當於所有蛋白質30¾的産量 (Biotech. App1. B i ochem >, 12，284 (1990)) °
Sato et al·則報導，當使用一種含有一受trp啓動子 控制的老鼠間白素——2基因以及一被插置於該間白素——2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 505694 A7 B7 五、發明説明（4 ) 基因3’端之後的trpA轉錄終止子之質體時，該間白素一2 的産量可提高為未插置有trpA轉譯終止子的對照組所生成 者之 5倍Βι·〇-(^θιπ. , 101· 525 (1987))。 除了以上這些研發之外，發展一種符合商業實用性且 具經濟規模的BGH大量生産方法仍為一個持續存在的需要 〇 *· 因此，本發明之目地為提供一種適合BGH大量生産的 表現載體。 本發明之另一目地為提供一種被此一表現載體轉形的 寄主細胞。 本發明進一步之目地則為提供一種包含培養此轉形體 的BGH的大量生産方法。 依據本發明，藉箸製造一種表現載^，提供了 一種改 良的大量生産BGH的方法*其含有一經修飾過之BGH基因， 其中在5 τ端區域之核苷酸序列被修飾但不改變其内編碼的 胺基酸序列，以及一插置於該經修飾過之BGH基因3’端之 後的trpA轉錄終止子；然後在被該載體轉形的大腸桿菌中 ，獲得超過所有蛋白質50¾的産量。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明上述及其他的目標以及特色可由以下敘述，對 照所附圔片而變得清楚，其中： 第1圔比較BGH (ptrphs BGH 1-13)及其變異體（ Ptrphs BGHRAN #5) 5’端區域的核苷酸序列； 第2圖A 描繪一製造ptrphs BGHRAH質體的槪圖， - 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505694 A7 _B7_ 五、發明説明（5 ) 其含一經修飾過之BGH基因； 第 2 圖 B 展示一製造 ptrp3H BGH 1-13 及 ptrp3H BGHRAN質體的概圖，其分別含有BGH基因及一變異體，一 trpA轉錄終止子接於它們3’端； 第3圖提供SDS-聚丙烯醯胺電泳的緯果，其使用被 ptrphs BGH 1-13， ptrphs BGHRAN tf5'ptrp3H BGH 1-13 ，或Ptrp3H BGHRAN質體轉形之大腸捍菌沈澱物；以及 第4圖提出以光密度計決定牛生長激素之量的結果 f 其分別表現於為 Ptrphs BGH 1-13，ptrphs BGHRAN 115， Ptrp3H BGH 1-13,及ptrp3H BGHRAN質體轉形的大腸桿菌 a 細胞。 依照本發明的一値觀點，本發明提供了 一種用於大量 生産BGH的表現載體，其包含有一經修飾過之BGH基因，以 及一插置於該修飾過之BGH基因3 f端之後的trpA轉錄終止 子0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中之經修飾過之BGH基因，為修飾其5’端區域 的核苷酸序列，以減低轉訊RNA二级結構的産生及增加表 現效率，唯其編碼正常牛生長激素中未改變的胺基酸序列 。本發明中之修飾過之BGH基因在5’端區域中偏好擁有下 列的核苷酸序列：
5，-道 GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7_ 五、發明説明（6 ) CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3f 其中ilMBGH基因的轉譯起始密碼。 本發明的表現載體也包含了一插置於修飾過之BGH基 因3’端之後的trp A轉錄終止子，其偏好擁有下列的核苷酸 序列： . 5，-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTT-3f 本發明的表現載體可依照傳統的基因重組或基因合成 方法製備，如下述過程。 首先，根據一 BGH基因核苷酸序列的資料合成隨機引 子（參見韓國專利公開案第92-3665號）。這些隨機引子 被設計將一用於SacI限制酶的辨識址引入BGH ，以及在 不改變其編碼胺基酸序列的情況下，隨修飾編碼BGH的 核苷酸序列。 另製備一引子，其對應於在包含有BGH基因的重組載 體Ptrphs BGH 1-13中之抗青黴素基因的一部分（參見 (韓國專利公開案第92-3665號；ATCC 68975於1992年5月 6日寄存，並有一用於Pvul限制酶的辨識址。接著，使用 上述引子並以Ptrphs BGH 1-13作為模販，一聚合酶連鎖 反應被完成以增量BGH基因。增量後之BGH基因被Pvul及 SacI限制酶切開，並連接於被同種酶切開的ptrphs BGH 1-13質體的DNA片段，以獲得一BGH的表現載體。此表現載 體用於轉形大腸桿舖，一包含有經修飾過之BGH基因的質 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 B7 五、發明説明（7) 鱧被分離並命名為ptrphs BGHRAN。 再者，為了將一trpA轉錄終止子引入BGH表現載體， 一些用於聚合酶連鎖反應的引子被製備出來，其包含有一 — trpA轉錄終止子，一用於Sail限制酶的辨識址，以及 另一用於ΡνιιΙ限制酶的辨識址。 然後，使用上述引子以及做為模販的質體Ptrphs BGH 1-13，Μ聚合酶連鎖反應增量包含trpA轉錄終止子的DNA 片段。此增量後之DNA基因被Pvul及Sail限制酶切開，並 連接於被同種酶切開的Ptrphs BGHRAN質體的DNA片段，以 獲得一 BGH的表現載體。此表現載體用於轉形大腸桿菌， 一包含有經修飾過之BGH基因的質體被分離並命名為 Ptrp3H BGHRAN 〇 本發明的表現載體被用於轉形大腸桿菌細胞，如大腸 捍菌株W3110 (ATCC 37339)，其適合於表現在此表現載體 中的BGH基因。轉形後的大腸捍菌細胞被培養在容許BGH表 現的狀態下，之後被表現的BGH可依據任何傳統方法自培 養基中分離並純化出來。 所以，本發明進一步提供一種大量生産BGH的方法， 其包含培養被本發明之表現載體轉形的大腸桿菌細胞，及 自培養基中分離BGH。依據本發明方法，自此大腸捍菌轉 形體中生産出超過總蛋白質含量50¾的BGH是可能的。 以下的實施例子是為了在不局限本發明的範晴下，進 一步說明它。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 再者，除非待別指出，否則下述之固體於固態混合物 、液體於液態混合物、及固體於液態混合物中的百分比， 分別以wt/wt、vol/vol、及wt/vol為依據。 Μ..1.:經修飾過之BGH基因的增量以及製造包含它的表現 載體 . (步驟1 ) · ^ 用於聚合酶連鎖反應的引子，其對應於BGH的5f端區 域，並有下列的核苷酸序列，依據BGH基因核苷酸序列的 資料被合成（韓國專利公開案第92-3665號）： PBGHRAH 引子： 5 f-TGCTGAGCTCGNAGHACNGCRTTHGCRAANAGNCCNGANAGNGACAT NGCNGGRAANGCCATTTATAATTCCTCCA-3 f 其中N表示A，T，G，或C;以及R表示A或G。 PBGHRAN包含一 SacI限制酶的辨識址，及編碼在BGH N 端的16個胺基酸的經修飾過之核苷酸序列。 再者，包含有Ptrphs BGH 1-13内部分抗青黴素基因 (參見韓國專利公開案第92-3665; ATCC68975)，及一 ΡνυΙ限制酶的辨識址的PPBR3720引子*也被合成出來，其 核苷酸序列如下： 5 f-TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA-3 ’ (步驟2 ) -11 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29<7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 - B7 五、發明説明（9 ) 將做為模販的i>trphs BGH 1-13質體lng、製備完成的 PBGHRAN及PPBR3720引子（步驟1 )各g、10倍聚合酶 反應緩衝液 10 以 1 (10 raM IVis-HCl, pH 8.3, 500 iqM KC1 15 mM MgCl2, (Kl%(w/v)明膠）、dNTP、混合液 10 "1 (dGTP、dATP、dCTP、及 dTTP 各 2 inM)、及 Taq DNA 聚合 酶 2.5單位（Perkin Elmer Cetus, U.S.A*)加入試管；並 加入蒸餾水至100 yl的最終體積。 聚合酶連鎖反應被重覆執行25次，每循環有：95 °C 1 分鐘（變性），55°C 40秒（煉化），及72°C 2分鐘（聚 合化）。 以上獲得的聚合酶連鎖反應産物被置於5¾聚丙烯醯胺 膠體電泳中，且其結果証實約990 bp長的DNA被增量。此 DNA被以上述聚丙烯醯胺膠體電泳純化並命名為BGHRAN片 段0 (步驟3 )
2/ig 的 ptrphs BGH 1-13質體於 NEB (New England Bio-labs Inc·)緩衝液 1 (10 mM BisTris 丙烷-HC1, 10mM
MgCl2, 1 πιΜ DTT, pH 7.0)中，在37°C下 1 至 2小時，被 SacI限制酶完全切開，再於相同的狀況下，在NEB緩衝液 3 (100 irM NaCl, 50 mM Tr is-HC 1, lOfflM MgCl2, 1 inM DTT, pH 7.9)中，被Pvul限制酶完全切開。得到的混合 物被置於0.7%瓊脂糖膠體電泳中，以分離一 2 Kb片段，其 -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂 505694 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明説明（10 ) 被命名為PBGH-T/P片段。 在步驟2中獲得的BGHRAN片段2以g，在NEB缓衝液1中 ，被Sac I限制酶完全切開，之後再在NEB緩衝液3中，被 Pvul限制酶完全切開。得到的DNA片段以酚/氯仿萃取， 之後再溶解於20 /i 1的TE緩衝液中。此.DNA片段命名為 BGHRAN-T/P片段。" 使用上面得到的DNA片段，一接合反應依下列方法進 行。將BGHRAN-T/P及PBGH-T/P片段各100 ng、10倍接合緩 衝液2 /i 1、及T4 DNA接合酶10單位置入反應管中；之後 加入蒸餾水至20 的最終體積。此接合反應在16°C下進 行12小時。 大腸捍菌株W3110 (ATCC 37339)被此接合混合物轉形 ，以得到一重組的大腸捍菌轉形體，其^有包含BGHRAN片 段的Ptrphs BGHRAN質體（參見圖2)。 例2 :經修飾過之BGH基因的表現及該基因的定序 (步驟1 ) 約100値在例一中得到的大腸捍菌菌落被培養於含有 50^g/ml青黴素的液態Luria培養基（6¾細菌胰蛋白腺， 0.5¾酵母菌萃出物，1% NaCl)中，在37°C下12小時。此培 養基3 ml被轉植入300 ml的M9培養基（40niM K2HP〇4,22 mM ΚΗ2Ρ〇4, 8·5 ibM HaCl, 18·7 mMNHiCl, 1¾¾ 萄糖，0·1Μ MgS〇4，0·1 mM CaCl2, 0.4¾ 酪蛋白胺基酸，l〇wg/ml 維 他命Bl, 40 μ g/ml青黴素）中，在37°C振盪培養4小時。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11 ) 當該培養基在650 nm的O.D.值約達0.3時，加入吲哚丙 烯酸（IAA)到培養基中至50v g/ml的最終濃度。經4小時後 ，得到的培養基之O.D.被決定，且該培養基在ll,〇〇〇rPin下 離心25分鐘，以收集大腸捍_細胞沈澱物。該細胞沈澱物 被置於15% SDS-PAGE中，利用Laemπι Π的方法（Nature · 680 (1970))驗証BGH的表現。展出較含有ptrphs BGH卜13質體（對照組）的大腸桿菌轉形體之BGH表現量高 出40¾的菌落被挑選出來，且其含有的質體命句為Ptrphs BGHRAN #5 (參見圖 3 )。 (步驟2 ) 在步驟2得到的ptrphs BGHRAN #5質體中BGH基因的定 序如下。Ptrphs BGHRAN #5質體在NEB緩衝液1中，被SacI 限制酶完全切開，之後再在NEB緩衝液3中，被EcoRI限制酶 完全切開。此反應混合物被置於7%聚丙烯醯胺膠體電泳中 ，以分離一約187 bp的DNA片段，其命名為BGHRAN-T/P。 另一方面，2 yg的M13mpl8質體在NEB緩衝液1中，被 SacI限制酶完全切開，之後再在NEB緩衝液3中，被EcoRI限 制酶完全切開。得到的混合物被置於〇. 7¾瓊脂糖膠體電泳 中，以分離一約7 Kb的DNA片段，其命名為M13-T/P。將BGH RAN-T/P及M13-T/P片段各100 ng、10倍接合緩衝液1、 及T4 DNA接合酶10單位置入接合反應管中·，之後加入蒸養留 水至20 ul的最終體積。此接合反應在16°C下進行12小時 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2Κ)Χ297公釐） (.請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 將得到的接合混合物與200 // 1的大腸桿菌株JM105 (ATCC 47016)細胞混合，再於此混合物中加入0.2 M IPTG 溶液8/il、預先培養的助細胞（大腸桿菌JM105) 100 、2XYT上層瓊脂（軟瓊脂；每升16 g細菌胰蛋白腺，10 g 酵母菌萃出物，5 g NaCl, 5 g Bacto-agar)、及 4¾ X-gal 25 u 1。此混合物塗開於Min A>板上（每升l〇,5g KH2P〇4，1 g (NH4)2S〇4, 0·5 g 檸檬酸鈉，12邑83(^〇-agar, 1 ml 20¾ MgS〇4, 0·5 ml 1¾ 維他命 B, 10 ml 50¾ 葡萄耱），之後在37°C下培養12小時。 産生於培養基上半透明的噬菌斑被挑起，並轉植至2 ml的2XYT液態培養基中，然後在37° C下培養5小時。此培養 基被離心，以得到上清液，並將1/4體積的PEG/NaCl (20% 聚乙二醇，2.5 M NaCl)加入此上清液。無M13噬菌體自上 清液中分離；自其中萃取出單股DN A，：並確認BGH基因5’區 域的核苷酸序列（參見圖1 )。 &LR......：製造一包含trpA轉譯終止子基因的表現載體 (步驟1 ) 為了增量trPA轉譯終止子基因及將其插入例2中製備 的BGH表現載體，以下的引子被合成。 PTRPATER引子： 5 ^GCTTTGTCGACTAATTAAAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTG CCTCGCGCGTTTCGGT-3， PTRPATER引子包含一用於Sail限制酶的辨識址，且其 _ 15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 中第23至50及第51至67的核苷酸，分別對應於trpA轉譯終 止子基因及BGH基因V端之後的核苷酸序列。 如下所述，PPBR3740引子對應於ptrphs BGH 1-13質 體中之抗青黴素基因的一部分，且包含一用於Pvul限制酶 的辨識址。 PPBR3740引子·· 5，-TGACMCGATCGGAGG‘ACCGAAGGA-3， 將作為模販的Ptrphs BGH卜13質體1 ng、於（步驟 1 )製備完成的PTRPATER及PPBR3740引子各g、10倍聚 合酶反應緩衝液 10/i 1 (10 inM Tris-HCl, pH 8.3,500 πιΜ ΚΙ, 15 mM MgCl2, O.UU/v)明膠）、dNTPfs 混合液 10 以 1 (dGTP、dATP、dCTP、及 dTTP各 2 ®M)、及 Taq DNA聚 合酶2.5單位加入試管‘，並加入蒸餾水至100m 1的最終體 積。聚合酶連鎖反應被重覆執行25次，每循環有：95 °C 1 分鐘，55°C 40秒，及72°C 2分鐘。 以上獲得的聚合酶連鎖反應産物被置於1%瓊脂糖膠體 電泳中，以確認約1·5 Kb長的DNA被增量。此DHA被以上述 同樣的瓊脂糖膠體電泳純化並命名為PBR片段。 (步驟3 ) 2/ig的Ptrphs BGH 1-13質體於NEB緩衝液3中，被Sail及 Pvul限制酶完全切開，得到的混合物被置於0·7%瓊脂糖膠 體電泳中，以分離一約1.5 Kb片段，其被命名為PBGH-P/L 片段。 在例2之步驟1中獲得的ptrphs BGHRAN 質體 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 _B7__ 五、發明説明（14 ) ag，在NEB緩衝液3中，被Sail及Pvul限制酶完全切開， 得到的混合物被置於0.7¾瓊脂糖膠體電泳中，以分離一約 1.5 Kb片段，其被命名為PBGHRAN-P/L片段。再者，在步 驟2中獲得的ptrphs BGHRAN 質體 2m g，在NEB緩衝 液3中，被Sal I及Pvu I限制酶完全切開。得.到的DNA片段以 酿/氯仿萃取，之後再溶.解於20 /i 1的TE緩衝液中。此 DNA片段命名為PBR-P/L片段。 使用上面得到的DNA片段，一接合反應依下列方法進 行。將PBGH-P/L及PBGHRAN-P/L片段各100 ng，分別加入 二反應管A及B中。於各管中加入PBR-P/L片段100 ng、10 倍接合緩衝液2 /i 1、及T4 DNA接合酶10單位；之後加入 蒸餾水至20 Ml的總體積。此接合反應在16°C下進行12 小時。 ! 大腸捍菌株 W3110 (ATCC 37339)依據 〇3(：12法(Hale-cu 1 ar Cloning* A Laboratory Manua 1 ,被此接合混合物 轉形* Cold Spring Habor, 1982)，以得到重組的大腸捍 菌轉形體，其含有Ptrp3H BGH 1-13質體（管A)或 ptrp3H BGHRAN質體（管 B )(參見圖 2)。
例4 :利用包含經修飾過之BGH基因及trpA終止子的表現 載體表現BGH 將在例3得到的大腸桿菌轉形體振盪培養於含有50 Mg/ml青黴素的液態Luria培養基（6%細菌胰蛋白腺， 0.5%酵母菌萃出物，1¾ KaCl)中，在37°C下12小時。此 -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —· 訂 505694 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（15 ) 培養基3 ml被轉植入300 ml的M9培養基（40 mM K2HP〇4, 22 mM ΚΗ2Ρ〇4, 8·3 mM NaCl, 18.7 mM NfUCl, 1¾¾ 萄糖， 0.1MMgS〇4, 0·1 πιΜ CaCl2, 0·«酪蛋白胺基酸，10 χ/g /ml雒他命Bl，40 Aig/ml青黴素）中；在37°C振盪培養4 小時。 當該培養基在δ50 nm的O.D.值約-0,3時，加入吲哚 丙烯酸（IAA)到培養基中至50/i g/mi的最終濃度。經4小時 後，得到的培養基之0 . D .被決定，且該培養基在離心機中 (Beckman J2-21, JA14 轉盤）以 ΙΙ,ΟΟΟγρπι 離心 25 分鐘， 以收集大腸捍鋪細胞沈澱物。該細胞沈澱物被置於15¾ SDS-PAGE 中，利用 LaemmH的方法（Nature· 227· 680 (1970))驗証BGH的表現。其結果表示於圔3。 如圖 3 所示，被 ptrp3H BGH 1-13 或 ptrp3H BGHRAN 質 體轉形的大腸桿菌細胞所産生之BGH量，分別為細胞中所 産生的蛋白質總量的39.9%及57.3%。這些産量此被ptrphs BGH1-13或ptr>phs BGHRAN #5轉形的大腸桿菌細胞所産生 的量，亦即26.3!«及39.9¾，分別高出40至50¾ (參見圖4 )° 依據布達佩斯條約對於為達專利程序之目的*而對微 生物寄存的國際認可所設定之規定，被f>trp3H BGHRAN質 體轉形的大腸桿謹株W3110於1994年12月26日被寄存於韓 國典型菌種收集中心UCTC)(住址：GERI, KIST, Ρ·0.
Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, the Republic of 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 505694 ! 年月β τ' τ' 9l Q3 A7 1 B7 五、發明説明（16 )
Korea)，寄存编號為 KCTC 0143BP(CCRC 940123 卜 當本發明已就上述待定的實施例予以描述時，應可了 解到精熟此技者可以做出本發明之各種的修飾及變化，而 仍落在以下所附申請專利範圍所界定的本發明之範圍内。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
9 1X 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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- 505694 ................................... u- -Irt-r — 一—…嫌麟j- AO ㈣,ΤΠ 秦 fP| il 您月日， L8 Μ—巧-- 六、申請專利"範面^" —^ 第085106241號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正日期：91年4月 1 · 一種用以製備一供用於牛生長激素（BGH)基因的表現 載體之方法，該基因包含：一啟動子、一經修飾之BGH 基因及一終止子，該方法包含有：修飾該位於BGH基 因之5 '端區域的核苷酸序列，俾使mRNA二級結構之形 成降至最低並增加表現速率，但不改變該BGH基因内 所編碼之胺基酸序列，將所得之被修飾BGH基因插置 於一包含有一啟動子及鮭魚生長激素（SGH)基因或其 部份之習知載體内，俾使該經修飾的基因存在於該 SGH基因或其部份之3 '端，並將一個包含有隨附序歹》J 之trpA轉錄終止子於該被修飾BGH基因之3 1端後被 插置於所得載體内：· 5 < -AGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTT-3 < ° 2 · 如申請專利範圍第1項之方法，其中該經修飾過的牛 生長激素基因的V端區域包括如下之核苷酸序列： 1 -ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-31 其中ATG是該BGH基因之一轉譯起始密碼子。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該表現載體為 ptrp3H BGHRAN 質體(KCTC 0143BP) (CCRC 940123) 〇 4 · 一種用於製備大腸桿菌轉形株之方法，其包含利用如 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂丨 :嫌_ 505694 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 申請專利範圍第1至3項中任一項之表現載體來轉形 大腸桿菌細胞。 5 . 如申請專利範圍第4項之方法，其中該大腸桿菌細胞 為大腸桿菌株W3 110。 6. —種用於大量生產牛生長激素（BGH)之方法，其特徵 在於：製備一供用於BGH之表現載體，該表現載體含 有一被修飾之BGH基因，其中位在該基因5,端區域之 核苷酸序列包括下列核苷酸序列： 5 1 -ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-31 (其中ATG為該BGH基因之轉譯起始密碼子)， 一個鮭魚生長激素基因或是其部份存在於該經修飾之 BGH基因的5,端上，與一個trpA轉錄終止子被插置在 該經修飾之BGH基因的3 *端之後； 利用該表現載體來轉形大腸桿菌細胞；培養該大 腸桿菌轉形體；以及由培養基中分離出牛生長激素。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂— .#線_ -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐）
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