KR101557509B1 - 락토코커스 프로모터 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분자 생물학의 분야에 속하고, 재조합 조작 및 단백질 발현에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 락토코커스로부터 유래되고 프로모터로서 유용한 서열을 포함하는 단백질의 재조합 발현을 위한 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 그것으로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이종 또는 동종 단백질을 발현하기 위한, 그리고 상기 단백질을 대상에게 전달, 특히 치료적 전달하기 위한 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 용도를 포함한다.
락토코커스, 단백질 발현

Description

락토코커스 프로모터 및 그것의 용도{LACTOCOCCUS PROMOTERS AND USES THEREOF}
본 발명은 분자 생물학의 분야에 속하고, 재조합 조작 및 단백질 발현에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 락토코커스(Lactococcus)로부터 유래되고 프로모터로서 유용한 서열을 포함하는 단백질의 재조합 발현을 위한 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 그것으로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이종성 또는 동종성 단백질을 발현하기 위한, 그리고 상기 단백질을 대상에게 전달, 특히 치료적 전달하기 위한 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 용도를 포함한다.
유산 세균은 시험관내 이종성 폴리펩티드의 재조합 발현을 위한 숙주(예를 들어, US 특허 제5,559,007호); 및 항원 및/또는 치료적으로 관련된 폴리펩티드의 생체내 또는 인시츄 발현 및 전달을 위한 숙주(예를 들어, WO 97/14806)로서 점차 더 중요해지고 있다.
유산 세균, 특히 락토코커스는 GRAS-미생물로서 간주되고(즉, 일반적으로 안전한 것으로 간주됨), 이로써 인간 및 동물에게 비교적 바로 투여될 수 있다.
그러나, 유산 세균 내 강한 이종성 발현 수준을 달성하기 위해서는, 상기 세 균들에 대해 내인성인 프로모터 및 기타 서열의 도입이 필요하고(예를 들어, 문헌 [Wells et al.], 1993A 참조), 이에 따라 상기 세균의 GRAS 인정을 저감할 수 있다.
따라서, 유산 세균, 더욱 바람직하게는 락토코커스로부터 유래되고 거기에서 단백질 발현, 바람직하게는 이종성 단백질 발현에 유리하게 사용될 수 있는 추가의 프로모터를 제공할 필요가 존재한다.
또한, 산업적 및/또는 치료적 환경에서 충분한 양의 상기와 같이 발현된 단백질을 수득하기 위해 높은 발현 수준을 달성할 수 있도록 하는 프로모터도 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 측면은 당업계의 상기 논의된 필요들 중 적어도 일부, 예를 들어 한가지 이상을 해결한다.
특히, 본 발명자들은 숙주 세포, 바람직하게는 세균, 더욱 바람직하게는 락토코커스 내 재조합 발현, 예컨대 바람직하게 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 프로모터로서 유리하게 사용될 수 있는, 락토코커스로부터 유래된 핵산 및 핵산 서열을 인지하였다.
보다 특히, 본 발명자들은 숙주 세포, 바람직하게는 세균, 더욱 바람직하게는 락토코커스 내, 재조합 발현, 예컨대 바람직하게 폴리펩티드의 발현을 위한 강한 프로모터, 즉 높은 발현 수준을 달성하는 프로모터로서 기능할 수 있는, 락토코커스로부터 유래된 핵산 및 핵산 서열을 동정하기 위해 착수하여, 이에 성공하였다. 강한 발현은 유리하게, 예를 들어 숙주 세포로부터의 정제 또는 숙주 세포에 의한 치료적 전달을 위한 용도와 같은 추가의 용도들을 위해 이용가능해진, 숙주 세포에 의해 재조합 생산되는 발현 생성물, 예를 들어 폴리펩티드의 양을 증가시킬 수 있다.
더욱 더 놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 핵산 및 핵산 서열이, 과거 락토코커스로부터 유래되었던 프로모터보다 더 강한, 특히 락토코커스에 사용될 때에, 더욱 더 강한 프로모터로서 작용할 수 있음을 파악하였다. 보다 구체적으로, 본 발명의 핵산 및 서열은, 본 발명자들이 최대 알고 있는 바로는 지금까지 가장 강한 락토코커스-유래 프로모터, 보다 특히 가장 강한 구성 락토코커스-유래 프로모터인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 티미딜레이트 합성효소 유전자(thyA)의 프로모터보다 더욱 더 강한 프로모터, 예를 들어 더욱 더 강한 구성 프로모터로서 상기와 같이 기능할 수 있다. 락토코커스 락티스의 thyA 프로모터는 또한 본 발명자들이 최대 알고 있는 바로는, 락토코커스, 바람직하게는 락토코커스 락티스 내 재조합 유전자 발현, 예를 들어 이종성인 유전자 발현을 위한, 현재 알려진 가장 강한 프로모터이기도 하다.
놀랍게도, 정교한 단백질체학 데이터와 함께 예로서 나타낸 바와 같은 조합 전사체(transcriptome) 분석은 후보 프로모터의 강도 또는 활성을 제시함에 있어 효율적이지 않았다. 특히, 동정된 일부 프로모터는 시험 시에 단지 활성이 약하였다. 부가적으로, 일부 잠재적 프로모터 서열은 자연적 환경 또는 네이티브 구성을 벗어나면, 즉 이종성 유전자를 이용하여 시험할 때에는, 활성적이지 않았다.
부가 이점으로서, 바람직한 표적으로서 특히 인간 IL-10, 인간 펩티드 YY(PYY), 인간 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1), 인간 GLP-2(GLP-2) 및 인간 트레포일(Trefoil) 인자(TTF)에 대해 본 발명의 프로모터를 이용할 때 특히 높은 발현이 관찰된다.
또한, 본 발명자들에 의해 동정된 핵산 및 핵산 서열은 GRAS 미생물(즉, "일반적으로 안전하다고 간주됨")로 확립된 락토코커스로부터 유래된다는 것도 또한 인식하도록 한다. 궁극적으로, 그러한 프로모터를 포함하는 조성물, 예를 들어 숙주 세포는 예를 들어 비-GRAS 미생물 또는 기타 공급원으로부터 비롯되는 서열을 도입할 때보다 생물학적 안전성에 대한 보다 적은 염려로 인간 및 동물에게 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 숙주 세포, 바람직하게는 세균, 더욱 더 바람직하게는 락 토코커스에서의 재조합 발현, 예를 들어 폴리펩티드의 재조합 발현을 수반하는 다수의 용도들에 사용하기 위한, 추가의 프로모터, 더욱 바람직하게는 추가의 강한 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 thyA 프로모터보다 강한 프로모터를 구성하는 유리한 락토코커스-유래, 즉 동등하게 안전한 핵산 및 서열을 제공한다.
본 발명은 다양한 측면들에서 상기 관련 파악내용들을 통합한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 프로모터(P)로서, 이 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된, 락토코커스 종으로부터의 네이티브 프로모터 또는 그것의 기능성 변이체 또는 기능성 단편인 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)는 락토코커스 락티스의 티미딜레이트 합성효소 유전자(thyA)의 프로모터보다는 락토코커스에서 더 강한 것을 특징으로 하는 재조합 핵산을 제공한다.
따라서, 이와 관련하여, 본 발명은 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)는 1) DNA-지정 RNA 중합효소, 베타' 서브유닛/160 kD 서브유닛(rpoC), 2) DNA-지정 RNA 중합효소, 베타 서브유닛/140 kD 서브유닛(rpb2), 3) DNA-결합 페리틴-유사 단백질(산화성 손상 보호제(oxidative damage protectant))(dps), 4) 피루베이트 키나제(pyk), 5) 글루타밀- 및 글루타미닐-tRNA 합성효소(glnS), 6) 에놀라제(eno), 7) 글루타민 합성효소(glnA) 8) HTH-형 전사 조절제(glnR), 9) Xaa-His 디펩티다제(argE 또는 pepV), 10) F0F1-형 ATP 합성효소 베타 서브유닛(ATP 합성효소 F1 베타 서브유닛)(atpD), 11) 3-포스포글리세레이트 키나제(pgk), 12) 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소/에리트로스-4-인산염 탈수소효소(gapA), 13) 아세트테이트 키나제(ackA), 14) 3-옥소아실(아실-운반체-단백질) 합성효소(fabB), 15) 3-옥소아실-(아실-운반체-단백질) 환원효소(fabG), 16) DNA-지정 RNA 중합효소, 알파 서브유닛/40 kD 서브유닛(rpoA), 17) Xaa-Pro 아미노펩티다제(pepP), 18) 프룩토스/타가토스 비스포스페이트 알돌라제(tbp), 19) 리보솜 단백질 S4(rpsD), 20) 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA), 21) 리보솜 단백질 S12(rpsL) 및 리보솜 단백질 S7(rpsG), 22) 리보솜 단백질 L18(rplR) 및 리보솜 단백질 S5(rpsE) 및 리보솜 단백질 L30/L7E(rpmD), 23) S-리보실호모시스테인 탈이효소(lyase)(luxS), 24) 리보솜 단백질 L19(rplS), 25) 리보솜 단백질 S11(rpsK), 26) 리보솜 단백질 L10(rplJ), 27) 리보솜 단백질 L7/L12(rplL), 28) 세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU(hup), 29) 5OS 리보솜 단백질 L28(rpmB), 30) 인산기전이효소(phosphotransferase)계 셀로비오스-특이적 성분 IIB(lacE), 31) F0F1-형 ATP 합성효소 알파 서브유닛(atpA), 32) ABC-형 당 수송계(ATP아제 성분)(malK), 33) 아세토인 탈수소효소 복합체 E1 성분 알파 서브유닛(acoA), 34) 세포 분열 단백질(diflVA 또는 ftsA), 35) UDP-갈락토피라노스 뮤타제(glf), 36) 글루타밀 아미노펩티다제(frvX), 37) 예측된 탈수소효소 관련 단백질(mviM), 38) 리보솜 단백질 S2, 39) 번역 개시 인자 3(IF-3)(infC), 40) 리보솜 단백질 L4(rplD) 및 리보솜 단백질 L23(rplW) 및 리보솜 단백질 L2(rplB), 41) EMAP 도메인(ydjD), 42) 전사 신장 인자(greA), 43) ATP-의존성 Clp 프로테아제의 프로테아제 서브유닛(clpP), 44) 리보솜 단백질 L15(rplO), 45) 리보솜 단백질 L11(rplK), 46) 리보솜 단백질 S8(rpsH), 47) 리보솜 단백질 L21(rplU), 48) 리보솜 단백질 S13(rpsM), 49) 리보솜 단백질 S19(rpsS) 및 리보솜 단백질 L22(rplU) 및 리보솜 단백질 L16(rplP) 및 리보솜 단백질 L14(rplN), 50) 리보솜 단백질 S10(rpsJ), 51) 코-샤페로닌 GroES(Hsp10)(cpn10), 52) 리보솜 단백질 L24(rplX) 및 53) 가설 단백질 LACR_0137(duf965)을 위한 락토코커스의 유전자의 네이티브 프로모터 및 그 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 또한 제공한다.
본 발명은 프로모터(P)는 1) DNA-지정 RNA 중합효소, 베타' 서브유닛/160 kD 서브유닛(rpoC), 3) 비-헴 철-결합 페리틴(dpsA), 4) 피루베이트 키나제(pyk), 5) 글루타미닐-tRNA 합성효소(gltX), 6) 포스포피루베이트 수화효소(eno), 9) 디펩티다제 PepV(pepV), 12) 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(gapB), 13) 아세테이트 키나제(ackA), 18) 프룩토스 비스포스페이트 알돌라제(fbaA), 20) 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA), 21) 리보솜 단백질 S12(rpsL) 및 리보솜 단백질 S7(rpsG), 22) 리보솜 단백질 L18(rplR) 및 리보솜 단백질 S5(rpsE) 및 리보솜 단백질 L30/L7E(rpmD), 24) 리보솜 단백질 L19(rplS), 26) 리보솜 단백질 L10(rplJ), 28) HU-유사 DNA-결합 단백질(hllA), 29) 5OS 리보솜 단백질 L28(rpmB), 30) 인산전달효소계(phosphotransferase system) IIB 성분(ptcB), 31) F0F1-형 ATP 합성효소 알파 서브유닛(atpA), 32) 다중 당-결합 수송 ATP-결합 단백질(msmK), 33) 피루베이트 탈수소효소 E1 성분 알파 서브유닛(pdhA), 34) 세포 분열 단백질(diflVA 또는 ftsA), 35) UDP-갈락토피라노스 뮤타제(glf1), 36) 글루타밀 아미노펩티다제(pepA), 37) 예측된 탈수소효소 관련 단백질(llmg 0272), 38) 리보솜 단백질 S2(rpsB), 39) 번역 개시 인자 3(IF-3)(infC), 40) 리보솜 단백질 L4(rplD) 및 리보솜 단백질 L23(rplW) 및 리보솜 단백질 L2(rplB), 41) 페닐알라닐-tRNA 합성효소 베타 사슬(pheT), 42) 전사 신장 인자 GreA(greA), 43) ATP-의존성 Clp 프로테아제 단백질분해 서브유닛(clpP), 44) 리보솜 단백질 L15(rplO), 45) 리보솜 단백질 L11(rplK), 46) 리보솜 단백질 S8(rpsH), 47) 리보솜 단백질 L21(rplU), 48) 리보솜 단백질 S13(rpsM), 49) 리보솜 단백질 S19(rpsS) 및 리보솜 단백질 L22(rplU) 및 리보솜 단백질 L16(rplP) 및 리보솜 단백질 L14(rplN), 50) 리보솜 단백질 S10(rpsJ), 51) 코-샤페로닌 GroES(Hsp10)(groES), 52) 리보솜 단백질 L24(rplX) 및 53) 추정적 홀리데이 정션 레솔바제(holiday junction resolvase)(llmg_0151)를 위한 락토코커스, 바람직하게는 락토코커스 락티스의 유전자의 네이티브 프로모터 및 그 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 제공한다.
더욱 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 프로모터(P)는, 표 1에 정의된 바와 같이, 1) DNA-지정 RNA 중합효소, 베타' 서브유닛/160 kD 서브유닛(rpoC), 3) 비-헴 철-결합 페리틴(dpsA), 4) 피루베이트 키나제(pyk), 5) 글루타미닐-tRNA 합성효소(gltX), 6) 포스포피루베이트 수화효소(eno), 9) 디펩티다제 PepV(pepV), 12) 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(gapB), 13) 아세테이트 키나제(ackA), 18) 프룩토스 비스포스페이트 알돌라제(fbaA), 20) 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA), 21) 리보솜 단백질 S12(rpsL) 및 리보솜 단백질 S7(rpsG), 22) 리보솜 단백질 L18(rplR) 및 리보솜 단백질 S5(rpsE) 및 리보솜 단백질 L30/L7E(rpmD), 24) 리보솜 단백질 L19(rplS), 26) 리보솜 단백질 L10(rplJ), 28) HU-유사 DNA-결합 단백질(hllA), 29) 5OS 리보솜 단백질 L28(rpmB), 및 30) 인산전달효소계 IIB 성분(ptcB)을 위한 락토코커스, 바람직하게는 락토코커스 락티스의 유전자의 네이티브 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 제공한다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 프로모터에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터 28) 세균 핵양체 DNA-결합 단백질/HU-유사 DNA-결합 단백질(hllA 또는 hup)을 포함하는 재조합 핵산을 제공한다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 프로모터는 PhllA 프로모터이다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 각기 프로모터에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된, 프로모터 3) 비-헴 철-결합 페리틴(dpsA 또는 LACR_2311), 프로모터 9) 디펩티다제 PepV(pepV 또는 LACR_0908) 또는 프로모터 20) 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA 또는 LACR_0458)를 포함하는 재조합 핵산을 제공한다. 더욱 더 바람직하게, 상기 프로모터는 PdpsA, PpepV 또는 PsodA 프로모터이다.
한 바람직한 선택양태에서, 본 발명은 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)가 상기 1) 내지 30), 또는 표 1 하에 열거된 락토코커스의 유전자의 네이티브 프로모터, 바람직하게는 PhllA, PdpsA, PpepV 또는 PsodA 프로모터, 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 핵산을 제공한다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 유전자, 및 각각의 네이티브 프로모터 및 그것의 기능성 변이체 및 기능성 단편은 락토코커스 락티스에서 유래된다.
관련 예시적 측면에서, 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 벡터; 염색체 통합 발현 카세트, 본 발명의 재조합 핵산 또는 그것을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포; 숙주 세포에서 상기 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 발현 생성물, 바람직하게는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위한 본 발명의 재조합 핵산의 용도; 상기 숙주 세포를 이용한 관심 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드의 재조합 발현 및 분리 방법; 상기 숙주 세포에 의해, 치료 관련 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드, 예를 들어 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드(non-vaccinogenic therapeutically active polypeptide)를 인간 또는 동물로 인시츄 전달하는 것을 수반하는 치료 방법; 및 상기 전달을 용이하도록 하는 의약의 제조를 위한 숙주 세포의 관련 용도; 상기 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물; 등도 또한 제공된다
본 발명의 상기 측면 및 기타 측면, 또한 바람직한 실시양태가 하기 단락들 및 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다.
도면의 간단한 설명
도 1(a-h)은 바람직한 프로모터 서열을 도시한다.
도 2는 락토코커스 락티스 MG1363 폴리펩티드의 전기영동 분리를 도시한다.
도 3은 클로닝 기법을 도시한다.
도 4 프로모터-Usp45-h[Gly2]GLP2 융합의 서브클로닝. P는 P1(문헌 [Waterfield, et al. 1995]), PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터) 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터)와 같은 프로모터들 중 임의의 것을 나타내고; usp45는 야생형 usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk, et al. 1990]), 또는 위치 4에 있는 리신이 아스파라긴으로 치환된 Usp45 N4을 포함한 상기 분비 신호의 돌연변이체를 나타내며; Em은 에리트로마이신 선택 마커를 나타내고; ori는 복제 기점을 나타낸다.
도 5 항-hGLP2 항체에 의해 나타내어지는 재조합 L. 락티스 균주에 의한 h[Gly2]GLP-2의 생산 및 분비. (A) h[Gly2]GLP-2의 분비. 1 ㎍의 재조합 hGLP-2를 양성 대조군으로서 로딩하였다. (B) h[Gly2]GLP-2의 세포내 생산 및 분비. 블롯 상의 각 레인(lane)은 3시간의 성장 후에 수득된 1 ml의 L. 락티스 세포 분획 또는 배양 상등액을 나타낸다. 씨블루
Figure 112009042065156-pct00001
플러스2(SeeBlue
Figure 112009042065156-pct00002
Plus2)(인비트로겐(Invitrogen))를 분자량 마커(MW)로 사용하였다.
도 6 L. 락티스 MG1363과 본 연구에 사용된 각종 hIL-10 발현 균주들의 모식적 비교. 작제 중, hIL-10 발현 카세트를 각기 hIL-10 발현 카세트 및 thyA의 상류 및 하류 모두에서 동일한 서열에서의 상동성 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체 내에 통합한다. 재조합 지점은 ＼에 의해 모식적으로 나타낸다. 이에 따라, 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 상기 기재된 균주들에 대해 동일하게 된다. 유전 요소는 일정한 비례로 확대하여 도시된 것이 아니다.
도 7 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 균주 sAGX0005 및 Thy12)로부터의 hIL-10 발현과 (A) PdpsA 프로모터(DNA-결합 페리틴-유사 단백질, 서열 번호 3, sAGX0012), (B) PpepV(Xaa-His 디펩티다제 프로모터 서열 번호 9 또는 158, 균주 sAGX0018), (C) PsodA(수퍼옥시드 디스뮤타제 프로모터, 서열 번호 20 sAGX0029) 및 (D) PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 균주 sAGX0037)로부터의 hIL-10 발현의 비교. "프로모터"는 hIL-10 유전자의 전방에 있는 프로모터를 가리킨다.
도 8 109개 MGI363, sAGX0005 및 sAGX0037 세포 당, hIL-10 발현의 비교
도 9 L. 락티스 MG1363 및 본 연구에 사용된 각종 hTFF 발현 균주들의 모식적 비교. 작제 중, TFF 발현 카세트를 각기 TFF 발현 카세트 및 thyA의 상류 및 하류 모두에서 동일한 서열에서의 상동성 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체 내에 통합한다. 재조합 지점은 ＼에 의해 모식적으로 나타낸다. 이에 따라, 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 상기 기재된 균주들에 대해 동일하게 된다. 돌연변이 usp45는 ★로 나타내어진다. 유전 요소는 일정한 비례로 확대하여 도시된 것이 아니다.
도 10 이하의 비교:
(A) 야생형(wt) usp45 분비 신호 및 hTFF1(균주 sAGX0041)에 연결된 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터), 돌연변이(mut) usp45 분비 신호 및 hTFF1(균주 sAGX0049)에 연결된 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU; 서열 번호 28의 프로모터), 또는 wt usp45 분비 신호 및 hTFF1(균주 sAGX0048)에 연결된 PhllA로부터의 hTFF1 발현.
(B) wt usp45 분비 신호 및 hTFF3(균주 sAGX0043)에 연결된 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터), wt usp45 분비 신호 및 hTFF3(sAGX0059)에 연결된 PdpsA 프로모터(DNA-결합 페리틴-유사 단백질, 서열 번호 3), 및 mut usp45 분비 신호 및 hTFF3(균주 sAGX0057)에 연결된 PhllA로부터의 hTFF3 발현.
"프로모터" 및 "분비 신호"는 TFF 유전자의 전방에 있는 프로모터 및 분비 신호를 가리킨다.
도 11 표시된 각종 균주들의 상등액의 웨스턴 블롯 분석. 기준 단백질을 함유하는 레인을 "hTFF1"(기준 hTFF1) 및 "MWM"(분자량 마커, 분자량은 "kDa"로 나타냄)으로 나타낸다. 다른 모든 레인은 상기 기재된 바와 같이 회수된, 표시된 균주의 당량 0.5 ml의 배양 상등액을 함유한다. 첫 번째 항체는 마우스 단클론성 항-hTFF1: 1/1000(압노바(Abnova): 카달로그 # H00007031-M02)였다. 두 번째 항체는 염소 항-마우스-AP: 1/1000(서던 바이오테크(Southern Biotech): 4050-04)였고, NBT/BCIP(로쉐(Roche) 11 697 471 0001)을 이용하여 검출을 행하였다. MWM은 인비트로겐 씨블루 플러스2로 예비염색된 표준물질(카달로그 #LC5925)이다.
도 12 pT1NX 및 본 연구에 사용된 각종 hPYY G9(3-36) 발현 플라스미드의 구조의 모식적 개략도. 발현 플라스미드 pAGX0211, pAGX0212 및 pAGX0213은, EcoRI-SpeI 개방 pT1NX 내 EcoRI-SpeI 단편으로서 각각의 발현 카세트를 삽입함으로써 수득되었다. 이에 따라, 복제 기점(ori) 및 에리트로마이신 내성 마커(EmR)와 같은 발현 카세트의 외측에 있는 모든 DNA 서열의 구조 및 위치가 모든 플라스미드들에 대해 동일하다. 유전 요소는 일정한 비례로 확대되어 도시된 것이 아니다.
도 13 usp45 분비 신호 및 hPYY G9(3-36)에 연결된, P1(문헌 [Waterfield et al. 1995])(플라스미드 pAGX0211), PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 플라스미드 pAGX0212), 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 플라스미드 pAGX0213)로부터의 hPYY G9(3-36) 발현의 비교. 모든 플라스미드들은 L. 락티스 MG1363 내에 존재하였다. "프로모터"는 hPYY G9(3-36) 유전자의 상류에 있거나 pT1NX에 동등한 부위에 존재하는 프로모터를 가리킨다.
도 14 pT1NX 및 본 연구에 사용된 각종 hGLP-1 G8(7-36) 발현 플라스미드의 구조의 모식적 개략도. 발현 플라스미드 pAGX0233 및 pAGX0234는, EcoRI-SpeI 개방 pT1NX 내 EcoRI-SpeI 단편으로서 각각의 발현 카세트를 삽입함으로써 수득되었다. 이에 따라, 복제 기점(ori) 및 에리트로마이신 내성 마커(EmR)와 같은 발현 카세트의 외측에 있는 모든 DNA 서열의 구조 및 위치가 모든 플라스미드들에 대해 동일하다. 유전 요소는 일정한 비례로 확대되어 도시된 것이 아니다.
도 15 usp45 분비 신호 및 hGLP-1 G8(7-36)에 연결된, P1(문헌 [Waterfield et al. 1995])(플라스미드 pAGX0211), PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 플라스미드 pAGX0212) 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 플라스미드 pAGX0213)로부터의 hGLP-1 G8(7-36) 발현의 비교. 모든 플라스미드들은 L. 락티스 MG1363 내에 존재하였다. "프로모터"는 hGLP-1 G8(7-36) 유전자의 상류에 있거나 pT1NX에 동등한 부위에 존재하는 프로모터를 가리킨다.
도 16 L. 락티스 MG1363 및 본 연구에 사용된 각종 hIL-10 발현 균주들의 모식적 비교. 작제 중, hIL-10 발현 카세트를 각기 hIL-10 발현 카세트 및 thyA의 상류 및 하류 모두에서 동일한 서열에서의 상동성 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체 내에 통합한다. 재조합 지점은 ＼에 의해 모식적으로 나타낸다. 이에 따라, 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 상기 기재된 균주들에서 동일하게 된다. 유전 요소는 일정한 비례로 확대되어 도시된 것이 아니다. 여기에서, "프로모터"는 균주 "sAGXOOxx"에 존재하는 프로모터들 중 임의의 하나이다(표 11). 유전 요소는 일정한 비례로 확대되어 도시된 것이 아니다
도 17 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 균주 sAGXOOO5)로부터의 hIL-10 발현과 일련의 균주들 중의 임의의 하나로부터의 hIL-10 발현의 비교(도 16 및 표 11 참조)(여기에서, 이들 락토코커스의 프로모터는 usp45-hIL-10 융합 유전자의 상류에 위치함).
발명의 상세한 설명
본원에 사용되는 단수 형태(영문 a", "an", "the"에 상응)는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 단일 지칭대상 및 복수 지칭대상 모두를 포함한다. 예로서, "세포"는 1개 또는 1개 초과의 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)" 및 "~로 이루어진"은 "포함하는(including)", "포함한다(includes)", 또는 "함유하는(containing)", "함유한다(contains)"와 동의어이고, 한계치를 포함하거나 한도가 개방되어 있으며, 언급되지 않은 부가적인 구성원, 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다.
종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포섭되는 모든 수 및 분수뿐만 아니라 언급된 종점도 포함한다.
파라미터, 양, 일시적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 본원에 사용되는 용어 "약"은 ±20% 이하, 바람직하게는 ±10% 이하, 더욱 바람직하게는 ±5% 이하, 더욱 더 바람직하게는 ±1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 ±0.1% 이하의 변동을 포함하는 의미이고, 단 그러한 변동은 개시된 본 발명에서 수행하기에 적절한 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 그 전체 내용이 본원에 참조 인용된다. 특히, 구체적으로 지칭된 본원의 모든 문헌들의 교시내용이 참조 인용된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적 용어 및 과학적 용어를 포함한, 본 발명을 개시하는 데 사용된 모든 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 추가의 지침에 의해, 본 발명의 교시내용을 보다 잘 인식하기 위해, 추후 이어지는 정의도 포함되도록 한다.
본원에 사용되는 용어 "핵산"은 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드로 본질적으로 구성된 임의의 길이의 중합체를 의미한다. 핵산은 푸린 및/또는 피리미딘 염기 및/또는 기타 천연 뉴클레오티드 염기(예를 들어, 잔틴, 이노신, 하이포잔틴), 화학적 또는 생화학적 변형(예를 들어, 메틸화), 비천연, 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 핵산의 골격은, 전형적으로 RNA 또는 DNA에서 볼 수 있는 바와 같은, 당 및 인산염 기, 및/또는 하나 이상의 변형되거나 치환된 당 및/또는 하나 이상의 변형되거나 치환된 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 추가로 바람직하게 DNA, RNA 및 DNA/RNA 혼성체 분자를 포함하고, 이에는 구체적으로 hnRNA, 프리-mRNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 증폭 생성물, 올리고뉴클레오티드 및 합성(예를 들어 화학적 합성) DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체가 포함된다. "핵산"은 이중 가닥, 부분 이중 가닥, 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 부가적으로, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 프로모터를 포함하는 핵산은 DNA 또는 RNA, 더욱 바람직하게는 DNA이다.
용어 "재조합 핵산"은 일반적으로 재조합 DNA 기술을 이용하여 함께 결합된 분절들로 이루어진 핵산을 지칭한다. 재조합 핵이 숙주 유기체 내에서 복제할 때, 그 자손 핵산도 또한 용어 "재조합 핵산" 내에 포함된다.
재조합 DNA 기술의 일반 원리가 나와 있는 표준 참조문헌에는 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989]; 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992](정기 갱신물 포함)("문헌 [Ausubel et al. 1992]"); 및 문헌 [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990]이 포함된다. 미생물학의 일반 원리는 예를 들어 문헌 [Davis, B. D. et al., Microbiology, 3rd edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980)]에 나와 있다.
"프로모터"란 일반적으로 RNA 중합효소가 결합하여 전사를 개시하게 되는 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자 상의 영역을 의미한다. 프로모터는 바람직하게 그것이 전사를 조절하게 되는 서열의 상류에, 즉 5'에 위치하나, 반드시 그러한 것은 아니다. 본 발명에서, 특정 프로모터는 용어 "P"로 표시되고, 이 뒤에 그것의 유래 출처가 되는 유전자 명을 붙인다. 예를 들어, "PthyA"는 thyA 유전자의 프로모터를 나타내고, "PhllA"는 hllA 유전자의 프로모터를 나타낸다.
용어 "네이티브 프로모터"는 자연적으로 존재하는 프로모터, 예를 들어 자연적으로 세포 또는 유기체 내에 존재하는 프로모터의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터이다. 따라서, 수식어 "네이티브 프로모터"는 프로모터의 서열에 관한 것이나, 프로모터가 어떠한 특정 방식으로 수득되거나 생산되어질 필요가 있는 것으로 간주되지는 않는다. 따라서, 예로서 또한 비제한적으로, 그 용어는 자연 숙주로부터 분리되어, 재조합 DNA 기술을 이용하여 클로닝 및 증식되며, 증폭 방법에 의해 생산되거나 합성 수단 등에 의해 생성되는, 상기 자연 숙주 내의 프로모터를 포함하나, 단 그러한 프로모터의 서열은 자연적으로 발생되는 것으로 그것의 상대부의 서열과 동일하다(예를 들어 표 1 참조).
당업자는 소정의 유전자의 프로모터의 네이티브 서열이 락토코커스의 상이한 종들 및/또는 락토코커스의 단일 종 내의 상이한 아종들 및/또는 락토코커스의 단일 종 또는 아종 내의 상이한 균주들 간에, 상기 종, 아종 및/또는 균주 간의 자연 유전 발산성로 인해, 상이할 수 있음을 이해한다. 따라서, 그와 같은 발산성이나 자연적으로 발견되는 프로모터 서열은 네이티브로 간주될 것이다.
당업자는 일반적으로 자연 세균 프로모터, 예컨대 락토코커스의 프로모터를 예측하고 동정할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 부가 지침을 제공하자면, 자연 프로모터는 종종 세균, 바람직하게는 락토코커스 종으로부터의 게놈 서열 또는 그것의 부분을 분석하고; 그 안의 오픈 리딩 프레임, 즉 번역 개시 코돈(바람직하게는, ATG)으로 시작하여 번역 종결 코돈(예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA)으로 끝나나 어떠한 내부 인-프레임 번역 종결 코돈도 함유하지 않는 연속 뉴클레오티드 트리플릿을 동정하며; 상기 번역 개시 코돈의 상류에 있는 서열을 분석하여, 최상류 번역 개시 코돈을 위치시키고, 이에 대한 상류에 인-프레임 번역 종결 코돈이 있도록 함으로써 동정될 수 있다. 바람직하게, 이와 같이 동정된 오픈 리딩 프레임의 전사는 예를 들어 노던 블롯팅(Northern blotting) 또는 RT-PCR에 의해서와 같이 실험적으로 입증될 수 있고; 전사 개시 부위(예를 들어, 최상류 및/또는 가능한 경우에는 보다 하류인 번역 개시 코돈 중 하나 이상과 인접함)는 예를 들어 cDNA 말단 5'-고속 증폭 방법(5'-RACE)을 이용하여 평가될 수 있다.
전형적으로, 최상류 번역 개시 코돈(및/또는, 실험적 증거가 본 경우와 같이 나타낼 경우에는, 보다 하류인 번역 개시 코돈 중 하나 이상)에 대해 5'에 인접하고 측근에 있는 서열은 상기 ORF을 전사하는 데 기여할 수 있는 네이티브 프로모터를 포함할 수 있다. 한 바람직한 예로서, 번역 개시 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드를 +1로 나타내고(예를 들어, ATG 코돈의 A 뉴클레오티드가 +1임), 그것의 5'에 바로 있는 뉴클레오티드를 -1로 나타내면, 용어 "네이티브 프로모터"는 약 -500 내지 약 +50, 예를 들어 약 -500 내지 약 +20, 약 -500 내지 약 +10, 약 -500 내지 약 +5, 약 -500 내지 약 +2, 또는 약 -500 내지 약 -1; 바람직하게는 약 -400 내지 약 +50, 예를 들어 바람직한 예들에서, 약 -400 내지 약 +20, 예를 들어 약 -400 내지 약 +10, 약 -400 내지 약 +5, 약 -400 내지 약 +2 또는 약 -400 내지 약 -1; 더욱 바람직하게는 약 -300 내지 약 +50, 예를 들어 바람직한 예들에서, 약 -300 내지 약 +20, 예를 들어 약 -300 내지 약 +10, 약 -300 내지 약 +5, 약 -300 내지 약 +2 또는 약 -300 내지 약 -1; 예컨대 예를 들어 바람직한 예들에서, 약 -200 내지 약 +50의 서열, 또한 추가의 바람직한 예에서, 약 -200 내지 약 +20, 예를 들어 약 -200 내지 약 +10, 약 -200 내지 약 +5, 약 -200 내지 약 +2 또는 약 -200 내지 약 -1; 또는 예컨대 예를 들어 다른 바람직한 예에서 약 -100 내지 약 +50, 또한 추가의 바람직한 예에서, 약 -100 내지 약 +20, 예를 들어 약 -100 내지 약 +10, 약 -100 내지 약 +5, 약 -100 내지 약 +2 또는 약 -100 내지 약 -1의 서열을 지칭할 수 있으나; 단 상기 서열은 프로모터 활성을 나타낸다.
본 발명의 재조합 핵산에서의 네이티브 락토코커스 프로모터의 기능성 변이체의 용도도 또한 고려된다. 용어 "변이체"는 상응 네이티브 서열, 예를 들어 상응 네이티브 락토코커스 프로모터의 서열과 실질적으로 동일한(즉, 대체로 동일하나, 전적으로 동일한 것은 아닌) 서열을 지칭한다. "실질적으로 동일한"은 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상 동일, 더욱 바람직하게는 80% 이상 동일, 예를 들어 85% 이상 동일, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상 동일, 예를 들어 91% 이상 동일, 92% 이상 동일, 더욱 더 바람직하게는 93% 이상 동일, 예를 들어 94% 이상 동일, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 동일, 예를 들어 96% 이상 동일, 더욱 더 바람직하게는 97% 이상 동일, 예를 들어 98% 이상 동일, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일함을 지칭한다. 서열 정렬 및 서열 동일성의 결정은 예를 들어 원래 문헌 [Altschul et al. (1990)]에 의해 기재되었던 [Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)]에 의해, 예컨대 문헌 [Tatusova 및 Madden (1999)]에 의해 기재된 "Blast 2 Sequences" 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 내 네이티브 락토코커스 프로모터의 기능성 단편의 용도도 또한 고려된다. 본원에 사용되는 용어 "단편"은 네이티브 서열, 예를 들어 네이티브 락토코커스 프로모터 또는 그것의 변이체에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 결실을 가지는 서열이나, 다만 단편의 나머지 핵산 서열이 네이티브 락토코커스 프로모터 또는 그것의 변이체의 서열 내 상응 위치와 동일한 서열을 지칭한다. 단편의 나머지 서열은 바람직하게는, 예를 들어 표 1의 특정 서열 번호에 의해 제공되는 바대로, 예컨대 본 발명의 방법에 의해 동정되는, 각각의 네이티브 락토코커스 프로모터 또는 그것의 변이체의 핵산 서열의 30% 이상, 예를 들어 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 예를 들어 80% 이상 또는 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 95% 이상, 또는 그 이상을 나타낼 수 있다.
상기 프로모터의 변이체 및 단편과 관련한 용어 "기능성"은, 특정 변이체 및 단편은 상응 네이티브 프로모터의 프로모터 활성, 즉 RNA 중합효소에 결합하여 전사를 개시하는 능력을 적어도 부분적으로 보유하게 된다는 사실을 가리킨다. 바람직하게, 그러한 기능성 변이체 또는 기능성 단편은 상응 네이티브 프로모터의 활성의 50% 이상, 예를 들어 상응 네이티브 프로모터의 활성의 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 예를 들어 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 85% 이상, 예를 들어 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상 또는 89% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어 96% 이상, 97% 이상, 매우 바람직하게는 98% 이상 또는 99% 이상을 보유할 수 있다. 또한, 바람직하게, 그러한 기능성 변이체 또는 기능성 단편은 심지어 상응 네이티브 프로모터보다 더 큰 활성을 가질 수 있다.
당업자는 또한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산이 심지어 본 발명의 하나 초과의 프로모터(P) 및/또는 기능성 변이체 및/또는 기능성 단편을 포함할 수 있음을 인식할 수 있다. 예를 들어, 동일하거나 상이할 수 있는 상기 프로모터, 기능성 변이체 또는 기능성 단편은 상기 재조합 핵산 내 구분된 전사 단위에 작동가능하게 연결되어 그 전사 단위의 발현을 조절할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 단일 전사 단위의 발현은 그것에 작동가능하게 연결된, 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 프로모터(들), 기능성 변이체(들) 및/또는 기능성 단편(들)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 활성을 갖는 상기 요소들 중 하나 초과와 단일 전사 단위의 작동가능한 결합은 상기 단위의 전사 수준을 추가로 증가시킬 수 있다. 예로서 또한 비제한적으로, 상기와 같은 프로모터, 기능성 변이체 및/또는 기능성 단편은 순차적으로, 예를 들어 각각의 전사 단위의 상류에 순차적으로 배열될 수 있다.
또한 대안적으로는, 본 발명은 또한 새 프로모터를 구성함과 함께 본 발명의 상이한 프로모터, 기능성 변이체 및/또는 기능성 단편으로부터 유래된 2개 이상의 부분을 포함하는 키메라 프로모터를 포함하는 재조합 핵산을 구상한다.
당업자는 프로모터의 활성 평가 기법을 인지하고 있다. 예를 들어, 프로모터로서의 활성을 결정하고자 하는 핵산 서열을, 리포터 서열, 바람직하게는 리포터 코딩 서열, 예컨대, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 등과 같은 리포터 서열, 바람직하게는 리포터 코딩 서열과 작동가능하게 연결되도록 재조합 리포터 작제물에 삽입할 수 있고, 상기 리포터 작제물을 관심 숙주 세포 또는 유기체에 도입할 때, 리포터 mRNA의 발현 및/또는 축적(예를 들어, 노던 블롯팅, 정량적 RT-PCR 등 이용) 및/또는 단백질의 발현 및/또는 축적(예를 들어, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 형광도 또는 효소 활성의 측정 등 이용)을 검정한다.
한 예시적 바람직한 실시양태에서, 발현은, 발현을 측정하는 유기체에 대해 이종성이고, 예를 들어 세균에 대해 이종성이며, 바람직하게는 락토코커스에 대해 이종성이고, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스에 대해 이종성인 단백질에 대해 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 바람직한 실시양태에서, 세균, 바람직하게는 락토코커스, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스 내 발현은 진핵생물 기원의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 더욱 더 바람직하게는 (본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같은) 본 발명의 핵산을 이용한 발현을 위해 의도된 치료 관련 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 중 임의의 것, 바람직하게는 GLP-2, GLP-1, PYY 및 TFF, 더욱 더 바람직하게는 면역-조절성 폴리펩티드, 사이토킨, 성장 인자 또는 인터루킨, 예컨대 매우 바람직하게는 hIL-10에 대해 평가될 수 있다. 검정된 핵산 서열에 대해 그와 같이 측정된 값은, 잠재적 프로모터의 활성 또는 강도가 그러한 서열 내에 포함됨을 나타낸다. 당업자는 또한 그러한 프로모터 활성 검정의 상대적 성질을 확실히 하기 위해, 검정된 핵산 서열 외의 조건을 상이한 검정들 간에 대략 동일하거나, 이상적으로는 동일하도록 유지하여야 함을 이해한다. 그러한 조건은 예로서 세포에 도입된 리포터 작제물의 양, 상기 도입에 사용되는 형질전환법, 검정된 수혜 세포의 게놈 내 상기와 같은 리포터 작제물 통합의 수 및 부위 및/또는 측정 시의 수혜 숙주 세포의 상태(예를 들어, 성장상, 예를 들어 바람직하게는 지수적 성장상) 등을 포함할 수 있다. 발현된 유전자로서 hIL-10을 이용하여 락토코커스 락티스 수혜 세포 내 프로모터의 강도를 측정하는 한 예시적 방법이 실시예 2에 나와 있다. 발현된 유전자로서 GLP2를 이용하여 락토코커스 락티스 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 수혜 세포 내 프로모터의 강도를 측정하는 추가의 한 예시적 방법이 실시예 3 및 4에 나와 있다. 발현된 유전자로서 현재 GLP1, hPYY, hIL-10 및 TFF를 이용하여 락토코커스 락티스 수혜 세포 내 프로모터의 강도를 측정하는 더욱 더 예시적인 방법이 실시예 5 내지 9에 나와 있다. 수혜 세포로서 락토바실러스 카세이를 이용한 실험은 유사한 성과를 초래한다(나타내지 않음).
따라서, 또 다른 프로모터(2)보다 "더 강한" 것으로 일컬어지는 프로모터(1)는 적당한 검정, 예를 들어 전술된 단락들에서 기재된 검정, 예를 들어 실시예 2 내지 9에 예시된 검정에 의해 평가 시에 유의적으로 더 큰 활성을 나타낼 것이다. 상당히 더 큰 활성이란, 프로모터(1)에 대한 보다 큰 활성의 통계적으로 유의한, 예를 들어 바람직하게 p <0.5 또는 p <0.05에서의 발견 결과를 가리킨다.
프로모터(1)의 활성은 프로모터(2)의 활성보다 임의의 정도만큼 더 클 수 있고, 바람직하게 프로모터(1)의 활성은 프로모터(2)의 활성보다 프로모터(2)의 활성 값의 1% 이상, 예를 들어 2% 이상, 3% 이상 또는 4% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 이상, 예를 들어 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상 또는 9% 이상, 더욱 더 바람직하게는 10% 이상, 예를 들어 15% 이상, 더욱 더 바람직하게는 20% 이상, 예를 들어 30% 이상 또는 40% 이상, 더욱 더 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 높을 수 있고, 추가의 매우 바람직한 예에서, 프로모터(2)의 활성 값의 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 400% 이상, 또는 500% 이상 높을 수 있거나; 추가의 매우 바람직한 예에서, 프로모터(1)의 활성은 프로모터(2)의 활성보다 10× 이상, 예컨대 약 50× 이상, 약 100× 이상, 500× 이상 또는 약 1000× 이상 더 높을 수 있다.
따라서, 프로모터, 특히 본 발명에 의해 개시된 프로모터의 기능성 변이체 또는 단편을 파악하기 위해, 당업자는 그러한 변이체를 제조하거나(예를 들어, 표적화 또는 무작위 돌연변이유발 이용), 단편를 제고하고(예를 들어, 5' 및/또는 3' 절단(truncation), 예를 들어 제한 분해 또는 PCR 이용), 그러한 변이체 또는 단편을 상기와 같은 이들의 프로모터 활성에 대해 검정하는 것을 알 것이다. 그럼에도 불구하고, 추가의 지침에 의해 또한 비제한적으로, 세균 프로모터는 종종 위치 -10 및 -35에 인접한 일치 서열을 포함함을 주목한다. 따라서, 세균, 예를 들어 락토코커스 프로모터의 기능성 단편은 바람직하게 약 -10 내지 약 -35, 더욱 바람직하게는 약 -8 내지 약 -40, 더욱 더 바람직하게는 약 -5 내지 약 -40 또는 약 -5 내지 약 -45, 더욱 더 바람직하게는 약 -2 또는 -1 내지 약 -50의 네이티브 프로모터 내 위치에 상응 서열을 적어도 포함할 수 있다. 또한, 세균, 예를 들어 락토코커스 프로모터의 기능성 변이체는 바람직하게 네이티브 상대부 프로모터 내에 존재하거나 당업계에 공지된 바대로 위치 -10 및 -35에 인접한 일치 서열을 포함할 수 있다.
"작동가능한 연결"은 발현하고자 모색되는 조절 DNA 서열 및 DNA 서열이 발현을 허용하도록 하는 방식으로 이어져 있는 연결이다.
예를 들어, 예컨대 바람직하게 프로모터 및 이종성 오픈 리딩 프레임과 같은 DNA 서열은, 서열들 간의 연결의 성질이 (1) 틀-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 오픈 리딩 프레임의 전사를 지정하는 프로모터의 능력을 간섭하지 않거나, (3) 프로모터 영역 서열에 의해 전사되는 오픈 리딩 프레임의 능력을 간섭하지 않는 경우, 작동가능하게 연결된 것으로 일컬어진다.
한 예시적 바람직한 실시양태에서, 상기 프로모터는 작동가능하게 연결되어 있는 오픈 리딩 프레임(들)의 상류, 즉 5'에 위치할 수 있다.
발현을 위해 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 유기체별로 다양할 수 있으나, 일반적으로는 진핵생물의 경우, (RNA 전사의 개시를 지정하는) 프로모터뿐만 아니라, RNA로 전사될 때 단백질 합성을 개시를 신호하게 되는 DNA 서열을 함유하는 프로모터 영역을 포함하게 된다. 그러한 영역은 정상적으로 전사 및 번역의 개시와 관련된 5'-비코딩 서열, 예컨대 프리브노우-박스(Pribnow-box)(cf. TATA-박스(TATA-box)), 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 등을 포함할 것이다.
유리하게, 본 발명의 소정의 프로모터가 통상 본래 결합되게 되는 각각의 번역 개시 코돈은, 예컨대 그러한 코돈으로부터의 번역 개시를 방지하기 위해 본 발명의 재조합 핵산에 포함되지 않을 수 있다. 예를 들어, 프로모터의 3' 말단은 -1 위치 또는 이의 상류에서 절단될 수 있고; 대안적으로는 번역 개시 코돈이 (예를 들어, ATG에서 상이한 코돈으로) 돌연변이화될 수 있다. 또한 대안적으로, 상기 네이티브 번역 개시 코돈이 존재할 수 있고, 가능하게는 또한, 본래 소정의 프로모터와 결합된 오픈 리딩 프레임의 수개(예를 들어, 바람직하게는 ≤20개, 더욱 바람직하게는 ≤10개, 더욱 더 바람직하게는 ≤5개, 예를 들어 최대 1, 2, 3 또는 4개) 후속 코돈 및 관심 이종성 오픈 리딩 프레임이 거기에 인-프레임으로 융합되어, 융합 생성물을 생산할 수 있다.
용어 "오픈 리딩 프레임" 또는 ORF는 번역 개시 코돈(바람직하게는 ATG)로 시작하여 번역 종결 코돈(예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA)으로 끝나고 어떠한 내부 인-프레임 번역 종결 코돈도 함유하지 않으며, 잠재적으로 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 연속되는 코딩 뉴클레오티드 트리플릿을 지칭한다. 그러므로, 그 용어는 당업계에 사용되는 "코딩 서열"과 동의어일 수 있다. 본 발명의 재조합 핵산에서, 하나 이상의 ORF의 번역 개시 코돈은 전형적으로 번역의 개시를 제어하는 조절 서열, 예를 들어 샤인-달가르노 서열과 결합될 수 있다. 또한, 락토코커스를 포함한 세균에서, 통상의 상류 프로모터에 의해 제어되는 2개 이상의 순차 ORF를 함유하는 다중-시스트론 단위가 그러한 번역 개시를 제어하는 상기 서열과 하류 번역 개시 코돈을 결합시킴으로써 발생될 수 있음이 알려져 있다.
소정의 ORF와 프로모터 간의 관계를 가리킬 때의 용어 "이종성"은, 상기 프로모터가 정상적으로 본래 상기 ORF와 결합되지 않는, 즉 정상적으로 상기 ORF의 전사를 제어하지 않음을 의미한다. 즉, 결합은 본 발명의 재조합 핵산에서 재조합 DNA 기법에 의해 생성된다.
용어 "락토코커스"란, 일반적으로 속 락토코커스를 지칭하고, 당업계에서 이에 속하는 것으로 분류되는 임의의 분류군(예를 들어, 종, 아종, 균주)을 포함한다. 예로서, 락토코커스에는 락토코커스 가르비에아에(Lactococcus garvieae), 락토코커스 락티스, 락토코커스 피스쿰(Lactococcus piscium), 락토코커스 플란타룸(Lactococcus plantarum) 및 락토코커스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 및 이들의 임의의 아종 및 균주가 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 락토코커스는 락토코커스 락티스이다. 락토코커스 락티스에는 비제한적으로, 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스(cremoris), 락토코커스 락티스 ssp. 호르드니아에(hordniae), 락토코커스 락티스 ssp. 락티스, 락토코커스 락티스 ssp. bv. 디아세티락티스(diacetylactis)가 포함된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 락토코커스 락티스는 락토코커스 락티스 ssp. 크로모리스 또는 락토코커스 락티스 ssp. 락티스, 더욱 바람직하게는 락토코커스 락티스 ssp. 락티스이고, 예를 들어 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스 SK11 또는 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 MG1363과 같은 상기의 임의의 균주를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 프로모터(P)는 상기 정의된 바와 같은 락토코커스, 더욱 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은, 특히 선행 두 단락에 정의된 바와 같은 바람직한 락토코커스 분류군으로부터 유래된다.
프로모터(P)가 락토코커스에서 락토코커스 락티스 thyA 프로모터보다 강하다고 일컬어지는 경우, 이는 그것이 하나 이상, 잠재적으로는 하나 초과 또는 모든 락토코커스 분류군(예를 들어, 종, 아종 또는 균주)에서 더 강함을 의미한다. 바람직하게, 프로모터(P)는 적어도 락토코커스 락티스보다 그와 같이 더 강할 수 있다. 또한, 바람직하게 프로모터(P)는 적어도 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스 및 락토코커스 락티스 ssp. 락티스, 더욱 바람직하게는 적어도 락토코커스 락티스 ssp. 락티스에서 그와 같이 더 강할 수 있다.
용어 "티미딜레이트 합성효소"는 효소 EC 2.1.1.45를 지칭하고, "락토코커스 락티스의 티미딜레이트 합성효소(thyA) 유전자"는 락토코커스 락티스에서 상기 효소를 코딩하는 유전자를 나타낸다. 예를 들어 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 MG1363(문헌 [Ross et al., 1990]; 문헌 [Steidler et al., 2003]; 유전자은행 등록번호: AF462070), 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 IL1403(문헌 [Bolotin et al., 2001]; 유전자은행 유전자 ID: 1115198) 및 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스 SK11(유전자은행 등록번호: NC_008527, 유전자좌 LACR_1631, 게놈 유전자 ID: 4434110)과 같은 수가지 락토코커스 락티스 분류군으로부터의 thyA 유전자의 서열이 기재되었다. 당업자는 락토코커스 락티스의 추가의 분류군으로부터의 thyA 유전자 동족체를 동정하고 분리할 수 있다.
이에 따라, thyA 유전자의 프로모터는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 thyA 유전자의 네이티브 프로모터를 지칭한다. 예로서, 소정의 thyA 프로모터는 상응 thyA 유전자의 약 -500 내지 약 +50(+1는 소정의 thyA 유전자의 번역 개시 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드를 나타냄)의 핵산 서열을 지칭할 수 있고; 추가의 바람직한 예로서, 약 -500 내지 약 +20, 약 -500 내지 약 +10, 약 -500 내지 약 +5, 약 -500 내지 약 +2, 또는 약 -500 내지 약 -1; 약 -400 내지 약 +50, 약 -400 내지 약 +20, 약 -400 내지 약 +10, 약 -400 내지 약 +5, 약 -400 내지 약 +2 또는 약 -400 내지 약 -1; 약 -300 내지 약 +50, 약 -300 내지 약 +20, 약 -300 내지 약 +10, 약 -300 내지 약 +5, 약 -300 내지 약 +2 또는 약 -300 내지 약 -1; 약 -200 내지 약 +50, 약 -200 내지 약 +20, 약 -200 내지 약 +10, 약 -200 내지 약 +5, 약 -200 내지 약 +2 또는 약 -200 내지 약 -1; 또는 약 -100 내지 약 +50, 약 -100 내지 약 +20, 약 -100 내지 약 +10, 약 -100 내지 약 +5, 약 -100 내지 약 +2 또는 약 -100 내지 약 -1의 핵산 서열을 지칭할 수 있는데; 단 상기 서열은 본래 thyA 프로모터와 대략 동일한 강도, 바람직하게는 동일한 강도를 표시한다.
바람직하게, 본 발명에서 기준으로 사용하기 위한 thyA 프로모터는 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 MG1363로부터의 thyA 유전자의 프로모터이고, 본 발명의 프로모터는 상기 정의된 바와 같은 것들보다 강하다.
실시예 2에 기재되고 문헌 [Steidler et al. 2003(ibid.)]에 기초한 한 예시적 검정에서, L. 락티스 ssp. 락티스 MG1363의 thyA 프로모터는 6.5 ng/1×109 세균의 MG1363 균주 내 thyA 유전자위에 대한 단일 복사체로 통합될 때, 인간 IL-10의 발현을 지정한다. 따라서, thyA 프로모터보다 강한 본 발명의 프로모터는 상기 검정에서 6.5 ng/1×109 세균 초과, 바람직하게는 ≥7 ng/1×109 세균, 예를 들어 ≥8 ng/1×109 또는 ≥9 ng/1×109 세균, 더욱 더 바람직하게는 ≥10 ng/1×109 세균, 예를 들어 ≥11 ng/1×109 세균, ≥12 ng/1×109 세균, ≥13 ng/1×109 세균 또는 ≥14 ng/1×109 세균, 더욱 더 바람직하게는 ≥15 ng/1×109 세균, 더욱 더 바람직하게는 ≥20 ng/1×109 세균, 예를 들어 ≥25 ng/1×109 세균, ≥30 ng/1×109 세균, ≥35 ng/1×109 세균 또는 ≥40 ng/1×109 세균, 가장 바람직하게는 ≥50 ng/1×109 세균 또는 그 이상, 예를 들어 ≥100 ng/1×109 세균; 및 추가의 매우 바람직한 예에서 ≥200 ng/1×109 세균, 예컨대 ≥500 ng/1×109 세균, 또는 ≥1000 ng/1×109 세균, 또는 ≥2000 ng/1×109 세균, 또는 ≥5000 ng/1×109 세균의 hIL-10의 발현을 달성할 수 있다.
예를 들어 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같은 추가의 예시적 검정에서, MG1363 균주 또는 L. 카세이는 pT1NX 벡터를 포함하는데, 여기에서 L. 락티스 ssp. 락티스 MG1363의 thyA 프로모터는 인간 GLP-2 유전자의 발현을 지정한다. 따라서, 당량의 1 ml의 배양액이 로그상의 말기에 회수되고, SDS-PAGE 상에 로딩되어, 웨스턴 블롯에 의해 분석될 때, 본 발명의 프로모터, 예를 들어 PhllA 프로모터는 thyA 프로모터보다 강하고, 본 발명의 프로모터를 통해 발현되는 GLP-2의 양은 thyA 프로모터를 통한 것보다 더 크다. 추가의 예시적 검정이 실시예 5 내지 9에 기재되어 있다.
따라서, 한 관련 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 GLP-2 유전자, hIL-10 유전자, GLP-1 유전자, hPYY 유전자 또는 TTF 유전자와 같이, 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)는 개요 단락에서 1) 내지 53) 하에 열거된 락토코커스의 유전자의 네이티브 프로모터, 바람직하게는 프로모터(P)가 1) 내지 53) 하에 표 1에서 정의된 바와 같은 1) DNA-지정 RNA 중합효소, 베타' 서브유닛/160 kD 서브유닛(rpoC), 3) 비-헴 철-결합 페리틴(dpsA), 4) 피루베이트 키나제(pyk), 5) 글루타미닐-tRNA 합성효소(gltX), 6) 포스포피루베이트 수화효소(eno), 9) 디펩티다제 PepV(pepV), 12) 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(gapB), 13) 아세테이트 키나제(ackA), 18) 프룩토스 비스포스페이트 알돌라제(fbaA), 20) 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA), 21) 리보솜 단백질 S12(rpsL) 및 리보솜 단백질 S7(rpsG), 22) 리보솜 단백질 L18(rplR) 및 리보솜 단백질 S5(rpsE) 및 리보솜 단백질 L30/L7E(rpmD), 24) 리보솜 단백질 L19(rplS), 26) 리보솜 단백질 L10(rplJ), 28) HU-유사 DNA-결합 단백질(hllA), 29) 5OS 리보솜 단백질 L28(rpmB), 및 30) 인산전달효소계 IIB 성분(ptcB)의 유전자의 네이티브 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 경우에, 열거되는 락토코커스의 유전자의 네이티브 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 표 1의 1), 3) 내지 6), 9), 12), 13), 18), 20) 내지 22), 24), 26), 및 28) 내지 30) 하에 열거된 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 28) 하에 열거된 PhllA 프로모터, 3) 하에 열거된 PdpsA 프로모터, 9) 하에 열거된 PpepV 프로모터, 또는 20) 하에 열거된 PsodA 프로모터, 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 제공한다. 프로모터(P)는 서열 번호 1, 3 내지 6, 9, 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 54, 160, 163 내지 165, 167, 169, 171 내지 180에 나타낸 핵산 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것도 또한 바람직하다.
상기 명칭들은 당업자에게 명백하고, 각종 락토코커스 분류군(예를 들어, 종, 아종 및 균주), 예컨대 상기 기재된 바람직한 락토코커스 분류군으로부터의 특정 유전자를 교시한다. 그럼에도 불구하고, 추가의 지침에 의해, 이하 표 1은 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스 SK11(SK11의 전장 게놈 서열의 유전자은행 등록번호: NC_008527) 및 ssp. 락티스 MG1363으로부터 분리된 상기 유전자를 동정하는 고유 유전자 ID 번호를 언급한다. 유전자 ID 번호는 문헌 [Maglott et al. 2005]에 기재된 바와 같은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene)의 "엔트레즈 유전자(Entrez Gene)" 데이터베이스에서의 상기 유전자를 고유하게 특정한다. 이에 기초하여, 당업자는 SK11 및/또는 MG1363 외의 락토코커스의 분류군, 예를 들어 본원에 교시된 바와 같은 바람직한 종, 아종 및 균주로부터의 상기 유전자의 동족체를 동정하고 분리할 수 있다. 본원에 개시된 "동족체"는 통상의 조상으로부터 비롯된 결과로서 유사한(예를 들어, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 실질적으로 동일할 수 있는) 2개 이상의 상이한 분류군으로부터의 서열, 특히 유전자를 지칭한다. SK11 및/또는 MG1363로부터의 상기 유전자의 동족체는 바람직하게는 다른 락토코커스 분류군에서 동일한 기능을 수행한다.
당업자는 본원의 교시내용을 따르고 당업계의 통상적 지식을 이용하여, SK11 및/또는 MG1363으로부터의 표 1에 열거된 유전자 또는 추가의 락토코커스 분류군으로부터의 그것의 동족체(다중-시스트론 전사 단위에서 발견되어, 이로써 이의 번역 개시 코돈의 직접적 상류에 있는 프로모터를 함유하지 않을 수 있는 유전자의 발현을 제어하는 프로모터 포함; 예컨대 SK11 및/또는 MG1363의 경우, 예시로서 양자 모두의 전사를 지정하는 rpsL의 상류에 프로모터가 있는 rpsL-rpsG, 양자 모두의 전사를 지정하는 rpsL의 상류에 프로모터가 있는 rpsL-rpsG; 또는 모두의 전사를 지정하는 rpsL의 상류에 프로모터가 있는 rplR-rpsE-rpmD; 또는 모두의 전사를 지정하는 rplD의 상류에 프로모터가 있는 rplD-rplW-rplB; 또는 모두의 전사를 지정하는 rpsS의 상류에 프로모터가 있는 rpsS-rplU-rplP-rplN; rpsM의 전사를 지정하는 번역 개시 인자 1(IF-1)를 코딩하는 상류 유전자 infA의 상류에 있는 프로모터가 있는 rpsM)의 발현을 제어하는 네이티브 프로모터를 동정하고 분리할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)는 개요 단락에서 1) 내지 30) 하에 열거된 락토코커스의 유전자(즉, 표 1 내의 첫 30개 유전자)의 네이티브 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 표 1의 1), 3) 내지 6), 9), 12), 13), 18), 20) 내지 22), 24), 26), 및 28)-30) 하에 열거된 프로모터, 더욱 더 바람직하게는 28) 하에 열거된 PhllA 프로모터, 3) 하에 열거된 DNA-결합 페리틴-유사 단백질(산화성 손상 보호제)(dps) 프로모터, 9) 하에 열거된 Xaa-His 디펩티다제(argE 또는 pepV) 프로모터, 또는 20) 하에 열거된 수퍼옥시드 디스뮤타제(sodA) 프로모터, 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 제공한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 프로모터(P)를 포함하는 재조합 핵산으로서, 프로모터(P)는 서열 번호 1 내지 54 및 157 내지 180에 나타낸 핵산 및 그것의 동족체, 더욱 더 바람직하게는 서열 번호 1, 3 내지 6, 9, 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 54, 160, 163 내지 165, 167, 169, 171 내지 180로 기재된 핵산 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편, 더욱 더 바람직하게는, 서열 번호 1, 3 내지 6, 9. 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 30, 160, 163 내지 165, 167, 169 및 171, 및 상기 네이티브 프로모터의 기능성 변이체 및 기능성 단편, 바람직하게는 서열 번호 28, 3, 9, 158 및/또는 20 및 그것의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 재조합 핵산을 제공한다.
상기 서열 번호 1 내지 54 및 157 내지 180의 서열은, 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 MG1363 및/또는 락토코커스 락티스 ssp. 크레모리스 SK11에서 상기 1) 내지 53) 하에 열거된(표 1에 보다 상세히 교시된 바와 같은) 유전자의 발현과 관련된 예시적이나 제한적이지 않은 네이티브 프로모터를 나타낸다. 따라서, 이 프로모터 및 그것의 동족체(특히 MG1363 및/또는 SK11 외의 락토코커스 분류군으로부의 것) 및 이들의 기능성 변이체 및 기능성 유도체는 숙주 세포, 바람직하게는 세균 숙주 세포, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스 ssp. 락티스, 예컨대 바람직한 예로서 균주 MG1363에서, 유용한 오픈 리딩 프레임의 발현을 행하기 위해 본 발명의 재조합 핵산에서 유용할 수 있다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 프로모터(P)는 서열 번호 1 내지 54, 및 157 내지 180, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1, 3 내지 6, 9, 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 54, 160, 163 내지 165, 167, 169, 171 내지 180, 더욱 더 바람직하게는, 서열 번호 1, 3 내지 6, 9, 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 30, 160, 163 내지 165, 167, 169 및 171, 가장 바람직하게는 서열 번호 28, 3, 9, 158 및/또는 20로 기재된 핵산 및 그것의 동족체, 이들의 기능성 변이체 및/또는 기능성 단편을 포함하거나 그들로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 프로모터(P)는 서열 번호 1 내지 30, 및 157 내지 171, 더욱 바람직하게는 서열 번호 28, 3, 9, 158 및/또는 20로 기재된 핵산 및 그것의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 포함하거나 이들로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 대해 3'에 위치한 전사 종결자 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 단지 하나의 오픈 리딩 프레임이 존재하는 경우, 종결자 서열은 유리하게 그것의 하류, 즉 3'에 위치할 수 있다. 재조합 핵산이 2개 이상의 ORF를 함유하는 경우, 예를 들어 연속적으로 정렬되어 함께 다중-시스트론 전사 단위를 형성하는 경우, 전사 종결자는 유리하게 최하류 ORF에 대해 3'에 위치할 수 있다.
용어 "전사 종결자"란 전사의 종결을 신호하는 전사 단위의 말단에 있는 서열 요소를 지칭한다. 바람직하게, 본 발명에 사용하기 위한 전사 종결자는 본 발명의 재조합 핵산과 함께 사용하기 위한 숙주 세포, 예컨대, 예를 들어 세균 숙주 세포, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스에서 전사의 종결을 신호하게 된다. 적당한 종결자, 예를 들어 락토코커스로부터의 종결자의 동정 및 분리 기법이 (예를 들어, 문헌 [van der Vossen et al., 1985]에서와 같이) 당업계에 공지되어 있고, 예시적 종결자도 마찬가지로 예를 들어 문헌 [van der Vossen et al., (1992)] 등을 참조한다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 프로모터(P)로부터의 전사를 제어하도록 구성된 오퍼페이터를 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "오퍼레이터"란 프로모터로부터의 서열의 전사의 개시 및/또는 유지를 제어하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 DNA 서열을 지칭한다.
전형적으로, 오퍼레이터는 일반적으로 프로모터와, 프로모터에 의해 전사가 제어되는 하류 서열 사이에 위치할 수 있다. 통상, 오퍼레이터는 리프레서 폴리펩티드를 결합시킬 수 있고, 이로써 그것은 상기 프로모터로부터의 전사를 감소시킨다. 유용한 리프레서는 그것이 오퍼레이터에 결합하는 상태와 오퍼레이터에 결합하지 않는 상태 사이에 교대할 수 있고, 그러한 교대는 외부 조건, 예를 들어 외부 물질 또는 특정 대사물에 의해 유리하게 제어될 수 있다. 따라서, 상용성 리프레서를 포함하는 숙주 세포에서, 본 발명의 핵산 내에 오퍼레이터가 포함되면, 프로모터 및 그것으로부터의 발현의 활성을 제어할 수 있을 것이다. 예시적 오퍼레이터 - 리프레서 시스템은 예를 들어 lac 시스템(이 또한 예를 들어 문헌 [Nauta et al. (1996)] 참조) 또는 히스티딘 생합성 시스템(예를 들어, 문헌 [Delorme et al., 1999] 참조)을 포함한다. 오퍼레이터 서열은 일반적으로 세균 염색체로부터 유래될 수 있다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 상기 재조합 핵산을 숙주 세포의 게놈, 예를 들어 염색체에 삽입하도록 구성된 서열을 추가로 포함한다.
특히 바람직한 예에서, 본 발명의 핵산의 숙주 세포의 게놈, 예를 들어 염색체 내의 특정 부위 내로의 삽입은 상동성 재조합에 의해 용이하게 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 핵산은 숙주 세포의 게놈, 예를 들어 염색체 내의 상기 통합 부위에 대한 상동성의 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 상기 게놈, 예를 들어 염색체의 부위의 서열은 자연적, 즉 자연 발생적일 수 있거나, 이전 유전 조작에 의해 도입된 외인성 서열일 수 있다.
예를 들어, 상동성의 상기 영역(들)은 50 bp 이상, 바람직하게는 100 bp 이상, 예를 들어 200 bp 이상, 더욱 바람직하게는 300 bp 이상, 예를 들어 400 bp 이상, 더욱 더 바람직하게는 500 bp 이상, 예를 들어 600 bp 이상 또는 700 bp 이상, 더욱 더 바람직하게는 800 bp 이상, 예를 들어 900 bp 이상, 또는 1000 bp 이상, 또는 그 이상일 수 있다.
한 바람직한 예에서, 상동성의 두 영역이 포함될 수 있고, 그 중 하나는 본 발명의 핵산 내에 존재하는 발현 단위(들)의 각 측의 측면에 있다. 그러한 구성은 유리하게 숙주 세포에, 관련 서열, 즉 본 발명의 프로모터로부터의 관심 오픈 리딩 프레임의 발현을 수행하는 서열을 삽입할 수 있다. 상동성 재조합을, 특히 세균 숙주에서 수행하고, 재조합을 선택하는 방법이 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 한 예시적 바람직한 방법은 예를 들어 외인성 서열을 락토코커스의 thyA 유전자위에 도입하기 위한 문헌 [Steidler et al. (2003)]의 방법이다.
이에 따라, 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 게놈, 예를 들어 염색체, 바람직하게는 세균 염색체, 더욱 바람직하게는 락토코커스 염색체에 통합될 때의 재조합 핵산을 제공한다. 그러한 통합은 본 명세서 내 다른 부분에 기재된 바와 같이, 상기 재조합 핵산 또는 그것을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 수득될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산에서 본 발명의 프로모터에 연결된 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 코딩한다.
인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 본질은 일차적으로 신규 프로모터 및 그것의 용도에 관한 것으로, 상기 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드의 성질은 어떠한 식으로도 제한되지 않는 것으로 한다.
그럼에도 불구하고, 락토코커스 프로모터-제어 오픈 리딩 프레임을 포함하는 숙주 세포는 인간 및 동물에서의 질병의 예방 또는 치료에 유용한 폴리펩티드를 포함한, 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 기원의 관련 폴리펩티드의 시험관내 생산 수단(예를 들어 US 특허 제5,559,007호; 문헌 [Steidler et al., 1995]; 문헌 [Wells et al., 1993B] 참조) 및 생체내 전달 수단(예를 들어 WO 97/14806; WO 01/02570; 문헌 [Steidler et al., 2003]; 문헌 [Steidler et al., 2000] 참조)으로서 보고되었다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산의 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 대상, 바람직하게는 인간 또는 동물 대상에게 치료적 반응을 유도할 수 있는 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
특히 유용하고 예시적이며 비제한적인 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산의 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "항원"은 일반적으로 체액성 면역 및/또는 세포성 면역 반응을 포함한 면역 반응을 일으키고 면역 반응의 생성물, 예를 들어 항체 또는 T 세포와 결합할 수 있는 물질을 지칭한다. 이에 따라, 한 바람직한 예에서, 항원은 그 항원을 투여하는 대상의 기능화 면역계가 상기 대상으로부터 생리학적 반응을 유도하도록 할 것을 필요로 한다. 본 발명의 "항원"은 또한 건강한 개체에서는 면역 반응을 유발하지 않으나 자가면역 질병, 즉 유기체가 자체의 구성 부분(하위 분자 수준까지 세분화됨)을 자체 인식하지 못하여 자신의 세포 및 조직에 대해 면역 반응을 초래하게 되는 질병을 앓는 사람에게서는 면역 반응을 유발하는 "자기 항원"도 포함한다. 그러한 이상 면역 반응으로부터 초래되는 임의의 질병을 자가면역 질병이라 칭한다. 따라서, 본 발명의 "항원"은 또한 건강한 개체에서는 면역 반응을 유발하지 않으나 상기 단백질이 유전적으로 결핍된 사람에게서는 면역 반응을 유발하는 (생리학적으로 활성인) 단백질도 포함한다. 또한, 본 발명의 "항원"은 또한 건강한 개체에서는 면역 반응을 유발하지 않으나 알레르기성 질병을 앓는 사람에게서는 면역 반응을 유발하는 알레르겐도 포함한다.
본 발명에 따른 항원은 인간 또는 동물 대상에서의 면역 반응이 치료적으로 유용하게 되는 임의의 폴리펩티드로부터, 예를 들어 병원체, 예를 들어 바이러스, 원핵생물(예를 들어, 세균) 또는 진핵생물 병원체, 비-생리학적 단백질(예를 들어, 암 조직으로부터 유래된 단백질), 알레르겐(예를 들어, 면역 관용(immune tolerance)을 유도하기 위한 것) 등으로부터 유래될 수 있다. 한 항원은 또한 단백질의 대사물일 수 있다. 한 예로서, 항원은 다당류, 지질 등일 수 있다. 본원에 기재된 강한 프로모터는 상기 다당류, 지질 등을 합성하거나 조합하는 데 필요한 효소의 발현을 유도할 수 있다.
용어 "비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드"란 일반적으로 그것을 투여하는 인간 또는 동물 대상에 있어 그 자체에 대해 면역 반응을 유도하지 않고 치료적 효과를 달성할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 이에 따라, 그러한 폴리펩티드의 치료적 효과는 그 자신의 자연 생물학적 기능에 직접 연관된 것으로 예상되며, 이로써 그것은 대상 내에서 면역원성 및/또는 면역보호성 항원으로서 작용함에 의해 치료적 효과를 산출하지 않으면서 대상의 신체 내에서 특정 효과를 달성할 수 있게 된다. 이에 따라, 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드는 그것의 발현 형태로 생물학적으로 활성이어야 하거나, 적어도 발현 숙주 세포로부터 일단 방출되면 생물학적으로 활성인 형태로 전환되어야 한다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드의 그러한 생물학적으로 활성인 형태는 그것의 네이티브 구성과 동일하거나 근접하게 유사한 이차, 바람직하게는 3차 형태를 나타낼 수 있다.
바람직하게, 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드는 또한 비독성이고 비병원성이다.
한 바람직한 실시양태에서, 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드는 인간 또는 동물에서 유래될 수 있고, 바람직하게는 그것을 투여하는 인간 또는 동물 대상과 동일한 분류군에 상응할 수 있다.
적당한 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드의 비제한적 예에는 국소적으로 또는 전신적으로 기능할 수 있는 폴리펩티드. 예를 들어 국소 신체 또는 전체 신체 대사에 영향을 주는 내분비 활성을 발휘할 수 있는 폴리펩티드이고/이거나, 생물학적 활성 폴리펩티드(들)는 면역용혈성 시스템에 속하는 세포의 활성을 제어할 수 있는 폴리펩티드(들)이고/이거나, 하나 이상의 생물학적으로 활성 폴리펩티드는 신체 내 각종 정상 세포 또는 신생물성 세포의 생육성, 성장 및 분화에 영향을 주거나, 면역 제어 또는 손상 및 감염에 대한 급성 상 염증성 반응의 유도에 영향을 줄 수 있는 폴리펩티드(들)이고/이거나, 하나 이상의 생물학적으로 활성 폴리펩티드는 그것의 표적 세포 수용체에 작용하는 케모카인에 의해 매개되는 세포 및 조직의 감염에 대한 내성 또는 상피 세포의 증식 또는 외상 치유의 촉진을 증진 또는 유도할 수 있는 폴리펩티드(들)이고/이거나, 하나 이상의 생물학적으로 활성 폴리펩티드는 신체 내 세포에 의한 물질의 발현 또는 생산을 조절한다.
그러한 폴리펩티드의 구체예에는 비제한적으로 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 소마토스타틴, 갑상선 자극 호르몬, 혈관확장작용성 장 폴리펩티드, 사이토킨, 예컨대 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 내지 IL-32 중 임의의 것, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, TNF 계통의 사이토킨, 예를 들어 TNFa, TNFb, CD40, CD27 또는 FAS 리간드, IL-1 계통의 사이토킨, 섬유아세포 성장 인자 계통, 혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 및 신경 성장 인자, 상피 성장 인자 계통의 사이토킨, 인슐린 관련 사이토킨 등이 포함된다. 대안적으로, 치료적 활성 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같은 치료적 활성 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 길항자일 수 있다. 대안적으로, 치료적 활성 폴리펩티드는 그것의 중화 항체 등일 수 있다. 또한, 그러한 적당한 폴리펩티드의 구체예가 예를 들어 본원에 참조 인용되는 WO 96/11277의 제14면 제1-30행; 본원에 참조 인용되는 WO 97/14806, 제12면 제1행 내지 제13면 제27행; 또는 본원에 참조 인용되는 US 특허 제5,559,007호 제8칼럼 제31행 내지 제9칼럼 제9행에 열거되어 있다. 바람직하게, 적당한 폴리펩티드는 IL-10 펩티드, 예를 들어 예컨대 실시예 2, 5 및 9에 예시된 바와 같은 인간 IL-10(hIL-10)이다.
한 바람직한 실시양태에서, 적당한 폴리펩티드는 트레포일 펩티드, 예컨대 TTF1, TTF2 및/또는 TTF3이다. 이 계통의 트레포일 펩티드의 3개 구성원이 인간에서 동정되었고, 원래는 pS2(유방암 에스트로겐 유도성 유전자, 문헌 [Lefebvre, 1993]), SP(진경성 펩티드) 및 ITF(장 트레포일 인자)와 같이 명명되었다. 본 명칭에서, pS2는 TFF1로, SP는 TFF2로, 또한 ITF는 TFF3로 각기 개명되었다(예를 들어, 문헌 [Wong et al., 1999] 참조). 이 신규 명칭은 본문 전반에 걸쳐 사용된다. 인간, 마우스 및 래트에서, TFF1 및 TFF2는 주로 위에서 발견되는 반면, TFF3은 주로 십이지장 및 결장에서 발견된다. TFF1는 세포 표면 수용체를 통해 작용하는 것으로 사료된다(문헌 [Tan et al., 1997]). 문헌 [Wong et al. (1999)]은 트레포일 펩티드의 최근 개요를 제공한다. 본 논문의 내용은 본 개시내용에 참조 인용된다. 트레포일 펩티드는 상피 점액 세포에 의해 분비되고, 산 환경에서 안정하다. 이 펩티드는 점막의 보호(상피 상에서의 겔 형성)에 기여하고, 아마도 상피 이동의 자극에 의해 손상된 점막의 수복과 관련된다(문헌 [Playford et al., 1996]). 트레포일 펩티드의 생산은 위궤양 및 대장염과 같은 손상이 발생하는 영역에서 국소적으로 증가한다(문헌 [Wright et al., 1990]). 문헌 [Babyatsky et al. (1996)]은 재조합 트레포일 펩티드의 투여가 상기 장소에서 손상을 감소시킴을 보여주었다. 점막의 보호에 중요한 대부분의 다른 단백질(예컨대, 상피 성장 인자)과 상반되게도, 대부분의 연구는 트레포일 펩티드가 증식을 거의 유발하지 않거나 전혀 유발하지 않음을 입증하였다(문헌 [Playford et al., 1996]).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 적당한 폴리펩티드는 PYY 펩티드, 예를 들어 인간 PYY(hPYY), 더욱 더 바람직하게는 실시예 7에 예시된 바와 같은 hPYY Gly9 변이체(3-36)이다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 적당한 폴리펩티드는 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1 또는 GLP1), 예를 들어 인간 GLP-1(hGLP-1), 더욱 더 바람직하게는 실시예 8에 예시된 바와 같은 hGLP-1 글리신 8 변이체(7-36)이다. 한 바람직한 실시양태에서, 적당한 폴리펩티드는 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2 또는 GLP2)이다. 인간 프로글루카곤 유전자(유전자은행 승인번호 nr. NM_002054)는 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)를 포함하는 4개의 구분된 성숙 펩티드로 절단되는 프리프로-단백질을 코딩한다. 외부 투여된 GLP-2는 개체, 예를 들어 인간에 있어, 장 성장, 장 기능 증진, 골 분해 감소, 및 신경보호를 포함한 다수의 효과들을 발생시킨다. GLP-2는 장 성장 및 대사를 영양소 섭취와 연관시키는 내분비 방식으로 작용할 수 있다. GLP-2 및 관련 유사체는 단장 증후군, 크론씨병, 골다공증의 치료법 또는 암 치료 중의 보조제로서의 치료법일 수 있다. 바람직하게, GLP-2 유전자는 락토코커스, 예를 들어 L. 락티스에서의 바람직한 코돈 용법에 맞게 적합화된다. 바람직하게, 유전자는 하기 아미노산 서열을 코딩한다:
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 유전자는 위치 2에서 알라닌이 글리신으로 치환된 성숙 인간 GLP-2 유사체를 코딩하며, 이는 디펩티딜 펩티다제-IV에 의한 분해 감수성을 감소시키는 것으로 나타났고(문헌 [Booth et al., 2004]), 예를 들어 유전자는 아미노산 서열 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD을 코딩한다.
더욱 더 바람직한 실시양태에서, GLP-2 유전자는 락토코커스에서의 바람직한 코돈 용법에 맞게 적합화되고, 위치 2에서 알라닌의 글리신으로의 치환을 포함하는데, 예를 들어 h[Gly2]GLP-2의 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
CACGGTGATGGTTCATTTTCAGATGAAATGAACACTATCCTTGATAACCTTGCTGCTCGTGATTTTATCAACTGGCTTATCCAAACTAAAATCACTGATTAA.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드를 코딩하며, 여기에서 상기 항원은 인간 또는 동물 대상에서 면역 반응, 바람직하게는 보호 면역 반응을 유도할 수 있고/있거나, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 인간 또는 동물 대상에서 치료적 효과를 생성시킬 수 있다.
WO 97/14806는 또한 구체적으로 세균에 의해 예를 들어 인터루킨, 예를 들어 IL-2 또는 IL-6과 같은 면역 반응 자극 분자와의 항원의 동시발현을 개시한다. 따라서, 본 발명의 프로모터를 이용한 그러한 동시발현도 또한 고려된다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임은 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 상에서 분비 시호를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 이는 유리하게 발현된 폴리펩티드가 숙주 세포로부터의 분비되도록 하고, 이로써 예를 들어 분리 또는 전달을 용이하게 할 수 있다.
전형적으로, 분비 신호 서열은, 지질 이중층 막 내에 삽입되어 짐으로써 동반 단백질 또는 펩티드 서열이 숙주 세포로부터 분비되도록 하는, 소수성 아미노산을 통상 함유하고 통상 단백질 또는 펩티드로부터 절단되는 약 16 내지 약 35개 아미노산 세그먼트를 나타낸다. 바람직하게, 분비 신호 서열은 상기 신호 서열을 포함하는 핵산과 함께 사용하도록 의도된 숙주 세포, 예를 들어 세균 숙주 세포, 바람직하게는 유산 세균, 더욱 바람직하게는 락토코커스, 더욱 더 바람직하게는 락토코커스 락티스에서 그와 같이 활성적일 수 있다.
적당한 숙주 세포 내의 분비 신호 서열 활성이 당업계에 공지되어 있고; 예시적 락토코커스 신호 서열에는 usp45의 그러한 서열(US 특허 제5,559,007호) 등이 포함되고, 이에 대해 예를 들어, 문헌 [Perez-Martinez et al. (1992)]; 문헌 [Sibakov et al. (1991)]을 참조한다. 바람직하게, 신호 서열은 프로모터 서열과 ORF 사이에 위치하는데, 즉 신호 서열이 프로모터 서열로부터 3'에 위치하고, 관심 폴리펩티드의 ORF에 선행한다. 한 바람직한 실시양태에서, 신호 서열은 아미노산 서열 MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA(usp45)을 코딩한다.
본 발명자들은 놀랍게도 PhllA 프로모터의 돌연변이화 usp45 신호 서열과의 조합이 관심 폴리펩티드의 추가의 제어가능한 생산 및 분비를 초래함을 발견하였다. 특히, 돌연변이체는 리신(K) 대신에 위치 4에 아스파라긴(N)을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 신호 서열은 아미노산 서열 MKKNIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYADTN을 코딩한다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산으로서,
(a) PdpsA, usp45 및 hIL-10(sAGX0012); PdpsA, usp45N4 및 hIL-10;
PpepV, usp45 및 hIL-10(sAGX0018); PpepV, usp45N4 및 hIL-10;
PsodA, usp45 및 hIL-10(sAGX0029); PsodA, usp45N4 및 hIL-10;
PhllA, usp45 및 hIL-10(sAGX0037); PhllA, usp45N4 및 hIL-10;
(b) PdpsA, usp45N4 및 hTFF1; PdpsA, usp45 및 hTFF1;
PpepV, usp45N4 및 hTFF1; PpepV, usp45 및 hTFF1;
PsodA, usp45N4 및 hTFF1; PsodA, usp45 및 hTFF1;
PhllA, usp45N4 및 hTFF1(sAGX0048); PhllA, usp45 및 hTFF1(sAGX0049);
(c) PdpsA, usp45N4 및 hTFF3; PdpsA, usp45 및 hTFF3(sAGX0048);
PpepV, usp45N4 및 hTFF3; PpepV, usp45 및 hTFF3;
PsodA, usp45N4 및 hTFF3; PsodA, usp45 및 hTFF3;
PhllA, usp45N4 및 hTFF3(sAGX0057); PhllA, usp45 및 hTFF3;
(d) PdpsA, usp45N4 및 hPYY; PdpsA, usp45 및 hPYY(sAGX0048);
PpepV, usp45N4 및 hPYY; PpepV, usp45 및 hPYY;
PsodA, usp45N4 및 hPYY; PsodA, usp45 및 hPYY;
PhllA, usp45N4 및 hPYY(sAGX0057); PhllA, usp45 및 hPYY; PhllA, usp45 및 hPYY G9(3-36)(sAGX0213);
(e) PdpsA, usp45N4 및 GLP-1; PdpsA, usp45 및 GLP-1;
PpepV, usp45N4 및 GLP-1; PpepV, usp45 및 GLP-1;
PsodA, usp45N4 및 GLP-1; PsodA, usp45 및 GLP-1;
PhllA, usp45N4 및 GLP-1; PhllA, usp45 및 GLP-1;
(f) PdpsA, usp45N4 및 GLP-2; PdpsA, usp45 및 GLP-2;
PpepV, usp45N4 및 GLP-2; PpepV, usp45 및 GLP-2;
PsodA, usp45N4 및 GLP-2; PsodA, usp45 및 GLP-2;
PhllA, usp45N4 및 GLP-2; 또는 PhllA, usp45 및 GLP-2
를 포함하는 재조합 핵산에 관한 것이다.
추가의 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 사용되는 "벡터"란 핵산 단편이 안에 삽입되어 클로닝될 수 있는, 즉 증식될 수 있는 핵산 분자, 전형적으로는 DNA를 지칭한다. 이에 따라, 벡터는 전형적으로 하나 이상의 고유 제한 부위를 함유할 것이고, 클로닝된 서열이 재현가능하도록 소정의 숙주 또는 비히클 유기체 내에서 자율 복제가능할 수 있다. 벡터에는 비제한적으로, 적절한 대로 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지, 박테리오파지-유래 벡터, PAC, BAC, 선형 핵산, 예를 들어 선형 DNA 등이 포함될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]; 문헌 [Ausubel 1992)] 참조).
특정 벡터, 예를 들어 플라스미드를 선택하는 데 중요한 인자에는 특히 벡터를 함유하는 수혜 세포가 인식되어 벡터를 함유하지 않는 그러한 수혜 세포로부터 선택하는 용이성; 특정 숙주에서 요망되는 벡터의 복제수; 및 상이한 종의 숙주 세포들 간의 벡터의 "왕복이동(shuttle)"가능한 것이 바람직한지의 여부가 포함된다. 바람직한 원핵생물 벡터에는 플라스미드, 예컨대 E. 콜라이(E. coli) 내에 복제가능한 플라스미드(예컨대, 예를 들어 pBR322, CoIE1, pSC101, pUC19 등)가 포함된다. 그러한 플라스미드는 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989]; 문헌 [Ausubel 1992]에 기재되어 있다. 특히, 바람직한 벡터는 E. 콜라이(또는 기타 그람 음성 세균)에서뿐만 아니라 또 다른 관심 숙주 세포, 예컨대 그람 양성 세균, 유산 세균, 바람직하게는 락토코커스, 더욱 바람직하게는 락토코커스 락티스에서 복제할 수 있는 벡터일 수 있다(예를 들어, 문헌 [Kok et al. (1984)] 참조). 다른 바람직한 벡터는 그람 음성 세균에서가 아니라, 하나 이상의 그람 양성 세균들 사이에 복제 및/또는 왕복이동할 수 있는 벡터일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 벡터는 구체적으로 본원에 참조 인용되는 문헌 [Steidler et al., (1998)]에 의해 기재된 pT1NX이다.
추가의 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 예를 들어, 그러한 형질전환은 상기 핵산 또는 벡터의 증식 및 유지에 유용할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 또한 유리하게는, 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 프로모터를 이용하여 본 발명의 핵산의 오픈 리딩 프레임(들)을 전사할 수 있고, 바람직하게는 상기 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 발현 생성물, 바람직하게는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있을 것이다.
이에 따라, 추가의 한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서 상기 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 발현 생성물, 바람직하게는 하나 이상의 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위한 본 발명의 재조합 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다. 바람직하게, 발현 생성물, 예를 들어 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 대해 이종성, 즉 외인성일 수 있다.
바람직하게, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 세균 세포, 더욱 바람직하게는 비병원성 및/또는 비침습성 세균, 더욱 더 바람직하게는 그람-양성 세균, 더욱 더 바람직하게는 유산 세균(예를 들어, 락토코커스 spp., 스트렙토코커스(Streptococcus) spp., 락토바실러스 spp., 류코노스톡(Leuconostoc) spp., 페디오코커스(Pediococcus) spp., 브레비박테리움(Brevibacterium) spp., 프로피오니박테리움(Propionibacterium) spp. 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium) spp.), 매우 바람직하게는 락토코커스 세균, 가장 바람직하게는 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 락토코커스 락티스 세균일 것이나; 단 본 발명의 프로모터는 상기 숙주 세포에서 적당하게 활성적이다.
본 발명의 재조합 핵산 또는 벡터는 염색체외에, 바람직하게는 자체의 복제 기점을 이용하여 자율 복제하는 숙주 세포 내에 존재할 수 있거나, 세균 게놈 DNA, 예를 들어 세균 염색체, 예를 들어 락토코커스 염색체 내로 통합될 수 있다. 후자의 경우에, 상기 핵산의 단일 또는 다중 복사체는 통합될 수 있으나, 바람직하게는 단일 복사체이고; 통합은 염색체의 무작위 부위에서 일어날 수 있거나, 상기 기재된 바와 같이, 염색체의 소정의 부위에서 일어날 수 있는데, 예컨대 한 바람직한 비제한적 예에서는 락토코커스, 예컨대 예를 들어 본원에 구체적으로 참조 인용되는 문헌 [Steidler et al., (2003)]에 기재된 바와 같은 락토코커스 락티스의 thyA 유전자위에서 일어날 수 있다.
따라서, 추가의 한 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 프로모터(P)가 상기 숙주 세포의 염색체 내에 존재하고, 상기 프로모터(P)가 상기 프로모터(P)에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되며, 더욱 바람직하게는 상기 프로모터(P)가 신호 서열, 바람직하게는 usp45 또는 usp45N4를 추가로 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 프로모터(P)가 상기 프로모터(P)로부터의 전사를 제어하도록 구성되는 오퍼레이터를 추가로 포함하며, 더욱 더 바람직하게는, 프로모터(P)가 서열 번호 1, 3 내지 6, 9, 12, 13, 18, 20 내지 22, 24, 26, 28 내지 54, 160, 163 내지 165, 167, 169, 171 내지 180에 나타낸 핵산 및 그것의 동족체, 및 이들의 기능성 변이체 및 기능성 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 제공한다.
추가의 한 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포로서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임이 대상, 바람직하게는 인간 또는 동물 대상에서 치료적 반응 또는 면역원성 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임이 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드를 코딩하며, 더욱 더 바람직하게는 상기 항원이 인간 또는 동물 대상에서 면역 반응, 바람직하게는 면역 관용 반응(immue tolerance response)을 유도할 수 있고/있거나, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 인간 또는 동물 대상에서 치료적 효과를 생성시킬 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 한 바람직한 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포로서, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF 또는 hPYY인 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 추가의 바람직한 측면에서, 본 발명은 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포로서, 상기 항원이 인간 또는 동물 대상 등에서 면역 반응을 유도할 수 있고 백신으로서 사용되는 숙주 세포를 제공한다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포로서,
(a) PdpsA, usp45 및 hIL-10(sAGX0012); PdpsA, usp45N4 및 hIL-10;
PpepV, usp45 및 hIL-10(sAGX0018); PpepV, usp45N4 및 hIL-10;
PsodA, usp45 및 hIL-10(sAGX0029); PsodA, usp45N4 및 hIL-10;
PhllA, usp45 및 hIL-10(sAGX0037); PhllA, usp45N4 및 hIL-10;
(b) PdpsA, usp45N4 및 hTFF1; PdpsA, usp45 및 hTFF1;
PpepV, usp45N4 및 hTFF1; PpepV, usp45 및 hTFF1;
PsodA, usp45N4 및 hTFF1; PsodA, usp45 및 hTFF1;
PhllA, usp45N4 및 hTFF1(sAGX0048); PhllA, usp45 및 hTFF1(sAGX0049);
(c) PdpsA, usp45N4 및 hTFF3; PdpsA, usp45 및 hTFF3(sAGX0048);
PpepV, usp45N4 및 hTFF3; PpepV, usp45 및 hTFF3;
PsodA, usp45N4 및 hTFF3; PsodA, usp45 및 hTFF3;
PhllA, usp45N4 및 hTFF3(sAGX0057); PhllA, usp45 및 hTFF3;
(d) PdpsA, usp45N4 및 hPYY; PdpsA, usp45 및 hPYY(sAGX0048);
PpepV, usp45N4 및 hPYY; PpepV, usp45 및 hPYY;
PsodA, usp45N4 및 hPYY; PsodA, usp45 및 hPYY;
PhllA, usp45N4 및 hPYY(sAGX0057); PhllA, usp45 및 hPYY;
PhllA, usp45 및 hPYY G9(3-36)(sAGX0213);
(e) PdpsA, usp45N4 및 GLP-1; PdpsA, usp45 및 GLP-1;
PpepV, usp45N4 및 GLP-1; PpepV, usp45 및 GLP-1;
PsodA, usp45N4 및 GLP-1; PsodA, usp45 및 GLP-1;
PhllA, usp45N4 및 GLP-1; PhllA, usp45 및 GLP-1;
(f) PdpsA, usp45N4 및 GLP-2; PdpsA, usp45 및 GLP-2;
PpepV, usp45N4 및 GLP-2; PpepV, usp45 및 GLP-2;
PsodA, usp45N4 및 GLP-2; PsodA, usp45 및 GLP-2;
PhllA, usp45N4 및 GLP-2; 또는 PhllA, usp45 및 GLP-2
를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
추가의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
a) 본 발명의 재조합 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 관심 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단계, 및
b) 상기 배양 단계에서 숙주 세포에 의해 생성된 관심 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드를 분리하는 단계
를 포함하는, 관심 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드의 재조합 발현 방법을 제공한다.
당업자는 일반적으로 숙주 세포, 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 하는 배양 조건, 예를 들어 온도, 필요한 영양소의 존재 및 농도, 산소첨가, 교반, 접종 등을 인지하고 있고, 이를 최적화할 수 있다.
당업자는 또한 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 발현 생성물, 예컨대 바람직하게 폴리펩티드의 분리를 위한 정제 기법을 인지하고 있고, 이를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리의 적당한 기법은 예를 들어 세포벽의 기계적 또는 효소적 붕괴 및 세포 파편의 제거, 또는 상등액 수집(예를 들어, 폴리펩티드가 분비될 때), 비-단백질 성분, 예컨대 DNA 및 지다당류, 황산암모늄 침전, 예를 들어 요망되는 단백질이 풍부하도록 하기 위한 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 의해, 숙주 유기체의 분해(예를 들어, 폴리펩티드가 세포내 축적될 때)를 수반할 수 있다.
추가의 한 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 핵산 내에 포함된 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 발현 생성물(들), 바람직하게는 폴리펩티드(들)를 인간 또는 동물에게 전달하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 재조합 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포의 용도를 제공한다.
한 관련 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 내에 포함된 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 당해 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 전달하는 방법으로서, 상기 인간 또는 동물에게 치료 유효량의, 본 발명의 상기 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 동물은 바람직하게 예를 들어 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 및 실험 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 축우, 암소; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 개과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양이과 동물, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대 암소, 돼지 및 양; 유제 동물, 예컨대 사슴 및 기린; 설치 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아피그 등과 같은 포유동물일 수 있다.
본원에 사용되는 용어들 "치료하다" 또는 "치료"는, 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 지칭하는 것으로, 그 목적은 대상에 있어 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애를 방지 또는 감속(경감)시키는 것이다. "치료가 필요한 인간 또는 동물"에는 소정의 상태의 치료로부터 이익을 얻게 되는 동물이 포함된다.
용어 "치료 유효량"이란 대상, 예를 들어 인간 또는 동물에서의 질환 또는 장애를 치료하는 데, 즉 원하는 국소 또는 전신 효과 및 성능을 수득하는 데 유용한 치료 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 예로서, 세균의 치료 유효량은 1개 이상의 세균, 또는 10개 이상의 세균, 또는 102개 이상의 세균, 또는 103개 이상의 세균, 또는 104개 이상의 세균, 또는 105개 이상의 세균, 또는 106개 이상의 세균, 또는 107개 이상의 세균, 또는 108개 이상의 세균, 또는 109개 이상 또는 1010개 이상 또는 1011개 이상 또는 1012개 이상 또는 1013개 이상 또는 1014개 이상 또는 1015개 이상 또는 그 이상 개수의 숙주 세포, 예를 들어 세균을, 예를 들어 단일 또는 반복 용량 내에 포함할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 단독으로 또는 하나 이상의 활성 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 후자는 상기 숙주 세포의 투여 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다.
항원 및/또는 치료적 활성 폴리펩티드의 전달에 대한 다수의 종래 기술의 개시내용들이 존재하고, 그러한 개시내용은 본 발명의 강한 프로모터를 이용하여 추가로 유리하게 변형될 수 있음을 인식하도록 한다. 예로서 또한 비제한적으로, 단장증, 크론씨병, 골다공증을 치료하기 위해, 또는 암 화학요법 중에 보조제 요법으로서, 대장염 치료를 위한 인터루킨, 특히 IL-10의 세균 전달(예를 들어, WO 00/23471 참조), 백신으로서의 항원의 전달(예를 들어, WO 97/14806), GLP-2 및 관련 유사체의 전달을 이용할 수 있다. 또한, 소화관의 질환을 치료하기 위해 트레포일 펩티드의 세균 전달을 이용할 수 있다(예를 들어, WO 01/02570 참조). 특히, 입, 식도, 위, 대장 및 소장을 포함한 소화관의 장애 및 그것들에 대한 손상의 치료뿐만 아니라 소화관 외부에 있는 조직의 보호 및 치료를 위한 트레포일 단백질 또는 펩티드의 사용이 WO 97/38712 및 WO 92/14837에 기재되어 있다. 이 단백질은 상기 부위들에서의 병변을 치료하거나 병변의 형성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이 병변은 암 치료를 위한 방사선요법 또는 화학요법, 소화관을 손상시키는 알코올을 포함하는 임의의 기타 약물, 방사선 또는 부식성 물질에의 우발적 노출, 감염, 소화 장애, 예를 들어 비제한적으로 비궤양 소화불량, 위염, 소화성 궤양 또는 십이지장 궤양, 위암, MALT 림프종, 메네트리어 증후군, 위-식도 역류 질환, 크론씨병, 궤양성 대장염, 및 화학적 기원, 세균 기원 또는 불명료한 기원의 급성 대장염에 의해 유발될 수 있다. 트레포일 펩티드는 급성 대장염을 치료하는 데 특히 유용하다. 본 발명의 프로모터 및 숙주 세포를 이용한 추가의 치료 용도가 구상된다.
본 발명에 따른 치료용 폴리펩티드의 전달에 의해 인간 또는 동물에서 치료가능한 질병의 유형의 추가의 비제한적 예에는 예를 들어 (예를 들어 IL-Ira 또는 IL-10 또는 트레포일 펩티드에 의해 치료가능한) 크론씨병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장 질환; (예를 들어, IL-Ira 또는 IL-10 또는 관련 자가항원으로 치료가능한) 건선, 류마티스성 관절염, 전신 홍반 루푸스를 포함하나 이에 국한되지 않는 자가면역 질환; (관련 알레르겐으로 치료가능한) 천식, 식품 알레르기를 포함하나 이에 국한되지 않는 알레르기성 질환; (글루텐 알레르겐으로 치료가능한) 셀리악병; (예를 들어, 뇌 유리 신경친화성 인자 및 모양체 신경친화성 인자로 치료가능한) 알츠하이머씨병, 파킨슨씨병 및 근위축성 측삭경화증을 포함하나 이에 국한되지 않는 신경학적 장애; (예를 들어, IL-1, 콜로니 자극 인자 또는 인터페론-W로 치료가능한) 암; (예를 들어, 형질전환 성장 인자 f3으로 치료가능한) 골다공증; (예를 들어, 인슐린으로 치료가능한) 당뇨병; 예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성제로 치료가능한) 심혈관계 질환; (예를 들어, 사이토킨 및 사이토킨 길항자로 치료가능한) 아테롬성동맥경화증; (예를 들어, 응고 인자로 치료가능한) 혈우병; (예를 들어, 간세포 성장 인자 또는 인터페론 a로 치료가능한) 퇴행성 간 질환; (예를 들어, 알파 안티트립신으로 치료가능한) 낭포성 섬유증과 같은 폐 질환; 비만; (임의의 수의 상기 언급된 조성물 또는 항원으로 치료가능한) 병원체 감염, 예를 들어 바이러스 또는 세균 감염; 등이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
숙련된 독자는 본원에 구체적으로 언급된 질환이 단지 예시적이고, 그 인용은 결코 본 발명에 의해 제공되는 시약(reagent), 예를 들어 본 발명의 프로모터, 핵산, 벡터 및 숙주 세포의 용도를 상기 특정 질환들에 국한하고자 의도되지 않음을 인식하도록 한다. 그 대신에, 숙련된 독자는 본 발명의 시약이 상기 언급된 질환들뿐만 아니라 인간 및 동물의 각종 추가의 질환 또는 상태에 있어 치료적으로 관련될 수 있는, 임의의 관심 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드를 원칙적으로 발현하기 위해 사용될 수 있음을 이해한다. 궁극적으로, 일단 적당한 발현 생성물, 바람직하게는 폴리펩티드, 예를 들어 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 소정의 병을 위해 선택되거나 결정된 경우, 당업자는 본 발명의 시약을 사용하여 그것의 발현, 분리 및/또는 전달을 달성할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 개, 말, 고양이 및 새를 포함한 기타 동물들에서의 질환의 치료를 고려한다. 개의 질병에는 개 디스템퍼병(파라믹소바이러스), 개 간염(아데노바이러스 Cav-1), 개 만성기침(kennel cough) 또는 후두기관염(아데노바이러스 Cav-2), 감염성 개 장염(코로나바이러스) 및 출혈성 장염(파르보바이러스)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
고양이의 질병에는 바이러스성 비기관염(헤르페바이러스), 고양이 칼리시바이러스 질환(칼리시바이러스), 고양이 감염성 복막염(파르보바이러스) 및 고양이 백혈병(고양이 백혈병 바이러스)가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 말 및 새의 기타 바이러스성 질환들도 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 치료가능한 것으로 고려된다. 이 목적을 위해, 재조합 인터페론을 발현하는 미생물의 사용이 특히 바람직할 것이다.
따라서, 추가의 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게, 그러한 제제는 치료 유효량의 본 발명의 숙주 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 즉 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 물질 및/또는 첨가제, 예를 들어 완충제, 담체, 부형제, 안정화제 등을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 약학 조성물의 다른 성분들과 상용적이고 그것의 수혜자에게 유해하지 않은 기술 및 수단과 일관된다.
본 발명의 재조합 숙주 세포는 치료하고자 하는 질환을 갖는 인간 또는 동물에게 투여하기 위한 약학적 제제 중에 현탁될 수 있다. 그러한 약학적 제제에는 투여에 적당한 매질 및 생 숙주 세포를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 재조합 숙주 세포는 락토스, 기타 당, 알칼리류 및/또는 알칼리토류 스테아르산염, 탄산염 및/또는 황산염(예를 들어, 스테아르산마그네슘, 탄산나트륨 및 황산나트륨), 카올린, 실리카, 풍미제 및 방향제와 같은 통상의 부형제의 존재 하에 동결건조될 수 있다.
이와 같이 동결건조된 숙주 세포는, 각기 경구 경로에 의해 투여될 수 있는 캡슐, 정제, 과립 및 분말의 형태로 제조될 수 있다.
대안적으로, 일부 재조합 세균은 적당한 매질 내의 수성 현탁액으로서 제조될 수 있거나, 동결건조된 세균이 사용 직전에 적당한 매질 내에 현탁될 수 있으며, 상기 매질은 본원에 언급된 부형제 및 기타 부형제, 예컨대 글루코스, 글리신 및 사카린산나트륨을 포함한다.
경구 투여를 위해, 위내성 경구 제형(oral dosage form)이 제형될 수 있는데, 그 제형은 숙주 세포의 제어 방출을 제공함으로써 그 안에 코딩된 원하는 단백질의 제어 방출을 제공하는 화합물을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 제형(정제, 펠렛, 과립, 분말 포함)는 위 내 용해 또는 붕해에 대해서는 내성을 가지나 장에서는 그러한 내성을 가지지 않음으로써, 장 내 붕해, 용해 및 흡수의 측면에서 유리하게 위를 통해 전달되도록 하는, 부형제(통상 중합체, 셀룰로스성 유도체 및/또는 친지성 물질)의 박층으로 코팅될 수 있다.
경구 제형은 숙주 세포 및 그것의 재조합 단백질의 느린 방출을 허용하도록, 예를 들어 제어된 방출, 지연된 방출, 연장된 방출, 지연된 작용의 정제 또는 캡슐로서 설계될 수 있다. 이 제형은 주로 통상적이고 공지된 부형제, 예컨대 친지성, 중합체성, 셀룰로스성, 불용성, 팽윤성 부형제를 함유한다. 제어된 방출 제제는 또한 장, 결장, 생접착 또는 설하 전달(즉, 치아 점막 전달) 및 기관지 전달을 비롯한 임의의 기타 전달 부위에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 직장 또는 질내 투여하고자 하는 경우, 약학적 제제는 좌제 및 크림을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 숙주 세포는 지질도 또한 포함하는 통상의 부형제의 혼합물 중에 현탁된다. 각각의 상기 제제가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 하기 참조문헌에 기재되어 있다: 문헌 [Hansel et al. (1990)], 문헌 [Chien (1992)], 문헌 [Prescott et al. (1989)], 및 문헌 [Cazzaniga et al. (1994)].
바람직하게, 직장 투여하기 위해 관장 제제가 사용될 수 있다. 용어 "관장"은 직장용으로 의도된 액체 제제를 포괄하도록 사용된다. 관장은 통상 단일 용량의 용기 내에 공급될 수 있고, 물, 글리세롤 또는 마크로골 또는 기타 적당한 용매 중에 용해 또는 분산된 하나 이상의 활성 물질을 함유한다.
따라서, 본 발명에 따라, 한 바람직한 실시양태에서, 요망되는 유전자를 코딩하는 재조합 숙주 세포가 특정 경로에 적용가능한 최신 기술의 제제들 중 임의의 제제에 의해 점막, 예를 들어 경구, 코, 직장, 질 또는 기관지 경로를 통해 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다. 투여를 위한 숙주 세포의 용량은 세균의 유형 및 이에 의해 코딩되는 유전자, 치료하고자 하는 질환의 유형 및 중증도, 및 사용하는 투여 경로를 포함하는 다수의 인자들에 따라 변동될 것이다.
따라서, 정확한 투약량은 본 발명의 각각의 모든 실시양태에 대해 한정될 수 없으며, 본 발명이 일단 적용되면 당업자에게 자명해질 것이다. 투약량은 공지된 방법, 예컨대 ELISA 또는 바이어코어(Biacore)(실시예 참조)로서 알려진 방법을 이용하여, 소정의 수의 세포를 투여한 후, 재조합 단백질의 혈청 중 수준 농도를 측정함으로써 케이스에 따라 임의의 방식으로 결정될 수 있다. 전달된 재조합 단백질의 동력학 프로파일 및 반감기의 분석은 형질전환된 숙주 세포에 대한 유효 투약량 범위를 결정하도록 하기에 충분한 정보를 제공한다.
한 실시양태에서, 숙주 세포가 항원을 발현하는 경우, 본 발명은 이에 따라 백신도 또한 제공할 수 있다.
용어 "백신"은 동물 또는 인간 대상에게 유효량으로 투여될 때, 백신 내에 포함되는 면역원에 대한 항체를 유도할 수 있고/있거나 대상 내에 보호 면역원성을 유도하는 약학적으로 허용가능한 조성물을 가리킨다.
본 발명의 백신은 본 발명의 핵산 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 추가의 임의적으로 부형제를 포함한다. 그러한 백신은 또한 보조제, 즉 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 화합물 또는 조성물을 포함할 수 있다. 보조제에는 완전 프로인트 보조제, 불완전 프로인트 보조제, 사포닌, 무기 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 다가음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 유화액, 및 잠재적으로 유용한 약학적으로 허용가능한 인간 보조제, 예컨대 BCG(바실 칼메뜨-게랭)(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 재조합 핵산의 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 인간 또는 동물에게 전달하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포의 용도에 관한 것이며, 바람직하게 상기 폴리펩티드는 항원 및/또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF 또는 hPYY이다. 본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 실시예에 의해 추가로 설명되나, 이 실시예는 제한적인 것으로 간주되지 않는다.
실시예에 사용된 재료
GM17 - 제조자의 사용설명서에 따라 제조되나 어떠한 당도 첨가되지 않은 M17 브로쓰(broth)(옥소이드(Oxoid) CM0817)
- 여과(스테리컵(Stericup)-GV 0.22 ㎛ PVDF 밀리포어(Millipore) CGVU05RE)에 의해 무균화된 20% 글루코스(머크(Merck) 1.08337).
- GM17 브로쓰: 0.5% 글루코스로 보충된 M17.
GM17T는 200 μM 티미딘(시그마(Sigma) #T9250)으로 보충된 GM 17이다.
GM17E는 96% 에탄올 스톡 용액 중 25 mg/ml 에리트로마이신으로부터의 희석에 의해 5 μg/ml 에리트로마이신(시그마 #E6376)으로 보충된 GM17이다.
BM9 - 121℃에서 15분 동안의 10% 카시톤(디프코(Difco) 225930) 고압살균.
- 여과(스테리컵-GV 0.22㎛ PVDF 밀리포어 CGVU05RE)에 의해 무균화된 0.5 M NaHCO3(머크 1.06329).
- 여과(스테리컵-GV 0.22㎛ PVDF 밀리포어 CGVU05RE)에 의해 무균화된 0.5 M Na2CO3(머크 1.06392).
- 121℃에서 15분 동안의 1 M MgSO4(머크 1.05886) 고압살균.
- 121℃에서 15분 동안의 100 mM CaCl2(머크 1.02382) 고압살균.
- 121℃에서 15분 동안의 10×M9 염(디프코 248510) 고압살균. 무균수 중에 10× 희석하여, M9 염을 수득한다.
- 10 ㎖ BM9: 상이한 성분들을 하기 기재된 바와 같은 순서로 첨가한다.
**1 ㎖ 10× M9 염
* 500 ㎕ 10% 카시톤
* 250 ㎕ 20% 글루코스
* 7.75 ㎖ 물
* 500 ㎕ 0.5 M NaHCO3
*500 ㎕ 0.5 M Na2CO3
하기 성분들을 적절히 혼합하여, 첨가한다:
* 20 ㎕ 1 M MgSO4
* 10 ㎕ 100 mM CaCl2
BM9T는 200 μM 티미딘(시그마 #T9250)으로 보충된 BM9이다.
BM9E는 96% 에탄올 스톡 용액 중 25 mg/ml 에리트로마이신으로부터의 희석에 의해 5 μg/ml 에리트로마이신(시그마 #E6376)으로 보충된 BM9이다.
ELISA
IL10 - BD OptEIA 인간 IL-10 ELISA 키트 II; 카달로그 N°: 550613; BD 바이오사이언시스(BD Biosciences); www.bdbiosciences.com
TFF-1 - 샌드위치(Sandwich) ELISA
- 코팅 항체: TFF1 마우스 단클론성 항체(M02), 클론 3H5(압노바 카달로그 N°: H00007031-M02)
- 검출 항체: 다클론성 토끼 항-hTFF1(알파 다이아그노스틱스(Alpha Diagnostics) 카달로그 N°: TFF12-A; www.4adi.com)
- 접합체: 항-토끼-HRP(서던 바이오테크(Southern Biotech) 카달로그 N°: 4050-05; www.southernbiotech.com)
- 기질: TMB
TFF-3 샌드위치 ELISA
- 코팅 항체: TFF-3에 대한 마우스 단클론성 항체 4408(R&D 시스템 즈(R&D Systems) 카달로그 N°: MAB4408; www.rndsystem.co)
- 검출 항체: TFF-3에 대한 인-하우스 비오티닐화된 마우스 단클론성 15C6(칼바이오켐(Calbiochem) 카달로그 No°: 585350; www. Calbiochem.com)
- 접합체: 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP(카달로그 N°: 554066; BD 바이오사이언시스; www.bdbiosciences.com)
- 기질: TMB
PYY 상업용 키트: 총 펩티드 YY(PYY) ELISA; 카달로그 N°: DSL-10-33600; 다이아그노스틱스 시스템 라보라토리즈 인코포레이티드(Diagnostic System Laboratories, Inc.); www.dslabs.com
GLP-1 상업용 kit: 글루카곤-유사 펩티드-1(활성) ELISA 키트; 카달로그 N°: EGLP-35K; 린코 리서치(Linco Research); www.millipore.com
실시예 1 락토코커스 락티스 로부터의 강한 프로모터의 분리
강하게 발현된 단백질을 문헌 [Antelmann et al. (2000)]의 방법을 이용하여 락토코커스 락티스 ssp. 락티스 MG1363에서 동정하였다.
간략히, 1 D 겔 내 풍부한 단백질 스폿에 의해 고발현 단백질을 동정하였다(도 2). 표시된 단백질 밴드를 트립신으로 절단하였고, 펩티드 혼합물을 이온 트랩형 질량 분광계(에스콰이어 HCT(Esquire HCT), 브루커(Bruker))에서 LC-MS/MS 방식으로 분석하였다. 스펙트럼(데이터 분석을 위해, 1회 수행 당 단지 250 MS/MS 스펙트럼을 유지함)을 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 sk11 단백질(유전자은행 NC_008527)로부터 데이터뱅크를 이용하여 마스코트(MASCOT)에 의해 분석하였다. 동 일성 역치 스코어를 초과하는 마스코트 스코어를 갖는 펩티드를 95% 확률로 동정한다. 동일 단백질에서 유래되는 펩티드가 많을수록, 동정 신뢰도가 높다.
이 분석으로 매우 풍부한 단백질 및 상응 유전자의 목록을 얻는다(상기 표 1 및 도 1). 이에 기초하여, 본 발명자들은 그 자체의 샤인 달가르노(SD) 서열을 갖는 표시된 유전자(서열 번호 1 내지 54 및 157 내지 180)의 상류에 있는 서열을 동정하고 분리하였다. 대부분의 프로모터에 있어, 이를 락토코커스 락티스 MG1363 염색체 DNA 상에서 PCR에 의해 행하였다. 예로서, 상기 1) 내지 30) 하에 열거된 유전자에 상응 프로모터의 서열을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머가 표 2에 나와 있다. 마찬가지로, 적당한 프라이머를, 상기 31) 내지 53) 하에 열거된 유전자에 상응 프로모터에 대해 입수가능한 게놈 정보에 기초하여 선택할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(표 3에서 올리고로 나타냄)에 대해 eno, tbp 및 lacE에 대한 프로모터를 또한 합성하였다.
실시예 2 프로모터 활성
분비가능한 hIL-10 유전자 앞에 있는 각종 프로모터의 서브클로닝을 허용하는 기법을 고안하였다(도 3). hIL-10 발현 카세트의 측면에 표적 서열이 배치되도록 하는 방식으로 서브클로닝을 수행하였다. 이 구조는 본질적으로 상기 문헌 [Steidler et al. 2003] 및 WO 02/090551에 기재된 바와 같이, thyA 유전자 주위의 이중 상동 재조합 및 이에 따른 염색체 통합을 가능하게 한다.
모식적으로, 기법은 도 3을 참조로 하여 약술된다.
A) 적절한 프라이머를 이용하여, 프로모터를 L. 락티스 MG1363 염색체 DNA로 부터 PCR에 의해 분리하고; B) PCR 어닐링에 의해 프로모터를 관련 측면 영역(부분 상류 표적 영역, 부분 hIL-10)에 결합시키며; C 및 D) 결합된 생성물을 적절하게 위치한 제한 엔도뉴클레아제 부위(Ncol+AflIII 또는 대안적으로 Ncol+BstEII)를 이용함으로써 조건부 비복제성 플라스미드 내에 서브클로닝한다. 이는 상류 표적 영역 및 hIL-10 모두를 완성한다. E) 프로모터 작제물을 연속적 상류 및 하류 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 내로 도입한다. 염색체 통합을 두 단계 절차를 통해 수행한다. 모 균주 L. 락티스 MG1363 내 비복제성 플라스미드의 도입 후에, 선택 배지를 함유하는 에리트로마이신에 대해 상류 또는 하류 표적 서열 모두에서의 첫 번째 상동 재조합을 선택할 수 있다. 대안적 표적에서의 두 번째 상동 재조합을 thyA의 부재에 의해 스크리닝한다. F) thyA를 hIL-10로 치환한 최종 염색체 구조.
염색체 통합 도입유전자를, 본질적으로 문헌 [Steidler et al. (2003)]에 기재된 바와 같은 다른 락토코커스 균주; WO 02/090551에 기재되고 본원에 간략히 기재된 자족형 락토코커스 균주 대비, 분비가능한 hIL-10(즉, 락토코커스 분비 신호 서열, 예를 들어 usp45 또는 동종체가 인-프레임으로 제공된 hIL-10)의 발현 수준에 대해 평가하는데, 즉 각종 락토코커스 락티스 균주를 단일 콜로니로 선상도말하여, GM17(M17, 옥소이드, 영국 햄프셔 소재, 0.5% 글루코스로 보충됨) 내에 1개 콜로니를 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 항온 배양함으로써 예비배양물을 제조한다. 이 예비배양물을 5 ㎖ GM 중에 1/25 접종하고, 30℃에서 4시간 동안 항온 배양한다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 5 ㎖의 새 BM9(표 4 중의 조성물) 내에 재현탁한다. 이 세포 현탁액을 30℃에서 3시간 동안 항온 배양한다. 세균 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상등액을 새 관으로 옮긴다. 상등액의 hIL-10 함량을 ELISA에 의해 결정하고, hIL-10 단백질을 당량의 1 ㎖ 배양물을 웨스턴 블롯으로 분석함으로써 가시화한다.
반복 시도 및 상이한 클로닝 기법 후에도, 각종 프로모터 서열들의 서브클로닝이 가능하지 않았다. 성공적으로 서브클로닝된 프로모터 서열이 표 12에 요약되어 있다.
실시예 3 프로모터 강도
수가지 프로모터를 동정한 후, 본 발명자들은 추가의 일련의 실험에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 GLP-2 유전자를 포함하는 리포터 작제물을 설계하였다.
인간 프로글루카곤 유전자(유전자은행 승인번호. nr. NM_002054)는 글루카곤-유사 펩티드-2(GLP-2)를 포함하는 4개의 구분된 성숙 펩티드로 절단된 프리프로단백질을 코딩한다. 본 발명자들은 L. 락티스의 우선적 코돈 사용에서 코딩되는 h[Gly2]GLP-2에 대한 유전자를 설계하였다. 이 유전자는 디펩티딜 펩티다제-IV에 의한 분해 감수성을 감소시키는 것으로 나타난, 위치 2에서 알라닌을 글리신으로 치환된 성숙 인간 GLP-2 유사체를 코딩한다(문헌 [Booth et al., 2004]). 합성 유전자를 본질적으로 본원에 참조 인용되는 문헌 [Stemmer et al.(1995)]에 의해 기재된 바와 같은 최신 방법을 이용하여 조립하였다.
생성된 단편을 usp45 분비 신호에 융합하였다(문헌 [van Asseldonk, et al., 1990]). 융합 작제물을 일련의 락토코커스 프로모터들, 즉 P1(문헌 [Waterfield, et al., 1995]), PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터) 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28)의 하류에 위치시켰다.
이 기법은 EcoRI-SpeI 개방 플라스미드 pT1NX 내 P1(pT1 GLP2) 또는 EcoRI-Spel(다른 모든 작제물) 단편에 대한 EcoRI-Xbal로 서브클로닝될 수 있는 단편을 생성시켰다(문헌 [Steidler et al., 1998]; 도 4).
각종 플라스미드들의 개요가 표 5에 나와 있다. 모든 플라스미드들을 서열 확인하였고, 그 후에 그것을 문헌 [Gasson(1983)]에 의한 방법을 이용하여 L. 락티스 MG1363으로 형질전환하였디.
GLP-2 발현 및 분비를 병렬 수득된 각종 균주들로부터의 단백질 추출액에 대해 기록하였다. 간략히, 포화된 배양물을 25배로 희석하여, 적당히 완충된 성장 배지에서 성장시켰고, 로그상 말기에 회수하였다. 당량의 1 ㎖ 배양물을 SDS-PAGE에 로딩하여, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. GLP-2를 다클론성 토끼 항-GLP-2 항체(아브캄(Abcam), 영국 캠브리지 소재)를 이용한 면역블롯팅에 의해 검출하였다. 이차 항체는 알칼리성 포스파타제에 결합된 염소 항-토끼 IgG(서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠(Southern Biotechnology Associates), 미국 알라바마주 버밍엄 소재)였다. NBT/BCIP 기질(로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 스위스 바젤 소재)을 이용하여 효소 활성을 나타냈다.
본 발명자들의 데이터로부터, PhllA 프로모터가 극히 강하다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4 신호 서열의 영향
생산 및 분비를 포함한 발현 수준을 제어하기 위해, 본 발명자들은 28)의 PhllA 프로모터와 함께 처음에 시험한 일련의 usp45 돌연변이체를 작제하였다.
놀랍게도, thy-A-프로모터 및 P1-프로모터 지정 발현 대비, 위치 4에 있는 리신을 아스파라긴으로 교환한 usp45 돌연변이체(usp45 N4)는 h[Gly2]GLP-2 생산 및 분비의 극적 증가를 초래하였다(PhllAN4GLP2)(도 5A). 또한, 이 형질전환체들은 매우 안정적이었다. L. 락티스의 게놈에 통합된 작제물은 또한 생산 및 분비의 실질적 증가를 제공한다. 락토바실러스 카세이 내의 리포터 작제물의 발현은 본질적으로 L. 락티스에서와 동일한 결과를 제공한다.
다음으로, 본 발명자들은 P1-프로모터 및 thyA-프로모터의 하류에 있는 usp45에서의 상기 돌연변이를 도입하여, 플라스미드 pT1N4GLP2 및 pThyAN4GLP2를 각기 생성시켰다. 놀랍게도, 돌연변이는 P1-프로모터에 의해 조절되는 h[Gly2]GLP-2 생산에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았으나, thyA-프로모터의 전사 제어 하에서 h[Gly2]GLP-2 생산을 완전히 파괴하였다(도 5B).
이 데이터로부터, 신호 서열 uspN4과 함께 PhllA 프로모터는 유전자의 발현을 제어하는 데 매우 적합함이 명백하다.
실시예 5 인간 인터루킨-10(hIL-10) 발현에 의해 시험한 프로모터 강도
본 발명자들은 일련의 실험들에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또 한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 합성 hIL-10 유전자에 융합된 usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk et al, 1990]) 앞에 연구 중인 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 생성시킨 리포터 작제물을 설계하였다(실시예 2도 참조). 이 경우, 융합 작제물을 일련의 락토코커스 프로모터들, 즉 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 균주 sAGX0005 및 Thy12), PdpsA 프로모터(DNA-결합 페리틴-유사 단백질, 서열 번호 3, sAGX0012), PpepV(Xaa-His 디펩티다제 프로모터 서열 번호 158, 균주 sAGX0018), PsodA(수퍼옥시드 디스뮤타제 프로모터, 서열 번호 20, sAGX0029) 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 균주 sAGX0037)의 하류에 위치시켰다.
도 3에 나와 있는 바와 같이, 모든 발현 카세트들을 이중 상동 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체의 thyA 유전자위에 통합함으로써 thyA 유전자를 제거하였으나(Thy12의 작제에 적용된 기법(문헌 [Steidler et al., 2003])과 유사한 기법), 헬퍼 플라스미드 pVE6007을 이용하지 않았다. 이에 따라, hIL-10 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 동일하게 된다. 각종 균주 내 hIL-10 발현 카세트의 구조 및 위치의 개요가 도 6에 나와 있다. 여기에 기재된 균주들의 hIL-10 발현 카세트(프로모터, usp45 분비 신호, hIL-10)를 서열 확인하였다.
각종 시험 균주들을 고체 아가 GM17T 플레이트 상의 단일 콜로니로 선상도말하였다. 단일 콜로니를 GM17T에 접종하여, 하룻밤 동안 포화 성장시켰다. 상기 배양물의 적정 희석액을 GM17T 중에서 4시간 동안 예비 성장시켰다. 세균들을 원심분 리에 의해 회수하여, 완충 배양 배지(BM9T) 중에서 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 세균들을 원심분리에 의해 제거하였고, 이 깨끗하게 된 상등액으로부터 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 샘플을 hIL-10에 대해 특이적인 ELISA에 의해 분석하였다. 발현 수준이 도 7에 나와 있다. 모든 데이터가 3개의 개별 측정값들의 평균값으로 나와 있다. 상대 프로모터 강도가 표 6에 나와 있다.
균주들 간의 상이한 성장 특성의 영향을 배제하기 위해, 본 발명자들은 상기 기재된 바와 같은 발현 실험 종료 시에 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하고, 각종 균주들에 대한 109 CFU 당 hIL-10 생산을 계산하였다. 이 실험은, 실질적으로 상이한 성장 속도가 관찰되지 않음과, hIL-10 발현으로부터 판단해볼 때, PhllA가 PthyA보다 대략 4× 강하다는 것을 보여준다(도 8 및 표 7).
본 발명자들의 데이터로부터, PdpsA, PpepV, PsodA 및 PhllA가 극히 강하고, 이종 유전자의 발현을 지정하기 위해 매우 적격이라는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 6 인간 트레포일 인자(TFF) 발현에 의해 시험한 프로모터 강도
잠재적으로 강한 프로모터를 동정한 후, 본 발명자들은 추가의 일련의 실험들에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 합성 hTFF1 또는 hTFF3 유전자에 융합된 야생형(wt) usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk et al., 1990]) 또는 그것의 돌연변이체(mut; 위치 4에 있는 리신이 아스파라긴으로 치환된 Usp45 N4 포함) 앞에 연구 중인 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 발생시킨 리포터 작제 물을 설계하였다. 융합 작제물을 일련의 락토코커스 프로모터들, 즉 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 균주 sAGX0041 및 sAGX0043), PdpsA 프로모터(DNA-결합 페리틴-유사 단백질, 서열 번호 3, 균주 sAGX0059), 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 균주 sAGX0048, sAGX0049 및 sAGX0057)의 하류에 위치시켰다. 도 3에 나와 있는 바와 같이, 모든 발현 카세트들을 이중 상동 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체의 thyA 유전자위에 통합함으로써 thyA 유전자를 제거하였으나(Thy12의 작제에 적용된 기법(문헌 [Steidler et al., 2003])과 유사한 기법), 헬퍼 플라스미드 pVE6007을 이용하지 않았다. 이에 따라, TFF 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 동일하게 된다. 각종 균주 내 TFF 발현 카세트의 구조 및 위치의 개요가 도 9 및 표 8에 나와 있다. 여기에 기재된 균주들의 TFF 발현 카세트(프로모터, 분비 신호, TFF)를 서열 확인하였다.
각종 시험 균주들을 고체 아가 GM17T 플레이트 상의 단일 콜로니로 선상도말하였다. 단일 콜로니를 GM17T에 접종하여, 하룻밤 동안 포화 성장시켰다. 상기 배양물의 적정 희석액을 GM17T 중에서 4시간 동안 예비 성장시켰다. 세균들을 원심분리에 의해 회수하여, 완충 배양 배지(BM9T) 중에서 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 세균들을 원심분리에 의해 제거하였고, 이 깨끗하게 된 상등액으로부터 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 샘플을 hTFF에 대해 특이적인 ELISA에 의해 분석하였다. 발현 수준이 도 10에 나와 있다. hTFF1 발현자 균주로부터의 샘플을 또한 hTFF에 대해 특이적 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(도 11). 모든 데이터가 3개 개별 측정값의 평균값으로 나와 있다. 상대 프로모터 강도가 표 8에 나와 있다.
실시예 4와 일관되게, 도 10의 데이터는 Usp45 N4 돌연변이체가 sAGX0057에 의한 hTFF3의 증진된 발현에 기여하지 않으나, 추가의 발현 조절 수준을 제공함을 보여준다.
hTFF1 및 hTFF3 발현 작제물 앞에 배치된 PdpsA, PpepV 및 PsodA도 또한 PthyA 대비 증진된 발현을 나타낸다.
본 발명자들의 데이터로부터, PdpsA, PpepV, PsodA 및 PhllA가 극히 강하고, 이종 유전자의 발현을 지정하기 위해 매우 적격이라는 결론을 내릴 수 있다
실시예 7 인간 펩티드 YY Gly9 변이체의 아미노산 3-36(hPYY G9(3-36))의 발현에 의해 시험한 프로모터 강도
잠재적으로 강한 프로모터를 동정한 후, 본 발명자들은 추가의 일련의 실험들에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 합성 hPYY G9(3-36) 유전자에 융합된 usp45 분비 신호(문헌 [Asseldonk, et al., 1990]) 앞에 연구 중인 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 발생시킨 리포터 작제물을 설계하였다. 융합 작제물을 일련의 락토코커스 프로모터들, 즉 P1(문헌 [Waterfield et al., 1995])(플라스미드 pAGX0211); PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 플라스미드 pAGX0212), 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 플라스미드 pAGX0213)의 하류에 위치시켰다. 모든 발현 카세트들을 플라스미드 pT1NX 내 EcoRI-SpeI 단편으로서 삽입하였다(문헌 [Schotte et al., 2000]). 이에 따라, 복제 기점 및 에리트로마이신 내성을 포함한 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 상기 플라스미드에 대해 동일하게 된다. 각종 발현 플라스미드의 구조의 개요가 도 12 및 표 9에 나와 있다. 여기에 기재된 균주들의 hPYY 발현 카세트(프로모터, usp45 분비 신호, PYY)를 서열 확인하였다.
빈(empty) 발현 벡터 pT1NX뿐만 아니라 모든 hPYY G9(3-36) 발현 플라스미드를 L. 락티스 MG1363으로 형질전환하였다. 생성된 균주를 고체 아가 GM17T 플레이트 상의 단일 콜로니로 선상도말하였다. 단일 콜로니를 GM17E에 접종하여, 하룻밤 동안 포화 성장시켰다. 상기 배양물의 적정 희석액을 GM17E 중에서 4시간 동안 예비 성장시켰다. 세균들을 원심분리에 의해 회수하여, 완충 배양 배지(BM9E) 중에서 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 세균들을 원심분리에 의해 제거하였고, 이 깨끗하게 된 상등액으로부터 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 샘플을 hPYY에 대해 특이적인 ELISA에 의해 분석하였다. 발현 수준이 도 13에 나와 있다. 상대 프로모터 강도가 표 9에 나와 있다.
합성 hPYY G9(3-36) 유전자에 융합된 usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk et al., 1990]) 앞에 배치된 PdpsA, PpepV 및 PsodA도 또한 PthyA 지정 발현 대비 증진된 발현을 나타낸다.
본 발명자들의 데이터로부터, PdpsA, PpepV, PsodA 및 PhllA가 극히 강하고, 이종 유전자의 발현을 지정하기 위해 매우 적격이라는 결론을 내릴 수 있다
실시예 8 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 Gly8 변이체의 아미노산 7-36(hGLP-1 G8(7-36))의 발현에 의해 시험한 프로모터 강도
잠재적으로 강한 프로모터를 동정한 후, 본 발명자들은 추가의 일련의 실험들에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 합성 hGLP-1 G8(7-36) 유전자에 융합된 usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk et al., 1990]) 앞에 연구 중인 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 발생시킨 리포터 작제물을 설계하였다. GLP-1 Gly8 변이체는 디펩티딜 펩티다제 VI에 의한 단백질분해 절단에 대한 감소된 감수성을 보여준다(문헌 [Deacon et al., 1998]). 융합 작제물을 2개의 락토코커스 프로모터들, 즉 PthyA(티미딜레이트 합성효소 프로모터, 플라스미드 pAGX0233), 및 PhllA(세균 핵양체 DNA-결합 단백질/DNA 결합 단백질 HU의 프로모터; 서열 번호 28, 플라스미드 pAGX0234)의 하류에 위치시켰다. 모든 발현 카세트들을 플라스미드 pT1NX 내 EcoRI-SpeI 단편으로서 삽입하였다(문헌 [Schotte et al., 2000]). 이에 따라, 복제 기점 및 에리트로마이신 내성을 포함한 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 상기 플라스미드에 대해 동일하게 된다. 각종 발현 플라스미드의 구조의 개요가 도 14 및 표 10에 나와 있다. 여기에 기재된 균주들의 GLP-1 Gly8 발현 카세트(프로모터, usp45 분비 신호, GLP-1 Gly8)를 서열 확인하였다. 빈 발현 벡터 pT1NX뿐만 아니라 모든 hGLP-1 G8(7-36) 발현 플라스미드를 L. 락티스 MG1363으로 형질전환하였다. 생성된 균주를 고체 아가 GM17E 플레이트 상의 단일 콜로니로 선상도말하였다. 단일 콜로니를 GM17E에 접종하여, 하룻밤 동안 포화 성장시켰다. 상기 배양물의 적정 희석액을 GM17E 중에서 4시간 동안 예비 성장시켰다. 세균들을 원심분리에 의해 회수하여, 완충 배양 배지(BM9E) 중에서 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 세균들을 원심분리에 의해 제거하였고, 이 깨끗하게 된 상등액으로부터 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 샘플을 hGLP-1에 대해 특이적인 ELISA에 의해 분석하였다. 발현 수준이 도 15에 나와 있다. 상대 프로모터 강도가 표 10에 나와 있다.
실시예 9 인간 인터루킨-10( hIL -10) 발현에 의해 시험한 프로모터 강도
본 발명자들은 추가의 일련의 실험들에서 수개의 프로모터 작제물을 시험하였다. 또한, 프로모터 활성이 리포터 유전자와 무관한지의 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 합성 hIL-10 유전자에 융합된 usp45 분비 신호(문헌 [van Asseldonk et al., 1990]) 앞에 연구 중인 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 발생시킨 리포터 작제물을 설계하였다. 융합 작제물을 일련의 락토코커스 프로모터들의 하루에 위치시켰다(도 16 및 표 11)
모든 발현 카세트들을 이중 상동 재조합에 의해 L. 락티스 MG1363 염색체의 thyA 유전자위에 통합함으로써 thyA 유전자를 제거하였으나(Thy12의 작제에 적용된 기법(문헌 [Steidler et al., 2003])과 유사한 기법), 헬퍼 플라스미드 pVE6007을 이용하지 않았다. 이에 따라, hIL-10 발현 카세트 외부의 모든 DNA 서열들이 동일하게 된다. 각종 균주(통상 "sAGXOOxx"로 표시됨) 내에 존재하는 hIL-10 발현 카세트의 구조 및 위치의 일반화 개요가 도 16에 나와 있다. 여기에 기재된 균주들의 hIL-10 발현 카세트(프로모터, usp45 분비 신호, hIL-10)를 서열 확인하였다.
각종 시험 균주들을 고체 아가 GM17T 플레이트 상의 단일 콜로니로 선상도말 하였다. 단일 콜로니를 GM17T에 접종하여, 하룻밤 동안 포화 성장시켰다. 상기 배양물의 적정 희석액을 GM17T 중에서 4시간 동안 예비 성장시켰다. 세균들을 원심분리에 의해 회수하여, 완충 배양 배지(BM9T) 중에서 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 세균들을 원심분리에 의해 제거하였고, 이 깨끗하게 된 상등액으로부터 샘플을 분석을 위해 수집하였다. 샘플을 hIL-10에 대해 특이적인 ELISA에 의해 분석하였다. 발현 수준이 도 17에 나와 있다. 모든 데이터가 3개의 개별 측정값들의 평균값으로 나와 있다. 상대 프로모터 강도가 표 11에 나와 있다.
계획한 단백질체학 분석 및 전사체 분석과 대조적으로, 이종 유전자의 발현을 지정하는 특정 프로모터의 강도 및 적격성은 예상치 못한 상태로 남았다.
Figure 112009042065156-pct00003
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Figure 112009042065156-pct00005
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Figure 112009042065156-pct00007
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Figure 112009042065156-pct00009
10× M9 염은 리터 당, 60 g의 Na2HPO4, 30 g의 KH2PO4, 10 g의 NH4Cl, 5 g의 NaCl으로 됨.
Figure 112009042065156-pct00010
Figure 112009042065156-pct00011
표시된 균주로부터의 hIL-10 발현을 측정함으로써 평가할 때의 각종 시험 프로모터들의 상대 강도. [2]: 문헌 [Steidler et al ., 2003].
Figure 112009042065156-pct00012
콜로니 형성 단위(CFU)와 함수 관계인 상대 프로모터 강도.
Figure 112009042065156-pct00013
본 연구에 사용된 각종 TFF 발현자 균주들 및 표시된 균주로부터의 분비된 TFF의 상대 발현 수준의 개요.
Figure 112009042065156-pct00014
본 연구에 사용된 각종 hPYY G9(3-36) 발현자 균주 및 표시된 플라스미드로부터의 분비된 hPYY G9(3-36)의 상대 발현 수준의 개요. 모든 플라스미드들이 L. 락티스 MG1363 내에 존재함. [3]: 문헌 [Schotte et al ., 2000].
Figure 112009042065156-pct00015
본 연구에 사용된 각종 hGLP-1 G8(7-36) 발현자 균주들 및 표시된 플라스미드로부터의 분비된 hGLP-1 G8(7-36)의 상대 발현 수준의 개요. 모든 플라스미드들이 L. 락티스 MG1363 내에 존재함. [3]: 문헌 [Schotte et al ., 2000].
Figure 112009042065156-pct00016
표시된 균주로부터의 hIL-10 발현을 측정함으로써 평가할 때의 각종 프로모터들의 상대 강도.
Figure 112009042065156-pct00017
참조문헌
Figure 112009042065156-pct00018
Figure 112009042065156-pct00019
SEQUENCE LISTING <110> ACTOGENIX N.V. <120> Lactococcus promoters and uses thereof <130> AGX-013-PCT <140> PCT/EP2008/050352 <141> 2008-01-14 <150> EP 07447001.4 <151> 2007-01-12 <150> EP 07120653.6 <151> 2007-11-14 <160> 185 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 1 gattttgtaa ttaatatttg gagagggatt tactgacaaa aattctgtca gtaaatctct 60 aatctcaaaa tcgtctagcg ttaaatttat tagaagtgga gaaagaattg 110 <210> 2 <211> 318 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 2 gttcagaaac tgcctgatgg gctagataag ccttgaaaat ttctacaata aatagtataa 60 tagaaataat ggtttgtcag caaaatctgt gggatatatt gtccccatag gctttgtaag 120 caacgaaaca ctactgtttt cgttgctttt ttggcgtctt ttatattgaa taaatcagaa 180 aagttattaa aaagacaaac tactgaattt tcggtttttt taattaaaaa ttcatcaaaa 240 acacagactt ttttaatcaa atctaaaaaa tagaggagaa aacacttgaa aaaaaagatt 300 atctcagcta ttttaatg 318 <210> 3 <211> 139 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 3 actaatctat acgaaaattg attttgaatg taactaaaaa tggaattaaa 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<211> 123 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 8 caaataaaaa gaactgatgt gagaaaatct cacattgaag cttgactttg cgaaagacaa 60 ggtctataat gatacgtatg gaggcgagat ttggtgaaag aacgtgaatt aagacgctct 120 atg 123 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 9 gttcagaaac tgcctgatgg gatattatct ttatcctcct tatatataat ctttttaaat 60 agtattttca gaataacata ataacctgta acaaggtagg taattaagat gccaataaaa 120 gctcgttatt agtgcagttt ttgaaacaat ataaaatgac tacctaataa ctgtgatact 180 tatttgagta aaatattttg aagggaaatt tactgatgaa agtggttaag aaaagttact 240 ttaattcata tttattagta cttattgcac catgttgagt aactatgata caatagataa 300 atatactact tcaaggagaa gattatgaaa aaaaagatta tctcagctat tttaatg 357 <210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 10 aaatgaatag aaattctgtt gttagacaga aaataaaaac aggaggaaaa acattg 56 <210> 11 <211> 204 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 11 gttgcttagc aaagctcaaa aaatctgtca gtaaaaataa aatcaagaat cttgtaaaag 60 taacccttta caagctaaaa gtaaaattct caaagccaaa atatccgaat ttgtgatata 120 attaacctat cgatttgaat tgaatcagca tggtgctttt tcaatctcaa caaaattatc 180 ttataaggag aatttttcca aatg 204 <210> 12 <211> 329 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 12 gttcagaaac tgcctgatgg gaataaaaat tactgtcagc ctgctcagta atttttttag 60 tcatattttt aggtggaaag tcaaagatta ttgccaaaag tattagcttt tttaatgtta 120 accgctttca ggagaagggg agttcatttg cttttgtaga gcgctttcta aggtagttta 180 tgtttgcaaa ttttaaaaaa agtgttaaaa taaaagagta agttaaattg ttaacttagt 240 caatttaaaa ggtttgcctt ttataaaatc taatccctat aaggaggaaa ctactaatga 300 aaaaaaagat tatctcagct attttaatg 329 <210> 13 <211> 190 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 13 aaataaaaaa ttattggcta gtctgtcagt aattttttat tgtataaaat cattaaaaat 60 gcaaacgctt tttatttgta attgaaataa aaaaataacc aagtgaatca tggctgaaaa 120 acacaaaaga aattgtaatt gtgttataat ttaaccgtat ttcaaattca aggaaggttt 180 attaaacatg 190 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 14 attgctcatt tataaatttt gaaattaaga aggataaaaa tatg 44 <210> 15 <211> 136 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 15 ggagaaagga attgagttcg tccttctaaa cagtcagcaa taatctgaca tcagagatat 60 cagattattg ctgtccttga agtctaagca ctaaagtgct aagaccctaa ggcgggctca 120 catcttataa ataatg 136 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 16 ttagtcactc ttgtcactaa tcacttttcg ctttagagga gaacatacat g 51 <210> 17 <211> 210 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 17 ctatcctctt tcttttcttt ttattcatag tatttatgaa aaccattttc atttacaaat 60 tatatcatga actgtaaacc ttttcaacct tcaagtgtgt ttttttacgt gatttttcaa 120 taaaaatagc gtagaatggg tatataatgt tttttatttt caggagaatt tagaaaactt 180 attttcatta atattggagg aaccattttg 210 <210> 18 <211> 210 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 18 gttcagaaac tgcctgatgg gataagatta atagttttag ctattaatct ttttttattt 60 ttatttaaga atggcttaat aaagcggtta ctttggattt ttgtgagctt ggactagaaa 120 aaaacttcac aaaatgctat actaggtagg taaaaaaata ttcggaggaa ttttgaaatg 180 aaaaaaaaga ttatctcagc tattttaatg 210 <210> 19 <211> 213 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 19 gcttttcttg acaaaataag gatttttggt ataatagaaa agttgaatat agcagtcagc 60 tagaaagctc gtcaacattt tgctgttatg tcaaggaaga taagtcatta tgttccttgt 120 gtcaagtaac tgaagctata agcgaaggca aaatgaacga attcgaggct gtcaatattc 180 ttcaaataaa atatttggag gacataaatt atg 213 <210> 20 <211> 151 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 20 aaatcaaatc atttggcaat gatttcaaaa acgactataa tgagaataga attaaaaaat 60 aatctaactg aattccattc tcaatctggt caaaataccc aagtattaag acttcaaaat 120 ggattcacat cttaaaagga gaattactat g 151 <210> 21 <211> 448 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 21 gttcagaaac tgcctgatgg ctcaaaatat aagcttaatc gctttttaaa aaaggattga 60 aagtaaaaaa tagattgaca atcactgtaa aaaatgatat tatattaaac ggtacttttt 120 actttggact ctcaggagaa cttgtataag ttgctaaact tcttgtcaga acttggctta 180 agcgaccata tactgactaa aaaattgata aaagaaattg agttcgattt cccatattct 240 aggaaaatag acaaatgttt ccaaggaact tcgttcctct ccaacgtttt ctaattttct 300 acgaatataa acggtcaatc tcacatctta aatcatccaa taaaaagaaa ggaatgcttt 360 tgtatttctc atcgcttcgc 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gattatctca gctattttaa tg 212 <210> 25 <211> 264 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 25 taaatcataa aacctctgtc agaggttttt tattttaaat atgaaaaatg aaagataaaa 60 tttactgaca gaaaagtcaa caagcttaaa aataaaaaga aacacccgaa agcattgcca 120 taggtactct tatcagataa tctgaaaata aaaatgttgc atttgttgtt gaaaaatgct 180 aaaatacata agtccgactt tttagatata tttaaatttg tatttatatc tttcgggaaa 240 tttttaagga ggtacttttg cttg 264 <210> 26 <211> 306 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 26 gttcagaaac tgcctgatgg aatagaagat atttttcagt agatatagat taataaaaga 60 taaatagatt tcaaagtaag tttatccttg catttctaaa aaaactttga tatacttatt 120 tacggttcta aaagaactga ccgaagacag taggggacga aagtcataaa cttcctaccg 180 aggacaaata tcaaaatgat aattgaactc tctatgtctt ttgtgtgtag agattttttg 240 tttctacaac caaaataaaa tggaggtaaa aaaatgaaaa aaaagattat ctcagctatt 300 ttaatg 306 <210> 27 <211> 122 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 27 aagaagaatc agctgcttaa ttataagcaa catcacttat atcggcggat ttacgcaaca 60 aactaaaaaa ttaataggag aatattaaaa tggcattgaa cattgaaaac atcgttgctg 120 aa 122 <210> 28 <211> 107 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 28 aaaacgcctt aaaatggcat tttgacttgc aaactgggct aagatttgct aaaatgaaaa 60 atgcctatgt ttaaggtaaa aaacaaatgg aggacatttc taaaatg 107 <210> 29 <211> 93 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 29 caaaagcttg atttttttat ttgaaaaatg ttataatcaa caagtatgtt gtttttaagc 60 acataaaaat tctaatggga ggtaaatata atg 93 <210> 30 <211> 295 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 30 gttcagaaac tgcctgatgg taaatttgtt ccaaatgaag aaacaaatat ttcaaaatcc 60 tactatttga tagtaggatt tttaatatat tagtccaaaa gctcaaaaag gctgatttaa 120 agcagatgag tagacttttc aattattttg taaagcactt tcaaaaaaat agataacgct 180 tgcattatga aaatgaaaac gttataatta tttttataaa gaacgttaaa ttataaaacg 240 ttaagaataa ggagaaataa ttatgaaaaa aaagattatc tcagctattt taatg 295 <210> 31 <211> 190 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 31 tcaggataga aaaattttct tcctttgtta aaaacttagt ggagaatttt tcaaactcaa 60 aatgttaaac ttttgaaaac atgcaaaggt aattttaaaa cttgcttatt catgctcaaa 120 aagtataact gcagtttaaa gctaaatagc cttgaactag taaaaatttc tagaagggag 180 catatttttg 190 <210> 32 <211> 225 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 32 taaatgataa aagttgctga cagagttgtc agtgactttt tttgatgctg tcagcaaaaa 60 gaaaagataa ttttaaattt atgaataaga gtgtggttta attgctagcc tgtcagtaat 120 ttgtgcaaac tgcccaaaag atttaggcac ttatcttatt gtttttagaa aacgtttaca 180 gtagaatata aacaaagaac aaaagttact agaggagaaa taatg 225 <210> 33 <211> 91 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 33 cttatttcac aagcataacc ttaggaaatt tctccaaaaa atgataaatt tctaattata 60 gacacataaa aaagaaaggg aatctattat g 91 <210> 34 <211> 165 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 34 tttaataaaa aactgaaaaa atcacagcta aactcttgtt ttactgtgat tttatgttaa 60 aataattaat gagtgtaatt gtatataaaa ttatctgtac acttaactaa tttattaaaa 120 aaaaatatga atcgtgatgt gtgagggaaa ggagtcgctt ttatg 165 <210> 35 <211> 79 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 35 actaatttaa ttaccagtaa aaatcacttg ttattaagtt aaaggttgag tttcaaaaga 60 tgaaagttag gaaaaattg 79 <210> 36 <211> 105 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 36 atggaaattt taacatattt cttggtataa ttatagtgta aatcatcaaa agaattactg 60 acagatttgt cagtaaattt ttcagtatcc cggaggagaa aaatg 105 <210> 37 <211> 201 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 37 aattcgctca cttaccgcac gaagcaattt taaactatca acgtttttag attacaacac 60 ttaatcattt ccttttgtaa ggaatttaat aggttaattt ttactgacag ttctgtcagt 120 aaattttcgt acgtcaaatc tacttagaaa ggaactgaat tcagtgagta atttacttgc 180 tgaatcgtat ttaatcttat g 201 <210> 38 <211> 398 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 38 atttctctcc tcacaaacta ttttatttac tataattatt ttatcacaaa aaaagcgttt 60 tcagcaaaaa tattaatttt attcttagaa aaaaatgcaa aaatctccct taaggggatt 120 atattggcaa aaatattagt taaatttgtc agataacatt gagatataaa aaacagaata 180 aaaagaaagt ggagtaggat agctttcact tactcatatt gataaaagaa ataaatgaat 240 agatgcttgc aaaagtagct taaacaatgt ataatgagag agttgctatg caaccatctc 300 gcatttcgtc tcgacaaagt cgtagtgtac gcaagtattg cggctgcgga tgacagatga 360 aagaggaaaa actattttaa aaggagacat taatatgt 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ttcacgttac caccgtcgtc ctggttcaat gggtcctgtt gcagctaaca aagttccaaa 480 aggtaaaaaa cttgctggac gtatgggtaa caaacgcgtt actgtacaaa accttgttat 540 tgcacaagtg cttcctgaaa agaacgttat ccttgtaaaa ggtaatgtcc caggtgctaa 600 gaaatcattg attgttgtta aatcagcaat caaagctaaa taagaaggaa aggagataga 660 aatctataat g 671 <210> 41 <211> 108 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 41 gactgatttc ttgaggtaaa atggagtcaa atactgacca ttgataaatc cagaaatata 60 ttctataata atcactgtta agaaattaaa agggaaaatt taaaaatg 108 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 42 agtatgattg attttgattt aactaaaaag aaaagtttat aataaaagga aagaaataaa 60 atg 63 <210> 43 <211> 138 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 43 aacacataaa agtgaggcat cagcctcact tttatgaata ttttcttttt atttgtaaaa 60 gtttaaaaga acggttacaa ttataaaaag aaaaatttaa ttattgagcg agagctaatc 120 ataaggagaa caaatttg 138 <210> 44 <211> 199 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 44 gccataatta taacaaattt gaaagcgtta agaaagttta aactcttttt ttaataattt 60 tagtaaaagt tgctaaaaaa aaacaatttt ctttgacctt ttttgaccaa tgagttataa 120 tatagaaaaa taaacaattg aacttaattt attcctaaat tgagtccata tcttatttat 180 aaaggagatt cattctatg 199 <210> 45 <211> 285 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 45 ataaaataac aatcctatct ttactgatag gatttttttc cttaaaaaat ccgtcagtaa 60 tttaaaaact tgtaaatttt atctcaccaa ttcaaaagat aactttagaa ttgtaaaatg 120 caggacaaac gaggaaatgg cttgtaattc caatcgaaaa atagtaaaat aataggagtc 180 tgttaataga caaataaata tattgaagta tcggcgagtt taattttcac gttccttaca 240 tgaaaattag gcgacagcaa ggtacaaaat aaggagaaaa aaatg 285 <210> 46 <211> 120 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 46 gagtgctctt ttttggatat aatactcggg tatgtgaatt ttcacatata aggcgtggaa 60 gctgtaaaat acagcatcat accacatcac gaaaacaaaa tataaggaga atttatcgtg 120 <210> 47 <211> 138 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 47 ttgtaaagaa aaatgttgac agagtgcgga acttctgcta tactaattaa gttcggtctt 60 tttatgaaaa agacctcatt aatttgaaag tgggatttga acaagcccaa actacaaata 120 aggagaaatt acactatg 138 <210> 48 <211> 157 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 48 aaaagaagta gtataataat atagttgtct ttgtgaaatc tcataaagtg caaccgcacg 60 aagtttcgta ataagtggcg taagcccacg aacaaaggcg agtctaacag tcgcttgact 120 taaaagcgat gaaatctaac aaggaggaat cacaatg 157 <210> 49 <211> 290 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 49 ctgtcagagg ttttttattt taaatatgaa aaatgaaaga taaaatttac tgacagaaaa 60 gtcaacaagc ttaaaaataa aaagaaacac ccgaaagcat tgccataggt actcttatca 120 gataatctga aaataaaaat ggactcaggc tagaaaaata aaggctttta tgaaagaaag 180 acttgcattt gttgttgaaa aatgctaaaa tacataagtc cgacttttta gatatattta 240 aatttgtatt tatatctttc gggaaatttt taaggaggta cttttgcttg 290 <210> 50 <211> 141 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 50 gagccttctc ggcgtcttgt taaatttgat aaaacttatt atcaaattta atgagatgtc 60 gaaagtgcat ctataaattc cgccaactcc gccttagtag cggcagtggt acaaatattt 120 aaaggagaaa ctcgcaaaat g 141 <210> 51 <211> 569 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 51 atgacgaaat tgataacatc gtttaagaaa gctccgtaag taaatttagt cttaccaaca 60 gttactgata agtgggcaag agcgctgctt tggacgaaca ttccaatcaa agggttaatc 120 aaattatcaa ccaaagattt aactaaagca gtaaaagctg ccccgatgat aaccccaacg 180 gccaagtcta agacattgcc acgcaaaata aagtttttaa attcctttaa cataaatcct 240 cctatataaa tagtttataa aacctttaat caaattatat caaaaagttt aaagatgaca 300 aagtgtgggt tcttgtcttt ttcagtaaat tcattgattt tatttaaaat tttaaaagat 360 atataaaaag aactggaaag aataaaaaaa gtctaaaaag tccttgacaa ggcacatctc 420 ctttgataga atagacaagt gctgttaaaa acagtatgta gcgacgaaac gagaggttgc 480 gacacacccg aaggtattgc catacctaac gtgtcggttt tcccgtggag ctagcctatt 540 gaatacaata gacgagagga gaaaaaatg 569 <210> 52 <211> 110 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 52 aaatctaaat gttttctctt gactaaatct gaccattgag ataaaataag aatatgttag 60 cacacaacta ttaagagtgc taaaaataaa aaatggagta aagtataatg 110 <210> 53 <211> 119 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 53 atggttttgt cggaaaaatt ttttgacaga gtcatatttt actgttatta ttaacagaat 60 agtcccctga tagtaaaata tgagggtgcc catcgggcgt aagaaaggaa ataaacatg 119 <210> 54 <211> 274 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 54 tatttggtga tttttcaaat tagaattcat attttattta aaagtctttt ctaaagactt 60 ttgtttactt tactagagaa aacggttgaa ttcaggcaaa aaataacgta taattaacat 120 gtatctaaga aatttttaat gagatatttc tgtcagtatt agaaaatgta aagttctcta 180 aagatgagaa agttaagtaa ctgacagaag tgaaattatt agtttttagt ttgatctggc 240 tttttacaga taaatttaaa ggaggtgtct tatg 274 <210> 55 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 55 gttcagaaac tgcctgatgg attttgtaat taatattttg agatttattt actgac 56 <210> 56 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 56 cattaaaata gctgagataa tctttttttt caattctttc tccacttcta ataaatttaa 60 c 61 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 57 gttcagaaac tgcctgatgg gctagataag ccttgaaaat ttc 43 <210> 58 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 58 cattaaaata gctgagataa tctttttttt caagtgtttt ctcctctatt ttttag 56 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 59 ggttcagaaa ctgcctgatg gactaatcta tacgaaaatt gattttgaat g 51 <210> 60 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 60 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cataactaac ctccattttt taaatatta 59 <210> 61 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 61 gttcagaaac tgcctgatgg ctaagttact gcaaatctgt ttc 43 <210> 62 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 62 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttgtgt ttttctccta taatg 55 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 63 gttcagaaac tgcctgatgg gataaatttc actgacgcaa gc 42 <210> 64 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 64 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttaatc caattctcct cattg 55 <210> 65 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 65 gttcagaaac tgcctgatgg aaattaagga tagatttttt ctatcctttt tc 52 <210> 66 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 66 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttagtc tccttattat ttttaagtgc 60 g 61 <210> 67 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 67 gttcagaaac tgcctgatgg atttggttga cataatttgt caag 44 <210> 68 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 68 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catgctttac tctcctagtt aaattttc 58 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 69 gttcagaaac tgcctgatgg caaataaaaa gaactgatgt gagaaaatc 49 <210> 70 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 70 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catagagcgt cttaattcac g 51 <210> 71 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 71 gttcagaaac tgcctgatgg gatattatct ttatcctcct tatatataat c 51 <210> 72 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 72 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cataatcttc tccttgaagt ag 52 <210> 73 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 73 gttcagaaac tgcctgatgg ttactgtcaa acattattct caatgttac 49 <210> 74 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 74 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catttttaag ctaatcagta aaaatttac 59 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 75 gttcagaaac tgcctgatgg gttgcttagc aaagctc 37 <210> 76 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 76 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catttggaaa aattctcctt ataag 55 <210> 77 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 77 gttcagaaac tgcctgatgg gaataaaaat tactgtcagc ctgc 44 <210> 78 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 78 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattagtagt ttcctcctta taggg 55 <210> 79 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 79 gttcagaaac tgcctgatgg aaataaaaaa ttattggcta gtctgtcag 49 <210> 80 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 80 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catgtttaat aaaccttcct tgaatttg 58 <210> 81 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 81 gttcagaaac tgcctgatgg attgctcatt tataaatttt gaaattaaga agg 53 <210> 82 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 82 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catattttta tccttcttaa tttcaaaatt 60 tataaatg 68 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 83 gttcagaaac tgcctgatgg ggagaaagga attgagttcg 40 <210> 84 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 84 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattatttat aagatgtgag ccc 53 <210> 85 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 85 gttcagaaac tgcctgatgg ttagtcactc ttgtcactaa tcac 44 <210> 86 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 86 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catgtatgtt ctcctctaaa gcg 53 <210> 87 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 87 gttcagaaac tgcctgatgg ctatcctctt tcttttcttt ttattcatag 50 <210> 88 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 88 cattaaaata gctgagataa tctttttttt caaaatggtt cctccaatat taatg 55 <210> 89 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 89 gttcagaaac tgcctgatgg gataagatta atagttttag ctattaatc 49 <210> 90 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 90 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catttcaaaa ttcctccgaa ta 52 <210> 91 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 91 gttcagaaac tgcctgatgg gcttttcttg acaaaataag gatttttg 48 <210> 92 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 92 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cataatttat gtcctccaaa tattttattt 60 g 61 <210> 93 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 93 gttcagaaac tgcctgatgg aaatcaaatc atttggcaat gatttc 46 <210> 94 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 94 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catagtaatt ctccttttaa gatgtg 56 <210> 95 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 95 gttcagaaac tgcctgatgg ctcaaaatat aagcttaatc gc 42 <210> 96 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 96 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttactg tctgcttttt atatttttcc 60 <210> 97 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 97 gttcagaaac tgcctgatgg gcgtcgggct tgcg 34 <210> 98 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 98 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cacaattcta cctctatatt attttaaatt 60 tc 62 <210> 99 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 99 gttcagaaac tgcctgatgg ctacaaacgc tttactgaaa acg 43 <210> 100 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 100 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cataaaatat atgatacaaa actcagc 57 <210> 101 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 101 gttcagaaac tgcctgatgg cagcattaag ataaagagtt atgagc 46 <210> 102 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 102 cattaaaata gctgagataa tctttttttt catttttttc tcctcttgcc c 51 <210> 103 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 103 gttcagaaac tgcctgatgg taaatcataa aacctctgtc agagg 45 <210> 104 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 104 cattaaaata gctgagataa tctttttttt caagcaaaag tacctcctta aaaatttc 58 <210> 105 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 105 gttcagaaac tgcctgatgg aatagaagat atttttcagt agatatag 48 <210> 106 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 106 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttttta cctccatttt attttgg 57 <210> 107 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 107 gttcagaaac tgcctgatgg ttataagcaa catcacttat atcgg 45 <210> 108 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 108 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttaata ttctcctatt aattttttag 60 <210> 109 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 109 gttcagaaac tgcctgatgg aaaacgcctt aaaatggcat tttg 44 <210> 110 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 110 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattttagaa atgtcctcca tttg 54 <210> 111 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 111 gttcagaaac tgcctgatgg caaaagcttg atttttttat ttgaaaaatg 50 <210> 112 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 112 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cattatattt acctcccatt agaattttta 60 tg 62 <210> 113 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 113 gttcagaaac tgcctgatgg taaatttgtt ccaaatgaag aaacaaata 49 <210> 114 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 114 cattaaaata gctgagataa tctttttttt cataattatt tctccttatt cttaacg 57 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 115 aaattaagga tagatttttt 20 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 116 ataataatga aaaaggatag aaaaaatcta tccttaattt 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 117 ctatcctttt tcattattat tcaaatgata aaatttcaaa 40 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 118 aaaaggtttt gcgcttacat tttgaaattt tatcatttga 40 <210> 119 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 119 atgtaagcgc aaaacctttt gaagtttagg tttgcgaaga 40 <210> 120 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 120 aaagattttt caagtgaaaa tcttcgcaaa cctaaacttc 40 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 121 ttttcacttg aaaaatcttt caaaaaatag taaaatcaaa 40 <210> 122 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 122 gtctgcactc ttaatacatc tttgatttta ctattttttg 40 <210> 123 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 123 gatgtattaa gagtgcagac gcacttaaaa ataataagga gactaaaatg 50 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 124 cattttagtc tccttattat ttttaagtgc 30 <210> 125 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 125 agagggttca gaaactgcct gatgggataa gattaatagt 40 <210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 126 tttagctatt aatctttttt tatttttatt taagaatggc 40 <210> 127 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 127 ttaataaagc ggttactttg gatttttgtg agcttggact 40 <210> 128 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 128 agaaaaaaac ttcacaaaat gctatactag gtaggtaaaa 40 <210> 129 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 129 aaatattcgg aggaattttg aaatgaaaaa aaagattatc 40 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 130 tcagctattt taatgtctac 20 <210> 131 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 131 gtagacatta aaatagctga gataatcttt tttttcattt 40 <210> 132 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 132 caaaattcct ccgaatattt ttttacctac ctagtatagc 40 <210> 133 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 133 attttgtgaa gtttttttct agtccaagct cacaaaaatc 40 <210> 134 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 134 caaagtaacc gctttattaa gccattctta aataaaaata 40 <210> 135 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 135 aaaaaagatt aatagctaaa actattaatc ttatcccatc 40 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 136 aggcagtttc tgaaccctct 20 <210> 137 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 137 gggttcagaa actgcctgat ggtaaatttg ttccaaatga 40 <210> 138 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 138 agaaacaaat atttcaaaat cctactattt gatagtagga 40 <210> 139 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 139 tttttaatat attagtccaa aagctcaaaa aggctgattt 40 <210> 140 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 140 aaagcagatg agtagacttt tcaattattt tgtaaagcac 40 <210> 141 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 141 tttcaaaaaa atagataacg cttgcattat gaaaatgaaa 40 <210> 142 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 142 acgttataat tatttttata aagaacgtta aattataaaa 40 <210> 143 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 143 cgttaagaat aaggagaaat aattatgaaa aaaaagatta 40 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 144 tctcagctat tttaatgtct 20 <210> 145 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 145 agacattaaa atagctgaga taatcttttt tttcataatt 40 <210> 146 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 146 atttctcctt attcttaacg ttttataatt taacgttctt 40 <210> 147 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 147 tataaaaata attataacgt tttcattttc ataatgcaag 40 <210> 148 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 148 cgttatctat ttttttgaaa gtgctttaca aaataattga 40 <210> 149 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 149 aaagtctact catctgcttt aaatcagcct ttttgagctt 40 <210> 150 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 150 ttggactaat atattaaaaa tcctactatc aaatagtagg 40 <210> 151 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 151 attttgaaat atttgtttct tcatttggaa caaatttacc 40 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 152 atcaggcagt ttctgaaccc 20 <210> 153 <211> 155 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 153 tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60 ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120 atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tcatg 155 <210> 154 <211> 56 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 154 tccggacatt cattgagtgc atgatgcaca gtaaccatag aaaggaagac acaatg 56 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 155 tggatatttt ttataaatct gg 22 <210> 156 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer, based on Lactococcus lactis <400> 156 catgaaattt tcctatcttt tttaattc 28 <210> 157 <211> 268 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 157 gctagataag ccttgaaaat ttctacaata aatagtataa tagaaataat ggtttgtcag 60 caaaatctgt gggatatatt gtccccatag gctttgtaag caacgaaaca ctactgtttt 120 cgttgctttt ttggcgtctt ttatattgaa taaatcagaa aagttattaa aaagacaaac 180 tactgaattt tcggtttttt taattaaaaa ttcatcaaaa acacagactt ttttaatcaa 240 atctaaaaaa tagaggagaa aacacttg 268 <210> 158 <211> 327 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 158 gttcagaaac tgcctgatgg gatattatct ttatcctcct tatatataat ctttttaaat 60 agtattttca gaataacata ataacctgta acaaggtagg taattaagat gccaataaaa 120 gctcgttatt agtgcagttt ttgaaacaat ataaaatgac tacctaataa ctgtgatact 180 tatttgagta aaatattttg aagggaaatt tactgatgaa agtggttaag aaaagttact 240 ttaattcata tttattagta cttattgcac catgttgagt aactatgata caatagataa 300 atatactact tcaaggagaa gattatg 327 <210> 159 <211> 180 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 159 aaccgctttc agaagaaggg gagttcattt gcttttgtag agcgctttct aaggtagttt 60 atgtttgcaa attttaaaaa aagtgttaaa ataaaagagt aagttaaatt gttaacttag 120 tcaatttaaa aggtttgcct tttataaaat ctaatcccta taaggaggaa actactaatg 180 <210> 160 <211> 167 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 160 tgtcagtaat tttttattgt ataaaatcat taaaaatgca aacgcttttt atttgtaatt 60 gaaataaaaa aataactaag tgaatcatgg ctgaaaaaca caaaagaaat tgtaattgtg 120 ttataattta accgtatttc aaattcaagg aaggtttatt aaacatg 167 <210> 161 <211> 127 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 161 ggagaaagga attgagttcg tccttctaaa cagtcaacga taatctgaca tcagattatt 60 gctgtccctg aagtctaagc actaaagtgc taagacccta gggcgggctc acatcttata 120 aataatg 127 <210> 162 <211> 210 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 162 ctatcctctt tcttttcttt ttattcatag tatttatgaa aaccattttc atttacaaat 60 tatatcatga actgtaaacc ttttcaacct tcaagtgtgt ttttttacgt gatttttcaa 120 taaaaatagc gtagaatgga tatatagtgt tttttatttt caggagaatt tagaaaactt 180 attttcatta atattggagg aaccattttg 210 <210> 163 <211> 160 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 163 gataagatta atagttttag ctattaatct ttttttattt ttatttaaga atggcttaat 60 aaagcggtta ctttggattt ttgtgagctt ggactagaaa aaaacttcac aaaatgctat 120 actaggtagg taaaaaaata ttcggaggaa ttttgaaatg 160 <210> 164 <211> 433 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 164 tcaaaatata ggcttaatcg ctttttaaaa aaggattgaa agtaaaaaag gaatgccagt 60 tcctttttta caactattct aaaaaataga ttgacaatca ctataaaaaa tgatattata 120 ttaaacggta ctttttactt tggactctca ggagaacttg tataagttgc taaacttctt 180 gtcagaactt ggcttaagcg accatatact gactaaaaaa ttgataaaag aaattgagtt 240 cgatttccca tattctagga aaatagacaa atgtttccaa ggaacttcgt tcctctccaa 300 cattttctaa ttttctacga atataaacgg tcaatctcac atcttaatca tccaataaaa 360 agaaaggaat gcttttgtat ttctcatcgc ttcgcagaaa tgtggaaaaa tataaaaagc 420 agacagtaaa atg 433 <210> 165 <211> 271 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 165 tttttgcgtt gggcttgcgt cgttagcttt tgctttacat acgtcagtac gcttcagcat 60 ggacttcgtc ctaaaagctg cctagcaatc ctttagcaaa aaatgttatc cgtaattggt 120 ggtttgattt aggtcaaatt gccagtattt tgtcaatgct aactttgtta gacagacaaa 180 aactccccgc ttgctgatta ttttattaat cagtaagaaa atcgatggca aaaactatcg 240 aaatttaaaa taatatagag gtagaattgt g 271 <210> 166 <211> 170 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 166 ctacaaacgc tttactgaaa acgctataag gtcattttac cactttataa taaaaaaaaa 60 aaaatatttc gcttaaaaaa tgatagaata gaattagaat ttaaaataaa ggaggagata 120 ctgacaaggc tgacttttat cggctgagtt ttgtatcata tatttttatg 170 <210> 167 <211> 162 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 167 cagcattaag ataaagagtt atgagctaaa aataagcact tgtcaaactt ctgataatct 60 gttatactta tttagtatgt ttttgcatac taataaaact gttcatccgc tgagcttaat 120 ttgctaaaag ctgcttatga tgggcaagag gagaaaaaaa tg 162 <210> 168 <211> 305 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 168 taaatcataa aacctctgtc agaggttttt tattttaaat atgaaaaatg aaagataaaa 60 tttactgaca gaaaagtcaa caagcttaaa aataaaaaga aacacccgaa agcattgcca 120 taggtactct tatcagataa tctgaaaata aaaatggact caggctagaa aaataaaggc 180 ttttatgaaa gaaagacttg catttgttgt tgaaaaatgc taaaatacat aagtccgact 240 ttttagatat atttaaattt gtatttatat ctttcgggaa atttttaagg aggtactttt 300 gcttg 305 <210> 169 <211> 245 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 169 tttttcagta gatatagatt aataaaagat aaatagattt caaagtaagt ttatccttgc 60 atttctaaaa aaactttgat atacttattt atggttctaa aagaactgac cgaagacagt 120 aggggacgaa agtcataaac ttcctaccga ggacaaatat caaaatgata attgaactct 180 ctatgtcttt tgtgtgtaga gattttttgt ttctacaacc aaaataaaat ggaggtaaaa 240 aaatg 245 <210> 170 <211> 72 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 170 ttataagcaa catcacttat atcggcggat ttacgcaaca aactaaaaaa ttaataggag 60 aatattaaaa tg 72 <210> 171 <211> 244 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 171 taaatttgtt ccaaatgaag aaacaaatat ttcaaaatcc tactatttga tagtaggatt 60 tttaatatat tagtccaaaa gctcaaaaag gctgatttaa agcagatgag tagacttttc 120 aattattttg taaagcactt tcaaaaaata gataacgctt gcattatgaa aatgaaaacg 180 ttataattat ttttataaag aacgttaaat tataaaacgt taagaataag gagaaataat 240 tatg 244 <210> 172 <211> 191 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 172 tcaggataga aaaattttct tcctttgtta aaaacttagt ggagaatttt tcaaactcaa 60 actgttaaac ttttgaaaac atgcaaaggt aattttaaaa cttgcttatt catgctcaaa 120 aagtataact gcagtttaaa gctaaatagc cttgaactag taaaaaattt ctagaaggga 180 gcatattttt g 191 <210> 173 <211> 222 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 173 atgataaaag ttgctgacag agttgccagt gacttttttt gattctgtca gcaaaaagaa 60 aagataattt taaaattgtg aataagcgtg tggtttaatt gctagcctgt cagtaatttg 120 tgcaaactgc ccaaaagatt taggcactta tcttattgtt tttagaaaac gtttacagta 180 gaatataaac aaagaacaaa agttactaga ggagaaataa tg 222 <210> 174 <211> 91 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 174 cttatttcac aagcataacc ttaggaaatt tctccaaaaa atgataaatt tctaattata 60 gacacataaa atagaaaggg aatctattat g 91 <210> 175 <211> 164 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 175 tttaataaaa aactgaaaaa atcacaggta aactcttgtt ttactgtgat tttatgttaa 60 aataattaat gagtgtaatt gtatataaaa ttatctgtac acttacctaa tttattgaaa 120 aaaatatgaa tcgtgatgtg tgagggaaag gagtcgcttt tatg 164 <210> 176 <211> 201 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 176 aattcgctca cttaccgcac gaagtaattt taaactatca acgtttttag attacaacac 60 ttaatcattt ccttttgtaa ggaatttaat aggttaattt ttactgacag ttctgtcagt 120 aaattttcgt acgtcaaatc tacttagaaa ggaactgaat tcagtgagta atttacttgc 180 tgaatcgtat ttaatcttat g 201 <210> 177 <211> 395 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 177 ttctctcctc acaaactatt ttatttacta taattatttt atcacaaaaa aagcgttttc 60 agcaaaaata ttaattttat tcttagaaaa aaatgtaaaa atctccctta tggggattat 120 ataggcaaaa atattcgtta aatttgtcag acaacattga gatataaaaa acagaataaa 180 aagaaagggg agtaggatag ctttcattta ctcatattga taaaagaaat aaatgaatag 240 atgcttgcaa aagtagctta aacaatgtat aatgagagag ttgctatgca accatctcgc 300 atttcgtctc gacaaagtcg tagtgtacgc aagtattgcg gctgcggatg acagatgaaa 360 gaggaaaaac tattttaaaa ggagacatta acatg 395 <210> 178 <211> 292 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 178 tatttttatt ttattataat catttcatca tttaattatc attttgctaa atgatatgat 60 gcattttgaa gataataaaa tgctagtaat aagagctggc ctaatattct aaaattgtat 120 tatatatatc taaataataa aattaatctt aaaagtcatc taaaacaatc agtcaaaagt 180 tgataaagaa ttagggcttg acaagttcta aaataattga tagaataata gagttgaaaa 240 gcagaagcac ccgcttctcg ccttagaggt tatagccctg ggcaaacaaa tg 292 <210> 179 <211> 1313 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 179 aaatcctcct atataaatag tttataaaac ctttaatcaa attatatcaa aaagtttaaa 60 gatgacaaag tgtgggttct tgtctttttc agtaaattca ttgattttat ttaaaatttt 120 aaaagatata caaaaagaac aggaaagaat gaaaaaaagt ctaaaaagtc cttgacaagg 180 cacatctcct ttgatagaat agacaagtgc tgttaaaaac agtatgtagc gatgaaacga 240 gaggttgcga cacacccgaa ggtattgcca tacctaacgt gtcggttttc ccgtggagct 300 agcctattga atacaataga cgagaggaga aaaaatggca actaaaaaaa ttcgcattcg 360 cttgaaagca tacgaacatc gtatccttga cgcagctgca gaaaaaatcg tagaaactgc 420 taaacgtaca aacgcagaag taagtggtcc aattccactt ccaactgacc gtagcgtcta 480 cactgttatc cgcgcgactc acaaatataa agactcacgc gaacaattcg aaatgcgtac 540 acacaaacgc ttgatcgaca tcatcgaacc aacacaaaaa actgttgatt cacttatgaa 600 actcgatttg ccaagtggtg taaacatcga aattaaactc taattaagaa aggtaattct 660 catgtcaaaa ggaatcttag ggaaaaaagt gggaatgact caaatcttca cagacaacgg 720 tgaattaatt cctgttactg tgatcgaagc gactccaaac acagttcttc aagttaaatc 780 tgtcgaaaca gacggttacg aagcaactca agttggtttc gatacacttc gtgaagtttt 840 gaccaacaaa cctgccaaag gtcatgctgc taaagctaat acgactccta agcgcttcgt 900 tcgtgaattc aaaggactcg aaggcgctga agtaggagca gaaatcactg ttgatacatt 960 tgcagccgga gatgttgttg atgttaccgg aacttctaaa ggtaaaggtt tccaaggccc 1020 aatcaaacgt catggtcaat cacgtggtcc tatggcccac ggttcacgtt accaccgtcg 1080 tcctggttca atgggtcctg ttgcagctaa caaagttcca aaaggtaaaa aacttgctgg 1140 acgtatgggt aacaaacgcg ttactgtaca aaaccttgtt attgcacaag tgcttcctga 1200 aaagaacgtt atccttgtaa aaggtaatgt cccaggtgct aagaaatcat tgattgttgt 1260 taaatcagca atcaaagcta aataagaagg aaaggagata gaaatctata atg 1313 <210> 180 <211> 110 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 180 aaatctaaat gttttctctt gactaaatct gaccattgag ataaaataag aatatgttag 60 cactcaacta ttaagagtgc taaaaataaa aaatggagga aagtataatg 110 <210> 181 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 182 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid, based on homo sapiens <400> 182 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 183 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> based on homo sapiens <400> 183 cacggtgatg gttcattttc agatgaaatg aacactatcc ttgataacct tgctgctcgt 60 gattttatca actggcttat ccaaactaaa atcactgatt aa 102 <210> 184 <211> 27 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 184 Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala 20 25 <210> 185 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid, based on Lactococcus lactis <400> 185 Met Lys Lys Asn Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr Asn 20 25 30

Claims (44)

  1. 서열번호 28로 기재된, 락토코커스(Lactococcus) 종으로부터 유래된 HU-유사 DNA-결합 단백질에 대한 유전자의 네이티브 프로모터(PhllA), 또는 이의 동족체 또는 기능성 변이체를 포함하는 재조합 핵산으로서, 상기 동족체 또는 기능성 변이체는 상기 프로모터에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결되며 서열번호 28로 기재된 프로모터와 95% 이상 동일한 것인 재조합 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 대해 3'에 전사 종결자 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터로부터의 전사를 제어하도록 구성되는 오퍼레이터를 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 핵산을 숙주 세포의 염색체 내로 삽입하도록 구성되는 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열은 상기 재조합 핵산을 상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 염색체 내로 삽입하도록 구성되는 것인 재조합 핵산.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신호 서열은 usp45 또는 usp45N4인 것인 재조합 핵산.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 28을 포함하고, usp45 또는 usp45N4를 추가로 포함하는 재조합 핵산.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 대상체에서 치료적 반응 또는 면역원성 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인간 또는 동물 대상체에서 치료적 반응 또는 면역원성 반응을 유도할 수 있는 것인 재조합 핵산.
  11. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 항원 또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드 또는 둘 다를 코딩하는 것인 재조합 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있거나, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드는 인간 또는 동물 대상체에서 치료적 효과를 생성시킬 수 있는 것인 재조합 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 관용 반응(immune tolerance response)을 유도할 수 있는 것인 재조합 핵산.
  14. 제11항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있고 백신으로서 사용되는 것인 재조합 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF 또는 hPYY인 재조합 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 핵산은
    (a) PhllA, usp45 및 hIL-10; 또는
    (b) PhllA, usp45N4 및 hIL-10; 또는
    (c) PhllA, usp45N4 및 hTFF1; 또는
    (d) PhllA, usp45 및 hTFF1; 또는
    (e) PhllA, usp45N4 및 hTFF3; 또는
    (f) PhllA, usp45 및 hTFF3; 또는
    (g) PhllA, usp45N4 및 hPYY; 또는
    (h) PhllA, usp45 및 hPYY; 또는
    (i) PhllA, usp45 및 hPYY G9(3-36); 또는
    (j) PhllA, usp45N4 및 GLP-1; 또는
    (k) PhllA, usp45 및 GLP-1; 또는
    (l) PhllA, usp45N4 및 GLP-2; 또는
    (m) PhllA, usp45 및 GLP-2
    를 포함하는 것인 재조합 핵산.
  17. 제1항 또는 제2항에 정의된 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 pT1NX로부터 유래된 것인 벡터.
  19. 제1항에 정의된 재조합 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
  20. 제1항에 정의된 재조합 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  21. 제1항에 정의된 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 프로모터는 상기 숙주 세포의 염색체 내에 존재하고, 상기 프로모터는 그 프로모터에 대해 이종성인 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 것인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 핵산은 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 신호 서열은 usp45 또는 usp45N4인 것인 숙주 세포.
  24. 제21항에 있어서, 상기 프로모터는 그 프로모터로부터의 전사를 제어하도록 구성되는 오퍼레이터를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
  25. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 대상체에서 치료적 반응 또는 면역원성 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인간 또는 동물 대상체에서 치료적 반응 또는 면역원성 반응을 유도할 수 있는 것인 숙주 세포.
  27. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 항원 또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드 또는 둘 다를 코딩하는 것인 숙주 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있거나, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드는 인간 또는 동물 대상체에서 치료적 효과를 생성시킬 수 있는 것인 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 관용 반응을 유도할 수 있는 것인 숙주 세포.
  30. 제27항에 있어서, 상기 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드가 hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF 또는 hPYY인 숙주 세포.
  31. 제27항에 있어서, 상기 항원은 인간 또는 동물 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있고 백신으로서 사용되는 것인 숙주 세포.
  32. 제27항에 있어서, 상기 숙주 세포는
    (a) PhllA, usp45 및 hIL-10; 또는
    (b) PhllA, usp45N4 및 hIL-10; 또는
    (c) PhllA, usp45N4 및 hTFF1; 또는
    (d) PhllA, usp45 및 hTFF1; 또는
    (e) PhllA, usp45N4 및 hTFF3; 또는
    (f) PhllA, usp45 및 hTFF3; 또는
    (g) PhllA, usp45N4 및 hPYY; 또는
    (h) PhllA, usp45 및 hPYY; 또는
    (i) PhllA, usp45 및 hPYY G9(3-36); 또는
    (j) PhllA, usp45N4 및 GLP-1; 또는
    (k) PhllA, usp45 및 GLP-1; 또는
    (l) PhllA, usp45N4 및 GLP-2; 또는
    (m) PhllA, usp45 및 GLP-2
    를 포함하는 것인 숙주 세포.
  33. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 비병원성 및 비침습성 세균인 숙주 세포.
  34. 제33항에 있어서, 그람-양성 세균인 숙주 세포.
  35. 제33항에 있어서, 유산 세균인 숙주 세포.
  36. 제33항에 있어서, 락토코커스 세균 또는 락토바실러스(Lactobacillus) 세균인 숙주 세포.
  37. 제33항에 있어서, 락토코커스 락티스 또는 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 세균인 숙주 세포.
  38. 제1항의 재조합 핵산 또는 제1항의 재조합 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여, 숙주 세포에서 제1항의 재조합 핵산에 포함되는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 발현 생성물을 발현하는 방법.
  39. a) 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단계, 및
    b) 상기 배양하는 단계에서 숙주 세포에 의해 생성된 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계
    를 포함하는, 관심 폴리펩티드의 재조합 발현 방법.
  40. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 숙주 세포를 포함하고, 재조합 핵산의 상기 하나 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 폴리펩티드를 인간 또는 동물에게 전달하기 위한 것인 약학 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항원 또는 비백신형성성 치료적 활성 폴리펩티드인 것인 약학 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 hIL-10, GLP-2 GLP-1, TFF 또는 hPYY인 것인 약학 조성물.
  43. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물.
  44. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 숙주 세포.
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