TW213488B

TW213488B -

Info

Publication number: TW213488B
Application number: TW080102185A
Authority: TW
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 1993-09-21
Also published as: FI911367A0; AU643511B2; PT97081B; NZ237506A; NO911138L; US5559007A; ATE174055T1; AU7355891A; HUT57263A; ES2125864T3; DK0449770T3; HU910958D0; BR9101137A; EP0449770B1; FI911367A; EP0449770A3; DE69130544T2; EP0449770A2; CA2038706A1; DE69130544D1

Description

213463 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（1) 五、發明説明轻明夕绪城本發明偽有關基因工程領域且提供新穎DNA分子，其中包括多功能後製起點及/或乳球菌屬培養上清液中之之最查富蛋白質，後文稱為主要分泌産物（MSP)之编碼DNA Λ 序列，其倍號呔及/或MSP基因起動子之编碼DNA序列。新穎DHA分子用來生産至少一種大脹桿菌及乳球菌颶中择殖DNA用的新穎穿梭载體，或用來生産表現同源或異源基因用的載體及於革蘭氏陽性菌如乳球_屬及m m m 中生産分泌的基因産物。^ m > ^ m 於基因工程技術中，雖然已知異源或同源基因擇殖用之無數種原核媒介-寄主-糸統，但仍然持纗需要有擾於已知条統的新潁糸统。大部分DNA技術之重組工作偽使用細菌例如大腸桿菌或枯草桿菌進行。但乳酸ϋ相當令工#界感興趣。®此之故，多方面致力於開發於乳酸菌.持別乳捍菌屬及乳球屬中擇殖及表現同源及異源基因用的質體載體L參見 Gasson PCTW085/03945&Anderson(1985),EP-A-0316677, Λ Bates e t al. (1989),Jos e t al. (1985 )¾ Chassy(1987) 及De Vos ( 1987)之綜論〕。乳球菌屬先前稱為鍵球菌屬 Ο 至今為止，曾經研究的乳球菌品条攥帶有一種特激性 ...................................................裝...........................玎..........................._ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）

2134BB A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（2) 質體補醱偽由多值不同的霣體所組成。此種性質可用來鑑別各種乳球菌品条（Davies et al.，1981)。供遣傳研究之用，於質醴功能研究過程中，曾經藉反複熟化構成' 不含質體的品糸（De Vos.1 987 )。舉例言之，乳酸乳球_ 7 1 2 ,後文稱之為乳酸乳球菌 LL 712之質證補體偽由5質體所組成，其分別具有分子量1.8Md,2·5Md,5.2Md,9M¢i及33Md且，分別定名為pSH71 ,pSH72. pSH73, pSH74 , plp 712 (Gasson, 1983). 基於乳酸乳球菌之質睦PSH71及基於相關的乳脂乳ϊ$ 里質體pWV01(0tto..l982).曾經構成多種擇殖载體擇殖載體之生産方式為或藉著將基因標記例如抗生素抗藥性基因嵌入質腌内，或藉箸篩檢質睹段之複製功能起點，亦即篩檢持SDNA段之保持複裂能力而生産。依據後述方法所生成的择殖載禮為P N Z 1 2 ,其中含有包括複製起點的PSH71之1.7 kbp CUI約束段（Gasson and Ande「son，1985)。PSH71之複裂起點於其他革蘭氏陽性菌如捍菌腸及革闌氏陰氏大腸桿菌也有功能。基於此等質暖，曾經開發π用於乳酸菌體内引進及表現同源或異源基因用的择殖载禮。發展擇殖載體。結果導致性質改良，且可用於食品及飼料工業的轉形乳球菌品糸，例如噬_體抗性乳酸乳球菌品条（EP-A-0316677) 或可産生牛前凝乳酶之乳酸乳球菌品条（PCT WO 85/03945 )。開發生産同源或異源基因産物用之擇殖载體，不僅 -4 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂· •線· 甲 4 (210X297公笼） A 6 B 6 經濟部中央標举局印製 P.134SS 五、發明説明（3 ) 由於乳酸菌細胞改良而令人感興趣，同時也由於生成重组蛋白質而令人感興趣。於微生物表現糸統生産異源蛋白質之一大問題為産物之純化問題。細胞内蛋白質之純化耗時且經常産率不良。若産物從寄主細胞内分泌出，則可顯著加速純化作用。欲求避免於細菌體内表現的産物之純化問題，可用來生産已经分泌入上淸液内之重組蛋白質用的媒介-寄主条统相當有用。分泌性的蛋白質之另一優點為可具有天然的且具有生物活性的組態，由於其隨後無需再度摺《過程之故。若多肽沈積於胞内，通常需要再度摺叠。蛋白質之分泌通常於一次轉譯産物的按基端需要有一傾可指引蛋白質進入分泌路徑的倍號呔。若倍號呔於通過细胞楔之轉位過程中藉著稱作用從蛋白質上割裂，刖更優異。然而，情況往往並非如此。發明夕目的及解块：> 港提供新穎雜交载體其可於革蘭氏陽性及革闌氏陰性菌内複裂及/或其允許表現同源或異源基因且時安定的蛋白質産物分泌於上淸液内者，此乃本發明之一目的。特別，此目的可藉箸本新穎雜交載體而速成，本載體包括一新穎DNA插子，其中包括起動子區，佶號呔之編多碼DNA序列及至今未知的呔编碼基因之编碼區，此種多 A 呔為上清液經TC A沈澱，沈澱蛋白質經SDS-聚丙烯醛胺電泳及凝膠使用庫馬西亮·染色後判定為乳酸乳球菌之 -5 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）二 A6 B 6 2134S3 五、發明説明（4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上淸液内最竇富的蛋白質，於本文中稱之為主分泌蛋白質（HSP)。 .至於本發明之目的的另一解決之道為新顋雜交载體其中包括從乳酸乳球菌LL712之2.5Md或5.2Md質體衍生而得的複製起點，或其相鼷複製起點，其可於革《氏陽性及革蘭氏陰性_發揮功能者。如此，本發明之目的的另一解決之道傜提供新穎雜交載體，其中包括起動子區，倍號呔之编碼DNA序列及/ 或MSP基因或相關基因之编碼區及從乳酸乳球菌L L 7 1 2之 2.5Md或5.2Md質睡衍生而得的複裂起點或其相關複製起點。 · . 本發明tt關傣新穎DNA插子之功能段或複製起點本身。其可用於生産從乳酸菌分泌同源或異源蛋白質用的新穎表現載禮。本發明又提供一種新穎DNA分子及雜交载體之裂法，及利用以本發明之新穎雜交载體轉形的寄主生産分泌的基因産物之方法。本發明也提供纯質形式的MSP蛋白質。發昍连细說明 ΠΝ A 分？本發明偽有鼷一種雜交载體其中包括 a )質睡pUCRS之約3 . 5kbp EcoRI/Sall乳酸乳桿菌插子經濟部中央標準局印製，或其功能段，或甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6

2134SS 五、發明説明（5 ) b) 輿所述插子或與其功能段雜交的DMA序列.或包括天然與此種雜交的DNA序列作操作性驕结的起動子匾，或 c) 涵蓋於a)或b)中且编瑪著倍號呔之DN A序列之簡倂性序列，或 d) 涵蓋於a),b)或c)中之DNA分子衍生物.及/或 e) 下列各者之祺裂起點：(I).乳酸乳球i!LL712之2.5Md 質睹，或（II)乳酸乳球_[^712之5.2Md質體，或（III) 如同乳酸乳球菌L L712之2.5Md質腥或5.2Md質暖之不相容組的質體。質 S pUCRS之約 3 . 5kbp EcoR 1/ Sa 丨插子包括MSP基因之起動子區，MSP倍號之ifi碼DHA序列及 MSP编碼區。附箸箸其倍號呔之MSP於後文中稱為P「e-MSP。EcoRI/Sall插子包括1920 bp長DNA序列，於序列表列中定名為SEQ ID No. 1;而其取向為絵基位置1位在 EcoRI址近端。 MSP之编碼區從SEQ ID No.l序列之耱基位492伸展至驗基位1 7 93。编碼著27胺基酸長MSP倍號肽的DKA序列從起動子區之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. .線· 成 0 1 展No 伸 D \—/ T1 文 Q E 後 S 見義 (¾之端言末換熟從序點4C 起至列展序伸 A 1 N 1 D 4 瑪位编基之齡 P 71 S 之列出泌分胞细主寄從霣白 i 5 致導段能功其或呔號倍經濟部中央標準局印製菌球乳酸乳如H-® 之酸質孔白如蛋例要號倍與偽端只 P $ , Μ 菌。桿可金即 s 聯蘇鍵如價颶共菌端桿C-或之，呔 7 甲 4 (210X297公釐） 213488_B6_ 五、發明説明（6) 信號呔之C -端及有待從寄主細胞内分泌出的蛋白質H -端間産生共價鍵，可藉箸下述方式獲得5生産一棰融合基因，其中MSP倍號呔之全體编碼DHA序列或MSP倍號呔之官能段（其中包括C -端）之编碼部分像藉著適當解讀架與期望蛋白質的编碼結構基因之5’端聯結者。此穩融合基因例如SEQ Ho.2 DNA分子，其中包括MSP倍號呔之编碼 DNA序列及水蛭素結構基因。 MSP信號呔及MSP之胺基酸序列也示於SEQ ID No.l序列中。 MSP基因之起動之區位在MSP倍號呔之鱅碼DNA序列上游，其中包括至多約1 5 00，較好至多約100至1000核苷酸，於質體pUCRS之約3.5 kbp長EcoRI/Sall乳酸乳球闺插子中，起動子區從插子之EcoRI切割端（插子位在相當於SEQ ID Ho.l DNA序列之位置1的齡基上游）伸展至齡基位411。特定言之，起動子匾從位在相當於位置1之酴基上游的第一 Hind III約束址伸展至_基位411。起動子區可結合RNA聚合酶及調節蛋白質；且可控制與起動子匾作操作性聯結的結構基因的表現。功能段一詞包含保有起動子，倍號及/或結構功能的該等DNA段。經濟部中央標爷局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 較佳功能段為含有MSP起動子區，MSP倍號呔或起動子區之編碼DNA序列及MSP倍號呔之編碼DHA序列者。依本發明之段也可由保有MSP起動子活性之較小段及/或具 -8 - 甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6 9.134BB_ 五、發明説明（7 ) 有倍號呔活性的呔鼷碼較小段所組成。具有起動子功能之段，例如為第一齡基始於約3.5kbP EcoRI/Sa丨I乳酸乳桿菌插子的EcoRI切割端者.或特別始於Hind III址且伸展至相當於SEQ ID No.1序列之位 410之齡基者。其他具有起動子功能之段僳S自下述段：始於EcoRI輿Hind III址間之任一齡基而終於SEQ ID No. 1序列約位410之齡基。/較短的起動子區中之段也保有起動子活性。信號呔之編碼DNA段，例如從SEQ ID No.l序列之約略鹸基411伸展至齡基49U其可於5’端延伸一起動子區之段，其未保有起動子活性者。保有MSP起動子功能且编碼著倍號呔之段從插子之EcoR I 切割端（插子位在相當於SEQ ID No.1 DNA序列之位置1 上游）伸展至齡基位491。其他保有MSP起動子功能且编碼著倍號呔者從Hind III約束址（位在相當於SEQ ID No.1 D N A序列之位置1的齡基上游）伸展至相笛於位置4 9 1之酴基附近。其他保有MSP起動子功能及編碼著倍號肽之段偽選自下列各段：始於所述E c 〇 R I與H i n d I I I址間之任一鑛基而終於SEQ ID No. 1序列之位置491附質的_基〇段可含有聯結子，可成功地輿其他DNA分子躱結。前述段之適當聯結子具有適合嵌入DNA約束址之DHA序列ί 而段偽有待與此址聯結者。段也可含有預定約束址。甲 4 (210X297公釐） ...................................................^...........................、可...........................線- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經齊邹中"漂^¾卬製經濟部t夬揉莩局印製 A6 2l34Si3-——-- 五、發明説明（8) 舆所述插子雜交的DNA分子俱於習知條件下雜交。習知雜交程序例如由Benton及Davis(1977)所述。此種雜支DNA分子例如包括MSP編瑪结構基因之變醴作雜交DHA 序列，此種雜交變醱於後文中也稱為MSP基因相两结構基因。此種相鼷基因之编碼蛋白質稱之為MSP相闢蛋白質。如此，以天然作業方式舆可舆所述插子雜交的DNA 序列聯结的起動子區為MSP基因相鼷基因的起動子匾。 HSP基因之相阕结構基因例如為從乳酸乳捍菌以外之另一棰细菌衍生而得的天然愛居，持別得自另一種乳酸 m m 乳捍菌騷或乳球菌屬如乳脂乳球窗或睹热乳球窗。也可為/染色程或乳酸乳挥齠天然的質S5上之同基因所编碼的天然受§5。包活MSP基因相13基因的DHA分子可依習知方法革《。本發明之DNA分子&具有簡讲性DNA序列。其於基因81之定義範圍内簡併，亦即無限數目之核¥酸由其他核苷酸所S換而未改變其编碼胺基酸序列。具有此種簡讲性D Η A谇列之分子也有用.结因於其約束址不同，或搛因於在持定寄主内字瑪子之用途較佳之故，較佳者為MSP倍號呔编瑪DH A序列之筇倂性序列或其變睡。衍生物一w當與a),b)或c)所涵蓋之DHA分子連接使用時包含段，此種DNA分子之突變S或較大衍生物。衍生物一詞也包含段之較大衍生物或此種DNA分子之突變腥β 較佳者為保有起動子，倍號或结構功能之段。此等段之 -1 0 - 甲 4 (210X297公Φ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· A 6 B 6 213488 五、發明説明（9) 範例如前文所述。 a),b)或c)所述之DHA分子突變體例如為具有缺失，嵌合，倒位，或酤突變之DNA分子，其可天然出現或以人工方式依據習知方法於活匾或於試管試驗中引入DN A分子。突變體可顯示改變的約束圖案。 a),b)或c)所涵Μ之DNA分子之較大衍生物例如為可從乳酸乳球_之基因組切下。其見於以如下方式獲得的IL 酸乳捍菌LM0230之基因組庫：經由將核酸分段，使用適當約束酶如 Sau3AI,EcoRI,BaiaHI or Hindlll處理段. 接合入適酋载體内，例如λ噬菌賭λ EMBL3或質體PBR322 ，例如於大腸捍菌内擇51，及再度使用相H或另一種@ 通蓋於a)，b)或c)之DNA分子之较大衍生物也屬於具

當約束酶切割。有旁出序列的重组D N A分子，例如包括 A 可提供適當約束址之聯結子，或包括4¾節序列例如起 Λ 炎動子，倍號呔或終結子编碼DNA序列，及結因安置於

A 適酋距離或解讓架之睇結子；或包括衍生自載體例如用來構成雜交載體的噬菌賭或質體之序列。較大衍生物所包括的旁出序列可生成融合基因。 ...................................................^............................玎...........................瘅· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 菌球乳酸乳自或或體質得同而如生自衍或. .體暖質質的 Hd組 2容 -) 相不樣同體質如於，.及菌，球菌乳球 Π IU 例脂，乳製或 •E球帛乳 @酸乳乳| 於基睡酵質乙成二造，點菌起球裂乳複酸的乳菌捍腸大 0 桿腸大經濟部中央標準局印製酸乳或複内菌性於陽可氏也鼷或革製之複外内以菌鮮性如陰腸氏菌蘭桿一革如之例外，以製甲4 (2WX297公釐） 213488 m3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（10) 遂金桿菌。自乳酸乳球_1^712 2.5»^或5.21^質腰或自如同2.5 M.d質體或5.2Hd質體同樣不相容組的質饑衍生而得的複製起點，例如包括於使用適酋約束内核酸酶處理後所得的全體各別直線化質鼹。如此，本發明之雜交载體也腸於包括2.51^或5.2»^質睡之0“序列金體，或包括與2.5 Hd或§.2Md質體同樣不相容組質體之DNA序列金腥。兩種質賭例如可單離自以DSM 5804託存於DSM之品糸乳酸乳球菌LL712〇作為複製起點功能的DHAtt羼於保有複裂起點之任一質睡段。此種DNA段例如可S箸下述方式捎得.：例如以物理力如剪力，或以化學切割反匾.或以_切割D Η A如核酸痴如外核酸酶Ba丨31,S1或外核酸梅III，或内核酸酶如約束内核酸義將各別質皚或其段分段之後單離而得。持別，此種DNA段為以如下方式獲得的約束段；使用一種或兩種不同的約束内核酸薛逋理各別質體或其段後所得，約束内核酸_以2.5Md質®為例為Ndel,SphI及/ 或EcoRV;而以5.2Md質體為例例如為Sau 3A,NdeI,Hind III,AccI及 / 或 EcoRI。 2.5Md質鱧之複製起黏例如位在下列各段上：約1.8kbP 長Ndel/SphI段，約3.5kbp長SphI段經EcoRV部分消化後所得的約3.1 kbp長EcoRV/SphI段，約3.5kbp長SphI 段，約 1.2kbp 長 Ndel/EcoRV 段， -12- 甲 4 (210X297公釐） ...................................................裝...........................-可...........................缘 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A 6 B 6 81. 2. 13 ^iaAB.3- 五 '發明説明（11) 約 2 . 5 k b p 長 E c o R V 段.或約 3 . 5 k b I» 長 S p h I 段經 E c o R V 部分消化後所得的約3.51^0長£(：〇〇/5?111段。前述約3.5 kbp長SphI段及其他段也包括PSC12内。PSC12之生産敍述於實施例1.2。約束拼圖示於第2疆。

5.2Md質體之複製起點例如位在下列各段上••約i.OkbP 長 N d e I / H i n d I I I 段.約 2 . 2 k b p 長 N d e I / A c c I 段.長 2 . 7 kbp 長 Ndel/EcoRI 段.约 3.1kbp Ndel/Sau 3A段·約 2.0kbp長 Sau 3A/HindIII 段，約 3.2kbp長 Sau 3A/AccI 段，約 3.7kbp長 Sau 3A/EcoRI 段.或约 4.1kbp長 Sau 3A 段。具有Sau 3A切剌端之段偽於5.2Md質鳢.pSC18或此等質眭之睡當約束段經.過Sau 3A部分消化後所得。PSC18 之生産述於S施例1.3。約束拼圈示於第3圖。相同的不相容组的質體無法棰定地共存於同一细胞内。此等質體鶼帶有相關的複裂起點。重组DHA分子例如確實含有衍生自載體如噬菌篇或質 S的聯結子及/或序列，及任意含有揉記基因例如抗蕖性標記基因如紅徽素，安比西林.或四琛素抗蕖性標記基因等。包活本發明之複製起黏的重组DHA分子例如為乳酸菌之載體質暖，較好為至少可於乳酸豳及大腸桿菌 g内後製的穿梭载體；而其中本發明之從乳球菌衍生而得的起黏為唯一的複製起黏。較佳穿梭載體為 pSC12.pSC12A P,pSC12A N,pSC12A NP ,pSC18,pSC18A P,或pSC18A N。用於乳酸®内表現外來 -13- 甲 4 (210X297公釐） ...................................................^...........................#...........................Ψ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) * 經濟部中央標箏局印製 A 6 B 6 經濟部中夬標準局印製 2134HB—— 五、發明説明（12) 基因的較佳穿梭载體為.pSC12HIR,pSC12HIR-1或pSC12 HIRTeri較佳穿梭載體述於實施例中。 .涵蓋於如上e)之範園内的可至少於乳酸菌及大腸桿菌體内作複裂起點功能的DHA序列也靨於前文所定義之DNA 序列之倒位，嵌合，缺失或點突變體而其仍保有複製起點功能者。此種突變蹬於真正複製起點旁出的DNA序列中具有改變後之核苷酸序列，例如可引起複製址圖案改，pSC12ANP, pSC18AP, 變之點突變，或缺失突變體例如質體pSC12^P,pSC12AH，a ，或，pSC18AN之乳酸乳球_插子（參見表1)。前述真赏複裂起點偽指可作為後製起點功能的最小DNA段。本發明之雜交载體可用於寄主如徽菌或持別細菌體内擇？I。雑交载雊可衍生自基因工程業界有用的任一種栽，例如噬菌睡，宇宙體或質體。例如下列各者之衍生物：giggA例如NM989或EMBL3,噬菌醴M13,例如M13 πρ18 或 H13mpl9.細 _ 質饈例如 PBR322. PUC18或 PUC19 或乳爵菌質睡，或酵回菌質膜例如酵母菌2u質體，或者也可為缺陷噬菌龉或缺陷質賭有允許此棰缺陷噬菌賭或質屋複裂的铺肋性噬菌鱧或輔肋性質體共存。本§明之雜交載禮包括涵蓋於a)，b),c)或d)之DHA分子之核苷酸序列。雜交載體持別包括約3.5kbp EcoRI/ Sa 1 I乳酸乳球菌插子，MSP停號呔之编碼段及/或MSP基因之起動芊。依嵌入雜載體之本發明之DNA分子之類別而定，载體可包括雜交S表現控制序列。此種雜交體表 -1 4 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂· •線. 甲 4 (210X29了公笼） A6 B 6 2i34S; 五、發明説明（13) 現控制序列部分像由涵蓋於a),b)或c)之DNA分子所組成

;而部分像由輿涵蓋於a),b)或c)之DNA分子不同的DNA

分子所組成。舉例言之，.雜交載體包括MSP起動子與MSP Λ 信號fe之編碼DH Α序列组合，MSP倍號呔之编碼DN Α序列與M S P起動子以外者組合。此外，本發明之雜交裁體任意包括轉錄終結子區，如大腸捍闺之trpA轉錄終結子。包括本發明之龟號肽缠辑DNA序列之雜交載體，換言之，衍生自P「e-MSP基因或相阕基因之雜交载體，可用於乳酸菌，持別乳球ϋ屬,尤其乳酸乳球菌或乳脂乳球選或其他細菌例如_屋如蘇蚕金桿菌睡内生産分泌性基因産物。此種雜交載體包活可於期望菌腌内發揮功能 . 的起動子，例如可於乳酸菌S内表現的HSP起動子，及任意包括可於期望菌體内§揮功能的轉綠終結子區。使用终結子若與各別同源或異源结構基因睇結，則可增加重組基因産物産量。舉例言之，若大腸捍菌之t r ρ Α終結子與水蛭素基因作操作性犇结且於MSP起動子及MSP倍號呔之编碼DNA分子的控制下於乳酸菌睡内表現時，去硫酸根水蛭素之産量女增。本發明之雜交載禮也包括可於期望寄主如乳酸菌及/ 或桿菌靨及/或大腸捍崮發揮功能的複製起點。攜帶複製起點而至少可於乳酸菌腥内發揮功能之DNA 序列例如為乳球®質腥PSH71之1.7kbp CUI段（Gasson and Anderson,1985)或如前定義之DNA段其中包括乳酸 _ 1 5 _ 甲 4 (210X297公赞） ...................................................裝...........................訂...........................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部中央標準局印製 9Λ3483 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（乳球菌LL712之2.5Md質龌或5.2Md質體之複製起點者。本發明之雜支载體可含有S擇性楗記。榡記的S择像取決於有待轉形，遘择S擇殖的寄主。由於樣記作表現型表現而有助於選擇轉形體的任一種標記基因皆可用。適當標記待別為表現抗生素抗藥性，亦即抗红徽素，四環素或安比西林者，或以異養型突變體為例，適當標記可為與寄主病變互補的基因，如乳糖代謝路徑基因。本發明之較佳具龉例為包活同源或異源結溝基因之雜交載禮，例如HSP或持別為後文所定義之異源结構基因 ,其於適當解讀架内與MSP倍號呔编碼DNA序列作操作性聯结且，可於MS Pjg動子或異源起_子控制之下表現者。結構基因可來自病番，原核細胞或真核細胞且可衍生自基因組D N A或衍生自經in RM路徑製得的c D N A ,或可以化學方式合成。結_基因可编碼廣泛多種有用多呔，包含糖基化多呔，特別來自高等真核生物，持別哺乳動物如動物或尤其人膜來源者，例如酶可用於生産營養素及進行化學酶反應，或多呔可用於治療人或動物疾病或預防疾病者，例如激素，且免疫調理。抗病毒及抗臞裔性質之多呔，抗醴，病毒抗原，疫苗，凝血因子，食品等〇此等異源結構其因之例例如為下列各者之鏞瑪基因：激素例如分泌素，胸腺素，鬆弛素，促錚素，促黃S化激素.副甲狀腺激素，促醫上腺皮質素，黑素细胞剌撖 -1 6 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •線· 甲 4 (210X297公釐）

9.134SB Α6 Β 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（15) 激素，/3-親脂素，尿抑爾素或胰岛素；生長因子例如表皮生長因子，仿胰A素生長因子（IGF)如IGF-I及IGF-II 肥大細胞生長因子.神經生長因子，神經謬質衍生而得的神經细胞生長因子，或轉形生長因子（TGF)如TGF)3 ,生長激素如人或牛生長瀲素，間白素如間白素-1或-2 ，人巨噬细胞遷移抑制因子（MIF);干擾素例如人α-干擾素如干擾素- αΑ,αΒ,αΙ)或otF, /8-干擾素，7-干擾素或雜交干擾素例如aA-otD-或a ；S-aD-雜交干擾素，持別雜交干擾素BDBB;蛋白酶抑制劑例如a i -抗胃蛋白酶，SLPI等；肝炎病毒抗原如B型肝炎表面抗原或中心抗原或A型肝炎病毒抗原，或非A非B型肝炎抗原 :胞質柔原活化劑例如組継胞質素原活化劑或尿激酶 ,腫廇眾死因子，體騄止素，腎素，/9-腦啡；免疫球蛋白例如軽鐽及/或重鐽免疫球蛋白D,E或G,或人-鼠雜交免疫球蛋白，免疫球蛋白結合因子例如免疫球蛋白 E結合因子如sCD23,促鈣素，人促鈣素相關呔，凝血因子如因子IX或VIIIc.红血球生成素，eglin例如eglinC ,水姪素，去疏酸根水姪素如去硫酸根水姪素變髓HV1, 02.03，[1^1!1，1^「2]-01,[1^541]-02或？八，人超氣化物雙突變藤，病毒胸腺嘧啶瀲/3 -内睡胺 Μ萄糖異構酶。較佳基因為去.硫酸根水姪素之编碼基因如變腥HV1。於本發明之雜交載體中.本起動子及/或 MSP倍號呔之编碼DNA分子與多肱鑕碼區作操作性聯結， 1 7 - ...................................................^...........................-玎...........................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 9.1^483 A6 B 6 經濟部中央局印製五、發明説明（16) 修J ?曰因而確保有效表現多呔。1 ^ ^ 較佳雜交载體為 pUCRS.M13^p18RS,M13»p19H,pVAHIR. pVAHIR-1.pSC12HIR,pSC12HIR-1.且特別為 pSC12HIRTere 。雜交载體敘述於後文實施例中。本發明也關偽一種DHA分子其 a )為質賭pUCRS之約3 . 5kbp EcoRI/ Sail乳酸乳榫销桂子，或其功能段，或 Η與所述插子或與其功能段雜交者，或包括天然與此捶雜交的DHA序列作操作性聯結的起動子區•或 c) 為涵蓋於3)或b)中且编瑪箸倍號呔之DHA序列之序列，或 .· d) 為涵蓋於a),b)或c)中之DM A分子衍生物，及/或 e) 包括下列各者之複製起黏：(I)乳酸乳球菌LL712：> 2,5 Md質體，或（II)乳酸乳球菌LL712之5.2Hd質體，或 (11 I)如同乳酸乳球睹LL712之2.5Md質體或5.2Md質驗之不相容組的質賭本身，此等DNA分子可用來製備本發明之雜交载體或篩檢DH A基因庫或《RHA以找出其他類似的DNA或nRHA。 A分芊好KSP：>餺法本發明之又一目的為本發明之DNA分子，亦即雜交载嫌或前文所定莪之DNA分子之製法，所述製法包括 A)培育其中包括本發明之DNA分子的寄主及從此棰培餐後之寄主賭内單離本發明之DNA分子，或 _ 1 8 _ f 4 (210X297^») (請先閲讀背面之注意事項再填跨本頁} •裝. .訂- .線 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（17) B)經由試管試驗合成法製備本發明之DHA分子。寄主之培育你於習知營餐培餐基内進行，培餐基内可補充或去掉某些化合物，因此可將轉形醱（亦即含有期望的DNA分子連同選擇標記之寄主）與非轉形體（亦即缺期望的DHA分子之寄主）作陰性或陽性選揮。可使用任一種業界有用的適當可轉形寄主.例如適當細菌如革蘭氏陰性菌如大腸桿菌，或革黼氏陽性®如座菌靨或乳酸《如乳桿菌靨,或特別乳球菌屬如乳酸乳球 Μ , 乙醯基乳酸乳球睹或乳脂乳球菌。藉習知方法轉形的細菌及轉形醴可以習知方式例如以抗藥性如抗四環素抗藥性鑑別。 . 待別，所述雜交媒介於適當大腸桿Si寄主品糸内繁殖，如TGI,HB101,JM109,MH1等，或於適當桿_品糸内繁殖，或適當乳酸国内繁殖如乳球_品条如乳酸乳球_0230 ,二乙醛基乳酸乳球菌·乳脂乳球菌等。寄主經由業界習知之方法轉形及選擇。繁殖後之質體DNA藉習知方法例如Birnboin & Doly(1979)所述之方法從細®體内單離。本發明之DHA分手也可依習知方法經由試管試驗合成法製備。試管試驗合成法特別可應用於製備小段，例如 MSP基因之DHA序列段或起動子或特別倍號呔之编碼相關基因之DNA序列段。本發明之DNA分子可從含有此種DNA分子之乳酸®獲得 -19- ...................................................裝...........................玎...........................嫁' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標肀局印製五、發明説明（18) ,特別得自其基因組庫或經由《UHA獲得。下文中將更詳細説明約3.5kbp質體pUCRS之EcoRI/ Sal I乳酸乳球_插子之該種DHA分子之製備。至於起始物料可使用乳球菌鼸如乳酸乳球醣0230之基因組庫，此基因組庫偽依據習知方法製備，例如經由使用約束酶如Sau 3A或Mbol部分消化乳酸乳球菌品条如 0230,C2或LL712之基因組DNA,及於適笛媒介如大腸桿菌質體PUK121或λ噬®體如λ EMBL3體内擇飱高分子量 DNA 段。任何其他可生産MSP之乳酸菌品糸也可用作基因組庫之來源，同理，其他適酋媒介也可用作片段之接受者。欲求成功地篩檢本發明之DNA序列之基因組庫，襦要一種可與DNA序列如輿MSP結構基因雜交的DMA探針。若例如MSP基因或其部分序列未知，則探針可為合成DHA探針。由於MSP蛋白質或MSP基因序列或其部分於本發明之先前皆未知，故本發明首先解決MSP之純化，MSP之N -端序列決定及雜交DNA探針之製備等問題。經由上清液TC A沈澱，沈澱蛋白質作SDS-聚丙烯酵胺腠電泳及使用庫馬西亮藍染色凝膠之後判定MSP為乳球睹屬如乳酸乳球菌培養上淸液内之最躉富的基因産物。欲求純化HSP,可使用任一種含MSP之來源.例如乳酸 S如乳球_屬如乳酸乳球菌之培養上清液，可«著切下包括主要蛋白質帶之凝醪塊且溶離MSP而從SDS聚丙烯酷 - 2 0 - .......................'·.........^.................^...........................ΤΓ...........................舉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213483 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（19) 胺膠上鈍化MSP。進一步純化方法例如以酸如三氣乙酸沈澱，《析，脱鹽，以不同鹽形式再度沈澱，瘳析層析如親和層析，離子交換靥析，凝醪滲透層析，電泳如使用SDS聚丙烯醯胺_電泳，等電聚焦，電溶離等或其任一種組合也可_ 用來獲得鈍MSP。本發明中.名目分子量約56kD之MSP俱藉如下方式以純質型單離：使用三氟乙酸從乳酸乳球菌L Η 0 2 3 0上淸液中沈澱蛋白質，隨後於SDS聚丙烯醒胺膠上電泳沈澱的蛋白質，切下具有主要蛋白質帶之該區及從凝膠上電溶離MSP。此種方法也適合用來單離具有，9 一種名目分子量的HSP相關蛋白質。MSP之胺基酸序列可藉着決定順序部分決定且可從D H A序列部分推演而得。示於序列表列之SEQ ID No.1下方且由所示胺基酸序列之位28伸展至 466 〇純質也屬於本發明之主題。決定MSP N -端序列偽以習知方式進行且顯示如下胺基酸序列： X-X-Asn-Ser-Asp-I1e-Ala-Lys-Gln-Asp-Ala-Thr - I le- -Ser-X-Ala-Gln-Ser-Ala-Lys-Ala-Gln-Ala-Gln-Ala- Gln-Va卜Asp.至今未曾決定首二胺基酸及以"X”標示的位1 5之胺基酸。位基於5至13之按基酸序列可含成如下寡核苷酸混合物： A ~ 2 1 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. .線· 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製

五、發明説明（20) GAH! ATN2 GCIAAH3 CAN3 GAN! GCIAC.此核苷酸序列中，為丁或C; 為T,C或A; 為A或G。A代表具有齡基腺噤昤之核苷酸，T為胸腺哺啶，C為胞哺啶，G為鳥糞瞟昤而I為肌核苷。寡核苷酸混合物以習知方式加放射性標幟且用來篩檢乳球魅匾，特別乳酸乳麵LM0230之基因組庫。含有HSP胺基酸序列編碼序列且至β少為14bp之DNA探針可用來篩檢其中包括相關MSP基因或其部分的核酸，也包含篩檢pre-MSP之编碼bRNA。供篩檢目的之用，DNA探針使用7 32 P-ATP& T4撤_ iH 業界已知方法於其5’端加放射性標幟。鏞帶本發明之核酸作插子的寄主微生物體或噬鍤體可於基因組庫之過濾膜重複本上與加標幟的DNA探針進行雜交而鑑別。所用雜文條件為習知者且例如可單純藉著選擇不同溫度而變得更佳或更不醒苛。與寡核苷酸混合物雜交的庫之DH A純株之雜交部分依習知方法決定部分序列。決定後之序列幾乎包括整體功能MSP基因。該序列示於SEQ ID No.1下之序列表。 3.5kbp EcoRI/Sal I乳酸乳球闺插子可藉下述方法由基因組庫之陽性純株單離：經由以EcoRI及Sail消化且隨後依據習知方法例如使用瓊脂糖瞜電泳鈍化插子。片段可依習知方法製備且可接合於適當媒介内，例如接合於M13bp18來産生M13npl8RS或接合於PUC18而産生pUCRS .................................·-.................^...........................•玎...........................線' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（21) ο 同理，任何其他包括MSP序列之乳酸乳球豳插子，例如3.5 kbp EcoRI/Sall插子之較大衍生物變醱或段，或可與3.5kbp EcoRI/Sall插子雜交或包括天然與此種雜交DNA分子聯結的起動子區之DNA分子可從乳酸®之基因組庫單離。依據a)至c)之DNA分子段可藉f知方式«得，例如於使用適當外-或内核酸酶如外核酸酶III，Bal 31或S1或約束内核酸_如Sau 3A, HUdlll等消化後單離段而得。段可依習知方法經由試管試驗DNA合成法獲得。涵蓋於前文.a)至c)之DNA分子突變體，例如倒位，缺失，嵌合或點突變賭可依習知方法製備，例如於活體試驗或試管試驗經由使用致突變寡核苷酸引子進行址指導突變（參見 Zoller及 Smith 1983，Botstein及 Short丨e 1985 ，或Norris等人1983之綜論文章）；或經由以適當約束酶切割且再度接合D N A ,非必要地於稀釋溶液内再度接合，而刪去二約束址間之D N A段而製備。下文中將詳細説明其中包括可作為複製起點的DNA序列之本發明之重組D N A分子之製備。質體依習知方法例如BirnboU及Doly( 1979)所述，但略有修改如實施例所述者，從乳酸乳球_ L L 7 1 2中單離，且以習知方式分離，例如使用層析技術如ManiatU等人U982 )所述之瓊脂糖膠層析。2.5Md質體及5.2Md質體 -23- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂. .線. 甲 4 (210X297公釐） A 6 Β 6 βΐ. 2. 1 3 2^34^3- 五、發明説明（22) 依雄習知方法單離及分段。如此所得段混合物依習知方法如Maniatis等人（1982) 所述者與適當戚體接合，此等接合混合物用來藉習知方式轉形適當中間寄主品糸。適當載體攔帶可供於乳酸菌賭内遘擇用之標記基因. 例如抗藥性標記基因如红徽素抗藥性基因，及於乳酸闺體内無法發揮功能之複裂起點，但於細豳體内賻今用作中間寄主用來擇殖乳酸乳球菌質腥段者。適笛载體也包‘ 括可於中間寄主體内選擇用之標記基因，該基因可與乳酸乳菌睦内發揮功能之揉記子基因完金相同。適宜之中間寄主例如為大腸捍菌品糸如大.腸桿菌TG 1 .及適.酋擇殖成禮，亦即大腸捍_載體，如攥帶红黴素抗藥性基因之PUC18衍生物，如PUC38 3,其構成述於後文之買施例中。使用包括乳酸乳球菌2.5Md或5.2Md質腥之載體ft形的中間寄主細胞非必要地可依習知方式選擇，所用方式依據中間寄主細胞類別及所用载體而定，選择禳記例如為抗藥性標記或可篩檢標記酶之编碼基因，如大腸桿_ 1 acZ 基因産物，/3-半乳糖苷酶，規定寄主為基因組UcZ基因醱内之缺陷性大腸捍魅品条。選擇標記基因受到DNA 段之嵌入所干擾。若標記為lacZ,則攘帶有具有一段嵌入lacZ基因之該種载體的·寄主細胞更容易將X-Ga丨轉入藍色染料内，結果，酋使用IPTG誘使lacZ基因表現後，甲 4 (210X297公釐） ……-...........................................裝·….......................tr...........................痒. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印製 i.、 i.、 A6 B 6 213488 五、發明説明（23) 於包括X-Gal之理脂板上的陽性純株保持白色》 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 播帶有衍生自乳酸乳球菌2.5Md或5.2Md質醱的捶子之載體f試驗其舆不含質腥之乳酸乳球菌品条如乳酸乳球菌0230内複製之能力。用於此目的，從中間寄主單離質體且依習知方法如Powel丨等& (1988)所述轉形入乳酸乳球菌0 2 30细胞内。複製裁體包括衍生自乳酸乳球菌5 . 2 Kd或2 . 5 M d質睡的D Η A插子，此種插子可作規製起點之用。包括此種功能之DNA分子可從後製载體箪離，分段，突變等且可依據本發明用來構成重組DNA分子，例如擇殖或於乳酸菌體内複裂之表現载體。由複製起貼衍生而得的乳酸乳球菌2.5Md或5.2Md質體也可於乳酸菌以外之細菌脰内發揮功能..例如桿菌匾或大賜捍SS。因此，包括此棰DNA段之栽體可用作穿梭载體。攜帶複製起點的2.5Hd或5,2Md質醱段也可依據前述方法從段混合物中鑑別及單離，所述段混合物你經由將1 酸乳球茵L L712之金體質體匯集物分段獲得。搞帶複裂起點的—段擇殖段偽從2.5Md或5.2Md質體衍生而得。可藉下述方式測定：將擇殖段與衍生自乳酸乳球菌LL712 且於瓊脂糖暖上分離的質鱷匯集物中之霣醍雜交.或經由比較擇殖段及匯集物質醱之約束疆案來測定。經濟部中央標準局印製依本發明之重組DNA分子其中包括乳酸乳球菌2. 5Md或 5.2Md質暖之全體DHA序列或如同2.5Md或5.2Md質醱之不相容組的質醱之金腥DNA序列，例如可«下述方式獲得： -25- 甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6 813489- 五、發明説明（24) 使用適酋約束内核酸酶切割各別質饈及例如時質匾與其

中包括同源茸異源結媾基因，起動子匾或载體序列之DH A 段接合或與聯結子段等接合。適當約束内核酸酶於各別質腥内僅有一値辨認及切割址。 .一重組DNA分子其中包括衍生自2.5Md或5.2Md質體之具有複裂起點功能之序列者，例如可葙下述方法«得；該方法包括一習知方法製備乳酸乳球菌L L 7 1 2之質齦匯集物，鑑別2.5Md或5.2Md質腥，例如經由於瓊脂糖睡電泳中估計分子量，將各質體例如使用適當約束酶分段，製備包括複製起點功能段，例如前述任一段，及將此等段或段混合物與不包括複制.起鲇的0“分子如缺失複裂起點的擇殖載體接合，及選出至少可於乳酸乳球菌及大腸捍菌體内複製的DNA分子。其中包括屬於2.5Md或5.2Md質歷之相同不相容組的複製起點之質賭，由於無法與2.5Md或5.2Md質體一起保持於同一細胞内，因此可被鑑別。本發明也偽有關使用本發明DNA分子或重組DHA分子用來製備結構基因表現用之雜交載體。此等结構基因之範例列舉如前。雜交載體可依習知方法使用_如約束酶， DHA聚合酶，DNA接合酶等而製備。實施例4及5示例說明用於乳酸菌，持別乳酸乳球菌, 或桿菌屬，持別蘇炅金桿菌表現结構基因用之雜交载體的製備細節。 -26- 甲 4 (210X297公釐） ...................................................^...........................ΤΓ...........................漆 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印製 m. 2. l3 213488 五、發明説明（25) A6 B 6 經濟部中央標準局印製艙形寄本》萁餺法本發明進一步葆有蘭使用本發明之雜交载體轉形的細 _寄主。依本發明之轉形细菌寄主適合用於择殖，擴增及/或製備其中包括如a)至e)所定義的DNA分子之雜交载體。雜交載體可於此種寄主醴内複製，且於增生過程中於細胞族群内的選擇性壓力下不會喪失。有用的寄主偽依據雜交載體内所包括的複製起點而定，以其中包括具有遵照e)之複製起點功能的DNA序列之雜交載體為例，適當寄主例如為其中不含有具有相同不相容组的複製起點之質賄的任一種大腸桿®。捍菌屬或乳球菌屬。以其中包活於適當解讚架内與MSP倍號呔之编碼DNA序列融合之同源或異孭结構基因的雜交載賭為例，本發明之轉形寄主為適合闬來生産分泌性同源或異源蛋白質者 ,如乳酸乳球闺品糸。依本發明之轉形寄主之例為大賜捍_品条如以p U C R S ,pSC12.pSC12A P,pSC12A N,pSC12A HP,pSC18,pSC18A N ,pSC18AP,pVAHIR,pVAHIR-1,pSC12HIR,pSC12HIR-1,或 pSC12HIRTerra轉形的TGI,C600或HB101,或以其中任一種質體轉形的乳脂乳球_或不含質暖的乳酸乳球菌如乳酸乳球菌L Μ 0 2 3 0，或捍菌品条如蘇炅金捍艟。較佳者為以 ρ ϋ C R S 轉形的大腸捍菌 TGI,以 pUCRS.pSC12HIRTerB,pSC12 或PSC18轉形的乳酸乳球菌，及以pVAHI或pVAHIR-〗轉形 r —' 27- ...................................................^...........................tr...........................锋 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6 經濟部中央標準局印製 9>134SS 1 五、發明説明（26) 0¾蘇炅金捍菌。本發明也係關此種轉形醱之製法，該方法包括於轉形條件下使用本發明之重組DNA分手，特別本發明之雜交载體，非必要地連同選擇樣記基因處理寄主及選擇轉形體。多ife ：>斛法本發明又偽有關多呔之製法，其持點為同源或異源结構基因偽於適酋解謓架内與MSP倍號呔之编碼DHA序列融合，適當寄主如革蘭氏陽性皤寄主如乳球菌寄主，如亂酸乳球窗L Μ 0 2 3 0 ,或捍菌匾如蘇炅金捍菌傜使用包括此 Ρ融合基因的雜交載體轉形，及由此基因所编瑪的多呔從寄主細胞内分泌出。若有所需，多呔依習知方法從上清液中單離。於本發明之較佳具體例中，使用不會於培餐基内分泌可降解表現蛋白質的蛋白酶之該種细菌寄主 Ο 此種本發明之較佳具醴例例如為.蛋白質如去硫酸根水姪素之生産.偽使用其中包括此種蛋白質之缠碼基因的本發明雜交載體例如pSC12HIR,pSC12HIR-1或特別 pSC12HIRTe「m轉形的乳酸乳球菌LH0230細胞中分泌出此種蛋白質。從以PSC12HIR或SC12IUR-1轉形的乳酸乳球菌LM0230細胞之穩定期培餐上淸液中可播得活性去硫酸根水姪素濃縮物。於以pSC12HIRTe「m轉形的乳酸乳球菌 LM0230細胞之上清液中，去硫酸根水姪素的産置增加。 -28- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· .線. 甲 4 (210X297公釐）

Si. 2. ι3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製 213488 五、發明説明（27) 出人意外地，穩定期培餐物經長期培養例如隔夜培餐後，異源基因産物例如去昧酸根水蛭素之含量並未降低，代表上清液内之異源基因産物未出現蛋白質分解劣化作用。於本發明之另一具體例中，可於培餐對數期或檯定期，例如藉離心或過濾從營養培養基中收集細胞，及再度懸浮於小量匾積例如佔原始培養塍镡之約1%至20%的新鮮營養培養基或適酋缓衝液内。培育再度懸浮的細胞，結果導致分泌人上清&内的異源基因産物之産量增高。舉例言之，於使用p S C 1 2 Η I R轉形的乳酸乳球菌L M0 2 3 0 之培萑中，若藉離心收集棰定期培養物，再度約30懸浮於約1/10體橫的新鮮營養培養基内，且於約30艺培育約30分鐘，則於上清液内可播得去硫酸根水姪素的産量增高。本發明夕另一具體例為，依據前述方法從使用本發明之雜交載禮例如PUCRS轉形的革闌氏陽性寄主細胞分泌 MSP之生産方法。本發明之又一具體例為於使用pVAHIR或pVAHIR-1轉形的蘇炅金捍菌，較好品糸HD! cryB(DSM 4574)生産去硫酸根水姪素。匾式簡蛋說明第1圈：質醴PUC838之物理拼圈。拼圖位置為約略位置，且以1^?表示。？1](：18部分從拼圖位置0伸展至2.7 -29- (請先閲讀背面之注意事項再填寫衣頁) •裝. -訂. 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 經濟部中央標苹局印製五、發明説明（2马 :而攜帶紅徽素抗槩性基因的PVA8 38部分從拼園位置 2.7伸展至4.4。括弧内所示約束址於重組基因之製備過程中破壊。縮寫定義為iaiiipt ,安比西林抗藥性基因； ery1"·紅徵素抗藥性基因； λ 〇 r i ，從PUC18衍生而得的複製起點。 ' puc 第2圖：質體pSC12之物理拼画。拼圖位置為約略位置旦以kbp表示。pUC18 DNA從位置0伸展至2.7。1.7kb 之？¥卩838攜帶紅徽素抗藥性段從位置2.7伸展至4.4。迅酸乳球_ 2.5Md質體衍生而得之插子從位置4.4伸展至8% 。括弧内所示之約束址於重組分子之製備過程中被破瘻 ,縮寫之定義為：PL1,俱EcoRI至（Smal)址之pUC聚聯結子區。PL2,從（Smal)至SphI址之pUC聚聯結子區； am pf ,安比西林抗藥性基因；er/ ,紅徽素抗藥性基因；ori_ ，從PUC衍生而得的複制起點；oriu ,如同缺失分析進行的從乳球_ 2.5Md質體衍生而得的複製起點。第3圖質體pSC 18之物理拼圖，拼圖位置為約略位置且以kbp表示。pUC18 DNA從位置0伸展至2.7, 1.7kb之 PVA838之攜帶紅徽素抗藥性段位置2.7伸展至4.4,乳酸乳球菌5.2Md質體衍生而得之捅子從位置4.4伸展至8.5% 。括弧内所示之約束址於重組分子之製備過程中被破壊，縮寫之定義為：PL1,偽EcoRI至（Snal)址之pUC聚聯結子區。PL2,從（831!11^1)至11丨^111址之91)(：聚聯結子區 ,安比西林抗藥性基因；eryr ,紅徽素抗藥性 -30 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •線· 甲 4 (210X297公釐）經濟部中央標準局印製 A6213488_Be_ 五、發明説明（29) 基因；0「i pue ，從p U C衍生而得的複制起點；0 r i 12 , 如同缺失分析進行的從乳球菌5.2Md質體衍生而得的複製起點。縮寫 dNTP 去氣核苷酸三磷酸 HPLC 高效液相層析 IPTG 異丙基-/S-D-硫基半乳糖啪_糖¥ kbp 千鹸基對 k D 千道爾頓 LB 魯里亞肉汁營餐培養基（Gibco/BRL) Md 百萬道爾頓 . , xCD23 可溶性CD23,亦即25k IgE -結合因子 SLP I 分泌性白蛋白酶抑制劑下列實施例用來示例説明本發明但絶非視為限制其範圍。材料》方法品糸乳酸乳球菌LH0230為乳酸乳球_ C 2之不含質體的衍生物（E f s t a thiou J.D*and Mckay,1977)D 其託存於 Deutsche Samnlungvon Mikroorganisraen u n d Zellkulturen (參見後文 >。乳酸乳球菌C2(NCD0 2031 )及隨後用作2,5Hd或5,2Md 質體來源的乳酸乳球蘭L L 7 1 2彼此密切相關或相同（F . L , -3 1 - .....................................................裝...........................ΤΓ...........................線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213488 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（30) Davis et al., 1981)。前者例如得自英國國立乳品有機體收集會（NCD0 2031),後者託存於Deutsche Saamlung V.on Mikroorganisnen und Zellkulturen (參見後文）。大腸桿 _ TG1具有基因型 K12，A(lac-pro),supE,thi,hsdD5/FtraD36， proA+B+, lacl^, lacZAM15 且偽得自 Anersham;敘述於 Amershaia之手册”於試管試驗中寡核苜酸指導的突變發生糸統”。 , —1般方法：轉形大腸桿_偽依據Maniatis等人（1982)所述之氱化鈣方法轉形。乳球菌品条之轉形作用偽經由使用得自B i 〇 R a d之基因脈衝器裝置進行電泳，旦遵照BioRad之乳酸乳球_ LM0230 計劃書進行。曹餵之餺備得自大腸捍_之質體DNA像依據Birnboim及Doly(]979 )之方法製備。該種方法也用來從乳球闺單離質體而有下列修改： a) 隔夜培養物於30¾於M 17-G培餐基（Terzaghi and Sadine, 1975)内生長，於新鮮培養基内稀釋成1:10且又生長2小時。 b) 與溶®酶之培育也條於突變分解素（mutanolysinM 5 0 in g / 1 )共存之下於3 7 I〕進行1 0 - 2 0分鐘。 ...................................................裝............................可..........................._ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） A6 B 6 81. 2. 13 31) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) »該種方法從乳酸乳球BLL712裂得霣豔匯集物，且 SB部分進一步藉CsC卜ethidiu·溴平衡離心法純化（ C-lewell and Helinski, 1 969 )。三種小質黼（1.8Md，2.5 Md，5.2Md; Gasson,1983)於純化後之質匾部分内含量β 畜，而兩種大質體（9Md及33Md: Gasson,1983)則以小鼉存在。窖旃例： 1.乳敌献孖女瞄埕艏用夕窀掸&毈鏞 1.1 D II C 838 之機成 .訂· pVA838(ATCC 37160;Macrina et a 1.,1982)為一種1_L 球菌質塍，其於1.7 kbp AvaJ/Hindlll約束辱上攜帶有本質性表現的红激素抗藥性基因。約l〇u8 PVA838 DHA以Aval及Hindlll消化。DNA段末端於金部四種dilTP 共存之下使用Kleenow酶形成鈍端。於瓊脂糖醪上分離段及H電溶離從暖上回收1.7kbp Aval/Hindlll段。 -線· 缓濟.弗中夬碟苹马印製約 200ng所述段及 l〇〇ns Saal-切割的 pUC18(Horrander et at.),如Rusche等人所提示者，於T4 -接合_共存之下接合；而接合混合物用來轉形大腸捍菌TGU於含有X-Gal,IPTG及lOOrag/ 1安比西林的LB瓊脂平板上檢出白色菌落。藉箸單離及分析其質髏DNA,及藉著其餘含紅徽素（100 ms/ 1)之LB瓊脂平板上生長的能力來鑑別正確的纯株。所生成之質匾定名為p C 8 3 8。p U C 8 3 8之約束址及特擞列舉於第1圈。 -33 甲 4 (210X297公釐） 213463 A 6 B 6 五、發明説明（32 )1 . ?. dSC12，嫌成從乳酸乳球菌LL712單離的呈匯集狀態的質體，於製備性瓊脂糖膠上分離。距離底部之第二DNA帶相當於2.5 Md質賭之CCC形。切下該帶及電溶離出質體。使用SphI 消化此種質體，瓊脂糖膠電泳顯示出單一 3.5kbp段，代表於2.5Md質體上存在有單一或數個間隔緊密的SphI切割址。， PUC8 3 8於其獨待的SphI址切割，及使用小牛腸磷酸酶處理。約50ns經磷酸酶處理的150ng 3.5kbp之2.5Md質體之SphI段使用T4接含酶接合，且接合混合物用來轉形勝任的大腸桿gjTGl細胞。轉形混合物於37¾於Ini LB 内生長90分鐘，然後轉到200ml含lOOisg/ 1紅徽素之LB 内，且於37 1生長隔夜。由此培養物之細胞製備質體DNA ，約2Wg用來轉形乳酸乳球菌LM0230。轉形後之乳酸乳球_ LM0230細胞於30¾於含5mg/ 1紅徽素之M-17G瓊脂平板上選擇。質體DHA偽由經轉形的乳酸乳球豳LM0230細胞之若干純株中單離，旦接受約束酶分析。所有接受研究的轉形體皆含有8.0kbp質體PSC12,由其中可回收3.5kbp SphI 插子。PSC12之物理拼圖示於第2圖。 PSC1 2於乳酸乳球菌與大腸桿菌間可穿梭數次而其約束圖案不會有顯著變化。 ....................................................^...........................•玎...........................· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標爭局印製甲 4 (210X297公釐） -34- 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（33) 得自乳酸乳球魅LL712之質體匯集物DNA,經由將500ng 整分之DNA與不等量之約束酶培育，而使用Sau 3 AI約束。於瓊脂糖醪上鑑別其中含有部分切割DNA的樣品。此種DNA與PUC838媒介接合，後者事先於其獨待Bam HI 址切割且使用小牛腸磷酸_處理。大腸桿菌TG1質體之轉形，單離及隨後轉形乳酸乳球藍LM0230僳如對PSC12所述著一般進行。再度，約束消化作用傜對從乳酸乳球豳LM0230轉形體之若干純株單離的質體DNA進行。其攜帶8.8kbp質體，PSC18。質體介於乳酸乳球菌與大腸捍_間穿梭數次不會導致約束圖案有任何變化，代表構成體於兩型細胞内皆穩定。PSC18之物理拼圖示於第3圖。 ?..乳琺舖夕複餺耙點鑑別2.1 Psr.Psri8> ^ ^ m 質體PSC12及pSC18上攜帶乳球菌衍生而得之複製起點區，像藉ϋϋϋ定如下：介於適當約束址之DHA,藉著使用對應的約束酶切割質體及使用Τ4接合酶再度環化而被刪去。PSC12及PSC18 中約束酶切割址之約略位置分別示於第2及3_及表1。 PSC12A Ρ及pSC18A Ρ分別後經由刪去質體PSC12及PSC18 三PUC18部分中兩個ΡναΙΙ址間之DNA而構成.如此去除 c ο 1 Ε 1衍生的複製起點。於pSC12AN及PSC18A Ν中分別去除PSC12或PSC18之 ................................“.................裝...........................ΤΓ...........................線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213483 A 6 B 6 五、發明説明（34) N d e I小段。 pSC12A R缺少於p S C 1 2乳球菌DNA内之EcoRV段。 .於PSC12ANP中，介於pUC之PvuII址與pSC〗2乳球豳部分之Ndel址間之DNA被去除。於此例中，媒介DNA於再度接合前使用Kleenow酶變純端。另一種pSC18,pSC18A H,缺少質體内横跨Hindlll址 /間之DNA。 / 所有突變質體DHA首先偽從對紅徽素具抗藥性的大賭 _g_§TGl轉形體單離。然後，試驗質體DNA是否可用來將乳酸乳球_ LM0230轉形成紅徽素抗藥性。若無法逹成此目的，則推定代表乳球菌之複製起點被缺失所去除或if 毀。當獲得紅徽素抗藥性轉形體時，再度單離質體，且藉約束分析，再度證實其結構完整性。對2.5Md或5.2Md質體二者鑑別於鐽球菌體内複製所需之區。從△ P -衍生物可於大腸桿皤内複製之事實，顯然易見，擇殖後之乳球豳起點也可於革蘭氏陰性大腸桿菌内發揮功能。 ...................................................裝...........................·玎...........................峰 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印製甲 4 (210X297公釐） -36 - 2134S3 A6 _._B 6 五、發明説明（35) 實驗結果列舉於表1。弃 1 ： Dsri2» 觖生分析結果質醱於複製乳質體缺失區1 缺失段2 大腸捍菌酸乳球® pSC12 無 + + pSC12AP PvuII (0.1), PvuII (2.5) 2.4 + + pSC12AN Ndel (0.2), Ndel (6.2) 2.0 + + pSC12AR EcoRV (5.0), EcoRV (7.5) 2.5 + pSC12ANP Ndel (6.2), PvuII (2.5) 4.3 ND3 + pSC18 無 + + pSC18AP PvuII (0 · 1) , PvuII (2·5) 2.4 + + pSC18AN Ndel (0.2), Ndel (7.5) 1.2 + + pSC18AH Hindlll (0), Hindlll (6. 5) 2.0 + 1缺失伸展於二約束址間。PSC12及pSC〗8内約束址之約略位置以於質髏之P U C 8 3 8衍生而得的部分内距離 Hindlll 址（定義為位置（0))之距離示於括弧内。其分別與第2及 3圖所示之鹼基位置有關。 2缺失片段之約略長度，US kb P表示。 .......................)........./.................^...........................ΤΓ...........................· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標，局印製 3未測定。 2.2乳琺舖；>雄餺祀點夾藤 PSC12内之複製起點偽衍生自乳酸乳球菌LL712之2,5Md 質體如同對攜帶該起點之DNA Μ段的單離計畫所明白可見。約束酶切割圖案指示PSC18之複製起點係來自5.2Md質 -37- 甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6 2134S3 五、發明説明（36) 體。於其他乳醵乳球蘭内複製PSC〗2及pSC18 乳酸乳球菌.二乙醒基乳酸乳球_及乳脂乳球豳皆可以兩種質體成功地轉形。於遘擇壓力下，質體可與細胞族群保持穩定的結合。 2 .乳酸乳琺_丨,Μ 0 2 3 0之牛要分泌産物（M S P )缠碼基因之搔稍 3 . 1乳酴乳琺舖L Μ 0 2 0 ：>牛酉分泌蛋白晳（M S Ρ )之厘雞於3 0 t；於Μ - 1 7 G内隔夜培養的乳酸乳球菌L Μ 0 2 3 0醪1 , 5 1 ,於5〇「¥3丨丨0$-3轉子内，於4”於7000「？11!離心20分鐘。收集上清液，及經由添加等體積冰冷的10.%三氣乙酸 ,且於室溫培育30分鐘而沈澱出蛋白質。經由於Sorvall G S - 3轉子内，於4 υ以δ 0 0 0 r p m離心3 0分鐘而收集沈澱。將蛋粒瀝乾且再度溶解於3ml SDS -樣品緩衝液内（Laemmli ,1970 )。經由添加小量4N NaOH中和樣品及然後，對41 之 25nM T「is-HCl PH6.8, 0.02% SDS 滲析 4小時。回收之樣品體積約為4b1。將3X濃SDS-樣品緩衝液加入樣品内來將體積放大為6ml。使用得自Bio Rad細胞，將2ml整分於製備性8%SDS聚丙烯醯胺屦（L a e m b 1 i , 1 9 7 0 )上移動而分離蛋白質。順著凝_側切下小長條，使用庫馬西亮籃染色，且於含1 0 % 甲醇及10%乙酸之水溶液内脱去染色。此長條作為鑑別標記，及鑑別從凝膠上切下的具有名目分子量56KD之主甲 4 (210X297公釐） ...................................................裝...........................訂...........................線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標苹局印製經濟部中央標爭局印製 2134S3 五、發明説明（37) 蛋白質帶。使用Biotrap裝置，及含20bM乙酸銨及0.01%SDS之緩衝液，經由於150V電溶離2小時而從凝醪上回收MSP蛋白質。溶離分對20mM乙酸銨，0.005%SDS之兩次變化，進行滲析48小時。摻析後之蛋白質樣品於8% SDS-PAGE上移動，觀察到單一鮮明蛋白質帶，具有名目分子量約56 kD 〇 ' 3.? 某端序列分析單離後之MSP蛋白質之胺基端序列之決定係依據習知方法進行，使用定序列儀（應用生物糸統公司，型號407A)以HPLC定量切割後之胺基酸殘基的苯基硫基内醯脲衍生物。所得28肢基酸長序列為X-X-Asn-Ser-Asp-Ile-AU-Lys-Gln-Asp-Ala-Thr-Ile-Ser-X-Ala-Gln_Ser-Ala_ Lys-Ala-Gln-Ala-Gln-Ala-Gln-Val_Asp。首二胺基酸及以” X ”號標示的位置1 5胺基酸未測定。 3.3遐合宴枝苷酴探針之合成基於胺基酸序列 Asp-Ile-Al. a-Lys-G 丨 n-Asp-Ala-Thr-Ile-,(相當於MSP N端序列位置5至13之胺基酸）設計混計混合寡核¥酸且構成篩檢DNA庫之用。肌核苷嵌入23-元體之二位置，其中基因碼的退化，將需要全部4種dHTP ，以便減少探針之複雜性。寡核苷酸混合物之核苷酸序列為 GAN! ATH 2 GCIAAN 3 CAK 3 GAN i GC I AC . Ν ι T或 C; -39- A 6 B 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213483 A 6 B 6 經濟部中央標f局印製五、發明説明（3〇) N2ST,C或A;H3為A或G。A代表具有鹸基腺嗦昤三核苷酸，T代表胸腺嘧啶，C代表胞嘧啶，G代表烏糞嗦聆及I代表肌核¥。 .Ί . 4乳酴乳琺酺丨.Μ 0 0某因紐産夕嫌成藉著用於質體單離之計劃害之修改方式從乳酸乳球菌 LM0230中單離染色體DHA:使用溶菌酶及突變分解素處理後，細胞與蛋白酶K(10〇Htg/l>於10nM Tris-HCl ρΗ8 .20mM EDTA, 0.5%SDD 内於 56*C 培育 2 小時。DNA 使用酚/氨仿（1 vol: 1 vo])抽取一次，然後藉CsC丨密度梯度離心純化。 *染色體DNA以Sau.3AI作部分消化，及如Maniatis所述於Μ糖梯度上作尺寸分段。收集介於約10-20kbp之段。 AEMBL 3DHA以BasiHI及EcoRI切割，及酚抽取及乙醇沈澱而純化。然後，於六胺鈷（I I I )氨化物共存之下，與10-20kbp段接合而有利於生成聯結醱（Rusche J.R. et al.,1985)。接合混合物使用得自_St「atagene之 Gigapack Plus®条統進行試管試驗包裝。經由將基因組庫舖於大賭桿菌Q359上選出重組體（Kahn J.et al., 1980)。總計獲得約600000重組噬菌體。 3.5篩榆庫中之MSP溢碼DHA序列約15000重組體λ EMBL3斑舖於每餡培養皿（15cni直徑）上且轉到斑篩檢©膜（“(0上。經由使用實施例3.3所述之混合寡核苷酸探針（其加[7 32 P ] A T P標幟），使用T 4 -40- ......................」............................裝...........................tr...........................線' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213463 A 6 B 6 經濟部中央標準局印製五、發明説明（39) 激動依據Maniatis等人（1982)所述標準方法.進行雜交篩檢過濾膜。 .鑑別陽性斑，且於斑密度較低之上，進行第二回合篩檢。從陽性噬菌體製備DNA,使用約束酶消化及如Maniatis 所述進行南方分析。南方墨點使用混合寡核苷酸探測。探針與陽性噬_饅之乳酸乳球_插子内之3.5kbp EcoRI /Sail段雜交。進一步探測顯示3.5kbP EcoRI/Sall段内之2.1kbp HindUI段與寡核苷酸混合物雜交。使用各別酶及適當酶混合物消化後，經由瓊脂糖膠電泳測定不同的約束址距離3.5kbp EcoRI/Sall段之EcoRL 切割端的約略距離。E c o R I切割端之位置距離H i n d I I I址約 0.5kbp,距第二 Hindlll 址約 2.6 kbp,及距第三 Hindlll 址約 3.15kbp。 3.ft pHCRS之構成得自陽性噬g體之DNA使用EcoRI及Sail消化。於0.690 瓊脂糖_上分離DNA段及切下3.5 kbp EcoRI/Sall段，且藉電溶離單離。三倍莫耳過量的此段與，已經使用EcoRI 及Sail切割且使用鹸性璘酸酶處理的PUC19接合。接合混合物用來轉形大賭桿菌TG1,且於含100 mg/ 1 安比西林之平板上選出轉形體。從轉形體製得質體DNA ，及進行約束分析來鑑別定名為pUCRS之正確構成體。以pUCRS轉形的大腸桿菌TG1託存於Deutsche Samailung -4 1 - ...................................................^...........................Tr...........................線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213483 A 6 B 6 經濟部中央標苹局印製五、發明説明（40) von Mikroorganismen u n d Zel lkulturen (DSM) 〇 3.7泱宙Φ蓼分泌商物席列序列之決定偽使用得自USBC之Sequenase®進行鍵終結法（Sanger F.etal. ,1977)為之。如實施例3 . 6所述而製備之3 . 5 k b t> E c 〇 R I / S a丨I段，次擇殖於M13 βιρ18。所得質體定名為H13 npl8RS。3.5 k b p E c 〇 R I / S a 1 I 段之 2 . 1 k b p H i n d I I I 段擇殖於 Ml 3 n p 1 9 ，所得質醱為Μ13 19Η。經由使用外核酸酶III及SI消化 DNA.從M13 bp18RS内之插子之Sail端産生一組單向缺失（1^11;1<〇『『，1984;丫811;5(；[1-卩6「「〇11 et al.，1985 )。缺失伸展入插子内部約2kbp。從萬用bp18引子決定此等缺失之序列，結果獲得一股的序列資訊。基於此序列，合成一組寡核苷酸，且作為引子來作為第二股的序列。經由使用相同方法決定由M13 mpl9H産生的exoIII-Sl缺失之序列，可獲得額外序列資訊。3.5kbp EcoRI/Sall段之〗920bp段之DNA序列，闌述於序列表列之SEQ ID No.l 下。其中包括部分MSP起動子區，MSP佶號肽之编碼DNA 序列及成熟MSP之結構基因。分析約2kbp長DNA序列，顯示存在有單一開放解讀架 (0RF),編碼著具有461胺基酸殘基的蛋白質。將推定的胺基酸序列與從經單離的M S P Η -端決定序列所得資料相比較，鑑別出具有434胺基酸之蛋白質成熟型，其於架前方有27胺基酸。由後述胺基酸所生成之呔，具有異型 -42 - ......................h............................I...........................β...........................線. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） A 6 B 6 2134S3 五、發明説明（41) 倍號呔的結構。於N -端發現有帶電荷的殘基，而其餘序列主要像由疏水胺基酸所組成。割裂址周園的胺基酸組成遵照從其他倍號呔推定的規則（Von Heijen,1983)。 4 . 於乳酸乳琺觭肉牛産重如关碴敌梢水蛭宏 4.1去硫酴梢水蛭袤分泌靨體之構成質醴M13 mpl9H含有2.1kbp HUdlll段編碼著MSP之N-端半部，其中包含倍號肽及約1.5kbp上游DNA。此質體於倍號呔之C00H-端下游129bp的獨特 Sea址割裂。從質體PML310單離編碼著去硫酸根水蛭素遣傳資訊的己經形成鈍端的21〗bp DHA段（公開於歃洲專利申 1 68342)且嵌於M13 mpl9H之經亂裂Seal址。經由，去除，分隔信號呔最末胺基酸的字碼子（Ala)與去硫酸根水蛭素第一胺基酸之字碼子（Val)的，過量DNA,可使得MSP 信號呔编碼D H A序列與去硫酸根水蛭素結構基因間産生架中融合。此乃使用得自Araersham糸統進行試管試驗中寡核苷酸指導的突變作用而逹成。29bp寡核苷酸包括最末14bp的信號肽及最頭15bp的水姪素基因。所得融合之序列閫述於序列表之SEQ ID No. 2之下。攜帶著融合物之Hindlll段被切下，及嵌人PSC12之獨待Hindlll内。恢復插子之二取向。所得質體分別定名為 PSC12HIR及 PSC12HIR-1。經由將大腸桿睹之t「p A轉錄終結子（Pharaacia)嵌入去硫酸根水蛭素基因下游約125bp處之PSC12HIR的獨特 -43- 甲 4 (210X297公釐） ..................................................^...........................t...........................線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印製經濟部中央標肀局印製 A6Q134B3-si- 五、發明説明（42 H p a I址，可構成另一質體（P S C 1 2 Η I R T e r b )。 4 . 2由乳酚乳球馘分泌去碴齡枏水择棄 .去硫酸根水姪素融合質體轉形於乳酸乳球菌L Μ 0 2 3 0内。轉形體於補充以2%«萄糖M-17G介質内，於紅徽素（ 5mg/l)共存之下，於30C生長。培養逹到穩定期時， 15.β1樣品於Eppendorf管内離心。移出培養上清液且於 -70*0冷凍。取出第二樣品之前，培養又生長隔/夜，離心，取出上清液也冷凍。使用生物檢定法測定分泌性去硫酸根水蛭素之産量。生物檢定法測定所收集到的上淸液内之去硫酸根水姪素的餓維蛋白酶抑制活性。生物檢定法之詳細計畫呈示如後，此乃餓雒蛋白酶抑制作用檢定法。用來製成樣品及化學劑之所有稀釋液的緩衝液為：含有1.0M NaCl及0.01%牛血清白蛋白的0.2H Tris-HCl, PH7.5。戯維蛋白酶偽得自人體血漿（Protosen AG, LSufelfinsen,産品编號80-13-1102),産色的纖維蛋白酶酶基為産色酶TH(Boehringer,Mannheim,産品编號206849 )。從産色酶TH放出的對-硝基苯胺俗使用Dynatech MR 600撤平板閲讀機測定。所有檢定法皆於撤力價平板上進行（Nunc,Micro Wei丨平板）。各個孔接受：50w 1緩衝液，50m丨具有未知濃度的繼雒蛋白酶抑制活性之上清液，亦即去硫酸根水蛭素及25α 1纖維蛋白酶溶液。藉箸加入150« 1酶基溶液（330w g/ml)開始反應，平板於 -44 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標平局印製五、發明説明（43) 37υ培育2小時。調整錐維蛋白酶濃度，使得未受抑制的對照孔内獲得/U〇5 nra=0.8±0.2。_基及纖維蛋白酶二者皆於- 20¾維持冷凍，且恰在使用之前立刻解凍。具有未知濃度的7 〔 tyr s 〕去硫酸根水蛭素（40 , 20 , 10,5,25及1.251^/|111)之標準曲線用來將00-測量值_ 成活性去硫酸根水姪素濃度。於使用PSC12HIR或PSC12HIR-1轉形的乳酸乳球_ LM 0 2 30細胞之穩定期培養上清液中，可測得同樣水平的去硫酸根水姪素活性。於使用PSC12HIR Term轉形的乳酸乳球_ LM0230細胞之穩定期培養上淸液中，測得去硫酸根水蛭黑活性水平提高約50%。作為對照的使用PSC12 轉形的細胞上清液中，不含去硫酸根水蛭素活性。穩定期培養物經歴約16小時的長期培育之後，上淸液内之去硫酸根水姪素水平並未下降。結果代表乳酸乳球鱼L Η 0 2 3 0之上清液内不存在有蛋白質分解劣化作用。於實驗中，首先藉離心收集細胞.然後，再度懸浮於 1 / 1 0體積的新鮮培養基内，且於3 0 t：培W經歴3 0分鐘的表現期。生物檢定法測得去硫酸根水姪素活性水平比較前述實驗增高約6倍。於更複雜之形式中，對特定表現期而言，濃縮細胞為提高上清液内分泌産物濃度的一種手段。於籙炅余捏_肉牛帝重甜夬硫酴梅水綷袤 R . 1 皙鵲D V A Η T R夕牛商 -45- ......................V.............................裝...........................訂......................：…·線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 2134S3 A 6 B 6 經濟部中央標爭局印製五、發明説明（44〉質體 pVA838(Macrina et a丨.1982(使用 Hindlll消化 ,及藉電溶離從0.5%瓊脂糖腰中單離攜帶有紅徽素抗藥性基因及革«氏陽性複製起點的5.Okbp段。含去硫酸根水姪素基因的HindHI段以類似方式從PSC12 H IR中單離。兩段於Τ4接合酶共存之下接合，接合混合物直接用來籍電穿孔轉形乳酸乳銶菌LM0230。選出紅徽素抗藥性轉形體，且由此轉形體製得質體DNA。進行質體之約束分析，來鑑別正確的構成體。H i n d I I I 去硫酸根水蛭素表現匣之兩種取向皆可獲得，且可用來於蘇炅金捍菌内生産去硫酸根水姪素。質體定名為pVAHIR 及 pVAH IR-1。 5.?由蘇炅全揑觭分泌去硫酴枏水蛭素蘇炅金桿菌品糸HDI cry B(DSM 4574)以pVAHIR使用電穿孔轉形（W.Schurter et at，1989)。轉形體於271或30t],於含有20u s/bi丨紅徽素的LB 平板上選出。藉著對乳酸乳球菌所用之相同方法，從各別轉形體製得質體DNA。約束分析再度證實單離質體的結構與P V A Η I R完金相同。作為對照的，其中攜帶有pVAHIR或PVA8 38之轉形體，於含20ms/ 1紅徽素的LB内，於27C生長隔夜。培養物以1:200稀釋於新鮮培養基内且又於30C生長。培養物經離心，且於稀釋後7小時，檢定上清液的去硫酸根水 -46 - ...............................................^............................玎.......................i. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213483 A 6 B 6 經濟部中央標箏局印製五、發明説明（45) 姪素活性。檢測出使用pVAHIR轉形的細胞上清液内之去硫酸根水姪素，而使用PVA838轉形之對照組内並未測得任何活性。託存的榭牛物下列撤生物偽遵照布達顳斯條約託存於Deutsche S a m η 1u n g von Mikroorganisnen u n d Zel lkulturen( DSM).Mascheroder Weg lb,D-3300 Braunschweig1 徹生物託存编號託存B期大腸桿 _ ΙΠ2 TGI/ pUCRS DSM 5803 1 990年 2月 16 曰乳酸乳球菌LL712 DSM 5804 1990年 2月16曰乳酸乳球KLM0230 DSM 5805 1990年 2月16曰參者1r獻： Bates, E.E.M. et al. (1989) Applied and Environmental Microbiology 55, 2095. Bemton, W.D., and Davis, R.W. (1977), Science 196 180. Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res., 7, 1513. Botstein, D. and Shortle, D. (1985) Science 229, 1193. Chassy, B.M. (1987) FEMS Microbiol. Rev. 46, 297. Clewell, D. and Helinski, D.R. (1969) Froc. Natl. Acad. Sci. USA, 62, 1159. Davies, F.L., Underwood, H.M. and Gasson, J.M. (1981) J. of Applied Bacteriology, 5i， 325. De Vos, W.M. (1987) FEMS Microbiol. Rev. 46, 281. Efstathiou, J.D. and McKay, L.L. (1977) J. Bacteriol., Π0, 257. Gasson, J.M. (1983) J. Bacteriol., 154.1. Gasson, J.M. and Anderson P.H. (1985) FEMS Microbiol. Lett., 30, 193. Henikoff, S. (1984) Gene, 28, 351. Jos, M. (1985) Applied and Environmental Microbiology 50, 540. -47- ..............................·................裝...........................訂......................：…線：” (請先閲讀背面之注意事項再？^本頁) 甲 4 (210X297公釐） 213463 A 6 B 6 五、發明説明（46) Kara, J., Brenner, S., Barnett, L., and Cesareni, G. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5172. Laemmli, U.K. (1970) Nature, 227,680. Macrina, F.L. et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Plenum Press, New York, (1982). Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Norrander, J. et al. (1983) Gene, 26,101. Norris, K. et al. (1983) Nucl. Acids Res. Π, 5103. Powell et al. (1988) Applied and Environmental Microbiology 54,6. Oto, R. et al. (1982) Applied and Environmental Microbiology 43,1272. Rusche, J.R. and Howards-Flanders, P. (1985) Nucleic Acids Res., 13, 1997. Sanger, F. Milken, S., Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463. Schurter, W., Gciser, M. and Mathe, D. (1989) Mol. Gen. Genet. 218, 177. Terzaghi, B.K. and Sadine, N.E. (1975) Applied Microbiology, 29, 807. * Von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem., 133, 17. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103. Zoller, MJ. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468. (請先閲讀背面之注意事項再Ϊ本頁) •裝. -訂· 經濟部中央標準局印製席列弃别 SEQ ID Ho . 1 序列型：帶有對應蛋白質的核苷酸序列長度：1920_基對股：雙形狀：直線分子型：基因組DHA 原始有機體來源：乳酸乳球菌LH0230(DSM5805) -48- •線· 甲 4 (210X297公釐） 213463 A 6 B 6 五、發明説明（47) 即刻實驗來源：質鑤pUCRS(DSM5803) 基因組内位置：染色联持點：1至41 〇部允直動-子-區 411至49 1 MSP埤號妝 492至1 793成熟MSP蛋白質性質：乳酸乳球豳之主要産物（MSP)基因 TTTAGGTATT TACGGAATTG CGACCTTATT GTTCCCACTT ' 40 ATTGCTCTTT TTGTATATAA TATACAAATA ACTATATTTA 80 CTAATCGCTG GACAAGGCTT TTTACAACAA TTATTATTGT 120 GACCGCTTTT GAAGTTTTTA GTGCAATCAT TATGACAGCT 160 TTTGGATTTG CCCAACTTCA GTTTATCAAA TTTGTTGTTT 200 ACCAGTTAGC GCCTACACTT TTGCTCAATA TTATCTTAGC 240 TGTAGCCTTA CAATTCCCTT TAGAAATCTT TTACAGATTA 280 AAGAAAAGTC ATGTAAGATA CAATTAGAAA GTGTTTTGTA 320 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標爭局印製甲 4 (210X297公釐） -49- 213483 A6 B6 五、發明説明（48) ATCATAAAGA AATATTAAGG TGGGGTAGGA ATAGTATAAT 360 ATGTTTATTC AACCGAACTT AATGGGAGGA AAAATTAAAA 400 AAGAACAGTT ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT 4 34

Met Lys Lys Lys lie lie Ser Ala 5 ATT TTA ATG TCT ACA GTG ATA CTT TCT GCT GCA 467 lie Leu Met Ser Thr Val lie Leu Ser Ala Ala 10 15 GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCT GAC ACA AAC 500

Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr Asn 20 25 30 TCA GAT ATT GCT AAA CAA GAT GCG ACA ATT TCA 533

Ser Asp lie Ala Lys Gin Asp Ala Thr lie Ser * 35 40 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ‘裝· AGC GCG CAA TCT Ser Ala Gin Ser

As AA/Ly T a cl G A GCA CAA GCA CAA GCA 566 Ala Gin Ala Gin Ala 45 50 CAA GTT GAT AGC TTG CAA TCA AAA GTT GAC AGC 599 Gin Val Asp Ser Leu Gin Ser Lys Val Asp Ser 55 60 TTA CAA CAA AAG CAA ACA AGT ACT AAA GCA CAA 632 Leu Gin Gin Lys Gin Thr Ser Thr Lys Ala Gin 65 70 75 80 85 AAT GCT CAA ATT GCT ACT TTG AAC GAA AGT ATC 698

Asn Ala Gin lie Ala Thr Leu Asn Glu Ser lie 90 100 AAA GAA CGT ACA AAG ACA TTG GAA GCT CAA GCA 731 Lys Glu Arg Thr Lys Thr Leu Glu Ala Gin Ala 105 110 甲4(210Χ 297公韙） ATC lie

T a cl G A

As AA/Ly ATC GAA AGC GAA CGT AAA GCA CTT 665 lie Glu Ser Glu Arg Lvs Ala Leu •緣· 213483 A6 B6 五、發明説明（49) CGT AGT GCT CAA GTT AAC AGC TCA GCA ACA AAT Arg Ser Ala Gin Val Asn Ser Ser Ala Thr Asn 115 120 TAT ATG GAT GCT GTT GTT AAT TCA AAA TCT TTG Tyr Met Asp Ala Val Val Asn Ser Lys Ser Leu 764 797 125 130 ACA GAT GTT ATT CAA AAA GTA ACA GCT ATT Thr Asp Val lie Gin Lys Val Thr Ala lie 〆 135 140

T a cl G A 830 5 4

T r c h A T

T1 An TaAl G V c G T r G e As T r c e T s

A υ A 1 G G

s y L

c a o G υ c _—_ 5 A 1 G A 1 G G c n A s 3a

AAln c G

T u T e CL G υ A 1 G G AsAs A y A y ^ L A L

G t T e A M An A 1 c G G υ 5 c r T e 5 G e T L 1 A s

AAlu G G

Mln c G 160 165 AAG TCA GAA ACT GTT AAA AAG AAC TAC AAC CAG Lys Ser Glu Thr Val Lys Lys Asn Tyr Asn Gin 170 175 TTC GTT TCT CTT TCA CAA AGT TTG GAT TCT CAA Phe Val Ser Leu Ser Gin Ser Leu Asp Ser Gin

T a cl G A 180 185 CAA GAA TTG ACT TCA CAA CAA GCT GAA CTC Gin Glu Leu Thr Ser Gin Gin Ala Glu Leu 863 896 929 962 995 190 195 200 ..................:.........:.........................故..............................tr..............................# * {請先聞讀背面之注意事項再瑱寫本頁> AAA GTT GCG ACT TTG AAC TAT CAA GCA ACA Lys Val Ala Thr Leu Asn Tyr Gin Ala Thr 205 210

T e T 1 A I 1028 GCA ACT GCG CAA GAT AAA AAA CAA GCT TTA TTA Ala Thr Ala Gin Asp Lys Lys Gin Ala Leu Leu 1061 215 220 —51— 甲 4(210X 297公发） 213488 A6 B6 五、發明説明（5〇 ) GAT GAA AAA GCA GCT GCA GAA AAA GCA GCT CAA 1094 Asp Glu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Gin 225 230 GAA GCA GCT AAA AAA CAA GCG GCT TAT GAA Glu Ala Ala Lys Lys Gin Ala Ala Tyr Glu

T a cl G A 1127 235 240 CAA CAA AAA GAA GCA GCA CAA GCA Gin Gin Lys Glu Ala Ala Gin Ala

T a cl G A A a cl G A An A 1 c G 1160 245 250 255 TCA ACA GCA GCA ACT Ser Thr Ala Ala Thr

T a cl G A

As AA/Ly GCT GTA GAA GCA 1193 Ala Val Glu Ala 260 265 GCA Ala ACT Thr TCA Ser TCA Ser GCT Ala TCT Ser GCT Ala TCA Ser TCT Ser AGT Ser CAA Gin 1226 270 275 GCT Ala CCA Pro CAA Gin GTA Val AGT Ser ACA Thr AGC Ser ACT Thr GAT Asp AAT Asn ACA Thr 1259 280 285 ACA Thr TCA Ser AAT Asn GCT Ala AGT Ser GCC Ala TCA Ser AAC Asn AGT Ser TCT Ser AAT Asn 1292 9, 2 (請先閱讀背面之注意事項再瑱舄本頁) T r o G e o A,s 3 A r c e T s c n A,s w A Ά Γ c e T s o A r c e T s T r 5 G e o Als 3 T r G e As 5 A r 9 c e 2 T s T r o Gel A,s 3 c r G e As T r c e T s 1325 TCA TCA AGC TCA AGC TCA AGC TCA AGT AAT TCT Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser 1358 315 320 經；ίL 中央橾準局印裝 AAT GCT GGT GGG AAT ACA AAT TCA GGC ACT AGT Asn Ala Gly Gly Asn Thr Asn Ser Gly Thr Ser 1391 325 330 ACT GGA AAT ACT GGA GGA ACA ACT ACT GGT GGT Thr Gly Asn Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly 1424 335 340 _5 2· f 4(210X297y 发） 2134S3 A6B6 五、發明説明（51) T n As A e T 1 A I T y G 1 G Gc r G e Als AGT TCA CCA ATT GGA AAT CCT Ser Ser Pro lie Gly Asn Pro 1457 345 350 TAT GCT GTT GGT GGA TGT ACT GAC TAT GTA TGG Tyr Ala Val Gly Gly Cys Thr Asp Tyr Val Trp 355 360 365 CAA TAC TTT GCT GCA CAA GGA ATT TAT ATC AGA Gin Tyr Phe Ala Ala Gin Gly lie Tyr lie Arg x 370 375 AAT ATC ATG CCT GGT AAT GGT GGA CAA TGG GCT Asn lie Met Pro Gly Asn Gly Gly Gin Trp Ala 380 385 TCT AAT GGA CCT GCC CAA GGC GTG CTC CAT GTT Ser Asn Gly Pro Ala Gin Gly Val Leu His Val 390 395 GTA GGA GCT GCT CCT GGT GTT ATC GCA TCA AGC Val Gly Ala Ala Pro Gly Val He Ala Ser Ser 400 405 1490 1523 1556 1589 1622 (請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁)

A r c e T sc e T h TP GCT GAT TTT GTT GGA TAT GCA AAC TCA Ala Asp Phe Val Gly Tvr Ala Asn Ser 1655 410 415 420 CCT TAC GGT CAC GTA GCT ATT GTA AAA TCA GTT Pro Tyr Gly His Val Ala He Val Lys Ser Val 1688 425 430 AAT TCA GAT GGT ACA ATT ACT ATC AAA GAA GGC Asn Ser Asp Gly Thr lie Thr lie Lys Glu Gly 1721 435 440 GGA TAT GGT ACA ACT TGG TGG GGA CAT GAA CGT Gly Tyr Gly Thr Thr Trp Trp Gly His Glu Arg 1754 經濟部 X 央標準 Μ 印 445 450 ACT GTA AGT GCG TCT GGT GTT ACT TTC TTG ATG Thr Val Ser Ala Ser Gly Val Thr Phe Leu Met 1787 455 460 —53— 甲 4(210X297 公沒） 9.13483 A 6 B 6 五、發明説明（52) CCA AAC TAG AAAAAAGTCT TAATAAATAA AAAATAGTGG 1826 Pro Asn 465 · TTTGATAGTG GGGAATAATT TTCCTTCTGT CAAATCATTT 1866 TTTATTATTG TGGTATAATA ATAAGGAAAA ATGATAAGGG 1906 GATAGATACA AATG 1920 SEQ ID No . 2 , 序列型：帶有對應多肽的核苷酸序列長度：279 bp 股：雙形狀：直線分子型：重組體原始有機體來源：乳酸乳球®LM0230(DSH5805),Hirudo medicinal is 即刻實驗來源：質體pUCRS(DSM 5803),質體 pML310(參見歜洲專利申誚案 EP-A-168 342 ) 待點：1至81 bp MSP倍號呔 82至279 bp去硫酸根水姪素編碼匾性質：MSP佶號编碼之乳_乳球艟LM0230 DHA與可於細 _體内生産分泌性水姪素的水姪素結構基因之融合體。 ..................................................裝...........................訂.......................…線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局印製甲 4 (210X297公釐） 2134S3 a6 B6 五、發明説明（53) ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT ATT TTA ATG TCT 36

Met Lys Lys Lys lie lie Ser Ala lie Leu Met Ser -25 -20 ACA GTG ATA CTT TCT GCT GCA GCC CCG TTG TCA GGT 72

Thr Val lie Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly -15 —10 —5 GTT TAC GCT GTT GTT TAC ACC GAC TGC ACC GAA TCT 108

Val Tyr Ala Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser 1 5 GGT CAG AAC CTG TGC CTG TGC GAA GGT TCT AAC GTT 144

Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val 10 15 20 * « TGC GGT CAG GGT AAC AAA TGC ATC CTG GGT TCT GAC 180

Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys lie Leu Gly Ser Asp 25 30 GGT GAA AAA AAC CAG TGC GTT ACC GGC GAA GGT ACC 216

Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 CCG AAA CCG CAG TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA 252

Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu 50 55 GAA ATC CCG GAA GAA TAC CTG CAG TAG 279

Glu lie Pro Glu Gin Tyr Leu Gin 60 65 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 線. 經濟部中央標準局印製甲 4(210X 297 公.餐）

Claims

經濟部中央樣準局貝工消费合作社印11 ΒΤ C7 D7 213.4S3 第80 1 02 185號「^^ΊΠΤϋΓΪ^表現載體之方法」専利案 I4 '上f、气β V 7日（8 2年8月修正） I桃充+ ：L____________________ 公告本 Λ申鯖專利範圔 1.—種DHA製備雜交載《的方法，包括 a)為質體pUCRS之約3.5kbp EcoRI/Sal丨乳酸乳球豳插子，插子之DKA序列如下： TTTAGGTATT TACGGAATTG CGACCTTATT GTTCCCACTT ATTGCTCTTT TTGTATATAA TATACAAATA ACTATATTTA CTAATCGCTG GACAAGGCTT TTTACAACAA TTATTATTGT GACCGCTTTT GAAGTTTTTA GTCCAATCAT TATGACAGCT TTTGGATTTG CCCAACTTCA GTTTATCAAA TTTGTTGTTT ACCAGTTAGC GCCTACACTT TTGCTCAATA TTATCTTAGC TGTAGCCTTA CAATTCCCTT TAGAAATCTT TTACAGATTA AAGAAAAGTC ATGTAAGATA CAATTAGAAA GTGTTTTGTA ATCATAAAGA AATATTAAGG TGGGGTAGGA ATAGTATAAT ATGTTTATTC AACCGAACTT AATGGGAGGA AAAATTAAAA AAGAACAGTT ATG AAA AAA AAG ATT aV： TCA GCT ATT TTA ATG TCT ACA GTG ATA GTT TCT GCT GCA GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCT GAC ACA AAC TCA GAT ATT GCT AAA CAA GAT GCG ACA ATT TCA AGC GCG CAA TCT GCT AAA GCA CAA GCA CAA GCA CAA GTT GAT AGC TTG CAA TCA AAA GTT GAC AGC TTA CAA CAA AAG CAA ACA AGT ACT AAA GCA CAA ATC GCT AAA ATC GAA AGC GAA CGT AAA GCA CTT AAT GCT CAA ATT GCT ACT TTG AAC GAA AGT ATC AAA GAA CGT ACA AAG ACA TTG GAA GCT CAA GCA 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 434 467 500 533 566 599 632 665 698 731 \……...............................乂 ...........¾...............................打...........{..............綠 {功先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) B7213463 經濟奋中央樣準局員工消费合作社印製六，申請專利範a CGT AGT GCT CAA GTT AAC AGC TAT ATG GAT GCT GTT GTT AAT ACA GAT GTT ATT CAA AAA GTA ACT GTT TCT AGT GCC AAC AAA CAA CAA GAA AAA GAG CAA AAA AAG TCA GAA ACT GTT AAA AAG TTC GTT TCT eTT TCA CAA AGT GCT CAA GAA TTG ACT TCA CAA AAA GTT GCG ACT TTG AAC TAT GCA ACT GCG CAA GAT AAA AAA GAT GAA AAA GCA GQT GCA GAA GAA GCA GCT AAA AAA CAA GCG CAA CAA AAA GAA GCA GCA CAA TCA ACA GCA GCA ACT GCT AAA GCA ACT TCA TCA GCT TCT GCT GCT CCA CAA GTA AGT ACA AGC ACA TCA AAT GCT AGT GCC TCA AGT TCA TCA AAC TCA AGT TCA TCA TCA AGC TCA AGC TCA AGC AAT GCT GGT GGG AAT ACA AAT ACT GGA AAT ACT GGA GGA ACA AGC GGT ATA AAT AGT TCA CCA TAT GCT GTT GGT GGA TGT ACT CAA TAC TTT GCT GCA CAA GGA AAT ATC ATG CCT GGT AAT GGT TCT AAT GGA CCT GCC CAA GGC TCA GCA ACA AAT 754 TCA AAA TCT TTG 797 ACA GCT ATT GCT 830 CAA ATG TTG GAA 863 GAG CTT AGC CAA 896 AAC TAC AAC CAG 929 TTG GAT TCT CAA 952 CAA GCT GAA CTC 995 CAA GCA ACA ATT i〇28 CAA GCT TTA TTA 1061 AAA GCA GCT CAA 1094 GCT TAT GAA GCT χΐ27 GCA CAA GCA GCT χ16〇 GCT GTA GAA GCA 1193 TCA TCT AGT CAA χ226 ACT GAT AAT ACA !259 AAC AGT TCT AAT ^292 AGT TCT AGC AGT 1325 TCA AGT AAT TCT 1358 TCA GGC ACT AGT i391 ACT ACT GGT GGT 1424 ATT GGA AAT CCT 1457 GAC TAT GTA TGG 149〇 ATT TAT ATC AGA ^523 GGA CAA TGG GCT 1556 GTG CTC CAT GTT 1589 (請先閱讀背面之注意事項再填其本百) 本纸張尺度適ffl t ffl田宋標準(CNS)甲4规格(210x297公 A7 B7213463 C7 < D7 六、申請專利範ffl GTA GGA GCT GCT CCT GGT GTT ATC GCA TCA AGC 1622 TTC TCA GCT GAT TTT GTT GGA TAT GCA AAC TCA 1655 CCT TAC GGT CAC GTA GCT ATT GTA AAA TCA GTT 1688 AAT TCA GAT GGT ACA ATT ACT ATC AAA GAA GGC 1721 GGA TAT GGT ACA ACT TGG TGG GGA CAT GAA CGT 1754 ACT GTA AGT GCG TCT GGT GTT ACT TTC TTG ATG 1787 CCA AAC TAG AAAAAAGTCT TAATAAATAA AAAATAGTGG 1826 TTTGATAGTG GGGAATAATT TTCCTTCTGT CAAATCATTT 1866 . TTTATTATTG TGGTATAATA ATAAGGAAAA ATGATAAGGG 1906 GATAGATACA AATG 或 1920 (請先聞讀背面之注意事項再琪tr本頁) 經濟部+央潘準ΛΛΧ消费合作社印鼓 b)為a蓋於a)中且缠瑪箸倍號呔之DHA序列之描併性序到•或〇>為S 2於a )或b )中之D K A分子衍生窃.及/或 d)包活下列各者之後裂起黏：（I)乳酸乳球菌LL71 2之 2.5Hd質S,或（II)乳酸乳球艟1^712之5.2HdgS ,该方法e括 π培育苗自包括大鵑桿齠、蘇s金桿鱸及乳酸乳球篇，其包括此種雜交載醱。 η)溶解上述寄主以釋出雜交載釅及 in)應用習知技蕕以分離上逑雜交載嫌。本紙»尺度速用中國β家樣旱(Clfs)甲< 規格(210x297公;m A7 B7 C7

213483 六、申請專利範团 2.—種DHA製備雜交載驩的方法，包括 a)為質鼸pUCRS之約3.5kbp EcoRI/Sall乳酸乳球_ 插子，插子之DNA序列如下： TTTAGGTATT TACGGAATTG CGACCTTATT GTTCCCACTT 40 ATTGC1*CTTT TTGTATATAA TATACAAATA ACTATATTTA 80 CTAATCGCTG GACAAGGCTT TTTACAACAA TTATTATTGT 120 GACCGCTTTT GAAGTTTTTA GTGCAATCAT TATGACAGCT 160 TTTGGATTTG CCCAACTTCA GTTTATCAAA TTTGTTGTTT 200 ACCAGTTAGC GCCTACACTT TTGCTCAATA TTATCTTAGC 240 TGTAGCCTTA CAATTCCCTT TAGAAATCTT TTACAGATTA 280 AAGAAAAGTC ATGTAAGATA CAATTAGAAA GTGTTTTGTA 320 ATCATAAAGA AATATTAAGG TGGGGTAGGA ATAGTATAAT 360 ATGTTTATTC AACCGAACTT AATGGGAGGA AAAATTAAAA 400 AAGAACAGTT ATG AAA AAA AAG ATT A^X： TCA GCT 434 ATT ΊΤΑ ATG TCT ACA GTG ATA €TT TCT GCT GCA 467 GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCT GAC ACA AAC 5〇〇 TCA GAT ATT GCT AAA CAA GAT GCG ACA ATT TCA 533 AGC GCG CAA TCT GCT AAA GCA CAA GCA CAA GCA 566 CAA GTT GAT AGC TTG CAA TCA AAA GTT GAC AGC 599 TTA CAA CAA AAG CAA ACA AGT ACT AAA GCA CAA 632 ATC GCT AAA ATC GAA AGC GAA CGT AAA GCA CTT 665 AAT GCT CAA ATT GCT ACT TTG AAC GAA AGT ATC 698 AAA GAA CGT ACA AAG ACA TTG GAA GCT CAA GCA 731 {請先面之汰$項再$本1) i裝. 訂· •線· 嫌濟部中*螵IHT興工消费合作杜^•製 213483 B：C： D' 經濟耜中夬樣準局員工消費合作社印51 六、申铸專_丨彳苑31 CGT AGT GCT CAA GTT AAC AGC TCA GCA ACA AAT 764 TAT ATG GAT GCT GTT GTT AAT TCA AAA TCT TTG 797 ACA GAT GTT ATT CAA AAA GTA ACA GCT ATT GCT 83〇 ACT GTT TCT AGT GCC AAC AAA CAA ATG TTG GAA gg3 CAA CAA GAA AAA GAG CAA AAA GAG CTT AGC CAA S96 AAG TCA GAA ACT GTT AAA AAG AAC TAC AAC CAG 929 TTC GTT TCT CTT TCA CAA AGT TTG GAT TCT CAA gg2 GCT CAA GAA TTG ACT TCA CAA CAA GCT GAA CTC 995 AAA GTT GCG ACT TTG AAC TAT CAA GCA ACA ATT 1〇28 GCA ACT GCG CAA GAT AAA AAA CAA GCT TTA TTA 1〇61 GAT GAA AAA GCA GQT GCA GAA AAA GCA GCT CAA 1〇g4 GAA GCA GCT AAA AAA CAA GCG GCT TAT GAA GCT 1127 CAA CAA AAA GAA GCA GCA CAA GCA CAA GCA- GCT ngQ TCA ACA GCA GCA ACT GCT AAA GCT GTA GAA GCA 1193 GCA ACT TCA TCA GCT TCT GCT TCA TCT AGT CAA 1226 GCT CCA CAA GTA AGT ACA AGC ACT GAT AAT ACA 1259 ACA TCA AAT GCT AGT GCC TCA AAC AGT TCT AAT 12S2 AGT TCA TCA AAC TCA AGT TCA AGT TCT AGC AGT 1325 TCA TCA AGC TCA AGC TCA AGC TCA AGT AAT TCT 1353 AAT GCT GGT GGG AAT ACA AAT TCA GGC ACT AGT 139X ACT GGA AAT ACT GGA GGA ACA ACT ACT GGT GGT 1424 AGC GGT ATA AAT AGT TCA CCA ATT GGA AAT CCT 1457 TAT GCT GTT GGT GGA TGT ACT GAC TAT GTA TGG 14g〇 CAA TAC TTT GCT GCA CAA GGA ATT TAT ATC AGA 1523 AAT ATC ATG CCT GGT AAT GGT GGA CAA TGG GCT iS56 TCT AAT GGA CCT GCC CAA GGC GTG CTC CAT GTT 1589 (請先閱猜背面之注意事項再填荈本百} •打· •線· 本纸張尺A適扣中衮樣毕(CHS)甲4規格(210x 297公货) 2134S3 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 GTA GGA GCT GCT CCT GGT GTT ATC GCA TCA AGC 1622 TTC TCA GOT GAT TTT GTT GGA TAT GCA AAC TCA 1655 CCT TAC GGT CAC GTA GCT ATT GTA AAA TCA GTT 1688 AAT TCA GAT GGT ACA ATT ACT ATC AAA GAA GGC 1721 GGA TAT GGT ACA ACT TGG TGG GGA CAT GAA CGT 1754 ACT GTA AGT GCG TCT GGT GTT ACT TTC TTG ATG 1787 CCA AAC TAG AAAAAAGTCT TAATAAATAA AAAATAGTGG 1826 ·_裝· TTTGATAGTG GGGAATAATT TTCCTTCTXST CAAATCATTT 1866 . TTTATTATTG TGGTATAATA ATAAGGAAAA ATGATAAGGG 1906 GATAGATACA AATG 或 1920 訂. b)為ag於a)中且纗瑪箸倍號呔之DHA序列之餌 I 併性序列.或 cJ為涵芰於a)或b):中之DKA分子衍生窃•及/或 d) S活下列各者之祺裂起》: (I)乳酸乳琼菌LL712之 2. 5HdS s .或（II)乳酸乳球窗LL712之5.2Hd質埋· 本方法包括使用習知技蕕在試管内合成所述之雜交載龌。 3.—種製備轉形大腸桿蔺之方法，該方法包括，步® i) 以CaCU製備轉形大腸捍®，Π)處理轉形完整大腸桿篇以雜交載匾包括線. 嫌濟部中*揲準馬霣工消费合作杜印《經濟部中央螵準爲β工消费合作社印髮 213483 a? B7 C7___________Ξ__ 六、申請專利範園 a)如申請専利範第1項之霣fllpUCRS之約3.5kbp EcoRI/Sall乳酸乳球睹插子•或句為涵蓋於a)中且缟碼著倍％呔之DK A序列之餌併性序列，或 c) 為涵s於a)3ib)!中之DHA分子衍生物•及/或 d) 包括下列各者之後裂起黏：(I)乳酸乳球菌LL712之 2.5Hd質* .或UI)乳酸乳球菌LL712之5.2Hd質級. 現情況S用一捺記基因.及Cii〇 S用一轉形鍰。 4. 一種製備轉形蘇靈金桿發或乳酸乳球皤之方法，該方法包括步糠i)懸浮蘇靈金桿篇或乳酸乳球凿细跑於雜交載匾包括 a)如申講専利範函第1項之質讎PUCRS之約3.5kbp EcoRI/Sall乳酸乳球躕插子，或 W為SS於a)中且缠珥萑隹铱呔之DHA序列之甜併性序列.莰 9為涵g於a>S2b)中之DKA分子衍生物.及/或 d)包活下列各者之夜裂起黏：(I)乳發乳球菌lL71?:> 2.5HdS.B . 12 (II)乳酸乳球茵 LL712 之 5.2Hd 質嫌1 ., 視情況S用一檫記基因· (請先閲面之注意事項再5FW本1) 裝. 訂. 線· 213463 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範固 (ii)把懸浮细《置入放《，及（iii)苗用一轉形鼸。 5. —種製備去硫酸根水姪索之方法，包括下列各步明： (i)勘合结構基因於適當解讀架内與MSP倍轚肽之縝碼 DHA序列 Met Lys Lys Lys lie He Ser Ala lie Leu Met Ser Thr Val He Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala (Π)使用包括（a)所製備之鼬合基因的雜交載臁轉形迪當選自大臈桿菌，蘇S金桿艟及乳酸乳球豳寄主，從寄主細胞内分泌出由所逑繳合基因所鑷碼的多肽，及若有所痛，#ν)依習知方法從上清液中單離多肽。 6. 根據申餹專利範園第5項之方法，其中使用菝自蘇轚金捍菌及乳酸乳球®中之任一種寄主。 7. 根據申餹専利範國第5項之方法•其中使用於培餐基内不會分泌出可降解表現出的蛋白質之蛋白鷗的细豳自大腸桿齠，蘇靈金桿篇及乳酸乳球醣中之任一種寄主。 8. 根據申請專利範团第5項之方法.其中使用以pSC12HIR • PSC12HIR-1 或 pSC12HIRTe「轉形的乳酸乳球睡 LH0230 細胞。 9. 根據申a専利範鼴第5項之方法，其中g用以 PSC12HIR Term鞞形的乳酸乳球想0?30细胞。 10·根拣申笛專利範圍第5項之方法•其中使用以 PVAHIR或pVAHIR-l轉形的蘇g金捍苗细胞。 ------------------------裝------β------線 (請先H1we面之注4m-項再5FW本頁) 經濟部中央標準房員工消费合作杜卹褽 213463 C7 D7

經濟部中夹檩準馮霣工消t合作杜印w 六、申請專利範囲11 .根據申諳專利範困第5項之方法•其待點為（i)鞞形细胞傜於培餐的對數期或择定期從培奄基收集而得， (ii)再度憨浮於較小量茵積的新鮮培奄基或涯當缓衝掖内及（iii)從上淸掖中箪離期望産物之前進一步培育。 12.根掸申請專利範圍第11項之方法•其持點為轉形细胞再度怒浮成佔原始培餐居積之约至約20%匾積。 13·根按申II專利範圍第丨2項之方法.其待鲇為以PSC12HIR 轉形的乳酸乳球睹LH0230细胞再度g浮於约1/ 10庭稷的新餌培萑基内且於约30Ό培哲约30分搜。14.根據申鯖専利範園第5項之方法•其中去硫酸根水姪素之结構基因由MSP具如下胺基酸序列之结構基因取代： Asp Thr Asn Ser Asp lie Ala Lys Gin Asp Ala Thr lie Ser Ser Ala Gin Ser Ala Lys Ala Gin Ala Gin Ala Gin Val Asp Ser Leu Gin Ser Lys Val Asp Ser Leu Gin Gin Lys Gin Thr Ser Thr Lys Ala Gin lie Ala Lys lie Glu Ser Glu Arg Lys Ala Leu Asn Ala Gin lie Ala Thr Leu Asn Glu Ser lie Lys Glu Arg Thr Lys Thr Leu Glu Ala Gin Ala Arg Ser Ala Gin Val Asn Ser Ser Ala Thr Asn ΊΥγ Met Asp Ala Val Val Asn Ser Lys Ser Leu Thr Asp Val lie Gin Lys Val Thr Ala lie Ala Thr Val Ser Ser Ala Asn Lys Gin Met Leu Glu Gin Gin Glu Lys Glu Gin Lys Glu Leu Ser Gin Lys Ser Glu Thr Val Lys Lys Asn *iyr Asn Gin Phe Val Ser Leu Ser Gin Ser Leu Asp Ser Gin Ala Gin Glu Leu Thr Ser Gin Gin Ala Glu Leu Lys Val Ala Thr Leu Asn *iyr Gin Ala Thr lie Ala Thr Ala Gin Asp Lys Lys Gin Ala Leu Leu Asp Glu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Gin Glu Ala Ala Lys Lys Gin Ala Ala Tyr Glu Ala Gin Gin Lys Glu Ala Ala Gin Ala Gin Ala Ala Ser Thr Ala Ala Thr Ala Lys Ala Val Glu Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gin Ala Pro Gin Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Thr Thr Ser Asn Ala Ser Ala Ser Asn Ser Ser Asn Ser Ser Ser (請先閲tfSe面之注項再SfW本頁) •裝. 訂· 線· 213483 A7 B7 «濟部中央#芈场霣工消费合作社印《 C7 _______D7__ 六、申請專利範团 Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Asn Ala Gly Gly Asn Thr Asn Ser Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ser Gly lie Asn Ser Ser Pro lie Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Gly Cys Thr Asp Tyr Val Trp Gin Tyr Phe Ala Ala Gin Gly lie iyr lie Arg Asn lie Met Pro Gly Asn Gly Gly Gin Trp Ala Ser Asn Gly Pro Ala Gin Gly Val Leu His Val Val Gly Ala Ala Pro Gly Val lie Ala Ser Ser Phe Ser Ala Asp Phe Val Gly Tyr Ala Asn Ser Pro Tyr Gly His Val Ala lie Val Lys Ser Val Asn Ser Asp Gly Thr lie Thr lie Lys Glu Gly Gly· Tyr Gly Thr Thr Trp Trp Gly His Glu Arg Thr Val Ser Ala Ser Gly Val Thr Phe Leu Met Pro Asn ' 15.呈純霣形式的具如下之胺基酸序列， Asp Thr Asn Ser Asp lie Ala Lys Gin Asp Ala Thr lie Ser Ser Ala Gin Ser Ala Lys Ala Gin Ala Gin Ala Gin Val Asp Ser Leu Gin Ser Lys Val Asp Ser Leu Gin Gin Lys Gin Thr Ser Thr Lys Ala Gin lie Ala Lys lie Glu Ser Glu Arg Lys Ala Leu Asn Ala Gin lie Ala Thr Leu Asn Glu Ser lie Lys Glu Arg Thr Lys Thr Leu Glu Ala Gin Ala Arg Ser Ala Gin Val Asn Ser Ser Ala Thr Asn -iyr Met Asp Ala Val Val Asn Ser Lys Ser Leu Thr Asp Val lie Gin Lys Val Thr Ala lie Ala Thr Val Ser Ser Ala Asn Lys Gin Met Leu Glu Gin Gin Glu Lys Glu Gin Lys Glu Leu Ser Gin Lys Ser Glu Thr Val Lys Lys Asn iyr Asn Gin Phe Val Ser Leu Ser Gin Ser Leu Asp Ser Gin Ala Gin Glu Leu Thr Ser Gin Gin Ala Glu Leu Lys Val Ala Thr Leu Asn Tyr Gin Ala Thr 工le Ala » Thr Ala Gin Asp Lys Lys Gin Ala Leu Leu Asp Glu Lys Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Gin Glu Aia Ala Lys Lys Gin Ala Ala iyr Glu Ala Gin Gin Lys Glu Ala Ala Gin Ala Gin Ala Ala Ser Thr Ala Ala Thr Ala Lys Ala Val Glu Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gin Ala Pro Gin Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Thr Thr Ser Asn Ala Ser Ala Ser Asn Ser Ser Asn Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Asn Ala Gly Gly Asn Thr Asn Ser Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Gly Ser Gly lie Asn Ser Ser Pro lie Gly Asn Pro Tyr Ala Val Gly Gly Cys Thr Asp (請先«$面之注項再Ϊ本頁) i裝· 订. •線. -10 -

A7 213463 b7 __D7__ 六、申請專利範困 Tyr Val Trp Gin Tyr Phe Ala Ala Gin Gly lie Tyr lie Arg Asn lie Met Pro Gly Asn Gly Gly Gin Trp Ala Ser Asn Gly Pro Ala Gin Gly Val Leu His Val Val Gly Ala Ala Pro Gly Val lie Ala Ser Ser Phe Ser Ala Asp Phe Val Gly Tyr Ala Asn Ser Pro Tyr Gly His Val Ala lie Val Lys Ser Val Asn Ser Asp Gly Thr lie Thr lie Lys Glu Gly Gly· Tyr Gly Thr Thr Trp Trp Gly His Glu Arg Thr Val Ser Ala Ser Gly Val Thr Phe Leu Met Pro Asn · 16· -種生産根雄申請専利範園第15項鈍質MSP之方法，包括下列步《 : U)使用三氰乙酸從乳酸乳球菌LM0230上淸液中沈鎩出蛋白質，（i i)於SDS聚丙烯匿胺謬上電泳沈澱出的蛋白質，（iii)切下具有主要蛋白質箝之B域，及（iv)從凝謬上霣溶離出56KD分子StMSP 。 <請先MtwB面之注項再sm本荑) -裝· 訂. .線. 故濟部中央榡筚扃R工消费合作社印製本纸張又Λ適用中®國家橒準（CNS)甲4规格<210 X 297公犛〉