KR20220113674A - 셀리악 병의 치료 - Google Patents

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KR20220113674A
KR20220113674A KR1020227013905A KR20227013905A KR20220113674A KR 20220113674 A KR20220113674 A KR 20220113674A KR 1020227013905 A KR1020227013905 A KR 1020227013905A KR 20227013905 A KR20227013905 A KR 20227013905A KR 20220113674 A KR20220113674 A KR 20220113674A
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specific
deamidated
lab
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KR1020227013905A
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Inventor
로타르 스테이들러
후이네겜 카롤리엔 반
Original Assignee
인트랙슨 액토바이오틱스 엔.브이.
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Abstract

IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 미생물, 예컨대, 락트산 박테리아 (예컨대, 락토코커스 락티스)를 제공하며, 여기서 두 외인성 핵산 모두는 박테리아 염색체에 통합된다. 이러한 미생물 균주는 인간 요법에 적합하다. 예컨대, 셀리악 질환 (CeD)의 치료를 위한 조성물 (예컨대, 약학 조성물), 미생물을 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 미생물은 경구 투여되어, 미생물이 위장관에 전달되고, 여기서 미생물이 방출되고 생체활성 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

Description

셀리악 병의 치료
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019 년 9 월 27 일에 출원된 미국 가출원 제62/907,350호 및 2020 년 4 월 1 일에 출원된 미국 가출원 제63/003,624호에 대한 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 원용된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 그 전체가 참조로 본원에 원용되는 서열 목록을 함유하고 있다. 2020 년 9 월 23 일에 생성된 상기 ASCII 사본은 205350-0036-00-WO-605355_SL.txt의 명칭이며, 69,696 바이트의 크기이다.
참조에 의한 원용
본원에 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 원용되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 원용된다. 본원의 용어 및 통합 참조문헌의 용어 사이에 상충하는 경우, 본원의 용어가 우선한다.
배경
유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, 박테리아)은 치료적 분자를 점막 조직에 전달하기 위해 사용되어 왔다. 예컨대, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; 및 Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11 참고.
인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프-생산 락트산 박테리아를 포함하는 글리아딘 펩티드는 이전에 기재되었으며, HLA-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 점막 투여된 글리아딘 펩티드는 셀리악 질환 (CeD)의 치료에 대해 설명되었다. 예컨대, 미국 특허 제8,524,246호; 및 Huibregtse et al., 2009, J. Immunol. 183:2390-2396 참고. 인터류킨-10 (IL-10) 생산 락트산 박테리아는 이전에 설명되었으며, HLA-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드와 조합하여 점막 투여된 IL-10은 CeD의 치료에 대해 설명되었다. 예컨대, 미국 특허 제8,748,126호 참고.
그러나, 안정적이고 하나 초과의 생체활성 폴리펩티드를 구성적으로 또는 유도적으로 발현하고 임상적 용법, 예컨대, CeD의 치료에 적합한 유전적으로 변형된 박테리아 균주에 대한 요구가 당업계에 여전히 있다. 본 개시내용은 이러한 요구를 다룬다.
요약
본 개시내용은 사이토카인 인터류킨-10 (IL-10), 및 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드를 코딩하는 염색체로 통합된 핵산을 함유하는 유전적으로 변형된 미생물, 이러한 미생물의 제조 방법 및 이러한 제조 방법에 유용한 핵산, 및 이러한 미생물의 사용 방법을 제공한다. 대안적인 실시양태에서, 인터류킨-2 (IL-2)가 IL-10 대신에 사용된다. 유전적으로 변형된 미생물은 셀리악 질환의 치료를 비제한적으로 포함하는 인간 요법에 적합할 수 있다.
본 개시내용은 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 락트산 박테리움 (LAB)을 제공한다. 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다. 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택될 수 있다. LAB의 일부 예에서, 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩한다: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 33). 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드, 및 SL#17, SL#21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩한다.
본 개시내용은 또한 다음을 포함하는 락트산 박테리움 (LAB)를 제공한다: (i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산, 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 hIL-10 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다. hIL-10은 분비 리더 없이 성숙한 hIL-10으로서 분비될 수 있다. 임의로, hIL-10은 성숙한 서열의 위치 2에 프롤린 (Pro) 대신 알라닌 (Ala)을 포함한다.
특정 예에서, 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 글리아딘 폴리펩티드 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다. 일부 예에서, 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다. 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 예에서, 글리아딘 폴리펩티드는 HLA-DQ2 특이적 에피토프를 포함하고, 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다. 특정 예에서, 글리아딘 폴리펩티드는 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프를 포함하고, 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 글리아딘 폴리펩티드는 α1- 및/또는 α2-글리아딘 에피토프를 포함한다. LAB의 일부 예에서, 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩한다: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 lqlqpfpqpelpypqpElpypqpelpypqpqpf (서열번호 33). 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, SL#17, SL #21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 추가로 코딩할 수 있다.
LAB의 특정 예에서, LAB는 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함한다. 특정 예에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 (i) 내인성 유전자의 내인성 유전자 프로모터, (ii) 내인성 유전자 프로모터의 3'에 위치한 내인성 유전자, (iii) 유전자간 영역, 및 (iv) hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 hIL-10 코딩 서열에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고, 내인성 유전자 및 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다. 일부 예에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 (i) hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산의 3'에 위치한 제2 유전자간 영역, 및 (ii) 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다. 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 제2 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다.
다른 예에서, LAB의 폴리시스트론 발현 유닛은 다음을 포함한다: (i) 내인성 유전자의 내인성 유전자 프로모터, (ii) 내인성 유전자 프로모터의 3'에 위치한 내인성 유전자, (iii) 유전자간 영역, 및 (iv) 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산. 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고, 여기서 내인성 유전자 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다. 일부 예에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 (i) 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 3'에 위치한 제2 유전자간 영역, 및 (ii) hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 hIL-10 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고, 여기서 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 제2 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다.
일부 예에서, LAB는 hIL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 구성적으로 발현 및 분비한다. 특정 예에서, LAB는 다음의 염색체로 통합된 폴리시스트론 발현 카세트를 포함한다:
a. eno 유전자의 5'에 위치한 eno 프로모터, 제1 유전자간 영역, hIL-10 분비 리더 서열, hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산; 제2 유전자간 영역, 글리아딘 폴리펩티드 분비 리더 서열, 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론 발현 카세트;
b. usp45 프로모터, usp45, 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산, 및 임의로 usp45 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역, 예컨대, rpmD를 포함하는 제2 폴리시스트론 발현 카세트; 및
c. hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한 하나 이상의 트레할로스 수송체를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 폴리시스트론 발현 카세트.
LAB는 다음을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다:
d) 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP)의 비활성화 또는 결실;
e) 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 (ptcC)의 비활성화 또는 결실; 및
f) 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA)의 결실.
LAB의 특정 예에서, 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제는 대장균 otsB이다. LAB의 특정 예에서, 제3 폴리시스트론 발현 카세트는 트레할로스 수송체 유전자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305를 포함한다.
본 개시내용은 개시된 LAB 중 임의의 것의 LAB를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일 예에서, 조성물은 인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 제1 LAB; 및 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB을 포함한다. 일 예에서, 조성물은 (i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다. 일 예에서, 조성물은 인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 제1 LAB; 및 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB를 포함한다. hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다. 일 예에서, 조성물은 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 락트산 박테리움 (LAB)을 포함한다. 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다.
또한 셀리악 질환의 치료에서 위에 기재된 LAB 중 임의의 것 또는 LAB를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 셀리악 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 위에 기재된 LAB 중 임의의 것 또는 LAB를 포함하는 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 (i) hIL-10을 코딩하는 핵산, 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 폴리뉴클레오티드 서열에서, hIL-10을 코딩하는 핵산은 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고/있거나 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다. 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 hIL-10을 코딩하는 핵산은 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산에 대해 5'에 위치하는 L. 락티스 프로모터를 추가로 포함하고, hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 L. 락티스 프로모터에 의해 전사적으로 제어된다. L. 락티스 프로모터는 eno 프로모터, P1 프로모터, usp45 프로모터, gapB 프로모터, thyA 프로모터 및 hllA 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 (i) 제1 유전자간 영역, (ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, (iii) 제2 유전자간 영역, 및 (iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다. 일 예에서, 제1 오픈 리딩 프레임 및 제2 오픈 리딩 프레임 중 하나는 hIL-10을 코딩하고, 제1 오픈 리딩 프레임 및 제2 오픈 리딩 프레임 중 다른 하나는 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩한다. 일 예에서, 제1 오픈 리딩 프레임은 제1 치료적 단백질에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고, 제2 오픈 리딩 프레임은 제2 치료적 단백질에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 유전자간 영역의 5' 및 3' 단부에 플랭킹된 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있고, 5' 플랭킹 핵산은 통합 표적 유전자의 3' 단부에서의 코딩 서열과 동일한 핵산 서열을 포함한다.
또한 (a) 다음을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다: (i) hIL-10을 코딩하는 핵산, 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산. hIL-10을 코딩하는 핵산은 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있고/있거나 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩할 수 있다.
또한 (i) 제1 유전자간 영역, (ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, (iii) 제2 유전자간 영역, 및 (iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다.
본 개시내용은 또한 셀리악 질환에 대한 치료적 방법을 제공한다. 치료적 방법 중 임의의 것에서, 투여된 LAB는 위에 및 상세한 개시내용에 기재된 LAB 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서. LAB은 sAGX0868이다.
일 예에서, 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 락트산 박테리움 (LAB)의 치료적 유효량을 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에 투여하여, 경구 내성을 유도하는 단계를 포함한다. 일 예에서, IL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합될 수 있다. 일부 예에서, 인터류킨-10은 인간 인터류킨-10 (hIL-10)이다. 일부 예에서, 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체는 위험 인자를 나타내며, 여기서 위험 인자는 유전적 소인이다. 일부 예에서, 대상체에 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계는 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 내성-유도 림프구를 증가시킨다.
대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법의 일부 예에서, 대상체에 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계는 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포를 증가시킨다. 방법의 일부 예에서, 대상체에 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계는 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 증가시킨다. 방법의 일부 예에서, 글루텐에 대한 노출시 융모 위축의 발달은 대상체에서 예방, 억제 또는 최소화된다. 대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법의 일부 예에서, 위에 기재된 치료적 효과 중 하나 초과가 달성된다.
일 예에서, 셀리악 질환으로 진단된 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법을 제공한다. 방법은 (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 LAB의 치료적 유효량을 융모 위축을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 LAB의 투여는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 55% 이상의 감소를 생산한다. 일부 예에서, 인터류킨-10은 인간 인터류킨-10 (hIL-10)이다. 일부 예에서, 융모 위축은 장내 글루텐 노출로 인해 대상체에 존재한다. 일부 예에서, LAB의 투여는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 감소를 생산한다. 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법의 일부 예에서, 투여 단계는 대상체에 투여하기 전 상피내 림프구증가증과 비교하여 대상체에서 상피내 림프구증가를 감소시키고/시키거나 투여 단계 전에 대상체로부터 수득된 샘플에 존재하는 CD3+ IEL과 비교하여 대상체로부터 수득된 샘플에서 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수준을 감소시킨다. 방법의 일부 예에서, 투여 단계는 투여 전에 대상체의 샘플에 존재하는 세포독성 CD8+ IEL과 비교하여 대상체에서 세포독성 CD8+ IEL의 수를 감소시킨다. 방법의 일부 예에서, 투여 단계는 투여 전에 대상체의 샘플에 존재하는 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 대상체의 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포의 수준을 감소시키고/시키거나 투여 전에 대상체의 샘플에 존재하는 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 대상체의 점막고유층 림프구의 샘플에서 Foxp3+Tbet-CD4+ T 세포의 수준을 증가시킨다. 방법의 일부 예에서, 투여 단계는 글루텐에 대한 노출시 대상체에서 융모 위축 반복을 예방, 억제 또는 최소화한다. 방법의 일부 예에서, 투여 단계는 대상체에서 융모 높이 (Vh)-음와 깊이(crypt depth) (Cd) 비율을 개선하고/하거나 대상체에서 Vh/Cd 비율을 정상 범위로 회복한다. 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법의 일부 예에서, 위에 기재된 치료적 효과 중 하나 초과가 달성된다.
본 개시내용은 (1) 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB, 예컨대, sAGX0868), 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 조성물, 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 약학 조성물, 또는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 유닛 투여량 형태; 및 (2) 포유류, 예컨대, 인간 (예컨대, 인간 환자)에 미생물 (예컨대, LAB), 조성물, 약학 조성물 또는 유닛 투여량 형태를 투여하기 위한 지침서를 함유하는 키트를 추가로 제공한다.
위에-기재된 위의 방법, 생성물 및 조성물 각각에서, 및 본원에 추가로 개시된 바와 같이, 인터류킨-10은 선정된 일차 사이토카인이다. 위에-기재된 위의 방법, 생성물 및 조성물 각각에서, 및 본원에 추가로 개시된 바와 같이, 인터류킨-2는 인터류킨-10에 대한 대안이다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 하나 이상의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 이 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a 및 1b를 포함하는 도 1은 융모 위축 (VA) (도 1a) 및 융모 대 음와 비율 (도 1b)의 그래프를 묘사한다. 융모 위축 (VA)을 H&E 염색 절편에서 판정하였다. 융모 높이 대 음와 깊이 비율 (Vh/Cd; 도면에서 V/Cr로 표지됨)을 가장 손상된 면적으로부터 최대 6 개의 융모 (V) 및 음와 (Cr)를 측정함으로써 결정하였다. Vh/Cd 비율 ≤2.0일 때 위축이 확인되었다. Kruskal-Wallis와 함께 Dunn의 다중 비교 테스트 (도 1a) 또는 ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트 (도 1b)를 사용하여 통계적 상이함을 테스트하였다.
도 2는 대조군과 비교하여 L. 락티스 (LL)의 상이한 균주로 치료된 마우스에서 100 개의 장 상피 세포당 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수의 그래프이다. IEL 계수를 독립적인 맹검 조사관에 의해 평가하였다. Kruskal-Wallis와 함께 다중 비교를 위한 Dunn의 테스트가 통계적 테스트로서 사용되었으며, 그룹 간에 유의한 상이함을 보이지 않았다.
도 3a, 3b, 3c 및 3d를 포함하는 도 3은 L. 락티스 (LL)-치료된 마우스로부터의 상피내 림프구 (IEL)의 유세포 분석법 분석을 묘사하는 그래프이다. 도 3a 및 3b는 CD8αβ+ T 세포에서 NKG2D의 발현에 대한 데이터를 묘사한다. 도 3c 및 3d는 CD4+ T 세포에서 NKG2D의 발현에 대한 데이터를 묘사한다. 도 3a 및 3c는 표시된 집단의 백분율을 도시한다. 도 3b 및 3d는 100 개의 상피 세포 (IEC) 중 CD3+ 세포의 절대 수를 도시한다. Kruskal-Wallis와 함께 Dunn의 다중 비교 테스트가 통계적 테스트로서 사용되었으며, 그룹 간에 임의의 유의한 상이함이 나타나지 않았다. 도 3a, LL-빈 벡터 대 (vs.) LL-[dDQ8] P=0.2302, 및 vs. LL-[dDQ8]+IL10 P=0.8, 기타 비교 P>0.99. 도 3b, LL-빈 벡터 vs. LL-[dDQ8] P=0.3898, 및 vs. LL-[dDQ8]+IL10 P=0.351, 기타 비교 P>0.99. 도 3c, P=0.634 LL-빈 벡터 vs. LL-[dDQ8]; P=0.3521 LL-빈 벡터 vs. LL-[dDQ8]+IL-10. 도 3d, P=0.2823 LL-빈 벡터 vs. LL-[dDQ8]; P=0.2229 LL-빈 벡터 vs. LL-[dDQ8]+IL-10.
도 4a, 4b 및 4c를 포함하는 도 4는 점막고유층 세포의 유세포 분석법 분석을 묘사하는 그래프이다. 도 4a는 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포 (Treg)에 대한 데이터를 묘사한다. 도 4b는 CD4+Tbet+ TH1 집단에 대한 데이터를 묘사한다. 도 4c는 도시된 TH1에 대한 Treg의 비율을 묘사한다. Kruskal-Wallis와 함께 Dunn의 다중 비교 테스트가 통계적 테스트로서 사용되었으며, 그룹 간에 유의한 상이함이 발견되지 않았다.
도 5a, 5b, 5c 및 5d를 포함하는 도 5는 상피 세포에서 유전자 발현의 수준을 묘사하는 그래프이다. Qa-1 (도 5a), Rae1 (도 5b), Mult1 (도 5c) 및 Prf1 (도 5d)의 발현을 판정하였다. mRNA를 IEL 분획으로부터 단리하였고, 표시된 유전자에 대한 qPCR을 수행하기 위해 cDNA로 전사하였다. Kruskal-Wallis와 함께 Dunn의 다중 비교 테스트 (도 5a) 또는 ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트 (도 5b-5d)를 사용하여 통계적 상이함에 대해 테스트하였다. 평균의 표준 오차를 갖는 평균이 표시된다.
도 6a 및 6b를 포함하는 도 6은 ELISA 검정 데이터를 묘사하는 그래프이다. 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (항-DGP) IgG 및 항-글리아딘 IgG2c 항체 혈청 수준을 ELISA 검정에 의해 결정하였다. 항-DGP IgG에 대한 데이터는 도 6a에 도시되어 있고, 항-글리아딘 IgG2c에 대한 데이터는 도 6b에 도시되어 있다. 데이터는 OD450 nm로서 표현된다. Kruskal-Wallis와 함께 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 그룹 간의 통계적 상이함을 결정하였다.
도 7a 및 7b를 포함하는 도 7은 융모 위축 (VA) (도 7a) 및 융모 높이 대 음와 깊이 비율 (도 7b)의 그래프를 묘사한다. 융모 위축 (VA)을 H&E 염색 절편에서 판정하였다. 융모 높이 대 음와 깊이 비율 (Vh/Cd; 도면에서 융모/음와 비율로 표지됨)을 가장 손상된 면적으로부터 최대 6 개의 융모 (V) 및 음와 (Cr)를 측정함으로써 결정하였다. Vh/Cd 비율 ≤2.0일 때 위축이 확인되었다. ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 상이함에 대해 테스트하였다. *P <0.05.
도 8은 대조군과 비교하여 L. 락티스 (LL)의 상이한 균주로 치료된 마우스에서 100 개의 장 상피 세포당 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수의 그래프이다. IEL 계수를 독립적인 맹검 조사자에 의해 평가하였다. ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 상이함에 대해 테스트하였으며, 그룹 간에 유의한 상이함을 보이지 않았다.
도 9a, 9b 및 9c를 포함하는 도 9는 L. 락티스 (LL)-치료된 마우스로부터의 상피내 림프구 (IEL)의 유세포 분석법 분석을 묘사하는 그래프이다. 도 9a 및 9b는 각자 CD8αβ+ T 세포 상의 및 CD4+ T 세포 상의 NKG2D의 발현에 대한 데이터를 묘사한다. 도 9a 및 9b는 100 개의 상피 세포 (IEC) 중 CD3+ 세포의 절대 수를 도시한다. 그랜자임 B의 발현을 또한 CD8αβ+ T 세포에서 결정하였다 (도 9c). ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트를 통계적 테스트로서 사용하였다.
도 10a, 10b 및 10c를 포함하는 도 10은 점막고유층 세포의 유세포 분석법 분석을 묘사하는 그래프이다. 도 10a는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포 (Treg)에 대한 데이터를 묘사한다. 도 10b는 CD4+ Tbet+ TH1 집단에 대한 데이터를 묘사한다. 도 10c는 도시된 TH1에 대한 Treg의 비율을 묘사한다. ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트를 통계적 테스트로서 사용하였으며, 그룹 간에 유의한 상이함은 발견되지 않았다.
도 11a, 11b, 11c 및 11d를 포함하는 도 11은 상피 세포에서 유전자 발현의 수준을 묘사하는 그래프이다. Qa-1 (도 11a), Rae1 (도 11b), Mult1 (도 11c) 및 Prf1 (도 11d)의 발현을 판정하였다. 퍼콜 분리 전 (도 11a-11c) 및 후에 (도 11d) IEL 분획으로부터 mRNA를 단리하고, cDNA로 전사하여, 표시된 유전자에 대한 qPCR을 수행하였다. 평균의 표준 오차를 갖는 평균이 표시되며; ANOVA와 함께 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 상이함에 대해 테스트하였다. *P <0.05. ** P <0.01.
도 12는 DQ2에 대한 후보 분비 리더 서열의 웨스턴 블롯 이미지를 포함한다. 테스트된 분비 리더는 모 단백질의 상응하는 Uniprot 번호로 표시된다. 각각의 클론에 대한 플레이트 번호 및 웰이 표시되고, 이어서 분비 리더 번호 (SL#; 표 14 참고)가 표시된다. 예상 크기는 왼쪽 열에 표시된다. 분비 리더의 질량은 2.3 내지 3 kDa의 범위이다. MG1363[pAGX0043]을 항체 반응성을 확인하기 위한 참조 재료로서 사용하였다. MG1363[pT1NX]을 빈 벡터 대조군으로서 사용하였다. SeeBlue™ Plus2 (Thermo Fisher Scientific #LC5925)를 분자량 마커 (MWM)로서 사용하였다. 프로모터, SL 또는 DQ2에 돌연변이를 포함하는 클론을 적색으로 마킹하였다.
도 13은 dDQ2에 대한 후보 분비 리더 서열의 웨스턴 블롯 이미지를 포함한다. 분비 리더는 모 단백질의 상응하는 Uniprot 번호로 표시된다. 각각의 클론에 대한 플레이트 번호 및 웰이 표시되고, 이어서 분비 리더 번호 (SL#; 표 Ex. I 참고)가 표시된다. 예상 크기는 왼쪽 열에 표시된다. 분비 리더의 질량은 2.3 내지 3 kDa의 범위이다. MG1363[pAGX0043]을 항체 반응성을 확인하기 위한 참조 재료로서 사용하였다. MG1363[pT1NX]을 빈 벡터 대조군으로서 사용하였다. SeeBlue™ Plus2 (Thermo Fisher Scientific #LC5925)를 분자량 마커 (MWM)로서 사용하였다. 프로모터, SL 또는 DQ2에 돌연변이를 포함하는 클론을 적색으로 마킹하였다.
도 14는 DQ2에 대한 선택 분비 리더 서열의 웨스턴 블롯 이미지를 포함한다. 분비 리더는 분비 리더 번호 (SL#; 표 Ex. I 참고) 및 모 단백질의 상응하는 Uniprot 번호로 표시된다. 예상 크기는 왼쪽 열에 표시된다. 분비 리더의 질량은 2.3 내지 3 kDa의 범위이다. MG1363[pAGX0043]을 항체 반응성을 확인하기 위한 참조 재료로서 사용하였다. MG1363[pT1NX]을 빈 벡터 대조군으로서 사용하였다. SeeBlue™ Plus2 (Thermo Fisher Scientific #LC5925)를 분자량 마커 (MWM)로서 사용하였다.
도 15는 dDQ2에 대한 선택 분비 리더 서열의 웨스턴 블롯 이미지를 포함한다. 분비 리더는 분비 리더 번호 (SL#; 표 Ex. I 참고) 및 모 단백질의 상응하는 Uniprot 번호로 표시된다. 예상 크기는 왼쪽 열에 표시된다. 분비 리더의 질량은 2.3 내지 3 kDa의 범위이다. MG1363[pAGX0043]을 항체 반응성을 확인하기 위한 참조 재료로서 사용하였다. MG1363[pT1NX]을 빈 벡터 대조군으로서 사용하였다. SeeBlue™ Plus2 (Thermo Fisher Scientific #LC5925)를 분자량 마커 (MWM)로서 사용하였다.
도 16은 eno>>hil-10>>ddq2, ΔthyA, otsB, trePTS, ΔtrePP, ΔptcC, (/절삭된/) 유전적 특성, 유전자간 영역 (IR), PCR 증폭 산물 크기 (염기 쌍 또는 bp)로 기재된 바와 같은 sAGX0868의 관련 유전적 유전자좌의 개략도를 묘사한다.
도 17a, 17b, 17c 및 17d를 포함하는 도 17 (서열번호 26)은 집합적으로 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)의 결실; 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자, llmg_0453 (LLMG_RS02300) 및 llmg_0454 (LLMG_RS02305); ptsI 및 ptsII; 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하는 HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터의 삽입, ptsI 및 ptsII 사이에 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)를 선행하는 유전자간 영역의 삽입을 나타낸 것이다. 도 17d에서, pgmB는 베타-포스포글루코뮤타제 유전자 (유전자좌 태그 LLMG_RS02315)를 지칭한다.
도 18a, 18b 및 18c를 포함하는 도 18 (서열번호 27)은 집합적으로 미식별된 분비된 45-kDa 단백질 유전자 (usp45; 유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)의 삽입을 나타낸 것이다. usp45 및 otsB 사이에 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)를 선행하는 유전자간 영역의 삽입. 도 18c에서, asnH는 아스파라긴 합성효소 유전자 (유전자좌 태그 LLMG_RS12590)를 지칭한다.
도 19a, 19b, 19c 및 19d를 포함하는 도 19 (서열번호 28)는 집합적으로 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 (ptcC; 유전자 ID: 4796893)의 결실을 나타낸 것이다. 도 19b-19d에서, bglA는 6-포스포-베타-글루코시다제유전자 (유전자 ID 4798119; 유전자좌 태그 LLMG_RS0224)를 지칭한다.
도 20a 및 20b를 포함하는 도 20 (서열번호 29)은 집합적으로 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)의 결실을 나타낸 것이다. 도 20a 및 b에서, PTS는 유전자좌 태그 LLMG_RS04900 (유전자ID 4796722; llmg_0963)을 지칭한다.
도 21a, 21b, 21c 및 21d를 포함하는 도 21 (서열번호 30)은 집합적으로 hIL-10의 발현 및 분비를 허용하기 위해 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 Pro2Ala (P2A); Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789)을 코딩하는, hil-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45)의 융합을 코딩하는 유전자 (TAA 정지 코돈을 포함하는 서열번호 22)의 삽입을 나타낸 것이다. hil-10 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다. 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프 (UniProt: Q9M4L6_wheat, 아미노산 57-89, 위치 66 및 80에서 글루타민 탈아미드화)를 기반으로 하는 프로테아제-저항성 33-mer인 탈아미드화된 DQ2 (ddq2)를 코딩하는 단편과 ps356 분비 리더 (SSps356)의 융합을 코딩하는 유전자 (TAA 정지 코돈을 포함하는 서열번호 25)가 이 hil-10 유전자의 다운스트림에 위치하여, dDQ2의 발현 및 분비를 허용한다. ddq2 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034)를 선행하는 IR의 사용에 의해 hil-10에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다. 도 21c-21d에서, xerD는 인테그라제-재조합효소 유전자 (유전자ID 4796855; 유전자좌 태그 LLMG_RS03220)를 지칭한다.
대상체에서 CeD의 치료 및/또는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드, 예컨대, 인간 백혈구 항원 (HLA)-특이적 글리아딘 항원, 예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프에 대한 내성을 회복하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
A. 상세한 설명
미생물 및 조성물
본 개시내용은 미생물, 예컨대, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원, 예컨대, 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 미생물, 예컨대, 그람-양성 박테리아, 예컨대, 락트산 박테리움 (LAB)을 제공하며, 여기서 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드)을 코딩하는 외인성 핵산은 둘 모두 염색체로 통합되어 있으며, 즉, 박테리아 염색체에 통합 (또는 위치)한다.
미생물은 그람-양성 박테리움, 예컨대, LAB일 수 있다. LAB는 락토코커스 종 박테리움일 수 있다. 예시적인 LAB 종은 락토바실러스 종, 또는 비피도박테리움 종을 포함한다. LAB는 락토코커스 락티스일 수 있다. LAB는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스일 수 있다. 다른 예시적인 LAB는 락토코커스 락티스 균주 MG1363이다. 예컨대, Gasson, M.J., J. Bacteriol. 1983, 154: 1-9 참고.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, CeD-특이적 항원은 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 CeD와 연관된 글루텐으로부터의 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함한다. 일부 예에서, CeD-특이적 항원은 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 밀 글루텐, 호밀 글루텐 또는 보리 글루텐의 글리아딘으로부터의 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 글리아딘은 밀 글리아딘 (UniProtKB Q9M4L6)이다:
Figure pct00001
밑줄 친 서열 (아미노산 잔기 57 내지 89)은 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프를 포함하는 예시적인 폴리펩티드이다. 밀 글리아딘 (UniProtKB Q9M4L6)을 코딩하는 예시적인 핵산은 GenBank 수탁 번호 AJ133611.1에 제공된다:
Figure pct00002
위의 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, CeD-특이적 항원은 글리아딘의 절삭된 버전, 예컨대, 절삭된 밀 글리아딘 폴리펩티드인 CeD-특이적 항원 변이체이다. CeD-특이적 항원은 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프를 포함하는 밀 글리아딘의 33 개의 아미노산 단편인 HLA-DQ2-특이적 에피토프 LQLQPFPQP Q LPYPQPQLPYPQP Q LPYPQPQPF (서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이 에피토프에 대한 예시적인 코딩 서열은 다음과 같다:
Figure pct00003
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, CeD-특이적 항원은 아미노산 서열 QYPSG Q GSFQPSQ Q NPQA (서열번호 5; 밀 글리아딘 (UniProtKB Q9M4L6)의 아미노산 잔기 225-242))를 갖는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이 에피토프에 대한 예시적인 코딩 서열은 다음과 같다: CAATACCCATCAGGTCAAGGTTCATTTCAACCATCACAACAAAACCCACAAGCT (서열번호 6).
다른 예에서, CeD-특이적 항원은 글리아딘의 돌연변이된 버전, 예컨대, 밀 글리아딘의 돌연변이된 버전인 CeD-특이적 항원 변이체이다. CeD-특이적 항원은 2 개의 특이적 글루타민 잔기를 글루타메이트 잔기로 대체하도록 변형된 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프를 포함하는 밀 글리아딘의 33 개의 아미노산 단편인 HLA-DQ2-특이적 에피토프를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다: LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (서열번호 7). 이 에피토프의 예시적인 코딩 서열은 cttcaacttcaaccatttccacaaccagaacttccatacccacaaccacaacttccatacccacaaccagaacttccatacccacaaccacaaccattt (서열번호 8)이다. 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, CeD-특이적 항원은 아미노산 서열 QYPSG E GSFQPSQ E NPQA (서열번호 9)를 갖는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 이 에피토프에 대한 예시적인 코딩 서열은 다음과 같다: CAATACCCATCAGGTGAAGGTTCATTCCAACCATCACAAGAAAACCCACAAGCT (서열번호 10).
위의 실시양태 중 임의의 것의 다른 예에서, CeD-특이적 항원은 글리아딘의 돌연변이된 버전, 예컨대, 밀 글리아딘의 돌연변이된 버전인 CeD-특이적 항원 변이체일 수 있으며, 여기서 항원은 HLA-DQ8-특이적 또는 HLA-DQ2 특이적 항원성 특성을 보유한다. 대안적으로, CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드는 밀 글리아딘 (UniProtKB Q9M4L6) 또는 이의 단편, 예컨대, LQLQPFPQP Q LPYPQPQLPYPQP Q LPYPQPQPF (서열번호 3) 또는 QYPSG Q GSFQPSQ Q NPQA (서열번호 5)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드는 LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (서열번호 7) 또는 QYPSG E GSFQPSQ E NPQA (서열번호 9)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 야생형 CeD-특이적 항원, 예컨대, 밀 글리아딘은 GenBank 수탁 번호 AJ133611.1로부터의 DNA 서열: CTTCAACTTCAACCATTTCCACAACCA C AACTTCCATACCCACAACCACAACTTCCATACCCACAACCA C AACTTCCATACCCACAACCACAACCATTT (HLA-DQ2; 서열번호 4) 또는 CAATACCCATCAGGTCAAGGTTCATTTCAACCATCACAACAAAACCCACAAGCT (HLA-DQ8; 서열번호 6), 또는 이의 코돈-최적화된 서열에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있으며, 여기서 서열번호 -- 또는 서열번호 --의 서열은 L. 락티스의 코돈 사용빈도(codon usage)를 반영하도록 변경된다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, IL-10 폴리펩티드는 다음의 서열을 갖는 인간 IL-10 (hIL-10; UniProtKB P22301)이다:
Figure pct00004
(여기서 밑줄 친 잔기 1-18은 신호 펩티드이고, 잔기 19-178은 성숙한 폴리펩티드임). 다른 예에서, IL-10은 예컨대, 박테리움에 의한 IL-10 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위한 예컨대, 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 IL-10 변이체 폴리펩티드일 수 있다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 발현된 IL-10은 "성숙한" 인간 IL-10 (hIL-10), 즉, 신호 펩티드가 없는 것이다. 예시적인 서열은 hIL-10 (UniProtKB P22301)의 잔기 19-178이다. 일부 실시양태에서, hIL-10은 성숙한 펩티드에서 아미노산을 계수할 때 위치 2에서 프롤린 (Pro)에서 알라닌 (Ala)으로의 치환을 포함한다. P2A 치환을 포함하는 예시적인 성숙한 인간 IL-10 서열은 다음과 같다: SAGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN (서열번호 12). 이러한 폴리펩티드는 예컨대, Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789에 기재되어 있다. 일부 예에서, IL-10 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-10일 수 있다. 다른 예에서, IL-10 폴리펩티드는 그 자체의 신호 펩티드가 없는 인간 IL-10이고 SAGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN (서열번호 12)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다음에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
Figure pct00005
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, IL-2 폴리펩티드가 IL-10 폴리펩티드 대신에 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2 폴리펩티드는 인간 IL-2 (hIL-2)이다. 야생형 인간 IL-2의 아미노산 서열은 다음에 의해 표현된다: MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(Uniprot P60568; 서열번호 14). 핵산 서열을 코딩하는 예시적인 IL-2는 다음에 의해 표현된다: gctccaacttcatcatcaactaaaaaaactcaattgcaacttgaacacttgcttttggatcttcaaatgatcttgaacggtatcaacaactacaaaaacccaaaacttactcgtatgttgacttttaaattttacatgccaaaaaaagctactgaacttaaacacttgcaatgtcttgaagaagaattgaaaccacttgaagaagttttgaaccttgctcaatcaaaaaactttcacttgcgtccacgtgatcttatctcaaacatcaacgttatcgttttggaacttaaaggttcagaaactacttttatgtgtgaatacgctgatgaaactgctactatcgttgaatttttgaaccgttggatcactttttgtcaatcaatcatctcaactttgacttaa (서열번호 15). 예시적인 아미노산 서열은 Uniprot P605658의 아미노산 21-153에 의해 표현되는 성숙한 야생형 인간 IL-2이다: APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSE (서열번호 16). 성숙한 야생형 hIL-2에 대한 예시적인 코딩 서열은 다음과 같다: gctccaacttcatcatcaactaaaaaaactcaattgcaacttgaacacttgcttttggatcttcaaatgatcttgaacggtatcaacaactacaaaaacccaaaacttactcgtatgttgacttttaaattttacatgccaaaaaaagctactgaacttaaacacttgcaatgtcttgaagaagaattgaaaccacttgaagaagttttgaaccttgctcaatcaaaaaactttcacttgcgtccacgtgatcttatctcaaacatcaacgttatcgttttggaacttaaaggttcagaaactacttttatgtgtgaatacgctgatgaaactgctactatcgttgaatttttgaaccgttggatcactttttgtcaatcaatcatctcaactttgacttaa (서열번호 15). 다른 예에서, IL-2 폴리펩티드는 자신의 신호 펩티드가 없는 인간 IL-2이고 Uniprot P605658의 아미노산 21-153에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, 단, IL-2 변이체 폴리펩티드는 일부 IL-2 활성 (기능적 폴리펩티드)을 유지한다. 일부 예에서, IL-2은 미국 특허 제4,518,584호 또는 미국 특허 제4,752,585호에 기재된 바와 같은 변이체이다. 사용될 수 있는 IL-2의 다른 형태는 IL-2 변이체 서열, 예컨대, 알데스류킨 또는 프롤류킨 (Prometheus Laboratories), 테셀류킨 (Roche), 바이오류킨 (Glaxo)에서 발견된 것들, 뿐만 아니라 Taniguchi et al., Nature 1983, 302(5906): 305-10 및 Devos et al., Nucleic Acids Res. 1983, 11(13): 4307-23; 유럽 특허 출원공보 제91,539호 및 제88,195; 미국 특허 제4,518,584호. 미국 특허 제9,266,938호; 미국 특허 제7,569,215호; 미국 특허 제5,229,109호; 미국 특허 공개공보 제2006/0269515호; EP 특허 공개공보 EP 1730184A2호; 및 PCT 공개공보 WO 2005/086751에 기재된 바와 같은 변이체를 포함한다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드를 발현 (예컨대, 구성적으로 발현)한다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, hIL-10)를 구성적으로 발현 및 분비한다. LAB는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드)를 구성적으로 발현할 수 있다. 미생물 (예컨대, LAB)은 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드)을 구성적으로 발현 및 분비할 수 있다. 또 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, hIL-10) 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드 (예컨대, 밀 글리아딘)를 구성적으로 발현 및 분비할 수 있다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 인간에 투여하기 위한 IL-10 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 IL-10 폴리펩티드를 발현 (예컨대, 구성적으로 발현)한다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, hIL-10)를 구성적으로 발현 및 분비한다. LAB는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드)를 유도적으로 발현할 수 있다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드)을 유도적으로 발현 및 분비한다. 또 다른 예에서, 유도성 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, hIL-10) 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드 (예컨대, 밀 글리아딘))을 발현 및 분비한다. 유도성 발현은 직접적으로 유도성일 수 있거나, 간접적으로 유도성일 수 있다.
위의 방법, 생성물 및 조성물에 따른 일부 예에서, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다른 유전자의 3'에 위치하고, IL-10의 발현 및 분비는 다른 유전자, 예컨대, 폴리시스트론 발현 카세트에 커플링된다. IL-10 발현 카세트는 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432) 및 eno 프로모터 Peno의 다운스트림에 염색체로 통합될 수 있다. 미생물 (즉, LAB)에서, 바람직하게는 발현 카세트의 eno 유전자는 이의 천연 염색체 유전자좌에 위치한다. 일부 예에서, IL-10 발현 유닛은 유전자간 영역을 사용함으로써 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 유전자간 영역은 eno 유전자의 정지 코돈의 바로 3'에 위치한다. 폴리시스트론 발현 카세트에서 예시적인 유전자간 영역은 rpmD 유전자 5' 유전자간 영역 (즉, rpmD를 선행하는 영역; 본원에 IRrpmD로서 지칭됨)이다. 예시적인 IRrpmD는 TAAGGAGGAAAAAATG (서열번호 17)의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 이는 제1 유전자의 정지 코돈 TAA 및 제2 유전자의 출발 코돈 ATG를 포함한다). 출발 및 정지 코돈이 없으면, 유전자간 영역 rpmD는 GGAGGAAAAA (서열번호 18)의 핵산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 유전자간 영역은 분비 서열의 출발 코돈의 바로 5'에 위치한다. 예시적인 IL-10 분비 서열은 예를 들어, atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacag tgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20) 또는 atgaagaagaaaatcattagtgccatcttaatgtctacag tgattctttcagctgcagctcctttatcaggcgtttatgca (서열번호 21)에 의해 코딩된, 미식별된 분비된 45-kDa 단백질 (usp45) MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA (서열번호 19)의 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 이러한 분비 서열은 본원에 SSusp45로서 지칭된다. usp45 분비 리더 (SSusp45)와 hil-10 유전자의 융합을 코딩하는 예시적인 유전자는
Figure pct00006
이다. 일부 예에서, SSusp45는 MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA (서열번호 19)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, 5SSusp4는 atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20) 또는 atgaagaagaaaatcattagtgccatcttaatgtctacagtgattctttcagctgcagctcctttatcaggcgtttatgca (서열번호 21)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일부 예에서, IL-10 발현 카세트에서의 SSusp45는 atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacag tgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일부 예에서, IL-10 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hIL-10.
본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하는 다른 예에서, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 hllA 프로모터 (PhllA), 예컨대, 락토코커스 락티스 PhllA의 3'에 위치한다. 예시적인 PhllA 서열은 다음과 같으며: aaaacgccttaaaatggcattttgacttgcaaactgggctaagatttgctaaaatgaaaaatgcctatgtttaaggtaaaaaacaaatggaggacatttctaaaatg (서열번호 23), 이는 HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (유전자 ID: 4797353; 유전자좌 태그 LLMG_RS02525)의 구성적 프로모터이다. IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 PhllA에 의해 전사적으로 조절될 수 있다. 다른 예에서, LAB는 PhllA 프로모터 (예컨대, 락토코커스 락티스 PhllA), (예컨대, PhllA의 3'에 위치한) IL-10 분비 서열, 및 (예컨대, IL-10 분비 서열의 3'에 위치한) IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 IL-10 발현 카세트를 포함한다. 일부 예에서, IL-10 발현 카세트는 염색체로 통합된다. 일부 예에서, IL-10 발현 카세트는 염색체로 통합되어, 다른 유전자를 대체하거나 부분적으로 대체한다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 IL-10 발현 카세트의 3'에 위치할 수 있으며, CeD-특이적 항원의 발현 및 분비는 IL-10 발현 카세트, 예컨대, 폴리시스트론 발현 카세트에 커플링된다. 바람직하게는, 유전자간 영역은 IL-10 발현 카세트의 정지 코돈의 바로 3'에 위치하고 CeD-특이적 항원의 출발 코돈 또는 CeD-특이적 항원에 융합된 분비 리더의 출발 코돈의 바로 5'에 위치한다. 일부 예에서, CeD-특이적 항원 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034)에 선행하는 IR인 IRrplN (GCAAAACTAGGAGGAATATAGC; (서열번호 24)의 사용에 의해 IL-10에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: hIL-10>>IRrplN>>CeD-특이적 항원 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다른 유전자의 3'에 위치하고, IL-10의 발현 및 분비는 다른 유전자, 예컨대, eno에 커플링된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 Peno>>eno>>IRrpmD>>hil-10>>IRrplN>>CeD-특이적 항원에 의해, 또는 Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>CeD-특이적 항원에 의해 예시된다. 미생물 (즉, LAB)에서, 바람직하게는, 발현 카세트의 eno 유전자는 이의 천연 염색체 유전자좌에 위치한다. 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 다른 예에서, CeD-특이적 항원 분비 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더 (SL)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다: SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#34, SL#35 및 SL#36 (표 1 참고). 예를 들어, CeD-특이적 항원은 HLA-DQ2 특이적 에피토프일 수 있고, 분비 서열은 (SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#34 및 SL#36)으로 이루어진 군 또는 SL#8, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23 및 SL#34로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 대안적으로, CeD-특이적 항원은 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 예컨대, ddq2이고, 분비 서열은 (SL#15, SL#17, SL# 21, SL#22, SL#23, SL#32, SL#34, SL#35 및 SL#36)으로 이루어진 군 또는 SL#17, SL#21, SL#22, SL#23 및 SL#34로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 각각의 모든 실시양태는 분비 서열로서 SL#34 없이 작동가능하다. CeD-특이적 항원 분비 서열은 또한 ps356 엔도리신 (ps356)의 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 분비 서열은 본원에 SSps356 (SL#21)으로서 지칭된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>SSps356-CeD-특이적 항원. 미생물 (즉, LAB)에서, 바람직하게는, 발현 카세트의 eno 유전자는 이의 천연 염색체 유전자좌에 위치한다. 예시적인 Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>SSps356-CeD-특이적 항원 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열은 도 23에 묘사되어 있으며, 여기서 CeD-특이적 항원은 밀 글리아딘의 탈아미드화된 HLA-DQ2-특이적 에피토프 LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (서열번호 7)(본원에 ddq2로서 지칭됨)이다.
위의 방법, 생성물 및 조성물에 따른 다른 예에서, CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다른 유전자의 3'에 위치하고, CeD-특이적 항원 폴리펩티드의 발현 및 분비는 다른 유전자, 예컨대, 폴리시스트론 발현 카세트에 커플링된다. CeD-특이적 항원 폴리펩티드 발현 카세트는 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432) 및 eno 프로모터 Peno의 다운스트림에 염색체로 통합될 수 있다. 일부 예에서, CeD-특이적 항원 폴리펩티드 발현 유닛은 유전자간 영역을 사용함으로써 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링될 수 있다. 폴리시스트론 발현 카세트에서의 예시적인 유전자간 영역은 rpmD 유전자 5' 유전자간 영역 (즉, rpmD을 선행하는 영역; 본원에 IRrpmD로서 지칭됨)이다. 예시적인 IRrpmD는 taaggaggaaaaaatg (서열번호 17)의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 이는 제1 유전자의 정지 코돈 TAA 및 제2 유전자의 출발 코돈 ATG를 포함한다). 출발 및 정지 코돈이 없으면, 유전자간 영역 rpmD는 ggaggaaaaa (서열번호 18)의 핵산 서열을 갖는다. 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 다른 양태에서, CeD-특이적 항원 분비 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더 (SL)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다: SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#34, SL#35 및 SL#36 (표 1 참고). 예를 들어, CeD-특이적 항원은 HLA-DQ2 특이적 에피토프일 수 있으며, 분비 서열은 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#34 및 SL#36으로 이루어진 군, 또는 SL#8, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23 및 SL#34로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 대안적으로, CeD-특이적 항원은 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 예컨대, ddq2이고, 분비 서열은 SL#15, SL#17, SL#21, SL#22, SL#23, SL#32, SL#34, SL#35 및 SL#36으로 이루어진 군, 또는 SL#17, SL#21, SL#22, SL#23 및 SL#34로 이루어진 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 각각의 모든 실시양태는 분비 서열로서 SL#34 없이 작동가능하다. CeD-특이적 항원 분비 서열은 또한 ps356 엔도리신 (ps356)의 분비 리더를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 분비 서열은 본원에 SSps356 (SL#21)으로서 지칭된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: Peno>>eno>>IRrpmD>>SSps356-CeD-특이적 항원. 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프 (UniProt: Q9M4L6_wheat)를 기반으로 하는 프로테아제-저항성 33-mer인 탈아미드화된 DQ2 (ddq2)를 코딩하는 단편과 ps356 분비 리더 (SSps356)의 융합을 코딩하는 예시적인 유전자는 다음과 같다:
Figure pct00007
본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하는 다른 예에서, CeD-특이적 항원 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 hllA 프로모터 (PhllA), 예컨대, 락토코커스 락티스 PhllA의 3'에 위치한다. CeD-특이적 항원 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 PhllA에 의해 전사적으로 조절될 수 있다. 다른 예에서, LAB는 PhllA 프로모터 (예컨대, 락토코커스 락티스 PhllA), (예컨대, PhllA의 3'에 위치한) CeD-특이적 항원 분비 서열, 및 (예컨대, CeD-특이적 항원 분비 서열의 3'에 위치한) CeD-특이적 항원 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드 발현 카세트를 포함한다. 일부 예에서, CeD-특이적 항원 발현 카세트는 염색체로 통합된다. 일부 예에서, CeD-특이적 항원 발현 카세트는 염색체로 통합되어, 다른 유전자를 대체하거나 부분적으로 대체한다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, hIL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 CeD-특이적 항원 발현 카세트의 3'에 위치할 수 있고, hIL-10의 발현 및 분비는 CeD-특이적 항원 발현 카세트, 예컨대, 폴리시스트론 발현 카세트에 커플링된다.
일부 예에서, hIL-10 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034; 유전자좌 태그 LLMG_RS11895)에 선행하는 IR인 IRrplN (gcaaaactaggaggaatatagc (서열번호 24)의 사용에 의해 CeD-특이적 항원에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: CeD-특이적 항원>>IRrplN>>hil-10. 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, CeD-특이적 항원 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 다른 유전자의 3'에 위치하고, CeD-특이적 항원의 발현 및 분비는 다른 유전자, 예컨대, eno에 커플링된다. 일부 예에서, 발현 카세트는 Peno>>eno>>IRrpmD>>CeD-특이적 항원>>IRrplN>>hil-10에 의해, 또는 Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-CeD-특이적 항원>>IRrplN>>hil-10에 의해 예시된다. 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, hIL-10 분비 서열은 예를 들어, atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacag tgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20) 또는 atgaagaagaaaatcattagtgccatcttaatgtctacag tgattctttcagctgcagctcctttatcaggcgtttatgca (서열번호 21)에 의해 코딩된, SSusp45, MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA (서열번호 19)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 예에서, SSusp45는 MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA (서열번호 19)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예에서, SSusp45는 atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacag tgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20) 또는 atgaagaagaaaatcattagtgccatcttaatgtctacag tgattctttcagctgcagctcctttatcaggcgtttatgca (서열번호 21)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일부 예에서, hil-10 발현 카세트에서의 SSusp45는 atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacag tgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgcc (서열번호 20)에 대해 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일부 예에서, 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: Peno>>eno>>IRrpmD>>SSps356-CeD-특이적 항원>>IRrplN>>SSusp45-hil-10.
CeD-특이적 항원, 예컨대, dDQ2 및 인터류킨-10, 예컨대, 인간 IL-10을 분비하는 L. 락티스에 대한 추가 실시양태가 고려된다. 이들 추가 실시양태는 하나 이상의 고도로 발현된 내인성 유전자의 다운스트림에 통합된 발현 유닛을 포함한다. 고려되는 실시양태는 실시예 5 및 표 XI-X4에 개시되어 있다. 표 X1-X4에 개시된 카세트는 임의로 본원에 기재된 구성요소를 추가로 포함한다. 예를 들어, 카세트는 예컨대, CeD-특이적 항원을 내인성 유전자에 전사적으로 커플링하는 하나 이상의 유전자간 영역을 추가로 포함할 수 있다. 카세트는 CeD-특이적 항원의 코딩 서열에 5'에 융합된 분비 리더를 코딩하는 서열 및 IL-10의 코딩 서열에 5'에 융합된 분비 리더를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 이로써 분비 리더 및 CeD-특이적 항원의 제1 융합 폴리펩티드, 및 분비 리더 및 IL-10의 제2 융합 폴리펩티드를 코딩한다.
위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제, 예컨대, otsB, 예컨대, 대장균 otsB를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산은 염색체로 통합된다. 일부 예에서, 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산은 미식별된 분비된 45-kDa 단백질 유전자 (usp45)의 3'에 염색체로 통합된다. 이 실시양태에 따른 일부 예에서, LAB는 usp45 프로모터, usp45 유전자 (예컨대, 프로모터의 3'), 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, usp45 유전자의 3')을 포함하는 제2 폴리시스트론 발현 카세트를 포함한다. 일부 예에서, 제2 폴리시스트론 발현 카세트는 usp45 유전자 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 제2 폴리시스트론 발현 카세트는 다음에 의해 예시된다: Pusp45>>usp45>>유전자간 영역>>otsB. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 유전자간 영역은 위의 본원에 기재된 바와 같은 (예컨대, taaggaggaaaaaatg (서열번호 17) 또는 ggaggaaaaa (서열번호 18)를 갖는) IRrpmD이다. 이어서, 제2 폴리시스트론 발현 카세트는 다음에 의해 예시될 수 있다: Pusp45>>usp45>>IRrpmD>>otsB.
위의 조성물 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP)는 미생물 (예컨대, LAB)에서 붕괴되거나 비활성화된다. 예를 들어, trePP는 trePP 유전자 또는 이의 단편을 제거함으로써 비활성화되거나, trePP는 정지 코돈을 삽입함으로써 붕괴된다. 따라서, 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 trePP 활성이 결여되어 있다.
다른 예에서, 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 유전자 (ptcC)는 미생물 (예컨대, LAB)에서 붕괴되거나 비활성화된다. 예를 들어, ptcC는 정지 코돈, 예컨대, 코돈 30에서의 TGA를 삽입함으로써 붕괴될 수 있거나, ptcC는 ptcC 또는 이의 단편을 제거함으로써 비활성화될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 ptcC 활성이 결여되어 있다.
조성물 및 방법에 따른 다른 예에서, LAB는 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 LAB에 대해 내인성이다. 일부 예에서, LAB는 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 과발현한다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 외인성 프로모터, 예컨대, hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한다. 예를 들어, 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 PhllA에 의해 전사적으로 조절된다. 일부 예에서, 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 LLMG_RS02300 (유전자 ID: 4797778; 이전에는 llmg_0453), LLMG_RS02305 (유전자 ID: 4797093; 이전에는 llmg_0454), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 예에서, LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305는 PhllA에 의해 전사적으로 조절된다.
일부 예에서, 하나 이상의 트레할로스 수송체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 2 개의 트레할로스 수송체를 코딩하는 2 개의 유전자를 포함하고, 여기서 유전자간 영역은 2 개의 유전자 사이에 위치한다. 일부 예에서, 유전자간 영역은 예컨대, taaggaggaaaaaatg (서열번호 17) 또는 ggaggaaaaa (서열번호 18)를 갖는 IRrpmD이다. 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 2 개의 상이한 트레할로스 수송체 (수송체 1 및 수송체 2 서열)를 코딩하는 2 개의 핵산 서열 (예컨대, 유전자), 및 2 개의 상이한 트레할로스 수송체를 코딩하는 2 개의 핵산 사이의 유전자간 영역을 포함하는 폴리시스트론 발현 카세트를 포함한다. 이러한 발현 카세트는 다음에 의해 예시될 수 있다: PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 유전자간 영역은 위의 본원에 기재된 바와 같은 (예컨대, taaggaggaaaaaatg (서열번호 17) 또는 ggaggaaaaa (서열번호 18)를 갖는) rpmD이다. 이어서, 폴리시스트론 발현 카세트는 다음에 의해 예시될 수 있다: PhllA>>수송체1>>IRrpmD >>수송체2.
따라서, 일부 실시양태에서, LAB는 단일 균주에서 여러 유용한 특징을 포함한다. 일 실시양태에서, LAB는 다음을 포함하는 락토코커스 락티스이다:
(A) 염색체로 통합된 프로모터>>분비 신호>>치료적 단백질, 예컨대, 인터류킨;
(B) 염색체-통합된 프로모터>>분비 신호>>제2 치료적 단백질, 예컨대 항원; 및
(C) 담즙염 및 건조에 대한 LAB 생존성을 향상시키는 트레할로스 축적을 촉진하기 위한 돌연변이 및 삽입의 조합. 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) 트레할로스의 흡수를 위한, 염색체-통합된 트레할로스 수송체(들), 예컨대, PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2, 예컨대, LLMG_RS02300 및/또는 LLMG_RS02305;
(ii) 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하기 위한, usp45 (유전자 ID: 4797218; 유전자좌 태그 LLMG_RS12595)의 다운스트림에 위치한 염색체-통합된 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914; 유전자좌 태그 c2311);
(iii) (예컨대, 유전자 결실을 통해) 비활성화된 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140; 유전자좌 태그 LLMG_RS02310; 이전에는 llmg_0455); 및
(iv) 비활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893; 유전자좌 태그 LLMG_RS02240; 이전에는 llmg_0440), ptcC, (예컨대, 446의 코돈 위치 30에서의 tga; tga30) 또는 결실된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ΔptcC.
LAB는 또한 생물학적 봉쇄를 위한 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA를 함유할 수 있다.
일 실시양태에서, LAB는 다음을 포함하는 락토코커스 락티스이다:
(A) LAB로부터 성숙한 hIL-10을 분비하기 위한 염색체로 통합 프로모터>>분비 신호>>hIL-10, 예컨대, Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hIL-10 또는 PhllA>>SSusp45-hil-10;
(B) LAB로부터 CeD-특이적 항원, 예컨대, ddq2를 분비하기 위한, 염색체-통합된 유전자간 영역>>분비 신호>>CeD-특이적 항원; 예컨대, 유전자간 영역>>IRrplN>>CeD-특이적 항원. 유전자간 영역은 예를 들어, IRrplN일 수 있음; 및
(C) 담즙염 및 건조에 대한 LAB 생존성을 향상시키는 트레할로스 축적을 촉진하기 위한 돌연변이 및 삽입의 조합. 돌연변이는 다음으로부터 선택된다
(i) 트레할로스의 흡수를 위한, 염색체-통합된 트레할로스 수송체(들), 예컨대, PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2, 예컨대, LLMG_RS02300 및/또는 LLMG_RS02305;
(ii) 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하기 위한, usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치한 염색체-통합된 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914);
(iii) (예컨대, 유전자 결실을 통해) 비활성화된 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140); 및
(iv) 비활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ptcC, (예컨대, 446의 코돈 위치 30에서의 tga; tga30) 또는 결실된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ΔptcC.
LAB는 또한 생물학적 봉쇄를 위한 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA를 함유할 수 있다.
일 실시양태에서, LAB는 다음을 포함하는 락토코커스 락티스이다:
(A) LAB로부터 IL-10 및 CeD-특이적 항원 둘 모두를 분비하는 염색체로 통합된 폴리시스트론 카세트, 예컨대, Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>SSps356-CeD-특이적 항원, 예컨대, ddq2; 및
(B) 담즙염 및 건조에 대한 LAB 생존성을 향상시키는 트레할로스 축적을 촉진하기 위한 돌연변이 및 삽입의 조합. 돌연변이는 다음으로부터 선택된다:
(i) 트레할로스의 흡수를 위한, 염색체-통합된 트레할로스 수송체(들), 예컨대, PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2, 예컨대, LLMG_RS02300 및/또는 LLMG_RS02305;
(ii) 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하기 위한, usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치한 염색체-통합된 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914);
(iii) (예컨대, 유전자 결실을 통해) 비활성화된 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140); 및
(iv) 비활성화된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ptcC, (예컨대, 446의 코돈 위치 30에서의 tga; tga30) 또는 결실된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ΔptcC.
LAB는 또한 생물학적 봉쇄를 위한 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA를 함유할 수 있다.
LAB는 락토코커스 락티스이며 다음을 함유할 수 있다:
(A) 생물학적 봉쇄를 위한, thyA 돌연변이;
(B) Peno>>eno>>IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>SSps356-CeD-특이적 항원, 예컨대, ddq2의 염색체-통합된 폴리시스트론 카세트;
(C) 트레할로스의 흡수를 위한, 염색체-통합된 트레할로스 수송체(들), 예컨대, PhllA>>수송체 1>>유전자간 영역>>수송체 2;
(D) (예컨대, 유전자 결실을 통해) 비활성화된 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140);
(E) 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하기 위한, 염색체로 통합된 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)(usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치함); 및
(F) 결실된 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (유전자 ID: 4796893), ΔptcC.
일 실시양태에서, LAB는 락토코커스 락티스 균주 sAGX0868이다. sAGX0868은 락토코커스 락티스 (L. 락티스) MG1363의 유도체이다. sAGX0868에서,
● 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)가 부재하여, 환경적 봉쇄를 보장한다 (Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789).
● 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)가 부재하여, 외인성으로 첨가된 트레할로스의 축적을 허용한다.
● 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)는 usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치하여, 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 한다. otsB 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역 (IR)의 사용에 의해 usp45에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다.
● HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터는 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305, 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하여, 트레할로스 흡수를 강화한다.
● 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 ptcC (유전자 ID: 4796893)가 결실된다 (ΔptcC). 이 돌연변이는 축적 후 트레할로스 잔류를 확인한다.
● 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에, 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 P2A [1])을 코딩하는, hil-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45) 융합을 코딩하는 단편의 삽입. hIL-10의 발현 및 분비를 허용하기 위해, hil-10 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다.
● hil-10 유전자의 다운스트림에, 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프 (UniProt: Q9M4L6_wheat, 아미노산 57-89, 위치 66 및 80에서 글루타민 탈아미드화)를 기반으로 하는 프로테아제-저항성 33-mer인 탈아미드화된 DQ2 (ddq2)를 코딩하는 단편과 ps356 엔도리신 유전자 (ps356; 유전자 ID: 4798697) 분비 리더 (SSps356)의 융합을 코딩하는 단편의 삽입. dDQ2의 발현 및 분비를 허용하기 위해, ddq2 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034)를 선행하는 IR의 사용에 의해 hil-10에 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다.
도 16은 sAGX0868의 관련 유전적 유전자좌의 개략도를 도시한다. sAGX0868의 모든 유전적 특질은 박테리아 염색체에 상주한다. sAGX0868의 유전적 배경은 다음을 보장한다:
● hIL-10의 구성적 분비.
● dDQ2의 구성적 분비.
● 성장 및 생존을 위해 외인성으로 첨가된 티미딘에 대한 엄격한 의존성.
● 트레할로스를 축적하고 보유하는 능력으로 담즙산 독성에 저항하는 능력을 획득함.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 미생물 (예컨대, LAB), 예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 제1 LAB, 및 CeD-특이적 항원 폴리펩티드, 예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 단백질을 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 CeD-특이적 항원 폴리펩티드를 발현하는 제2 LAB를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들어, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 제1 LAB; 및 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 실시양태에서, 외인성 핵산은 2 개의 LAB 중 하나 이상에 염색체로 통합된다. 외인성 핵산 구조 및 서열에 관한 위에 기재된 실시양태는 이들 조성물의 제1 및 제2 LAB에 적용가능하다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하며, 여기서 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더는 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 미생물 (예컨대, LAB), 예컨대, 위에 기재된 변형 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 함유하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 변형 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하고 용매 및 안정화제를 추가로 함유하는 미생물 현탁액 (예컨대, 세균 현탁액)을 추가로 제공한다. 일부 예에서, 용매는 물, 오일, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 본 개시내용의 LAB, 수성 혼합물 (예컨대, 음료) 및 안정화제를 함유하는 박테리아 현탁액을 제공한다. 예시적인 안정화제는 단백질 또는 폴리펩티드 (예컨대, 당단백질), 펩티드, 단-(mono-), 이-(di-) 또는 다당류, 아미노산, 겔, 지방산, 폴리올 (예컨대, 소르비톨, 만니톨 또는 이노시톨), 염 (예컨대, 아미노산 염), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 개시내용은 셀리악 질환 (CeD)의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 미생물 (예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB), 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 예컨대, 질환, 예컨대, 자가면역 질환, 예컨대, 셀리악 질환 (CeD)의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 미생물 (예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB), 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 추가로 제공한다.
방법 1: 질환 치료 방법
본 개시내용은 CeD의 치료를 필요로 하는 대상체에 CeD의 치료 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 본원에 개시된 바와 같은 미생물 (예컨대, LAB) (예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB), 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 대상체는 인간, 예컨대, 인간 환자이다. 일부 예에서, 방법은 대상체에 추가적인 면역조정제 (예컨대, 항-CD3 항체)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 방법은 대상체에 추가적인 면역조정제를 투여하는 단계를 배제하며, 예컨대, 항-CD3 항체의 투여를 배제한다). 따라서, 일부 예에서, CeD의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 CeD의 치료를 위한 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 본원에 개시된 바와 같은 LAB (예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB), 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 약학 조성물의 치료적 유효량을 인간 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
개시된 방법에 의해 치료되는 대상체는 CeD에 대한 유전적 감수성이 있는 것으로, 예컨대, HLA-DQ2 및/또는 HLA-DQ8을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 위의 방법의 포유동물 대상체는 CeD로 진단되었다. CeD 진단을 위한 표준 수단은 알려져 있다. 예컨대, Rubio-Tapia et al., 2013, "ACG Clinical Guidelines: Diagnosis and Management of Celiac Disease," Am. J. Gastroenterol. 108: 656-676 참고. CeD의 진단은 병력, 신체 검사, 혈청학적 테스트, 및 십이지장 생검의 다중 생검의 조직학적 분석과 함께 상부 내시경으로부터의 소견의 조합한 다음, 글루텐 프리 식단에 대한 유리한 임상적 및 혈청학적 반응을 기반으로 하여, 진단을 확인할 수 있다. 혈청학적 테스트는 IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TGA) 및/또는 IgG 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP)에 대한 테스트를 포함할 수 있다. 조직학적 분석은 융모 높이/음와 깊이 비율 (융모 위축 및/또는 음와 과형성) 및/또는 상피내 림프구 계수 (IEL 증식)을 판정하는 것을 포함할 수 있다. 진단된 대상체는 미생물 (예컨대, LAB)을 투여하기 전, 예컨대, 이전 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 또는 5 개월 이내에 글루텐에 대한 최근의 이전 노출을 가졌을 수 있다. 대안적으로, 진단된 대상체는 미생물 (예컨대, LAB)을 투여하기 전, 예컨대, 6 개월 이전, 9 개월 이전, 12 개월, 24 개월 이전, 36 개월 이전, 또는 36 개월 초과 이전에 글루텐에 대한 보다 덜 최근의 이전 노출을 가졌을 수 있다.
방법 1에 대한 변동 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 방법은 대상체, 예컨대, 대상체의 장기 또는 혈액에서 임상 마커 (예컨대, 면역 바이오마커 및/또는 조직병리학적 마커)를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 임상 마커는 혈청학적 테스트 IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TGA) 및/또는 IgG 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP), 및 융모 높이/음와 깊이 비율 (융모 위축 및/또는 음와 과형성) 및/또는 상피내 림프구 계수 (IEL 증식)를 판정하는 조직학적 분석을 포함한다. 또한 Hindryckx et al., 2016, "Disease activity indices in coeliac disease: systematic review and recommendations for clinical trials," Gut 67: 61-69 참고.
관련된 실시양태에서, 본 발명은 글루텐에 대한 경구 내성을 증가시키는 방법이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 장 글루텐에 노출된 대상체에서 융모 위축을 예방하거나 실질적으로 감소시키는, 바람직하게는 제거하는 방법이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 글루텐에 노출된 대상체에서 융모 높이 대 음와 깊이 비율을 2.0 초과, 또는 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 또는 2.5 이상으로 실질적으로 증가시키는 방법이다. 다른 실시양태에서, 활성화 자연 살해 (NK) 수용체 NKG2D를 발현하는 CD4+ 및 CD8αβ+ 상피내 세포 (IEL)의 양을 실질적으로 저하시키고/시키거나 억제성 자연 살해 (NK) 수용체 NKG2A를 발현하는 CD4+ 및 CD8αβ+ 상피내 세포 (IEL)의 양을 증가시키는 방법을 개시한다. 다른 실시양태에서, 글루텐에 노출된 적이 있는 대상체의 상피내 림프구의 수, 예컨대, 장 상피 세포 100 개당 CD3+ IEL을 실질적으로 저하시키는 방법을 또한 개시한다. 글루텐에 노출된 대상체의 점막고유층 세포에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 실질적으로 증가시키는 다른 방법을 또한 개시한다. 글루텐에 노출된 대상체의 점막고유층 세포에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 실질적으로 증가시키는 다른 방법을 또한 개시한다. 글루텐에 노출된 대상체의 점막고유층 세포에서 내성-유도 림프구를 증가시키는 다른 방법을 또한 개시한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TGA), IgG 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP), 및 IgG 항-글리아딘 펩티드 중 하나 이상의 양을 감소시키는 방법이다.
위의 방법 중 임의의 것에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 대상체에 경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 미생물 (예컨대, LAB)은 미생물 (예컨대, LAB) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 경구 투여용 약학 조성물의 형태 (예컨대, 캡슐, 정제, 과립 또는 액체)로 대상체에 투여된다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 식품의 형태로 대상체에 투여될 수 있거나, 식품 (예컨대, 음료)에 첨가될 수 있다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 식이 보충제의 형태로 대상체에 투여된다. 또 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 좌약 제품의 형태로 대상체에 투여된다. 일부 예에서, 본 개시내용의 조성물은 미생물 (예컨대, LAB)에 의해 발현되는 폴리펩티드의 점막 전달에 적합하다. 예를 들어, 조성물은 대상체의 위-장관 (예컨대, 소화관)에서 효율적인 방출을 위해 제형화될 수 있다.
기재된 다양한 방법은 또한 CeD-특이적 항원 폴리펩티드에 대한 내성의 확립을 필요로 하는 대상체에 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA- DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드에 대한 내성을 확립하는 단계를 고려한다. 예시적인 방법은 본원에 개시된 바와 같은 미생물 (예컨대, LAB) (예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB), 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에 따른 일부 예에서, 대상체는 인간, 예컨대, 인간 환자이다.
추가 실시양태에서, 치료적 방법은 예컨대, 임의의 임상 증상 전 투여에 의해 CeD를 예방하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 본원에 논의된 바와 같이 하나 이상의 CeD 위험 인자를 갖고 유전적 소인, 즉, HLA-DQ2 및/또는 HLA-DQ8을 포함하는 유전자형을 포함하는 것으로 식별된다. 다른 CeD 위험 인자는 CeD (특히 형제자매), T1D 당뇨병, 다운 앤 터너 증후군, 포진 피부염, 자가면역 내분비병증, 특히 갑상선 질환, 자가면역 간염 및 원발성 담즙성 간경변증의 확인된 진단을 갖는 1-촌 가족을 포함한다. 예컨대, Gujral et al., 2012, "Celiac disease: prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment," World J. Gastroenterol. 18(42): 6036-59 참고.
방법 2: CeD 치료를 위한 유전자-변형된 유기체의 제조 방법
본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, LAB)을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. (부위-특이적 재조합으로서 또한 알려진 부위-지시된 염색체 통합을 포함하여) 부위-지시된 통합의 다양한 방법은 잘 알려져 있으며 본원에 개시된 재조합 LAB를 생성하는 데 적용될 수 있다. 예시적인 방법은 (i) 미생물 (예컨대, LAB)을 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산과 접촉시키는 단계; 및 (ii) 미생물 (예컨대, LAB)을 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 염색체로 통합된다 (즉, 미생물, 예컨대, LAB의 염색체로 통합됨). 핵산이 예컨대, 염색체에서 미생물 (예컨대, 박테리아) 게놈에 통합되는 경우, 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, LAB)이 형성된다. 현재 방법의 유전적 변형이 적용된 미생물 (예컨대, LAB)은 임의의 미생물 균주일 수 있으며, 예컨대, 야생형 박테리아 균주일 수 있거나, IL-10 폴리펩티드을 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산과 접촉하기 전에 유전적으로 변형될 수 있다.
일부 예에서, 위의 방법은 상동 재조합을 사용하여, 핵산을 미생물 (예컨대, 박테리아) 염색체로 통합한다. 따라서, 일부 예에서, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 상동 재조합을 사용하여 (예컨대, 각자의 핵산을 함유하는 하나 이상의 통합 플라스미드를 사용하여) 염색체로 통합된다. 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)을 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드)과 접촉시키는 단계는 LAB를 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프 폴리펩티드를 포함하는 글리아딘 펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드)과 접촉시키기 전에 발생한다. 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)을 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드)과 접촉시키는 단계는 LAB를 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프 폴리펩티드의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드)과 접촉시킨 후에 발생한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에 따른 또 다른 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드), 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프 폴리펩티드를 포함하는 글리아딘 펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 통합 플라스미드), 또는 hIL-10 및 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드 둘 모두를 코딩하는 외인성 핵산과 동시에 접촉된다.
일부 예에서, 방법은 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, LAB)의 배양물을 하나 이상의 안정화제 (예컨대, 동결보존제)와 조합하여, 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 방법은 건조된 조성물을 형성하는 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물로부터 물을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물을 동결-건조시켜, 동결-건조된 조성물을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 방법은 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, LAB) 또는 건조된 조성물 (예컨대, 동결-건조된 조성물)을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여, 약학 조성물을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 또한 건조된 조성물 (예컨대, 동결-건조된 조성물) 또는 약학 조성물을 약학 투여량 형태로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 방법 (예컨대, 방법 2의 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법)에 의해 제조된 유전적으로 변형된 미생물 (예컨대, 유전적으로 변형된 LAB)을 추가로 제공한다.
방법 3: 약학 조성물의 제조 방법
본 개시내용은 약학 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 방법은 본원에 개시된 바와 같은 미생물 (예컨대, LAB)(예컨대, 위의 실시양태 중 임의의 것에 따른 LAB)의 배양물을 하나 이상의 안정화제 (예컨대, 동결보존제)와 접촉시켜, 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 안정화제는 하나 이상의 동결보존제를 포함한다. 일부 예에서, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유할 수 있으며, CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 함유하며, 여기서 IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 둘 모두 염색체로 통합, 즉 미생물 (예컨대, 박테리아) 염색체에 통합 (또는 위치)된다.
이러한 방법은 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물로부터 물을 제거하여, 건조된 조성물을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 미생물 (예컨대, 박테리아) 혼합물을 동결-건조시켜, 동결-건조된 조성물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
방법 3에 따른 일부 예에서, 방법은 건조된 조성물 (예컨대, 동결-건조된 조성물)을 약학 조성물을 형성하는 약학적으로 허용가능한 담체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 건조된 조성물 (예컨대, 동결-건조된 조성물)을 약학 투여량 형태, 예컨대, 정제, 캡슐 또는 사쉐(sachet)로 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
유닛 투여량 형태
따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 미생물 (예컨대, LAB, 예컨대 sAGC0868)을 포함하는 유닛 투여량 형태, 본 개시내용의 건조된 조성물 (예컨대, 본 개시내용의 동결-건조된 조성물) 또는 본 개시내용의 약학 조성물을 추가로 제공한다. 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 경구 투여량 형태, 예컨대, 정제, 캡슐 (예컨대, 분말을 함유하거나 미세-펠렛 또는 미세-과립을 함유하는 캡슐), 과립, 또는 (예컨대, 경구 투여용 액체 현탁액용 건조 박테리아를 함유하는) 사쉐이다. 일부 실시양태에서, 투여량 형태에 함유된 비-병원성 미생물 (예컨대, LAB)은 건조-분말 형태 또는 이의 압축된 버전이다.
이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 미생물 (예컨대, LAB)의 약 1×104 내지 약 1×1012 개의 콜로니-형성 유닛 (cfu)을 함유한다. 다른 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×106 내지 약 1×1012 개의 콜로니 형성 유닛 (cfu)의 미생물 (예컨대, LAB)을 함유한다. 다른 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×108 내지 약 1×1011 개의 cfu를 함유한다. 또 다른 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×109 내지 약 1×1012 개의 cfu를 함유한다. 일부 예에서, 유닛 투여량은 sAGX0868의 약 1×104 내지 약 1×1012 개의 콜로니-형성 유닛 (cfu)을 함유한다. 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×108 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1010 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1011 개의 cfu sAGX0868을 함유한다.
키트
본 개시내용은 (1) 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB, 예컨대, sAGX0868), 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 조성물, 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 약학 조성물, 또는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 미생물 (예컨대, LAB)을 함유하는 유닛 투여량 형태; 및 (2) 포유류, 예컨대, 인간 (예컨대, 인간 환자)에 미생물 (예컨대, LAB), 조성물, 약학 조성물 또는 유닛 투여량 형태를 투여하기 위한 지침서를 함유하는 키트를 추가로 제공한다.
위에-기재된 위의 방법, 생성물 및 조성물 각각에서, 및 본원에 추가로 개시된 바와 같이, 인터류킨-10은 선정된 일차 사이토카인이다. 위에-기재된 위의 방법, 생성물 및 조성물 각각에서, 및 본원에 추가로 개시된 바와 같이, 인터류킨-2는 인터류킨-10에 대한 대안이다.
B. 정의 및 추가 상세한 설명
명세서, 실시양태 및 실시양태에 사용된 바와 같이, 단수형 "(단수형)"은 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다. 유사하게, 본원에 기재된 바와 같은 의약의 치료 또는 제조를 위한 "화합물"의 사용은 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 이러한 치료 또는 제조를 위해 본 발명의 하나 이상의 화합물을 사용하는 것을 고려한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하나, 다른 것을 배제하지 않음을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용될 때 "본질적으로 이로 이루어진"은 조합에 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본질적으로 본원에 정의된 바와 같은 요소로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터 미량의 오염물질 및 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 포스페이트 완충된 식염수 및 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "이로 이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 초과의 요소를 배제하는 것을 의미한다. 이러한 이행 용어 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 발명의 범주 내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 유전자 또는 폴리펩티드를 "발현하는" 또는 폴리펩티드 (예컨대, IL-10 폴리펩티드 또는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드)를 "생산하는", 또는 폴리펩티드를 "분비하는"은 각자 "발현할 수 있는" 및 "생산할 수 있는" 또는 "분비할 수 있는"을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 외인성 핵산을 함유하는 미생물은 충분한 조건 (예컨대, 충분한 수화 및/또는 영양소의 존재) 하에서 외인성 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현 및 분비할 수 있다. 그러나, 미생물은 코딩된 폴리펩티드를 항상 활성적으로 발현하지 않을 수 있다. 미생물 (예컨대, 박테리움)은 건조 (예컨대, 동결-건조)될 수 있으며, 해당 상태에서는 휴면기로 간주될 수 있다 (즉, 폴리펩티드를 활성적으로 생산하지 않음). 그러나, 일단 미생물이 충분한 조건에 적용되면, 예컨대, 대상체에 투여되고 (예컨대, 대상체의 위-장관에서) 방출되면, 폴리펩티드의 발현 및 분비를 시작할 수 있다. 따라서, 유전자 또는 폴리펩티드를 "발현"하거나, 폴리펩티드를 "생산"하거나, 본 개시내용의 폴리펩티드를 "분비"하는 미생물은 "휴면기" 상태의 미생물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "분비하다"는 단백질이 세포 외부로 및 배양 배지/상청액 또는 다른 세포외 환경으로 내보내지는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로모터의 맥락에서 (또는 폴리펩티드의 유전자 발현 또는 분비와 관련한 확장에 의해) 용어 "구성적"은 연관된 유전자의 거듭되는 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다. 구성적 프로모터는 "유도성" 프로모터와 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 프로모터의 맥락에서 (또는 폴리펩티드의 유전자 발현 또는 분비와 관련한 확장에 의해) 용어 "유도성"은 상기 프로모터의 인듀서의 존재 하에 작동가능하게 연결된 유전자의 증가된 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다.
참조 수치와 관련하여 용어 "약", 및 본원에 사용된 바와 같은 이의 문법적 등가물은 참조 수치 자체 및 해당 참조 수치로부터 10% 플러스 또는 마이너스 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용어 "약 10"은 10 및 9 내지 11을 포함하는 임의의 양을 포함한다. 일부 경우에, 참조 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 해당 참조 수치로부터 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 플러스 또는 마이너스 값의 범위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 방법에 의해 측정된 수 또는 범위와 관련된 "약"은 주어진 수치가 해당 방법의 가변성에 의해 결정된 값을 포함한다는 것을 나타낸다.
범위: 본 개시내용을 통해, 본 발명의 다양한 양태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 제시된 범위 사이의 임의의 및 모든 전체 또는 부분 정수가 본원에 포함되는 것으로 이해된다. 범위의 설명은 또한 가능한 모든 하위범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대, 1 내지 6의 설명은 하위범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
개시된 물질의 조성물 및 방법과 관련하여 본 개시내용에서 구상된 바와 같이, 일 양태에서, 개시내용의 실시양태는 본원에 개시된 구성요소 및/또는 단계를 포함한다. 다른 양태에서, 개시내용의 실시양태는 본질적으로 본원에 개시된 구성요소 및/또는 단계로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 개시내용의 실시양태는 본원에 개시된 구성요소 및/또는 단계로 이루어진다.
용어 "염색체로 통합된" 또는 "염색체에 통합된" 또는 이의 임의의 변동은 핵산 서열 (예컨대, 유전자; 오픈 리딩 프레임; 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산; 프로모터; 및 발현 카세트 등)이 미생물 (예컨대, 박테리아) 염색체에 위치 (통합)되는 것, 즉, 에피솜 벡터, 예컨대, 플라스미드에 위치하지 않는 것을 의미한다. 핵산 서열이 염색체로 통합된 일부 실시양태에서, 이러한 염색체로 통합된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 구성적으로 발현된다. 예를 들어, 염색체로 통합된 예시적인 핵산 서열은 통합된 핵산이 코딩하는 폴리펩티드를 유도적으로 발현할 수 있다.
"IL-10 유전자"는 "IL-10 폴리펩티드"를 코딩하는 인터류킨 10 유전자를 지칭한다. 용어 "IL-10 유전자"는 "IL-10 변이체 폴리펩티드"를 코딩하는 "IL-10 변이체 유전자"를 포함한다. IL-10 유전자는 포유동물 유전자 (예컨대, 소, 말, 양, 염소, 뮤린, 영장류 등)일 수 있다. IL-10 유전자는 바람직하게는 인간 IL-10 폴리펩티드를 인간 IL-10 폴리펩티드의 변이체로 코딩한다. LAB에서 IL-10을 코딩하는 DNA 서열은 LAB에서 발현을 용이하게 하기 위해 최적화된 코돈일 수 있고, 그 자체로 천연 유기체 (예컨대, 인간)에서와 상이할 수 있다.
용어 "IL-10" 또는 "IL-10 폴리펩티드"는 적어도 성숙한 형태의 아미노산 서열 (즉, 이의 분비 신호 없음)을 갖지만 또한 막-결합된 형태 및 가용성 형태를 포함하는 기능적 IL-10 폴리펩티드 (예컨대, 인간 IL-10 폴리펩티드)뿐만 아니라 "IL-10 변이체 폴리펩티드"를 지칭한다.
"IL-10 변이체" 또는 "IL-10 변이체 폴리펩티드"는 변형된 (예컨대, 절삭된 또는 돌연변이된) 그러나 기능적 IL-10 폴리펩티드, 예컨대, 인간 IL-10의 절삭된 또는 돌연변이된 버전을 지칭한다. 용어 "IL-10 변이체 폴리펩티드"는 상응하는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 비교할 때 향상된 활성 또는 줄어든 활성을 갖는 IL-10 폴리펩티드를 포함한다. "IL-10 변이체 폴리펩티드"는 적어도 일부 IL-10 활성 (기능적 폴리펩티드)을 보유한다.
"IL-2 유전자"는 "IL-2 폴리펩티드"를 코딩하는 인터류킨 2 유전자를 지칭한다. 용어 "IL-2 유전자"는 "IL-2 변이체 폴리펩티드"를 코딩하는 "IL-2 변이체 유전자"를 포함한다. LAB에서 IL-2를 코딩하는 DNA 서열은 LAB에서 발현을 용이하게 하기 위해 최적화된 코돈일 수 있고, 그 자체로 천연 유기체 (예컨대, 인간)에서와 상이할 수 있다.
용어 "IL-2" 또는 "IL-2 폴리펩티드"는 적어도 성숙한 형태의 아미노산 서열 (즉, 이의 분비 신호 없음)을 갖지만 또한 막-결합된 형태 및 가용성 형태를 포함하는 기능적 IL-2 폴리펩티드 (예컨대, 인간 IL-2 폴리펩티드)뿐만 아니라 "IL-2 변이체 폴리펩티드"를 지칭한다.
"IL-2 변이체" 또는 "IL-2 변이체 폴리펩티드"는 변형된 (예컨대, 절삭된 또는 돌연변이된) 그러나 기능적 IL-2 폴리펩티드, 예컨대, 인간 IL-2의 절삭된 또는 돌연변이된 버전을 지칭한다. 용어 "IL-2 변이체 폴리펩티드"는 상응하는 야생형 IL-2 폴리펩티드와 비교할 때 향상된 활성 또는 줄어든 활성을 갖는 IL-2 폴리펩티드를 포함한다. "IL-2 변이체 폴리펩티드"는 적어도 일부 IL-2 활성 (기능적 폴리펩티드)을 보유한다.
셀리악 스프루(celiac sprue) 또는 글루텐-민감성 장병증으로서 또한 알려진 셀리악 질환은 글루텐을 함유하는 특이적 식이 곡물에 대한 면역 반응으로부터 발달하는 만성 염증성 질환이다. 글루텐의 섭취시, 면역계가 소장을 공격하고 중요한 영양소의 흡수를 억제함으로써 반응한다. 셀리악은 인간 백혈구 항원 (HLA) 변이체 HLA-DQ2 또는 HLA-DQ8을 코딩하는 유전자와 강하게 연관된 복합 다유전자 장애이다. 2 개의 HLA-DQ2 아이소폼, HLA-DQ2.2 및 HLA-DQ2.5가 있으며, 그 중 HLA-DQ2.5는 CeD의 가장 높은 위험과 연관된 일배체형이다 (Fallang et al., 2009, "Differences in the risk of celiac disease associated with HLA-DQ2.5 or HLA-DQ2.2 are related to sustained gluten antigen presentation," Nat. Immunol. 10(10): 1096-1101). CeD 환자의 대략 90%가 HLA-DQ2 일배체형을 지니는 반면, HLA-DQ8은 환자의 5-10%에서 발견된다 (Sollid, 2000, "Molecular basis of celiac disease," Annu. Rev. Immunol. 18: 53-81). 셀리악 질환의 발병기전에서 가장 중요한 양태 중 하나는 T-헬퍼 1 면역 반응의 활성화이다. 이는 HLA-DQ2/DQ8 분자를 발현하는 항원-제시 세포 (APC)가 CD4+ T-세포에 독성 글루텐 펩티드를 제시할 때 발생한다. 글루텐의 특정 구성요소, 즉, 글리아딘, 글루테닌, 호르데인 및 세칼린은 프롤린 및 글루타민 잔기의 높은 함량을 함유하여 위-장관 효소에 의한 분해에 저항성을 갖게 한다 (Gujral et al., 2012, "Celiac disease: prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment," World J. Gastroenterol. 18(42): 6036-6059). 그 결과, 글루텐-함유 식사 후에 잠재적인 면역활성 펩티드의 상승된 장 농도가 유지된다. 이들 소화되지 않은 펩티드 단편은 글루타민을 글루타메이트로 전환시키는 조직 트랜스글루타미나제 2 (tTG2)에 의해 탈아미드화된다. 이는 항원 제시 세포 (APC) 상의 HLA-DQ2 및 HLA-DQ8에 대해 더 강한 결합 친화도를 갖는 음전하를 도입하며 (Kupfer et al., 2012, "Pathophysiology of celiac disease," Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 22(4): 639-660), 이는 보다 엄격한 글루텐-특이적 CD4+ T 헬퍼 유형 1 세포 (Th1) 활성화를 야기한다 (Schuppan et al., 2009, "Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies," Gastroenterology 137(6): 1912-1933). 따라서, 탈아미드화는 에피토프의 면역원성을 향상시킨다. 글루텐 구성요소는 HLA-DQ2 및 HLA-DQ8, 즉, 셀리악-특이적 T 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는 펩티드를 함유한다. 지금까지 12 개 초과의 셀리악-특이적 T 세포 에피토프가 대부분이 HLA-DQ2-제한되는 (Tollefsen et al., 2006, "HLA-DQ2 and -DQ8 signatures of gluten T cell epitopes in celiac disease," J. Clin. Invest. 116(8): 2226-2236) 글리아딘으로부터 식별되었다 (Arentz-Hansen et al., 2002, "Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadins rich in proline residues," Gastroenterology 123(3): 803-809). 글루텐 단백질의 두 부류인 글리아딘 및 글루테닌은 HLA-DQ2 및 HLA-DQ8에 특이적으로 결합하는 펩티드 서열을 함유한다.
"CeD-특이적 항원 폴리펩티드"는 HLA-DQ2 및/또는 HLA-DQ8에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 펩티드 서열을 포함하는 글루텐 단백질을 지칭한다. 예시적인 CeD-특이적 항원 폴리펩티드는 글리아딘 및 글루테닌이다. HLA-DQ2 및/또는 HLA-DQ8에 특이적으로 결합하는 펩티드 서열은 CeD-특이적 T 세포 에피토프이다. 본원에 사용된 바와 같이, HLA-DQ2 특이적 에피토프는 HLA-DQ2에 결합하는 CeD-특이적 T 세포 에피토프이고, HLA-DQ8 특이적 에피토프는 HLA-DQ8에 결합하는 CeD-특이적 T 세포 에피토프이다.
"CeD-특이적 항원 폴리펩티드 유전자"는 "CeD-특이적 항원 폴리펩티드"를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 용어 "CeD-특이적 항원 폴리펩티드 유전자"는 "CeD-특이적 항원" 또는 "CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드"의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함한다. LAB에서 CeD-특이적 항원을 코딩하는 DNA 서열은 LAB에서 발현을 용이하게 하기 위해 코돈 최적화될 수 있으며, 그 자체로 천연 유기체 (예컨대, 인간)에서와 상이할 수 있다.
용어 "CeD-특이적 항원 폴리펩티드"는 기능적, 예컨대, 전장, 폴리펩티드뿐만 아니라 "CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드"를 지칭하며, 이는 상응하는 야생형 폴리펩티드와 비교할 때 향상된 활성 또는 줄어든 활성을 가질 수 있다.
용어 "CeD-특이적 항원 변이체" 또는 "CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드"는 변형된 (예컨대, 절삭된 및/또는 돌연변이된), 그러나 기능적 폴리펩티드, 예컨대, 글리아딘 또는 글루테닌의 절삭된 및/또는 돌연변이된 버전을 지칭한다. 특히, 용어 "CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드"는 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 글리아딘은 CeD, 특히 밀 (예컨대, 트리티쿰 아에스티붐 및 트리티쿰 스펠타), 호밀 (예컨대, 세칼레 세레알) 또는 보리 (예컨대, 호르둠 불가레) 글루텐과 연관된 임의의 글루텐으로부터 선택될 수 있다. HLA-DQ2-특이적 에피토프 및 HLA-DQ8-특이적 에피토프는 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제8,748,126호, 제9,017,690호, 제10,105,437호 및 제10,053,497호, 및 Vader et al., 2003, "Characterization of cereal toxicity for celiac disease patients based on protein homology in grains," Gastroenterology 1225: 1105-1113 참고. 알파-글리아딘은 주요 T-세포 에피토프, 예컨대, DQ2.5-glia-α1, DQ2.5-glia-α2 및 DQ2.5-glia-α3을 포함하며 글루텐 단백질의 가장 면역원성 분획이다 (예컨대, Ruiz-Carnicer et al., 2019, Nutrients, 11, 220; doi:10.3390/nu11020220 참고). 밀 α-글리아딘 단백질은 3 개의 고도의 자극성 에피토프의 6 개의 중첩 카피를 포함하는 33 개의 아미노산 펩티드에 3 개의 주요 면역원성 펩티드를 함유한다 (예컨대, Ozuna et al., 2015, The Plant Journal, 82: 794-805 참고). 본 개시내용에서 예시적인 HLA-DQ2-특이적 에피토프는 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프를 포함하는 33 개의 아미노산 단편 LQLQPFPQP Q LPYPQPQLPYPQP Q LPYPQPQPF (UniProt: Q9M4L6의 아미노산 57-89; 서열번호 3) 및 이의 상응하는 탈아미드화된 버전 LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (UniProt: Q9M4L6의 위치 66 및 80에 상응하는 아미노산은 탈아미드화됨; 서열번호 7)을 포함한다. 예시적인 HLA-DQ8-특이적 에피토프는 QYPSG Q GSFQPSQ Q NPQA (UniProt Q9M4L6의 아미노산 225-242; 서열번호 5) 및 이의 상응하는 탈아미드화된 버전 QYPSG E GSFQPSQ E NPQA (서열번호 9)를 포함한다. 항원성 특성 (예컨대, HLA-DQ8-특이적 또는 HLA-DQ2 특이적)을 보유하는 알려진 에피토프의 서열 변이체는 또한 본 개시내용의 조성물 및 방법에 유용하다. 일반적으로, CeD-특이적 항원의 절삭된 버전은 미생물 (예컨대, 락토코커스 락티스)에 의해 효율적으로 발현 및 분비된다.
폴리펩티드 서열 사이의 "백분율 동일성"은 참조 서열을 질의 서열과 비교하는 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 기본 매개변수를 사용하여 (예컨대, BLASTP 또는 CLUSTAL 또는 기타 정렬 소프트웨어에 의해 측정된 바와 같이) 참조 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대해 70%, 70% 이상, 75%, 75% 이상, 80%, 80% 이상, 85%, 85% 이상, 90%, 90% 이상, 92%, 92% 이상, 95%, 95% 이상, 97%, 97% 이상, 98%, 98% 이상, 99%, 또는 99% 이상 또는 100% 동일하다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산과 관련하여 기재될 수 있으며, 예컨대, 이들은 (예컨대, BLASTN 또는 CLUSTAL, 또는 기본 매개변수를 사용한 기타 정렬 소프트웨어에 의해 측정된 바와 같이) 참조 핵산 또는 이의 단편에 대해 50%, 50% 이상, 60%, 60% 이상, 70%, 70% 이상, 75%, 75% 이상, 80%, 80% 이상, 85%, 85% 이상, 90%, 90% 이상, 95%, 95% 이상, 97%, 97% 이상, 98%, 98% 이상, 99%, 99% 이상 또는 100% 동일할 수 있다. 하나의 분자가 더 큰 분자와 특정 백분율의 서열 동일성을 갖는다고 할 때, 이는 2 개의 분자가 최적으로 정렬되었을 때 작은 분자의 잔기 백분율이 2 개의 분자가 최적으로 정렬된 순서에 따라 더 큰 분자에서의 매칭 잔기를 찾는 것을 의미하고, "%" (퍼센트) 동일성은 더 작은 분자의 길이에 따라 계산된다.
셀리악 질환
용어 "셀리악 질환"은 편평한 소장 점막 (과형성 융모 위축)을 특징으로 하는 중증 형태 및 더 경미한 증상을 특징으로 하는 기타 형태를 포함하는 다양한 정도의 글루텐 민감도에 의해 유발되는 대상체에서의 병태의 스펙트럼을 포함한다. 예컨대, Rubio-Tapia et al., 2013, Am. J. Gastroenterol. 108:656-676 and Ludvigsson et al., 2014, "BSG Coeliac Disease Guidelines Development Group; British Society of Gastroenterology. Diagnosis and management of adult coeliac disease: guidelines from the British Society of Gastroenterology," Gut 63(8): 1210-28; Epub 2014 Jun 10 참고.
대상체
"대상체"는 예컨대, 본 개시내용의 방법에 따라 본 개시내용의 조성물이 투여되는 것으로부터 이익을 있을 수 있는 유기체이다. 대상체는 포유류 ("포유동물 대상체")일 수 있다. 예시적인 포유동물 대상체는 인간, 농장 동물 (예컨대, 소, 돼지, 말, 양, 염소), 애완동물 또는 가축 (예컨대, 개, 고양이 및 토끼), 및 기타 동물, 예컨대, 마우스, 랫트 및 영장류를 포함한다. 일부 예에서, 포유동물 대상체는 인간 환자이다
프로모터
"프로모터"는 일반적으로 RNA 폴리머라제가 결합하고 전사를 개시하는 핵산 분자, 예컨대, DNA 분자 상의 영역을 의미한다. 프로모터는 예를 들어, 이것이 제어하는 전사 서열의 업스트림, 즉 5'에 위치한다. 당업자는 프로모터가 추가적인 천연 조절 서열 또는 영역, 예컨대, 오퍼레이터와 연관될 수 있는 것임을 이해할 것이다. 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 유기체마다 다를 수 있지만, 일반적으로 원핵생물에서 (RNA 전사의 개시를 지시하는) 프로모터뿐만 아니라 RNA로 전사될 때 단백질 합성의 개시의 신호를 보낼 DNA 서열 둘 모두를 함유하는 프로모터 영역을 포함해야 한다. 이러한 영역은 보통 전사 및 번역의 개시와 연루된 5'-비-코딩 서열, 예컨대, Pribnow-박스 (cf. TATA-박스) 및 Shine-Dalgarno 서열 등을 포함할 것이다.
용어 "분비 리더 서열", "분비 리더" 및 "분비 신호 서열"은 본원에 상호교환적으로 사용된다. 용어는 당업계에 인정된 의미에 따라 사용되며, 일반적으로 "신호 펩티드" 또는 "분비 신호 펩티드"를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "분비 리더"는 또한 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 신호 펩티드 또는 분비 신호 펩티드 또는 분비 리더는 미생물에 의해 발현되고 신호 펩티드 또는 분비 리더를 포함하는 폴리펩티드가 미생물에 의해 분비되도록 하며, 즉, 폴리펩티드가 세포내 공간에 남겨지도록, 예컨대, 주변 배지에 분비되도록, 또는 예컨대, 미생물의 표면 상에서 폴리펩티드의 적어도 일부가 주변 배지에 노출되도록 세포벽에 고정되도록 한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. 예를 들어, 연결 또는 연접이 상기 유전자의 전사를 허용하거나 영향을 미치는 경우, 프로모터는 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다고 한다. 추가 예에서, 연결 또는 연접이 적어도 3' 유전자의 번역을 허용하거나 영향을 미치는 경우, 5' 및 3' 유전자, 시스트론, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열은 폴리시스트론 발현 유닛에 작동가능하게 연결되어 있다고 한다. 예를 들어, DNA 서열, 예컨대, 프로모터 및 오픈 리딩 프레임은 서열 간의 연결의 성질이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 오픈 리딩 프레임의 전사를 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나, (3) 프로모터 영역 서열에 의해 전사되는 오픈 리딩 프레임의 능력을 방해하지 않는 경우 작동가능하게 연결되어 있다고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 융합 폴리펩티드는 상이한 기원의 2 개 이상의 코딩 서열 또는 개재 아미노산 링커 서열이 있거나 없는 상이한 기원의 코딩 서열의 일부를 함유할 수 있는 단일 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 폴리펩티드와 관련하여, 및 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "융합된"은 각각의 구성요소가 융합되지 않은 경우와 같이 다른 구성요소에 대한 융합에서 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭한다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 "융합된"은 제1 및 제2 폴리펩티드 서열 사이의 직접적인 공유 연결 및 간접적인 공유 연결, 예컨대, 제1 및 제2 폴리펩티드 서열 사이에 개재 아미노산 링커 서열이 있는 것 둘 모두를 포함한다. 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 관련하여, 어구 "작동가능하게 연결된"은 상이한 기원의 2 개 이상의 코딩 서열의 서열 또는 개재 아미노산 링커를 코딩하는 서열이 있거나 없는 상이한 기원의 코딩 서열의 일부가 코딩 서열이 동일한 프레임에 있도록 하여 번역될 때 상이한 기원의 2 개 이상의 2 개 이상의 코딩 서열 또는 상이한 기원의 코딩 서열의 일부에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대한 정확한 아미노산 서열을 산출한다는 사실을 지칭한다.
발현 카세트
용어 "발현 카세트" 또는 "발현 유닛"은 당업계에서 이의 일반적으로 허용되는 의미에 따라 사용되며, 하나 이상의 유전자 및 하나 이상의 유전자의 발현을 제어하는 서열을 함유하는 핵산을 지칭한다. 예시적인 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 서열 및 하나 이상의 오픈 리딩 프레임을 함유한다
폴리시스트론 발현 카세트
용어 "폴리시스트론 발현 카세트" "폴리시스트론 발현 유닛" 또는 "폴리시스트론 발현 시스템"은 본원에 상호교환적으로 및 당업계에서 이들의 일반적으로 허용되는 의미에 따라 사용된다. 이들은 2 개 이상의 유전자의 발현이 보통의 조절 메커니즘, 예컨대, 프로모터 및 오퍼레이터 등에 의해 조절되는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 폴리시스트론 발현 유닛은 멀티시스트론 발현 유닛과 동의어이다. 폴리시스트론 발현 유닛의 예는 제한 없이 바이시스트론, 트리시스트론 및 테트라시스트론 발현 유닛이다. 2 개 이상, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이상의, 개별 발현 생성물, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역을 포함하는 임의의 mRNA는 용어 폴리시스트론 내에 포함된다. 폴리시스트론 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터, 및 프로모터에 의해 제어되는 2 개 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 여기서 유전자간 영역은 2 개의 오픈 리딩 프레임 사이에 임의로 배치된다.
일부 예에서, "폴리시스트론 발현 카세트"는 미생물 (예컨대, LAB)에 내인성인 프로모터에 의해 전사적으로 제어되는 하나 이상의 내인성 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리시스트론 발현 유닛 또는 시스템은 미생물 (예컨대, LAB)에 외인성인 프로모터에 의해 전사적으로 제어될 수 있다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 번역적으로 또는 전사적으로 커플링된 하나 이상의 내인성 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자는 상기 하나 이상의 내인성 유전자 (중 하나)의 천연 프로모터에 의해 전사적으로 제어된다. 바람직하게는, 미생물 (예컨대, LAB)에서, 폴리시스트론 발현 카세트는 염색체에 통합되어, 내인성 유전자가 미생물의 천연 염색체 유전자좌에 위치하도록 한다. 다른 실시양태에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 상기 폴리시스트론 발현 유닛에 포함된 상기 하나 이상의 내인성 유전자 (중 하나)의 천연 프로모터에 의해 전사적으로 제어된다. 다른 실시양태에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 그람-양성 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터는 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임(들)의 업스트림, 즉, 5'에 위치할 수 있다. 추가 실시양태에서, 프로모터는 폴리시스트론 발현 유닛에서 가장 5', 즉, 가장 업스트림의 내인성 유전자의 천연 프로모터이다. 따라서, 일부 예에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 내인성 유전자 및 상기 하나 이상의 내인성 유전자의 3' 단부에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 외인성 유전자를 함유하며, 예를 들어, 여기서 상기 하나 이상의 외인성 유전자(들)는 폴리시스트론 발현 유닛의 가장 3'의 유전자(들)이다. 예시적인 폴리시스트론 발현 시스템은 WO 2012/164083호 및 미국 특허 제9,920,324호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 원용된다.
일 실시양태에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 다음을 포함하며: (i) 내인성 유전자 프로모터; (ii) 내인성 유전자 프로모터의 3'에 위치한 내인성 유전자; (iii) 유전자간 영역; 및 (iv) hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산, 여기서 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 hIL-10 코딩 서열에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 여기서 내인성 유전자 및 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다. 일 실시양태에서, 폴리시스트론 발현 유닛은 (i) hIL-10을 코딩하는 상기 외인성 핵산의 3'에 위치한 제2 유전자간 영역; 및 (ii) 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 여기서 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산 및 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산은 제2 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링된다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리시스트론 통합 벡터"는 폴리시스트론 발현 유닛을 표적 핵산에 통합하기 위한 벡터이다. 폴리시스트론 통합 벡터는 핵산 작제물이고 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 유전자간 영역을 포함하는 다중핵산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 2 개 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역을 포함한다. 하나 이상의 유전자간 영역은 2 개의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역을 전사적으로 커플링한다. 일부 예에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 2 개 이상의 유전자간 영역 및 2 개 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역을 포함한다. 일부 예에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 코딩 영역에 프레임 내 융합된 분비 리더를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된 제1 유전자간 영역, 제1 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역의 3' 단부에 전사적으로 커플링된 제2 유전자간 영역을 포함하며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된다. 이 폴리시스트론 통합 벡터의 구조는 유전자간 영역>>오픈 리딩 프레임>>유전자간 영역>>오픈 리딩 프레임으로서 나타낼 수 있다.
추가 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 3' 단부에서, 코딩 영역에 프레임 내 융합된 분비 리더를 코딩하는 서열에 전사적으로 커플링된 제1 유전자간 영역, 코딩 영역의 3' 단부에 전사적으로 커플링된 제2 유전자간 영역을 포함하고, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서, 제2 코딩 영역에 프레임 내 융합된 분비 리더를 코딩하는 서열에 전사적으로 커플링된다. 이 폴리시스트론 통합 벡터의 5' 내지 3' 구조는 유전자간 영역>>코딩 영역에 융합된 분비 리더>>유전자간 영역>>코딩 영역에 융합된 분비 리더로서 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터 구조는 유전자간 영역>>hil-10에 융합된 분비 리더>>유전자간 영역>>CeD-특이적 항원에 융합된 분비 리더로서 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터 구조는 유전자간 영역>>hil-10에 융합된 SSusp45>>유전자간 영역>>탈아미드화된 HLA-DQ2-특이적 에피토프에 융합된 SSps356으로서 나타낼 수 있다. 일 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 IRrpmD>>SSusp45-hil-10>>IRrplN>>SSps356-CeD-특이적 항원으로서 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 조절 서열, 예컨대, 정지 코돈 및 출발 코돈을 추가로 포함한다.
폴리시스트론 통합 벡터는 유전자간 영역의 3' 단부에서 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열을 다른 핵산 서열로 클로닝하는 데 적합하다. 일부 예에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 미생물, 예컨대, 그람-양성 박테리움에서 복제되기에 적합하다. 일부 예에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 미생물, 예컨대, 그람-양성 박테리움에서 상동 재조합을 이뤄내는 데 적합하다. 특히, 폴리시스트론 통합 벡터는 유전자간 영역 및 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역의 염색체 통합에 적합하다. 일부 예에서, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 유전자간 영역의 5' 및 3' 단부에 플랭킹된 핵산 서열을 추가로 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터. 5' 플랭킹 핵산은 통합 표적 유전자의 3' 단부에서 코딩 서열과 동일한 핵산 서열을 포함한다. 5' 플랭킹 핵산 서열은 통합 표적 유전자의 3' 단부와 동일한 약 50 개 이상의 뉴클레오티드, 약 100 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 5' 플랭킹 핵산 서열은 통합 표적 유전자의 3' 단부와 동일한 서열의 최대 약 1000 개의 뉴클레오티드, 약 1500 개의 뉴클레오티드 또는 약 2000 개의 뉴클레오티드, 또는 통합을 위해 필요에 따라 그 초과를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 5' 플랭킹 서열은 제1의 하나 이상의 유전자간 영역 바로 5'에 표적 유전자의 정지 코돈을 포함한다. 3' 플랭킹 핵산은 통합 표적 유전자에 대해 3'인 DNA 서열과 동일한 핵산 서열을 포함한다. 3' 플랭킹 핵산 서열은 통합 표적 유전자에 대해 3'인 DNA 서열과 동일한 약 50 개 이상의 뉴클레오티드, 약 100 개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 3' 플랭킹 핵산 서열은 통합 표적 유전자에 대해 3'인 DNA 서열과 동일한 서열의 최대 약 1000 개의 뉴클레오티드, 약 1500 개의 뉴클레오티드 또는 약 2000 개의 뉴클레오티드, 또는 통합을 위해 필요에 따라 그 초과를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 3' 플랭킹 영역 서열은 통합 표적 유전자의 바로 3'에 있는 서열과 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 폴리시스트론 통합 벡터는 통합 표적 유전자를 표적화하는 5' 플랭킹 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 플랭킹 핵산 서열에 대해 3'에 위치하는 하나 이상의 선택 마커, 예컨대, 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사적으로 커플링된"은 "전사적으로 연결된" 또는 "전사적으로 연계된"과 동의어이다. 이들 용어는 일반적으로 하나의 mRNA로서 보통 전사되고 2 개 이상의 개별 폴리펩티드로 번역될 수 있는 2 개 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열을 포함하는 다중핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "번역적으로 커플링된"은 "번역적으로 연결된" 또는 "번역적으로 연계된"과 동의어이다. 이러한 용어는 본질적으로 폴리시스트론 발현 카세트 또는 유닛과 관련된다. 2 개 이상의 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열은 공통 조절 요소(들), 예컨대, 특히 공통 프로모터가 후속적으로 2 개 이상의 개별 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있는 상기 2 개 이상의 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열을 코딩하는 하나의 mRNA로서 상기 2 개 이상의 유전자의 전사에 영향을 미칠 때 번역적으로 커플링되었다고 한다. 당업자는 박테리아 오페론이 2 개 이상의 유전자가 번역적으로 또는 전사적으로 커플링된 자연 발생 폴리시스트론 발현 시스템 또는 유닛임을 이해할 것이다.
유전자간 영역
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자간 영역"은 "유전자간 링커" 또는 "유전자간 스페이서"와 동의어이다. 유전자간 영역은 인접한 (즉, 동일한 다중핵산 서열에 위치하는) 유전자, 오픈 리딩 프레임, 시스트론 또는 코딩 서열 사이의 다중핵산 서열로서 정의된다. 확장하여, 유전자간 영역은 상기 유전자간 영역에 의해 연결된 5' 유전자의 정지 코돈 및/또는 3' 유전자의 출발 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, 용어 유전자간 영역은 구체적으로 폴리시스트론 발현 유닛에서 인접한 유전자 사이의 유전자간 영역에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 유전자간 영역은 오페론에서 인접한 유전자 사이에서 발견될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 유전자간 영역은 오페론 유전자간 영역이다. 예시적인 유전자간 영역 개시내용은 WO 2012/164083호 및 미국 특허 제9,920,324호에 밝혀져 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
일부 예에서, 유전자간 영역, 링커 또는 스페이서는 그람-양성 박테리움의 rplW, rplP, rpmD, rplB, rpsG, rpsE 또는 rplN에 선행하는, 즉 5'의, 보다 특히 바로 5'의 유전자간 영역으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 상기 그람 양성 박테리움은 락트산 박테리움, 예를 들어, 락토코커스 종, 예컨대, 락토코커스 락티스, 및 이의 임의의 아종 또는 균주이다. 일 실시양태에서, 상기 유전자간 영역은 rplW, rplP, rpmD, rplB, rpsG, rpsE 또는 rplN의 출발 코돈 및/또는 선행하는, 즉, 5'의 유전자의 정지 코돈을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 발명은 본원에 기재된 바와 같은 그람-양성 박테리움 또는 재조합 핵산에 관한 것이며, 여기서 내인성 유전자 및 하나 이상의 외인성 유전자는 그람-양성 박테리움에서 활성인 유전자간 영역 또는 영역들에 의해 전사적으로 커플링되고, 예를 들어, 여기서 유전자간 영역 또는 영역들은 상기 그람-양성 박테리움에 대해 내인성이며, 예를 들어, 여기서 내인성 유전자간 영역은 rplW, rplP, rpmD, rplB, rpsG, rpsE 또는 rplN에 선행하는 유전자간 영역으로부터 선택된다.
당업자는 유전자간 영역이 5' 정지 코돈 및/또는 3' 출발 코돈을 포함하는 경우, 일부 경우에 이들 각자의 코돈이, 올바른 번역 개시 및/또는 종결에 영향을 줄 수 있는 이중 출발 및/또는 정지 코돈을 피하기 위해 상기 유전자간 영역에 의해 연결된 유전자에 존재하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 유전자간 영역을 식별하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 추가 지침에 의해, 유전자간 영역은 예를 들어, 오페론, 및 연관된 프로모터 및 오픈 리딩 프레임의 예측에 기반하여 식별될 수 있으며, 이에 대한 소프트웨어는 당업계에 알려져 있고 이용가능하다. 예시적인 유전자간 영역 (IR)은 예를 들어, 국제 특허 공개공보 WO2012/164083호 및 미국 특허 제9,920,324호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
용어 "국제 유닛" (IU)은 당업계에-인정된 의미에 따라 본원에 사용되며 물질 (예컨대, 폴리펩티드)의 양을 나타낸다. 하나의 국제 유닛을 구성하는 질량 또는 부피는 측정되는 물질에 기반하여 다양하다. 세계보건기구 (WHO)는 생체활성 폴리펩티드에 대한 유닛 특성화를 제공한다.
CeD 특이적 항원
본 개시내용의 하나 이상의 미생물은 하나 이상의 질환-특이적 (즉, CeD-특이적) 항원 유전자를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하고, 발현에 충분한 조건 하에서 이러한 유전자를 발현할 수 있다. 특히, 용어 "CeD-특이적 항원 변이체 폴리펩티드"는 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 글리아딘은 CeD, 특히, 밀 (예컨대, 트리티쿰 아에스티붐 및 트리티쿰 스펠타), 호밀 (예컨대, 세칼레 세레알) 또는 보리 (예컨대, 호르둠 불가레) 글루텐과 연관된 임의의 글루텐으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 밀 글리아딘 서열은 UniProtKB Q9M4L6이다:
Figure pct00008
밀 글리아딘을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 AJ133611.1이다. 추가적인 예시적인 글리아딘 서열은 호밀 글리아딘:
Figure pct00009
및 보리 글리아딘 (B1-호르데인으로 또한 칭함)을 포함한다:
Figure pct00010
Figure pct00011
(서열번호 32)(여기서 잔기 1-18은 신호 펩티드임; UniProtKB P06470 및 GenBank 수탁 번호 X03103).
HLA-DQ2-특이적 에피토프 및 HLA-DQ8-특이적 에피토프는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,748,126호, 제9,017,690호, 제10,105,437호 및 제10,053,497호를 참고하며, 이들 각각은 본원에 참조로 원용된다. 또한, Vader et al., 2003, "Characterization of cereal toxicity for celiac disease patients based on protein homology in grains," Gastroenterology 1225: 1105-1113; 및 Tye-Din et al., 2010, "Comprehensive, quantitative mapping of T cell epitopes in gluten in celiac disease, Sci. Transl. Med. 2(41):41ra51 참고. 예시적인 HLA-DQ2-특이적 에피토프는 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프를 포함하는 33 개의 아미노산 단편 LQLQPFPQP Q LPYPQPQLPYPQP Q LPYPQPQPF (UniProt: Q9M4L6의 아미노산 57-89; 서열번호 3), 및 LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (UniProt: Q9M4L6의 위치 66 및 80에 상응하는 아미노산은 탈아미드화됨; 서열번호 7) 및 LQLQPFPQP E LPYPQP E LPYPQP E LPYPQPQPF (UniProt: Q9M4L6의 위치 66, 73 및 80에 상응하는 아미노산은 탈아미드화됨; 서열번호 33)를 포함하는 상응하는 탈아미드화된 형태를 포함한다. 예시적인 HLA-DQ8-특이적 에피토프는 QYPSG Q GSFQPSQ Q NPQA (서열번호 5) (UniProtKB Q9M4L6의 아미노산 225-242) 및 상응하는 탈아미드화된 형태 QYPSG E GSFQPSQ E NPQA (서열번호 9)를 포함한다. 항원성 특성 (예컨대, HLA-DQ8-특이적 또는 HLA-DQ2 특이적)을 보유하는 알려진 에피토프의 서열 변이체는 또한 본 개시내용의 조성물 및 방법에 유용하다. 예는 임의의 알려진 HLA-DQ2-특이적 에피토프 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프와 1, 2 또는 3 개의 아미노산 상이함을 갖는 에피토프이다. 일반적으로, CeD-특이적 항원의 절삭된 버전은 미생물 (예컨대, 락토코커스 락티스)에 의해 효율적으로 발현 및 분비된다.
밀 글리아딘 (UniProtKB Q9M4L6)의 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 약 20 개 이상, 약 30 개 이상, 약 40 개 이상, 약 50 개 이상, 약 60 개 이상, 약 70 개 이상, 또는 약 80 개 이상의 연속 아미노산을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3과 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
당업자는 본 개시내용의 방법을 사용하여 대상체에 전달될 CeD-특이적 항원의 최적량이 예컨대, 항원의 유형, 항원을 발현하는 미생물 및 유전자 작제물, 예컨대, 유전자 작제물에 사용된 프로모터의 강도에 따라 다양하다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 미생물은 발현된 항원의 특정 양과 등가인 양으로, 또는 각자의 대상체에서 각자의 항원 폴리펩티드에 대한 원하는 PK 프로파일을 생성하는 양으로 투여될 것이다. 예시적인 일일 항원 용량은 하루당 약 10 fg (펨토그램) 내지 약 100 μg (마이크로그램)의 활성 폴리펩티드이다. 다른 예시적인 용량 범위는 하루당 약 1 pg (피코그램) 내지 약 100 μg; 또는 하루당 약 1 ng 내지 약 100 μg이다.
위의 항원 용량은 하루당 미생물의 유효량을 대상체에 투여함으로써 실현될 수 있으며, 여기서 미생물은 원하는 용량, 예컨대, 위의 것들을 실현하기에 충분한 양의 생체활성 폴리펩티드를 발현하도록 적응된다. 항원 폴리펩티드를 분비하는 미생물은 하루당 약 104 개의 콜로니 형성 유닛 (cfu) 내지 약 1012 개의 cfu, 예컨대, 하루당 약 106 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu, 또는 하루당 약 109 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu의 용량으로 전달될 수 있다. 일부 예에서, 유닛 투여량은 약 1×104 내지 약 1×1012 개의 콜로니-형성 유닛 (cfu)의 sAGX0868을 함유한다. 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×108 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1010 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1011 개의 cfu의 sAGX0868을 함유한다.
분비된 항원 폴리펩티드의 양은 예를 들어, Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355에 기재된 방법에 따라, 또는 ELISA를 사용함으로써 cfu에 기반하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 미생물은 109 개의 cfu당 약 1 ng (나노그램) 이상 내지 약 1 μg의 활성 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 이에 기반하여, 당업자는 다른 cfu 용량에서 분비되는 항원 폴리펩티드의 범위를 계산할 수 있다.
각각의 위의 용량/용량 범위는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 투약 양생법과 관련하여 투여될 수 있다. 활성 폴리펩티드의 일일 용량은 하루 종일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 분량으로 투여될 수 있다. 또한, 일일 용량은 투여 기간 사이에 임의의 수의 휴식 기간과 함께 임의의 수의 일자 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01 내지 약 3.0 백만 개의 국제 유닛 (MIU)의 IL-10/일/대상체의 용량이 총 6 주 동안 격일로 투여될 수 있다.
치료
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 및 "치료하는" 등은 질환 또는 병태, 예컨대, CeD의 특징적인 증상 또는 징후를 완화 또는 경감시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CeD의 치료는 대상체에서 항원-특이적 면역 내성의 회복 또는 유도를 초래할 수 있다. 다른 예에서, 치료는 융모 위축을 감소 또는 제거하고/하거나 대상체의 소장에서 융모 높이/음와 깊이 비율을 증가시키는 것, 예를 들어, 융모 높이/음와 깊이 비율 (Vh/Cd)을 정상 범위로 증가시키는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, Vh/Cd에 대한 "정상 범위"는 CeD가 전혀 없는 참조 대상체의 Vh/Cd일 수 있거나, 치료될 대상체가 장내 글루텐에 노출된 적이 없는 경우 해당 치료될 대상체의 Vh/Cd를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이들 용어는 또한 질환 또는 병태, 또는 상기 질환 또는 병태로 고통받기 전에 이와 연관된 증상의 중증도를 감소시키는 것을 포함하여, 질환 또는 병태의 개시 또는 질환 또는 병태와 연관된 증상의 개시를 예방 또는 지연시키는 것을 포함한다. 고통 전의 이러한 예방 또는 감소는 투여 시점에 질환 또는 병태로 고통받지 않은 환자에 대한 발명의 화합물 또는 조성물의 투여를 지칭한다. "예방하는"은 또한 예를 들어, 개선의 기간 후에 질환 또는 병태 또는 이와 연관된 증상의 반복을 예방하는 것 또는 재발-예방을 포함한다. "치료를 필요로 하는" 대상체의 치료는 대상체가 질환 또는 병태를 갖고 있음을 전하며, 발명의 치료적 방법은 특이적 질환 또는 병태를 치료하려는 의도적인 목적으로 수행된다.
환자 집단 및 하위-집단
대상체는 셀리악 질환 (증상적 또는 무증상적)을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심될 수 있다. 대상체는 글루텐-프리 식단 (GFD)을 먹고 있을 수 있다. 대상체는 예를 들어, 1 일 내지 최대 21 일의 글루텐 섭취 기간 이후 GFD에 있을 수 있다. 대상체는 급성기 반응 중에 있을 수 있다 (예를 들어, 이들은 셀리악 질환으로 진단되었으나, 14 내지 30 일 동안 글루텐-프리 식단을 먹기 전 지난 24 시간 동안 글루텐만을 섭취하였다). 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 대상체는 예를 들어, 소장 생검의 조직병리학적 판정에 의해 결정된 바와 같은 융모 위축을 갖는다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 대상체는 상피내 림프구증가증 및/또는 상승된 수준의 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)를 갖는다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 대상체는 세포독성 CD8+ IEL의 상승된 수를 갖는다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 대상체는 점막고유층 림프구에서 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포의 상승된 수준 및/또는 Foxp3+Tbet-CD4+ T 세포의 감소된 수준을 갖는다.
대상체는 셀리악 질환, 예컨대, 유전적 감수성에 취약할 수 있다. 유전적 감수성은 셀리악 질환에 대한 소인을 유발하는 유전자, 셀리악 질환 및/또는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 다른 자가면역 질환과 관계가 있는 유전자, 예컨대, HLA-DQ2 및 HLA-DQ8의 존재를 식별함으로써 결정될 수 있다.
본원에 기재된 치료는 글루텐에 대한 노출을 갖는 대상체에 존재하는 융모 위축을 역전, 호전 또는 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 치료는 글루텐에 대한 노출시 융모 위축 반복을 예방 또는 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 치료는 융모 높이-대-음와 깊이 비율 (Vh/Cd)을 개선하고/하거나 융모-대-음와 비율을 정상 범위로 회복시킬 수 있다. 본원에 기재된 치료는 상피내 림프구증가증을 감소시키고/시키거나 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 상승된 수준을 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 치료는 IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TGA), IgG 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP), 및 IgG 항-글리아딘 펩티드 중 하나 이상의 양을 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 치료는 흡수불량, 예컨대, 설사, 복부 팽만 및 통증의 증상을 경감하고, 위산 역류, 복부 팽만감 및 팽만 및/또는 고창을 감소시킬 수 있다.
본원에 입증된 바와 같이, 글루텐에 대한 장내 노출에 의해 유도된 셀리악 질환을 갖고 LL-[dDQ8]+IL10으로 치료된 다음, 글루텐 챌린지(challenge)를 받은 마우스는 융모 위축이 없었다. 대조적으로, 글루텐에 대한 장내 노출에 의해 유도된 셀리악 질환을 갖고, LL-IL10으로 치료되고, 글루텐 챌린지를 받은 마우스는 20% 융모 위축을 가졌다. 2 개의 대조군을 검사하였다. 글루텐에 대한 장내 노출에 의해 유도된 셀리악 질환을 갖고, 비히클 또는 빈 LL 벡터로 치료된 다음, 글루텐 챌린지를 받은 마우스는 각자 55% 융모 위축 및 40% 융모 위축을 가졌다. 이들 데이터는 LL-IL10을 사용한 치료가 비히클로 치료된 마우스에 비해 융모 위축의 발생률에서 64% 감소, 및 빈 LL 벡터로 치료된 마우스에 비해 융모 위축의 발생률에서 50% 감소를 제공하였음을 나타낸다. 대조적으로, 이들 데이터는 LL-[dDQ8]+IL10을 사용한 치료가 비히클, 빈 LL 벡터 또는 LL-IL10으로 치료된 마우스에 비해 융모 위축의 발생률에서 100% 감소를 제공하였음을 나타낸다. 셀리악 질환을 갖는 대상체에 대한 IL-10 및 HLA-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드를 발현하도록 조작된 L. 락티스 균주의 투여는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 HLA-DQ2-특이적 또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프를 포함하는 글리아딘 펩티드를 발현하지 않은 참조 L. 락티스 균주에 비해 융모 위축의 50% 초과 및 최대 100%의 감소를 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "셀리악 질환의 마우스 모델"은 실시예 1에 기재된 마우스 모델을 지칭한다. 약 55% 이상 내지 100%, 약 60% 이상 내지 100%, 약 65% 이상 내지 100%, 약 70% 이상 내지 100%, 약 75% 이상 내지 100%, 약 80% 이상 내지 100%, 약 85% 이상 내지 100%, 약 90% 이상 내지 100%, 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 내지 100%의 감소는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 참조 L. 락티스 균주에 비해 IL-10 및 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드를 발현하도록 조작된 L. 락티스 균주의 투여에 의해 제공될 수 있다. "참조 L. 락티스 균주"는 치료적 L. 락티스 균주로서 (i) 기능적 IL-10 또는 (ii) 동일한 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 동일한 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드 중 어느 하나를 발현하는 것을 제외하고, 투여된 조작된 치료적 L. 락티스 균주로서 동일한 유전적 특질을 갖는 L. 락티스 균주를 지칭한다. 적합한 참조 L. 락티스 균주는 IL-10 및 글리아딘 펩티드 발현 유닛을 포함하지 않은 조작된 치료적 L. 락티스 균주의 모 L. 락티스 균주일 수 있다. 대안적으로, 적합한 참조 L. 락티스 균주는 발현되지 않거나 비-기능적 IL-10 및/또는 비-항원성 글리아딘 펩티드를 발현하는 IL-10 및 글리아딘 펩티드 발현 유닛을 포함할 수 있다. 참조 L. 락티스 균주의 투여는 모의 치료의 일 예이다.
치료적 유효량
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 양생법에 따라 투여될 때 원하는 치료적 효과 또는 반응을 이끌어낼 본 개시내용의 비-병원성 미생물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 경우에, 화합물 또는 조성물은 하루당 1 회 또는 다중 회 투여될 때 치료적 유효량과 등가인 활성 구성요소의 양을 함유하는 유닛 투여량 형태, 예를 들어, 정제 또는 캡슐로 제공된다.
당업자는 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 (예컨대, CeD의 효과적인 치료를 위해) 요구되는 재조합 미생물의 치료적 유효량이 예컨대, 미생물에 의해 발현되는 IL-10 폴리펩티드의 성질, 미생물에 의해 발현되는 CeD-특이적 항원 폴리펩티드의 성질, 투여 경로, 및 수용자의 연령, 체중 및 기타 특성화에 따라 다양할 것임을 이해할 것이다.
분비된 폴리펩티드의 양은 cfu에 기반하여, 최신 방법, 예컨대, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)에 의해, 또는 ELISA를 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 미생물은 109 개의 cfu당 약 1 ng 이상 내지 약 1 μg의 활성 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 이에 기반하여, 당업자는 다른 cfu 용량에서 분비되는 항원 폴리펩티드의 범위를 계산할 수 있다.
치료적 유효량은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 투약 양생법과 관련하여 투여될 수 있다. 활성 폴리펩티드의 일일 용량은 하루 종일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 분량으로 투여될 수 있다. 또한, 일일 용량은 투여 기간 사이에 임의의 수의 휴식 기간과 함께 임의의 수의 일자 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 0.01 내지 약 3.0 MIU/일/대상체의 활성제 (예컨대, CeD-특이적 항원 및/또는 IL-10)의 용량이 총 6 주 동안 격일로 투여될 수 있다. 다른 예에서, CeD-특이적 항원 및/또는 IL-10은 하루당 0.1 내지 1000 mg 범위의 용량, 예컨대, 각각의 식사에서 1-100 mg의 용량으로 투여된다.
점막
용어 "점막" 또는 "점막(mucous membrane)"은 당업계에 인정된 의미에 따라 본원에 사용된다. "점막"은 신체, 예컨대, 구강 점막, 직장 점막, 위 점막, 장 점막, 요도 점막, 질 점막, 안구 점막, 협측 점막, 기관지 또는 폐 점막, 및 비측 또는 후각 점막에서 발견되는 임의의 점막일 수 있다. 점막은 또한 표면 점막, 예컨대, 물고기 및 양서류에서 발견되는 점막을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "점막 전달"은 당업계에 인정된 의미, 즉, 예컨대, 본 개시내용의 조성물을 점막과 접촉시키는 것을 통한 점막으로의 전달에 따라 사용된다. 구강 점막 전달은 협측, 설하 및 치은 전달 경로를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, "점막 전달"은 위 전달, 장 전달, 직장 전달, 협측 전달, 폐 전달, 안구 전달, 비측 전달, 질 전달 및 경구 전달을 포함한다. 당업자는 경구 전달이 위장관의 원위 부분으로의 전달에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "점막 내성"은 대상체가 점막 경로를 통해 항원에 노출된 후의 포유동물 대상체 (예컨대, 인간 환자)에서 항원에 대한 특이적 면역 반응성의 억제를 지칭한다. 일부 경우에, 점막 내성이 전신 내성이다. 저 용량 경구 내성은 저 용량의 항원에 의해 유도된 경구 내성이며, 나이브 숙주에 내성을 전달할 수 있는 사이클로포스파미드 민감성 조절 T-세포에 의해 매개되는 활성 면역 억압을 특징으로 한다. 고 용량 경구 내성은 고 용량의 항원에 의해 유도된 경구 내성이며, 사이클로포스파미드 치료에 대해 둔감하며, 항원 특이적 T-세포의 아네르기 및/또는 결실을 통해 T 세포 저반응성의 유도로 진행한다. 사이클로포스파미드에 대한 민감도의 상이함은 저 용량 및 고 용량 내성 간에 구별하는 데 사용될 수 있다 (Strobel et al., 1983). 일부 경우에, 경구 내성은 Mayer and Shao (2004)에 의해 기재된 바와 같은 저 용량 경구 내성이다.
면역-조정 화합물
용어 "면역-조정 화합물" 또는 면역-조정제"는 당업계에-인정된 의미에 따라 본원에 사용된다. 면역-조정 화합물은 당업자에게 알려진 임의의 면역-조정 화합물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역-조정 화합물은 내성 유도 화합물이다. 내성 유도는 예컨대, 조절 T-세포를 유도함으로써, 또는 간접적인 방식으로, 예컨대, 수지상 세포를 내성화하기 위한 미성숙한 수지상 세포의 활성화 및/또는 성숙한 수지상 세포에서 "공동-자극" 인자의 발현을 유도하는 Th2 면역 반응을 억제함으로써 수득될 수 있다. 면역-조정 및 면역-억압 화합물은 당업자에게 알려져 있으며, 박테리아 대사물, 예컨대, 스페르구알린, 진균 및 스트렙토미세스 대사물, 예컨대, 타크롤리무스 또는 사이클로스포린, 면역-억압 사이토카인, 예컨대, IL-4, IFNα, (조절 T-세포에 대한 선택적 아쥬반트로서) TGFβ Flt3L, TSLP 및 (선택적 관용원성 DC 인듀서로서) Rank-L, 항체 및/또는 길항제, 예컨대, 항-CD40L, 항-CD25, 항-CD20, 항-IgE, 항-CD3, 및 단백질, 펩티드 또는 융합 단백질, 예컨대, CTL-41g 또는 CTLA-4 작용제 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 면역-조정 화합물은 면역-억압 화합물일 수 있다. 면역-억압 화합물은 또한 면역-억압 사이토카인 또는 항체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역-억압 사이토카인은 내성-향상 사이토카인 또는 항체이다. 용어 "면역-조정 화합물"은 또한 이의 기능적 상동체를 포함한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 기능적 상동체는 의도된 목적을 위해 본질적으로 동일하거나 유사한 기능을 갖지만 구조적으로는 상이할 수 있는 분자이다. 일부 예에서, 면역-조정 화합물은 항-CD3 또는 이의 기능적 상동체이다. 다른 예에서, 항-CD3 항체는 치료로부터 배제된다
미생물
발명은 하나 이상의 미생물의 용도에 관한 것이다. 조성물 및 조성물을 사용하는 방법에서, 미생물은 비-병원성 및 비-침습성 박테리움이다. 미생물은 또한 비-병원성 및 비-침습성 효모일 수 있다.
미생물은 또한 사카로마이세스 종, 한세눌라 종, 클루이베로마이세스 종 쉬조사카로마이세스 종 지고사카로마이세스 종, 피치아 종, 모나스쿠스 종, 게오트쿰 종 및 야로위아 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 균주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비시아에이다. 다른 실시양태에서, S. 세레비시아에는 보울라디이 아종이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 재조합 효모 숙주-벡터 시스템은 생물학적으로 함유된 시스템이다. 생물학적 봉쇄는 당업자에게 알려져 있으며, 영양요구성 돌연변이, 예를 들어, 자살 영양요구성 돌연변이, 예컨대, thyA 돌연변이, 또는 이의 등가물의 도입에 의해 실현될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 미생물은 박테리움, 예컨대, 비-병원성 박테리움, 예컨대, 식품 등급 박테리아 균주이다. 일부 예에서, 비-병원성 박테리움은 그람-양성 박테리움, 예컨대, 그람-양성 식품-등급 박테리아 균주이다. 예시적인 그람-양성 식품 등급 박테리아 균주는 락트산 발효 박테리아 균주 (즉, 락트산 박테리움 (LAB) 또는 비피도박테리움)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 락트산 발효 박테리아 균주는 락토코커스, 락토바실러스 또는 비피도박테리움 종이다. 본원에 사용된 바와 같이, 락토코커스 또는 락토바실러스는 특정 종 또는 아종으로 제한되지 않으며, 락토코커스 또는 락토바실러스 종 또는 아종 중 임의의 것을 포함하는 것을 의미한다. 예시적인 락토코커스 종은 락토코커스 가르비에, 락토코커스 락티스, 락토코커스 피시움, 락토코커스 플란타룸 및 락토코커스 라피노락티스를 포함한다. 일부 예에서, L. 락티스는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에, 또는 락토코커스 락티스 아종 락티스이다.
예시적인 락토바실러스 종은 락토바실러스 아세토톨레란스, 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 아길리스, 락토바실러스 알기두스, 락토바실러스 알리멘타리우스, 락토바실러스 아밀롤리티쿠스, 락토바실러스 아밀로필루스, 락토바실러스 아밀로보루스, 락토바실러스 아니말리스, 락토바실러스 아비아리우스, 락토바실러스 아비아리우스 아종 아라피노수스, 락토바실러스 아비아리우스 아종 아비아리우스, 락토바실러스 바바리쿠스, 락토바실러스 비페르멘탄스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카르니스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 카세이 아종 알락토수스, 락토바실러스 카세이 아종 카세이, 락토바실러스 카세이 아종 슈도플란타룸, 락토바실러스 카세이 아종 람노수스, 락토바실러스 카세이 아종 톨레란스, 락토바실러스 카테나포르미스, 락토바실러스 셀로비오수스, 락토바실러스 콜리노이데스, 락토바실러스 콘푸수스, 락토바실러스 코리니포르미스, 락토바실러스 코리니포르미스 아종 코리니포르미스, 락토바실러스 코리니포르미스 아종 토르쿠엔스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 쿠르바투스, 락토바실러스 쿠르바투스 아종 쿠르바투스, 락토바실러스 쿠르바투스 아종 멜리비오수스, 락토바실러스 델브루에키이, 락토바실러스 델브루에키이 아종 불가리쿠스, 락토바실러스 델브루에키이 아종 델브루에키이, 락토바실러스 델브루에키이 아종 락티스, 락토바실러스 디베르겐스, 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 페르멘툼, 락토바실러스 포르니칼리스, 락토바실러스 프룩티보란스, 락토바실러스 프룩토수스, 락토바실러스 갈리나룸, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 그라미니스, 락토바실러스 할로톨레란스, 락토바실러스 함스테리, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 헤테로히오치이, 락토바실러스 힐가르디이, 락토바실러스 호모히오치이, 락토바실러스 이네르스, 락토바실러스 인테스티날리스, 락토바실러스 젠세니이, 락토바실러스 존소니이, 락토바실러스 칸들레리, 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 케피라노파시엔스, 락토바실러스 케피르그라눔, 락토바실러스 쿤케이, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 레이크만니이, 락토바실러스 린드네리, 락토바실러스 말레페르멘탄스, 락토바실러스 말리, 락토바실러스 말타로미쿠스, 락토바실러스 마니호티보란스, 락토바실러스 미노르, 락토바실러스 미누투스, 락토바실러스 무코사에, 락토바실러스 무리누스, 락토바실러스 나겔리이, 락토바실러스 오리스, 락토바실러스 파니스, 락토바실러스 파라부크네리, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이, 락토바실러스 파라카세이 아종 톨레란스, 락토바실러스 파라케피리, 락토바실러스 파라리멘타리우스, 락토바실러스 파라플란타룸, 락토바실러스 펜토수스, 락토바실러스 페롤렌스, 락토바실러스 피스시콜라, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 폰티스, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 람노수스, 락토바실러스 리마에, 락토바실러스 로고사에, 락토바실러스 루미니스, 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 사케이 아종 카모수스, 락토바실러스 사케이 아종 사케이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리시니우스, 락토바실러스 살리바리우스 아종 살리바리우스, 락토바실러스 산프란시스센시스, 락토바실러스 샤르페아에, 락토바실러스 수에비쿠스, 락토바실러스 트리코데스, 락토바실러스 울리, 락토바실러스 바시노스테르쿠스, 락토바실러스 바지날리스, 락토바실러스 비리데스센스, 락토바실러스 비툴리누스, 락토바실러스 자일로수스, 락토바실러스 야마나시엔시스, 락토바실러스 야마나시엔시스 아종 말리, 락토바실러스 야마나시엔시스 아종 야마나시엔시스, 락토바실러스 제아에, 비피도박테리움 아도레센티스, 비피도박테리움 안굴라툼, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 론굼 및 비피도박테리움 인판티스를 포함한다. 일부 예에서, LAB는 락토코커스 락티스 (LL)이다.
추가의 예에서, 박테리움은 엔테로코커스 알세디니스, 엔테로코커스 아퀴마리누스, 엔테로코커스 아시니, 엔테로코커스 아비움, 엔테로코커스 카카에, 엔테로코커스 카멜리아에, 엔테로코커스 카닌테스티니, 엔테로코커스 카니스, 엔테로코커스 카셀리플라부스, 엔테로코커스 세코룸, 엔테로코커스 코룸바에, 엔테로코커스 데브리세이, 엔테로코커스 디에스트람메나에, 엔테로코커스 디스파르, 엔테로코커스 두란스, 엔테로코커스 유레켄시스, 엔테로코커스 파에칼리스, 엔테로코커스 패시움, 엔테로코커스 갈리나룸, 엔테로코커스 길부스, 엔테로코커스 해모페록시두스, 엔테로코커스 헤르만니엔시스, 엔테로코커스 히라에, 엔테로코커스 이탈리쿠스, 엔테로코커스 락티스, 엔테로코커스 레마니이, 엔테로코커스 말로라도라투스, 엔테로코커스 모라비엔시스, 엔테로코커스 문티이, 엔테로코커스 올리바에, 엔테로코커스 팔렌스, 엔테로코커스 포에니쿨리콜라, 엔테로코커스 플란타룸, 엔테로코커스 슈도아비움, 엔테로코커스 퀘베센시스, 엔테로코커스 라피노수스, 엔테로코커스 라티, 엔테로코커스 리보룸, 엔테로코커스 로타이, 엔테로코커스 사카롤리티쿠스, 엔테로코커스 실레시아쿠스, 엔테로코커스 솔리타리우스, 엔테로코커스 설푸레우스, 엔테로코커스 테르미티스, 엔테로코커스 타이란디쿠스, 엔테로코커스 우레아시티쿠스, 엔테로코커스 우렐리티쿠스, 엔테로코커스 비키엔시스, 엔테로코커스 빌로룸 및 엔테로코커스 시앙판겐시스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가의 예에서, 박테리움은 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 안기노수스, 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 카니스, 스트렙토코커스 콘스텔라투스, 스트렙토코커스 디스갈락티아에, 스트렙토코커스 에퀴누스, 스트렙토코커스 이니아에, 스트렙토코커스 인테르메디우스, 스트렙토코커스 밀레리, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 무탄스, 스트렙토코커스 오랄리스, 스트렙토코커스 파라산귀니스, 스트렙토코커스 페로리스, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 스트렙토코커스 슈도뉴모니아에, 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 라티, 스트렙토코커스 살리바리우스, 스트렙토코커스 티구리누스, 스트렙토코커스 써모필루스, 스트렙토코커스 산귀니스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 스위스, 스트렙토코커스 우베리스, 스트렙토코커스 베스티불라리스, 스트렙토코커스 비리단스 및 스트렙토코커스 주에피데미쿠스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 그람-양성 식품 등급 박테리아 균주는 락토코커스 락티스, 또는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스, 락토코커스 락티스 아종 호르드니아에 및 락토코커스 락티스 아종을 포함하여 이의 아종 중 임의의 것이다. 예시적인 재조합 그람-양성 박테리아 균주는 우유에서 정상적인 성장 및 산 생산의 능력이 손실된 생물학적으로 함유된 시스템, 예컨대, 플라스미드가 없는 락토코커스 락티스 균주 MG1363 (Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154: 1-9); 또는 트레오닌- 및 피리미딘-영양요구성 유도체 L. 락티스 균주 (Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 1253-1258; Glenting et al. (2002) 68: 5051-5056)일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 재조합 박테리아 숙주-벡터 시스템은 생물학적으로 함유된 시스템이다. 생물학적 봉쇄는 당업자에게 알려져 있으며, 영양요구성 돌연변이, 예를 들어, 자살 영양요구성 돌연변이, 예컨대, ThyA 돌연변이 또는 DNA 합성을 약화시키는 이의 등가물의 도입에 의해 실현될 수 있다. 영양요구성 돌연변이의 다른 예는 RNA, 세포벽 또는 단백질 합성을 약화시킬 수 있다. 대안적으로, IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 중 하나 또는 둘 모두가 플라스미드로부터 발현되는 경우, 생물학적 봉쇄는 예컨대, 예를 들어, 몇 세대 후에 손실되는 불안정한 에피솜 작제물을 사용함으로써 IL-10 폴리펩티드 또는 CeD-특이적 항원을 코딩하는 유전자를 지니는 플라스미드의 수준에서 실현될 수 있다. 원하는 경우, 여러 수준의 봉쇄, 예컨대, 플라스미드 불안정성 및 영양요구성을 조합하여 높은 수준의 봉쇄를 보장할 수 있다.
작제물
본 발명에서, 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 의도된 부위, 즉, 점막에서 IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)을 전달할 수 있다. 예를 들어, 미생물 (예컨대, LAB)은 IL-10 폴리펩티드를 발현한 후 IL-10 폴리펩티드가 분비된다 (IL-10의 분비된 형태가 사용되는 경우). 따라서, 미생물 (예컨대, LAB), 예컨대, L. 락티스는 IL-10을 발현하고, 예컨대, 위장관의 의도된 점막의 부위에서 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 발현한다. 실시양태에서, 미생물은 의도된 부위에 2 개의 치료적 단백질, 예컨대, IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원만을 전달한다. 다른 실시양태에서, 미생물은 의도된 부위에 IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원을 포함하는 3 개 이상의 치료적 단백질을 전달한다.
대안적으로, 각각 치료적 단백질을 발현하는 2 개의 별개의 미생물은 의도된 부위에서 치료적 단백질을 전달할 수 있다. 예를 들어, 제1 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 IL-10 폴리펩티드를 전달할 수 있고, 제2 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 의도된 부위, 즉, 점막에 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)을 전달할 수 있다. 제1 및 제2 미생물 중 하나 또는 둘 모두는 의도된 부위에 하나 이상의 추가의 치료적 단백질을 전달할 수 있다.
오페론의 사용은 IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 폴리펩티드 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)의 발현이 조정될 수 있게 한다. 박테리아 숙주 세포에서 폴리시스트론 발현 시스템은 예컨대, 미국 특허 제9,920,324호 및 WO 2012/164083호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
안정적으로 형질주입된 미생물, 즉, IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)을 코딩하는 유전자 유전자가 숙주 세포의 게놈에 통합된 미생물을 또한 개시한다. 안정적으로 형질주입된 미생물을 확립하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합) 유전자가 상동 재조합을 통해 숙주의 게놈에, 예컨대, 염색체에서 클로닝될 수 있다. 일부 미생물에서, 미생물의 필수 유전자는 상동 재조합 이벤트, 예컨대, 유전자 결실, 필수 유전자에 의해 코딩된 단백질의 비활성 형태를 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 필수 유전자에 의해 코딩된 단백질의 절삭된 형태를 초래하는 프레임시프트 돌연변이에 의해 붕괴된다. 필수 유전자는 thyA 유전자일 수 있다. 바람직한 기술은 예컨대, WO 02/090551호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 플라스미드는 자가-복제하는 것, 예를 들어, 하나 이상의 관심 유전자 및 하나 이상의 저항성 마커를 지니는 것일 수 있다. 이어서, 형질전환 플라스미드는 붕괴된 필수 유전자, 예컨대, thyA 유전자를 보완할 수 없는 한, 임의의 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 플라스미드는 통합 플라스미드이다. 후자의 경우에, 통합 플라스미드 자체를 사용하여 필수 유전자, 예컨대, thyA 부위의 유전자좌에서 통합을 유발함으로써 필수 유전자를 붕괴시킬 수 있으며, 이로 인해 필수 유전자, 예컨대, thyA 유전자의 기능은 붕괴된다. 일부 경우에, 필수 유전자, 예컨대, thyA 유전자는 thyA 표적 부위와 같은 필수 유전자에 대한 삽입을 표적화하는 표적화 서열이 플랭킹된 관심 유전자 또는 유전자들을 포함하는 카세트에 의한 이중 상동 재조합으로 대체된다. 이들 표적화 서열은 표적 부위로의 관심 유전자의 통합을 가능하게 하기에 충분히 길고 충분히 상동성임이 이해될 것이다. 일부 예에서, 본 개시내용의 IL-10 발현 카세트는 thyA 유전자좌에서 통합된다.
IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)을 코딩하는 유전자 작제물은 미생물 게놈 DNA, 예컨대, 박테리아 또는 효모 염색체, 예컨대, 락토코커스 염색체로 통합될 수 있다. 후자의 경우, 핵산의 단일 또는 다중 카피가 통합될 수 있으며; 통합은 염색체의 무작위 부위에서, 또는 위에 기재된 바와 같이 이의 소정의 부위에서, 예를 들어, 소정의 부위에서, 예컨대, 비-제한적인 예에서 락토코커스, 예컨대, 락토코커스 락티스의 eno 유전자좌 또는 thyA 유전자좌에서 발생할 수 있다.
따라서, IL-10 폴리펩티드 및 CD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합)을 코딩하는 유전자 작제물은 유전자 작제물의 숙주 세포의 게놈, 예컨대, 염색체로의 삽입에 영향을 미치도록 구성된 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 유전자 작제물의 숙주 세포의 게놈, 예컨대, 염색체 내의 특정 부위로의 삽입은 상동 재조합에 의해 용이하게 될 수 있다. 예를 들어, 발명의 유전자 작제물은 숙주 세포의 게놈, 예컨대, 염색체 내의 상기 통합 부위에 대한 하나 이상의 상동성 영역을 포함할 수 있다. 상기 게놈, 예컨대, 염색체 부위에서의 서열은 자연적, 즉, 자연에서 발생하는 것과 같을 수 있거나, 이전의 유전 공학에 의해 도입된 외인성 서열일 수 있다. 예를 들어, 상동성 영역(들)은 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp 이상 또는 그 초과일 수 있다.
일 예에서, 2 개의 상동성 영역이 포함될 수 있으며, 하나는 발명의 유전자 작제물에 존재하는 관련 발현 유닛의 각각의 측면에 플랭킹된다. 이러한 구성은 숙주 세포에서 관련 서열, 즉, 적어도 관심 항원의 발현을 코딩하고 영향을 미치는 서열을 유리하게 삽입할 수 있다. 특히 박테리아 숙주에서 상동 재조합을 수행하고 재조합을 선택하는 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
미생물의 형질전환 방법, 예컨대, 예를 들어, 원형질체 형질전환 및 전기천공법은 당업자에게 알려져 있다.
미생물, 예컨대, L. 락티스에 존재하는 발현 벡터에 대한 상동 발현 및/또는 분비 신호를 사용함으로써 고도의 발현을 달성할 수 있다. 발현 신호는 당업자에게 명백할 것이다. 발현 벡터는 이것이 혼입된 미생물, 예컨대, L. 락티스에 따라 발현에 최적화될 수 있다. 예를 들어, 락토코커스, 락토바실러스 락티스, L. 카세이 및 L. 플란타룸에서 충분한 수준의 발현을 제공하는 특이적 발현 벡터가 알려져 있다. 더욱이, 비-병원성, 비-콜로니화, 비-침습성 식품-등급 박테리움 락토코커스 락티스에서 이종 항원의 발현을 위해 개발된 시스템이 알려져 있다 (참조로 본원에 원용된 미국 특허 제6,221,648호 참고). 다중-카피 발현 벡터를 포함하는 예시적인 작제물은 PCT/NL95/00135호 (WO-A-96/32487호)에 기재되어 있다. 이러한 작제물은 높은 발현 수준에서 락트산 박테리움, 특히, 락토바실러스에서 원하는 항원의 발현에 특히 적합하고, 또한 발현된 생성물을 박테리아 세포의 표면으로 지시하는 데 유리하게 사용될 수 있다. IL-10 폴리펩티드 및/또는 CeD-특이적 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 (예컨대, 출원 번호 PCT/NL95/00135호에 기재된 바와 같은) 이러한 작제물은 리보솜 인식 및 RNA 안정화에 필요한 적어도 최소 서열을 포함하는 5' 비-번역 핵산 서열이 IL-10 폴리펩티드 및/또는 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)을 코딩하는 핵산 서열을 선행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 번역 개시 코돈이 뒤따를 수 있으며, 락트산 박테리움 유전자의 번역된 핵산 서열의 5' 말단 부분의 5 개 이상의 코돈 단편, 또는 단편의 구조적 또는 기능적 등가물이 바로 뒤따를 수 있다. 단편은 또한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. PCT/NL95/00135호에 개시된 상이한 실시양태를 포함하여 PCT/NL95/00135호의 내용, 및 본 명세서에 언급된 다른 모든 문서는 참조로 본원에 원용된다. 숙주에서 이종 유전자의 높은 수준의 조절된 발현 및 분비에 대한 발현의 커플링을 허용하는 방법을 또한 제공한다. 다른 실시양태에서, T7 박테리오파지 RNA 폴리머라제 및 이의 동족 프로모터는 WO 93/17117호에 따른 강력한 발현 시스템을 개발하기 위해 사용되며, 이는 참조로 본원에 원용된다. 일 실시양태에서, 발현 플라스미드는 pT1NX (GenBank: HM585371.1)로부터 유래된다.
본 발명에 따라 사용된 프로모터는 일부 경우에 박테리움에서 구성적으로 발현된다. 구성적 프로모터의 사용은 발현이 일어나도록 하기 위한 인듀서 또는 기타 조절 신호를 공급할 필요성을 모면한다. 일부 경우에, 프로모터는 박테리아 숙주 세포가 생존가능한 수준, 즉, 성장이 유지되지 않더라도 일부 대사 활성을 보유하는 수준에서 발현을 지시한다. 이어서 유리하게는, 이러한 발현은 낮은 수준에 있을 수 있다. 예를 들어, 발현 생성물이 세포내 축적되는 경우, 발현 수준은 세포성 단백질의 약 10% 미만, 약 또는 약 5% 미만, 예를 들어, 약 1-3%에서 발현 생성물의 축적을 야기할 수 있다. 프로모터는 사용된 박테리움에 대해 상동일 수 있으며, 즉, 자연에서 해당 박테리움에서 발견된 것일 수 있다. 예를 들어, 락토코칼 프로모터는 락토코커스에서 사용될 수 있다. 락토코커스 락티스 (또는 다른 락토코키)에 사용하기 위한 바람직한 프로모터는 락토코커스 락티스의 염색체로부터 유래된 "P1" (서열번호 --)이다 (Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et al. (1995). "The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis," Gene 165(1): 9-15). 다른 프로모터는 thyA 프로모터이다 (Steidler, et al (2003). "Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10," Nature Biotechnology 21:785-789). 프로모터의 다른 예는 usp45 프로모터, gapB 프로모터, hllA 프로모터 및 eno 프로모터를 포함한다. 추가적인 예시적인 프로모터는 미국 특허 제8,759,088호 및 미국 특허 제9,920,324호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 추가의 예시적인 프로모터 개시내용은 WO 2008/084115호, WO 2001/039137호, 미국 특허 제8,769,088호 및 미국 공개공보 제2012/0183503호에 밝혀져 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
본 발명에 따라 사용된 프로모터는 일부 경우에 박테리움에서 유도가능하게 발현된다. 유도성 발현은 직접적으로 유도성일 수 있거나, 간접적으로 유도성일 수 있다. "직접 유도성 프로모터"는 조절 영역을 지칭하며, 여기서 조절 영역은 IL-10 폴리펩티드 및/또는 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되며; 상기 조절 영역의 인듀서의 존재 하에, 페닐알라닌-대사 효소가 발현된다. "간접 유도성 프로모터"는 2 개 이상의 조절 영역, 예를 들어, 제1 분자를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 제1 조절 영역, 예컨대, 전사 조절자를 포함하는 조절 시스템을 지칭하며, 이는 IL-10 폴리펩티드 및/또는 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 제2 조절 영역을 조절할 수 있다. 제1 조절 영역의 인듀서의 존재 하에, 제2 조절 영역은 활성화되거나 억압될 수 있고, 이에 의해 IL-10 폴리펩티드 및/또는 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)의 발현을 활성화 또는 억압할 수 있다. 직접 유도성 프로모터 및 간접 유도성 프로모터 둘 모두는 "유도성 프로모터"에 포함된다.
"외인성 환경 조건"은 위에 기재된 프로모터가 직접 또는 간접적으로 유도되는 설정 또는 정황을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 소화관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 상부 위장관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 하부 위장관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 소장에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 건강한 상태 또는 질환 상태의 포유동물 소화관에 특이적인 분자 또는 대사물의 존재, 예컨대, 프로피오네이트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 저-산소, 미세호기성 또는 혐기성 조건, 예컨대, 포유동물 소화관의 환경이다.
"외인성 환경 조건(들)"은 본원에 기재된 프로모터가 유도되는 설정(들) 또는 정황(들)을 지칭한다. 어구 "외인성 환경 조건"은 조작된 미생물에 대해 외부적이지만 숙주 대상체 환경에 대해 내인성이거나 천연인 환경 조건을 지칭하는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 맥락에서, "외인성" 및 "내인성"은 환경 조건이 포유동물 신체에 대해 내인성이지만 온전한 미생물 세포에 대해 외부적이거나 외인성인 환경 조건을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 소화관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 상부 위장관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 하부 위장관에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유류의 소장에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 저-산소, 미세호기성 또는 혐기성 조건, 예컨대, 포유동물의 소화관 환경이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 포유동물 소화관에 특이적인 분자 또는 대사물, 예컨대, 프로피오네이트이다. 일부 실시양태에서, 외인성 환경 조건은 조직-특이적 또는 질환-특이적 대사물 또는 분자(들)이다. 대안적으로, 외인성 환경 조건은 저-pH 환경이다. 유전적으로 조작된 미생물은 pH-의존적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시내용의 유전적으로 조작된 미생물은 산소 수준-의존적 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 박테리아는 산소 수준을 감지할 수 있는 전사 인자를 진화시켰다. 상이한 시그널링 경로는 상이한 산소 수준에 의해 촉발될 수 있으며 상이한 동역학으로 발생할 수 있다.
"산소 수준-의존적 프로모터" 또는 "산소 수준-의존적 조절 영역"은 하나 이상의 산소 수준-감지 전사 인자가 결합할 수 있는 핵산 서열을 지칭하며, 여기서 상응하는 전사 인자의 결합 및/또는 활성화는 다운스트림 유전자 발현을 활성화한다.
산소 수준-의존적 전사 인자의 예는 FNR, ANR 및 DNR을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상응하는 FNR-반응성 프로모터, ANR-반응성 프로모터 및 DNR-반응성 프로모터는 당업계에 알려져 있다 (예컨대, Castiglione et al., 2009, "The transcription factor DNR from Pseudomonas aeruginosa specifically requires nitric oxide and haem for the activation of a target promoter in Escherichia coli," Microbiology, 155(Pt 9): 2838-2844; Eiglmeier et al., 1989, "Molecular genetic analysis of FNR-dependent promoters," Mol. Microbiol., 3(7):869-878; Galimand et al., 1991, (Mar. 1991) "Positive FNR-like control of anaerobic arginine degradation and nitrate respiration in Pseudomonas aeruginosa," J. Bacteriol., 173(5): 1598-1606; Hasegawa et al., 1998, "Activation of a consensus FNR-dependent promoter by DNR of Pseudomonas aeruginosa in response to nitrite," FEMS Microbiol. Lett., 166(2): 213-217; Hoeren et al., 1993, "Sequence and expression of the gene encoding the respiratory nitrous-oxide reductase from Paracocous denitrificans," Eur. J. Biochem., 218(1): 49-57; Salmon et al., 2003, "Global gene expression profiling in Escherichia coli K12 - The effects of oxygen availability and FNR," J. Biol. Chem. 278(32): 29837-29855 참고). 예시적인 전사 인자 및 반응성 유전자 및 조절 영역은 예를 들어, 미국 특허 제10,195,234 B2호에 개시되어 있다.
핵산 작제물 또는 작제물은 분비 신호 서열을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 IL-10 및/또는 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)을 코딩하는 핵산은 예컨대, 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열을 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 적절하게 커플링함으로써) 폴리펩티드의 분비를 제공할 수 있다. 항원을 분비하는 핵산을 보유하는 박테리움의 능력은 유기체의 생존력을 유지하는 배양 조건에서 생체 외 테스트될 수 있다. 바람직한 분비 신호 서열은 그람 양성 유기체, 예컨대, 바실러스, 클로스트리디움 및 락토바실러스에서 활성을 갖는 것들 중 임의의 것을 포함한다. 이러한 서열은 바실러스 아밀로리퀘타시엔스의 α-아밀라제 분비 리더 또는 그람-양성 및 그람-음성 숙주 둘 모두에서 기능하는 것으로 알려진 스타필로코커스의 일부 균주에 의해 분비되는 스타필로키나제 효소의 분비 리더 ("Gene Expression Using Bacillus," Rapoport (1990) Curr. Opin. Biotechnology 1: 21-27 참고), 또는 수많은 다른 바실러스 효소 또는 S-레이어 단백질의 리더 서열 (Harwood and Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Co. 1990의 pp. 341-344 참고)을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 분비 신호는 usp45로부터 유래될 수 있다 (Van Asseldonk et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 240: 428-434). 이러한 분비 리더는 본원에 예컨대, SSusp45로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, IL-10 폴리펩티드는 SSusp45 (SL#34의 경우 서열번호)를 사용하여 구성적으로 분비된다. 다른 예에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프 폴리펩티드는 SSusp45 (SL#34의 경우 서열번호)를 사용하여 구성적으로 분비된다. 또 다른 예에서, IL-10 폴리펩티드 및 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프 폴리펩티드 둘 모두는 SSusp45 (SL#34의 경우 서열번호)를 사용하여 구성적으로 분비된다. 각각의 모든 실시양태는 분비 서열로서 SL#34 없이 작동가능하다.
다른 예에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프 폴리펩티드는 적절한 또는 개선된 분비를 갖는 분비 리더를 사용하여 구성적으로 분비된다. "개선된 분비"는 분비의 양 및 질 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 개선된 분비 품질의 비-제한적인 예는 참조 분비 리더, 예컨대, SSusp45에 대한 래더링에 비해 "래더링"으로서 또한 지칭된 불완전한 단백질 밴딩의 감소이다. 적절한 또는 개선된 분비를 갖는 분비 리더는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#34, SL#35 및 SL#36.
표 1
Figure pct00012
일부 실시양태에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 표 2에 도시된 리더로부터 선택된 분비 리더를 사용하여 구성적으로 분비된다.
표 2
Figure pct00013
일부 실시양태에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 표 3에 도시된 리더로부터 선택된 분비 리더를 사용하여 구성적으로 분비된다.
표 3
Figure pct00014
일부 실시양태에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 분비 리더 #21 (A2RJJ4): MKKVIKKAAIGMVAFFVVAASGPVFA (서열번호 42)을 사용하여 구성적으로 분비된다.
일부 실시양태에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 탈아미드화된 HLA-DQ2-특이적 에피토프 (dDQ2)이고 표 4에 도시된 리더로부터 선택된 분비 리더를 사용하여 구성적으로 분비된다.
표 4
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 탈아미드화된 HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 표 5에 도시된 리더로부터 선택된 분비 리더를 사용하여 구성적으로 분비된다.
표 5
Figure pct00016
일부 실시양태에서, HLA-DQ2-특이적 에피토프 폴리펩티드는 분비 리더 #21 (A2RJJ4; ps356 엔도리신): MKKVIKKAAIGMVAFFVVAASGPVFA (서열번호 42)를 사용하여 구성적으로 분비된다.
대안적으로, 위에 기재된 분비 리더 실시양태 중 임의의 것에 대해, 에피토프 폴리펩티드는 유도가능하게 발현 및 분비된다.
일부 실시양태에서, 분비 리더는 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 위에-개시된 분비 리더 중 임의의 것의 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 변이체이다. 개시된 분비 리더 서열 중 임의의 것으로 출발하여, 당업자는 분비 리더 서열에서 돌연변이를 생성하고 원래의 돌연변이되지 않은 분비 리더와 비교하여 분비 효능에 대해 각각의 변이체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 임의의 분비 리더의 코딩 서열은 다음의 임의의 알려진 합성적 생물학 접근법에 의해 돌연변이화될 수 있다: 무작위 점 돌연변이, 오류 경향이 있는 PCR, 부위 포화 돌연변이유발, 컴퓨터 지원된 설계 또는 기타. DQ2 또는 dDQ2 코딩 서열은 돌연변이화된 분비 리더 서열의 풀의 3' 단부에 프레임-내 연결 (즉, 작동가능하게 연결)될 수 있다. 분비 리더 서열 및 DQ2 에피토프 또는 탈아미드화된 DQ2 에피토프의 융합은 SL::DQ2 또는 SL::dDQ2 구성을 형성한다. SL::DQ2 및 SL::dDQ2 코딩 서열은 L. 락티스 프로모터 (P)의 적절한 거리의 다운스트림에서 위치하여, P>> SL::DQ2 및 P>> SL::dDQ2를 수득함으로써, DQ2 및 dDQ2의 발현 및 분비에 대한 모듈을 생성한다. 스크리닝에 유용한 L. 락티스 프로모터는 L. 락티스 hllA 유전자 프로모터 (PhllA) 및 P1을 포함한다. 이러한 모듈은 에리트로마이신 선택가능한 L. 락티스 플라스미드에 클로닝되고 L. 락티스로 형질전환되어, LL[P>> SL::DQ2] 및 LL[P>> SL::dDQ2] (d)DQ2 발현 균주를 수득할 수 있다. 적절한 분비 수준, 예컨대, 상응하는 비-돌연변이화된 버전과 적어도 거의 동일한 및/또는 분비 스크리닝 방법에서 배경보다 약 3x, 약 5x 또는 약 10x 이상 더 큰 분비 수준을 갖는 클론이 식별된다. 이어서, 적절한 분비 수준을 가진 선택된 클론을 시퀀싱할 수 있을 뿐만 아니라, 통상적인 방법, 예컨대, 필터 블롯팅 및 정량화, 및 질량 분석법 등에 의한 단백질 발현 및 분비 분석에 관해 추가로 특성화할 수 있다.
특이적 아미노산 변화는 또한 분비 리더 서열에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변화가 이루어질 수 있으며, 이는 단백질 또는 펩티드의 일차 서열을 변경하더라도 보통 기능을 변경하지 않는다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다:
Figure pct00017
따라서, 위에-개시된 분비 리더 중 임의의 것의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖고 적어도 거의 동일한 분비 효능을 갖는 변이체가 본 개시내용에 포함된다.
당업자는 본 개시내용의 방법을 사용하여 대상체에 전달될 IL-10 및 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드의 최적량이 예컨대, IL-10 폴리펩티드 및 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합 폴리펩티드를 포함하는 글리아딘 펩티드를 발현하는 미생물, 및 유전자 작제물, 예컨대, 유전자 작제물에 사용된 프로모터의 강도에 따라 다양하다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 미생물은 발현된 IL-10 폴리펩티드 및 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드의 특정 양과 등가인 양으로, 또는 각자의 대상체에서 각자의 IL-10 폴리펩티드 또는 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드에 대한 원하는 PK 프로파일을 생성하는 양으로 투여될 것이다. 예시적인 일일 IL-10 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드 용량은 하루당 약 10 fg 내지 약 100 μg의 활성 폴리펩티드이다. 다른 예시적인 용량 범위는 하루당 약 1 pg 내지 약 100 μg; 또는 하루당 약 1 ng 내지 약 100 μg이다.
위의 용량은 하루당 미생물의 유효량을 대상체에 투여함으로써 실현될 수 있으며, 여기서 미생물은 IL-10 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합 폴리펩티드)의 충분한 양을 발현하여 원하는 용량, 예컨대, 위의 것들을 실현하도록 적응된다. IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프 폴리펩티드)을 분비하는 미생물은 하루당 약 104 개의 콜로니 형성 유닛 (cfu) 내지 약 1012 개의 cfu, 특히, 하루당 약 106 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu, 보다 특히, 하루당 약 109 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu의 용량으로 전달될 수 있다. 분비된 IL-10 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합 폴리펩티드)의 양은 예를 들어, Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355에 기재된 방법에 따라, 또는 ELISA를 사용함으로써 cfu에 기반하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 미생물은 109 개의 cfu당 약 1 ng 이상 내지 약 1 μg의 IL-10을 분비할 수 있다. 이에 기반하여, 당업자는 다른 cfu 용량에서 분비되는 IL-10 폴리펩티드의 범위를 계산할 수 있다.
각각의 위의 용량/용량 범위는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 투약 양생법과 관련하여 투여될 수 있다. 일일 용량은 하루 종일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 분량으로 투여될 수 있다. 또한, 일일 용량은 투여 기간 사이에 임의의 수의 휴식 기간과 함께 임의의 수의 일자 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 약 1 주 이상, 약 2 주 이상, 약 3 주 이상, 약 4 주 이상, 약 5 주 이상 또는 약 6 주 이상의 기간 동안, 약 0.01 내지 약 3 MIU의 IL-10/일 또는 격일에 등가인 용량으로 미생물이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 예컨대, 약 5 일, 약 7 일 또는 약 14 일 동안 약 0.1 내지 약 5 MIU/일, 또는 약 0.3 내지 약 3 MIU에 등가인 용량으로 미생물이 투여된다. 예시적인 용량은 예컨대, Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1(4): 295-305에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다
제형 및 양생법
본 개시내용의 일부 방법에서, IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합 폴리펩티드)은 IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합) 폴리펩티드 둘 모두를 생산하는 미생물 (예컨대, LAB)를 사용하여 대상체 (예컨대, 인간 CeD-환자)에 투여 (전달)된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 (예컨대, 약학 조성물) 또는 본 개시내용의 유닛 투여량 형태에 임의로 함유된 미생물 (예컨대, LAB, 예컨대, sAGX0868)은 예컨대, 경구 제형을 사용하여 일일 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회 또는 6 회 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 매일, 격일로, 주당 1 회, 주당 2 회, 주당 3 회 또는 주당 4 회 투여된다. 다른 실시양태에서, 치료는 2 주 마다 1 회 발생한다. 다른 실시양태에서, 치료는 3 주 마다 1 회 발생한다. 다른 실시양태에서, 치료는 1 개월당 1 회 발생한다.
치료 주기의 지속기간은 예를 들어, CeD를 치료 또는 역전시키거나 재발을 예방하는 데 필요한 경우 대상체의 수명에 대해 7 일이다. 일부 실시양태에서, 치료 주기는 21 일 내지 약 2 년 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 치료 주기는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 1.5 년 동안 지속된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 1 년 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 11 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 10 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 9 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 8 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 7 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 6 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 5 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 4 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 3 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 21 일, 30 일 또는 42 일 내지 2 개월 지속되는 치료 주기를 가질 것이다.
추가 실시양태에서, 치료 주기는 환자 보고된 CeD 증상, 융모 위축, 융모 높이 대 음와 깊이 비율, IgA 항-조직 트랜스글루타미나제 (TGA), IgG 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP) 및 본원의 다른 곳에 개시된 기타 마커를 포함하여, 질환의 진행을 추적하는 마커의 수준에 기반할 것이다. 환자는 질환을 억압하고 역전시키는 Treg 세포 집단을 확보하기 위해 추가적인 기간 동안 치료될 수 있다. 대상체는 또한 다시-나타나는 질환의 임의의 표시(indicia)의 제1 출현시 모니터링 및 치료될 수 있다.
일일 유지 용량은 대상체에서 임상적으로 바람직한 기간 동안, 예를 들어, 1 일으로부터 최대 몇 년 (예컨대, 대상체의 전체 남은 수명 동안); 예를 들어, 약 (2, 3 또는 5 일, 1. 2, 또는 3 주, 또는 1 개월) 이상으로부터 및/또는 예를 들어, 최대 약 (5 년, 1 년, 6 개월, 1 개월, 1 주, 또는 3 일 또는 5 일) 제공될 수 있다. 약 3 내지 약 5 일 동안 또는 약 1 주 내지 약 1 년 동안 일일 유지 용량의 투여가 전형적이다. 그럼에도 불구하고, 유닛 용량은 치료적 효과가 관찰될 때까지 예를 들어, 일일 2 회 내지 2 주 마다 1 회 투여되어야 한다.
IL-10 폴리펩티드 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드) 폴리펩티드를 생산하는 미생물은 CeD의 치료를 위한 (예컨대, 공동-치료적 양생법을 사용하는) 단일- 또는 조합 요법으로 대상체에 투여될 수 있다. 용어 "공동-요법", "공동-치료적" 또는 이의 변동은 대상체가 곡물-프리 식이 (GFD)를 고수하고/하거나 대상체에 하나 이상의 추가적인 치료적 활성제, 예컨대, 추가적인 면역-조정 화합물을 투여하는 치료 양생법을 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 추가적인 치료적 활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 하나 이상의 추가적인 면역-조정 물질, 예컨대, 항체 (예컨대, 항-CD3 항체)를 함유한다. 일부 예에서, 본 개시내용의 방법은 추가적인 면역-조정 물질, 예컨대, 항체 (예컨대, 항-CD3 항체)를 대상체 (예컨대, 인간 환자)에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 추가적인 치료적 활성제는 항-CD3 항체를 배제한다
약학 조성물 및 담체
미생물 (예컨대, 박테리아, 예컨대, 본원에 기재된 LAB)은 다른 활성 성분과 조합되고/되거나 약학적으로 허용가능한 (즉, 무독성) 부형제 또는 담체와 조합된 순수한 형태로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한"은 당업계에-인정된 의미에 따라 본원에 사용되며, 약학 조성물의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에 대해 유해하지 않은 담체를 지칭한다.
본 개시내용의 조성물은 미생물 (예컨대, 박테리아)의 점막으로의 전달에 적합한 임의의 알려진 또는 달리 효과적인 투여량 또는 생성물 형태로 제조될 수 있으며, 이는 약학 조성물 및 투여량 형태뿐만 아니라 영양적 생성물 형태를 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물 (즉, 제형)은 경구 약학 조성물이다. 이 실시양태에 따른 일부 예에서, 제형 또는 약학 조성물은 건조된 형태 (예컨대, 건조-분말 형태; 예컨대, 동결-건조된 형태) 또는 임의로 다른 건조 담체와 조합한 이의 압축된 형태의 비-병원성 미생물을 포함한다. 경구 제형은 일반적으로 불활성 희석제 담체 또는 식용 담체를 포함할 것이다.
일부 예에서, 경구 제형은 코팅을 포함하거나 캡슐화 전략을 활용하며, 이는 제형의 장관으로의 전달을 용이하게 하고/하거나 미생물이 장관 (예컨대, 회장, 소장 또는 결장)에서 방출 및 수화되도록 허용한다. 일단 미생물이 제형으로부터 방출되고 충분히 수화되면, 생체활성 폴리펩티드를 발현하기 시작하고, 이는 후속적으로 주변으로 방출되거나 미생물의 표면 상에 발현된다. 이러한 코팅 및 캡슐화 전략 (즉, 지연-방출 전략)은 당업자에게 알려져 있다. 예컨대, U.S. 5,972,685호; WO 2000/18377호; 및 WO 2000/22909호를 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 임의로 다른 구성요소, 예컨대, 덱스트란, 소듐 글루타메이트 및 폴리올과 함께 동결건조된 또는 동결-건조된 형태의 미생물 (예컨대, 비-병원성 박테리아)을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 예시적인 동결-건조된 조성물은 예컨대, Corveleyn et al.의 미국 특허 출원 제2012/0039853호에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 예시적인 제형은 동결-건조된 박테리아 (예컨대, 박테리아의 치료적 유효량) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 동결-건조된 박테리아는 캡슐, 정제, 과립 및 분말의 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각각은 경구 투여될 수 있다. 대안적으로, 동결-건조된 박테리아는 적합한 배지에서 수성 현탁액으로서 제조될 수 있거나, 동결건조된 박테리아는 사용 직전에 적합한 배지, 예컨대, 음료에 현탁될 수 있다. 이러한 조성물은 예컨대, 박테리아 바이오매스의 침전, 응집 또는 부유 없이 안정한 현탁액을 유지하는 데 유용한 안정화제를 추가적으로 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 제형은 위-저항성 경구 투여량 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여량 형태 (예컨대, 캡슐, 정제, 펠렛, 마이크로-펠렛 및 과립 등)는 위에서의 용해 또는 붕괴에 저항하나, 장에서는 그렇지 않은 부형제 (보통 중합체, 셀룰로스 유도체 및/또는 친유성 재료)의 얇은 층으로 코팅되어, 이에 의해 장 (예컨대, 소장 또는 결장)에서의 붕해, 용해 및 흡수를 위해 위를 관통하는 통과를 허용할 수 있다.
일부 예에서, 경구 제형은 미생물의 제어 방출, 지속 방출 또는 장기간 방출을 제공하는 화합물을 포함하여, 이에 의해 그 안에 코딩된 원하는 단백질의 제어 방출을 제공할 수 있다. 이러한 투여량 형태 (예컨대, 정제 또는 캡슐)는 전형적으로 통상적이고 잘 알려진 부형제, 예컨대, 친유성, 중합체성, 셀룰로스성, 불용성 및/또는 팽윤성 부형제를 함유한다. 제어 방출 제형은 또한 장, 결장, 생체점착 또는 설하 전달 (즉, 치과 점막 전달) 및 기관지 전달을 포함하는 임의의 다른 전달 부위에 사용될 수 있다. 발명의 조성물이 직장으로 또는 질내로 투여되는 것인 경우, 약학 제형은 좌약 및 크림을 포함할 수 있다. 이 경우, 숙주 세포는 지질을 또한 포함하는 일반적인 부형제의 혼합물에 현탁된다. 각각의 전술한 제형은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 다음의 참고문헌에 기재되어 있다: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm. 108: 77-83).
일부 실시양태에서, 경구 제형은 미생물에 의해 발현되는 생체활성 폴리펩티드의 점막 전달 및/또는 점막 흡수를 향상시킬 수 있는 화합물을 포함한다. 다른 예에서, 제형은 제형 내에서 및/또는 일단 방출되면 미생물의 생존력을 향상시키는 화합물을 포함한다.
본 발명의 박테리아는 치료될 질환을 갖는 인간 또는 동물에 투여하기 위한 약학 제형에 현탁될 수 있다. 이러한 약학 제형은 살아있는 그람-양성 박테리아 및 투여에 적합한 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아는 일반적인 부형제, 예컨대, 락토스, 기타 당, 알칼라인 및/또는 알칼리 토류 스테아레이트, 카보네이트 및/또는 설페이트 (예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 카보네이트 및 소듐 설페이트), 카올린, 실리카, 향미료 및 아로마의 존재 하에 동결건조될 수 있다. 이렇게-동결건조된 박테리아는 캡슐, 정제, 과립 및 분말 (예컨대, 구강 세정제 분말)의 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각각은 경구 경로로 투여될 수 있다. 대안적으로, 일부 그람-양성 박테리아는 적합한 배지에서 수성 현탁액으로서 제조될 수 있거나, 동결건조된 박테리아는 사용 직전에 적합한 배지에 현탁될 수 있으며, 이러한 배지는 본원에 지칭된 부형제 및 다른 부형제, 예컨대, 글루코스, 글리신 및 소듐 사카리네이트를 포함한다.
일부 예에서, 미생물은 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체의 위장관에 국소적으로 전달된다. 예를 들어, 마이크로스피어 전달 시스템은 소화관으로의 전달을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 미소구체 전달 시스템은 대상체의 위장관으로 국소 방출을 제공하는 코팅을 갖는 마이크로입자 (예컨대, 제어 방출 제형, 예컨대, 장용-코팅 제형 및 결장 제형)를 포함한다.
경구 투여를 위해, 위저항성 경구 투여량 형태가 제형화될 수 있으며, 이 투여량 형태는 또한 그람-양성 박테리아의 제어 방출을 제공함으로써 그 안에 코딩된 원하는 단백질 (예컨대, IL-10 및 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 HLA-DQ8-특이적 에피토프)의 제어 방출을 제공하는 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, (캡슐, 정제, 펠렛, 과립, 분말을 포함하는) 경구 투여량 형태는 위에서의 용해 또는 붕괴에 저항하나, 장에서는 그렇지 않은 부형제 (보통 중합체, 셀룰로스 유도체 및/또는 친유성 재료)의 얇은 층으로 코팅되어, 이에 의해 장에서의 붕해, 용해 및 흡수를 위해 위를 관통하는 통과를 허용할 수 있다.
예를 들어, 제어 방출, 지속 방출, 장기간 방출, 지속 작용 정제 또는 캡슐과 같은 경구 투여량 형태는 그람-양성 박테리아 및 생산된 외인성 단백질의 느린 방출을 허용하도록 설계될 수 있다. 이러한 투여량 형태는 보통 통상적이고 잘 알려진 부형제, 예컨대, 친유성, 중합체성, 셀룰로스성, 불용성 및/또는 팽윤성 부형제를 함유한다. 이러한 제형은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 다음의 참고문헌에 기재되어 있다: Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; 및 Gazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108: 77-83 (1994).
약학 투여량 형태 (예컨대, 캡슐)은 위액 저항성을 수득하고 말단 회장 및 결장에서의 의도된 전달을 위해 pH-의존적 유드라짓 중합체로 코팅될 수 있으며, 여기서 중합체는 pH 6.5에서 용해된다. 다른 유드라짓 중합체 또는 중합체 간의 상이한 비율을 사용함으로써, 지연 방출 프로파일을 조정하여, 예를 들어, 십이지장 또는 공장에서 박테리아를 방출할 수 있다.
약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 비-제한적인 예는 보존제, 무기 염, 산, 염기, 완충액, 영양소, 비타민, 충전제 및 증량제, 예컨대, 전분, 당, 만니톨 및 규산 유도체; 결합제, 예컨대, 카복시메틸 셀룰로스 및 기타 셀룰로스 유도체, 알기네이트, 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈; 보습제, 예컨대, 글리세롤/ 붕해제, 예컨대, 칼슘 카보네이트 및 소듐 바이카보네이트; 용해 지체제, 예컨대, 파라핀; 재흡수 가속화제, 예컨대, 사차 암모늄 화합물; 표면 활성제, 예컨대, 아세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트; 흡착성 담체, 예컨대, 카올린 및 벤토나이트; 담체, 예컨대, 프로필렌 글리콜 및 에틸 알콜, 및 윤활제, 예컨대, 활석, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트, 및 고체 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약학적으로 상용가능한 결합제 및/또는 아쥬반트 재료는 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐 및 트로키 등은 다음의 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 바인더, 예컨대, 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스, 분산제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 활택제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료. 투여량 유닛 형태가 캡슐인 경우, 위의 유형의 재료 이외에 액체 담체, 예컨대, 지방유를 함유할 수 있다. 게다가, 투여량 유닛 형태는 투여량 유닛, 예를 들어, 당, 셸락 또는 장용제의 코팅의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 기타 재료를 함유할 수 있다. 또한, 시럽은 활성 화합물 이외에 감미제로서의 수크로스 및 특정 보존제, 염료, 착색료 및 향료를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 형태 및 특성은 함께 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 잘 알려진 변수에 의해 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있고 이의 수용자에 대해 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능해야" 한다.
투여를 위한 대안적인 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 디메틸설폭사이드, 알콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트이다. 수성 담체는 알콜 및 물의 혼합물, 완충된 배지 및 식염수를 포함한다. 정맥내 비히클은 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대, Ringer의 덱스트로스에 기반한 것들 등을 포함한다. 예를 들어, 보존제 및 기타 첨가제, 예컨대, 항미생물제, 항-산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 식염수, 알콜, DMSO 및 물-기반 용액을 포함하여 다양한 액체 제형이 이러한 전달 방법에 가능하다.
경구 수성 제형은 부형제, 예컨대, 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스 및/또는 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 이러한 조성물은 수성 담체, 예컨대, 예를 들어, 물, 알콜성/수성 용액, 식염수, 비경구 비히클, 예컨대, 소듐 클로라이드 및 링거(Ringer)의 덱스트로스 등을 추가로 포함하는 용액의 형태, 예컨대, 구강청결제 및 구강 세정제를 취한다.
수성 구강청결제 제형은 당업자에게 잘 알려져 있다. 구강청결제 및 경구 세정제에 관한 제형은 예를 들어, 미국 특허 제6,387,352호, 미국 특허 제6,348,187호, 미국 특허 제6,171,611호, 미국 특허 제6,165,494호, 미국 특허 제6,117,417호, 미국 특허 제5,993,785호, 미국 특허 제5,695,746호, 미국 특허 제5,470,561호, 미국 특허 제4,919,918호, 미국 특허 출원 공개공보 제2004/0076590호, 미국 특허 출원 공개공보 제2003/0152530호, 및 미국 특허 출원 공개공보 제2002/0044910호에 상세히 논의되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 구체적으로 원용된다.
기타 첨가제, 예컨대, 향미제, 감미제 또는 착색제, 또는 보존제가 본 개시내용의 제형에 존재할 수 있다. 예컨대, 페퍼민트 또는 스피어민트로부터의 박하, 계피, 유칼립투스, 시트러스, 카시아, 아니스 및 멘톨이 적합한 향미제의 예이다. 향미제는 액체 조성물의 경우, 예를 들어, 0 내지 3%의 범위; 최대 2%, 예컨대, 최대 0.5%, 예컨대, 약 0.2%의 양으로 경구 조성물에 존재한다.
감미료는 경구 조성물의 0 내지 2%의 범위, 예를 들어, 최대 1% w/w, 예컨대, 0.05 내지 0.3% w/w의 양으로 존재할 수 있는 인공 또는 자연 감미제, 예컨대, 소듐 사카린, 수크로스, 글루코스, 사카린, 덱스트로스, 레불로스, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 프럭토스, 말토스, 자일리톨, 타우마틴, 아스파탐, D-트립토판, 디하이드로칼콘, 아세설팜 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
착색제는 적합한 자연 또는 합성 안료, 예컨대, 티타늄 디옥사이드 또는 CI 42090 또는 이들의 혼합물이다. 착색제는 바람직하게는 액체 조성물의 경우에, 0 내지 3%의 범위; 예를 들어, 최대 0.1%, 예컨대, 최대 0.05%, 예컨대, 약 0.005-0.0005%의 양으로 조성물에 존재한다. 일반적인 보존제 중에서, 소듐 벤조에이트는 조성물의 pH를 변경하기에 실질적으로 불충분한 농도가 바람직하고, 그렇지 않으면 완충제의 양이 원하는 pH에 도달하도록 조정될 필요가 있을 수 있다.
다른 임의적 성분은 습윤제, 계면활성제 (비-이온성, 양이온성 또는 양쪽성), 증점제, 검 및 결합제를 포함한다. 습윤제는 제형에 바디감을 첨가하고 치약 조성물에 수분감을 보유한다. 게다가, 습윤제는 제형의 보관 동안에 미생물의 변질을 방지하는 데 도움이 된다. 이는 또한 상 안정성을 유지하는 데 도움이 되며, 투명한 또는 반투명한 치약을 제형화하는 방법을 제공한다.
적합한 습윤제는 글리세린, 자일리톨, 글리세롤 및 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜을 포함하며, 이는 예를 들어, 각각 최대 50% w/w의 양으로 존재할 수 있지만, 전체 습윤제는 일부 경우에 조성물의 약 60-80% w/w 이하이다. 예를 들어, 액체 조성물은 최대 약 30% 글리세린 + 최대 약 5%, 예를 들어, 약 2% w/w의 자일리톨을 포함할 수 있다. 계면활성제는 바람직하게는 음이온성이 아니며, 조성물의 최대 약 6%, 예를 들어, 약 1.5 내지 3% w/w의 양으로 폴리소르베이트 20 또는 코코아미도베타인 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 경구 조성물이 액체 형태인 경우, 필름-형성제를 경구 조성물의 최대 약 3% w/w, 예컨대, 경구 조성물의 0 내지 0.1%의 범위, 예를 들어, 약 0.001 내지 0.01%, 예컨대, 약 0.005% w/w로 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 필름-정형재는 (소듐 히알루로네이트 이외에) 상표명 간트레즈(Gantrez)로 판매되는 것들을 포함한다.
경구 또는 경장 투여를 위한 액체 영양 제형은 하나 이상의 영양소, 예컨대, 지방, 탄수화물, 단백질, 비타민 및 미네랄을 포함할 수 있다. 탄수화물, 지질, 단백질, 미네랄 및 비타민의 많은 상이한 공급원 및 유형이 알려져 있으며, 단, 이러한 영양소가 선택된 제형에 첨가된 성분과 양립가능하고 의도된 용도에 대해 안전하고 효과적이며, 달리 생성물 성능을 과도하게 손상시키지 않는다면, 본 발명의 영양 액체 실시양태에서 사용될 수 있다.
이러한 영양 액체는 예를 들어, 영양 액체를 마시거나 투여하는 동안 점막의 보다 효과적이고 진정되는 코팅을 제공하기에 충분한 점도, 유동, 또는 기타 물리적 또는 화학적 특성화로 제형화된다. 이러한 영양 실시양태는 또한 일부 경우에 개인의 단독, 일차 또는 보충 영양 요구를 충족시키기에 적합한 균형잡힌 영양 공급원을 나타낸다.
적합한 영양 액체의 비-제한적인 예는 미국 특허 제5,700,782호 (Hwang et al.); 미국 특허 제5,869,118호 (Morris et al.); 및 미국 특허 제5,223,285호 (DeMichele et al.)에 기재되어 있으며, 이의 설명은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
본원에 사용하기에 적합한 영양 단백질은 가수분해, 부분 가수분해 또는 비-가수분해될 수 있으며, 임의의 알려진 또는 달리 적합한 공급원, 예컨대, 우유 (예컨대, 카세인, 유청), 동물 (예컨대, 육류, 생선), 시리얼 (예컨대, 쌀, 옥수수), 야채 (예컨대, 대두), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다.
영양 액체에 사용하기에 적합한 지방 또는 지질은 코코넛 오일, 대두 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 잇꽃 오일, 고 올레익 잇꽃 오일, MCT 오일 (중쇄 트리글리세리드), 해바라기 오일, 고 올레익(high oleic) 해바라기 오일, 구조화된 트리글리세리드, 팜 및 팜 커널 오일, 팜 올레인, 카놀라유, 해양유, 면실유, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 영양 액체에 사용하기에 적합한 탄수화물은 단순 또는 복합, 락토스-함유 또는 락토스-프리, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적합한 탄수화물의 비-제한적인 예는 가수분해된 옥수수 전분, 말토덱스트린, 글루코스 중합체, 수크로스, 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고형물, 쌀-유래된 탄수화물, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 고 프럭토스 옥수수 시럽 및 소화불가능한 올리고당, 예컨대, 프럭토-올리고당 (FOS) 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
영양 액체는 다양한 비타민 중 임의의 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이의 비-제한적인 예는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 티아민, 리보플라빈, 피리독신, 비타민 B12, 니아신, 엽산, 판토텐산, 비오틴, 비타민 C, 콜린, 이노시톨, 이들의 염 및 유도체, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
영양 액체는 알려진 또는 달리 CeD의 위험이 있거나 이로 고통받는 환자에 사용하기에 적합한 다양한 미네랄 중 임의의 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이의 비-제한적인 예는 칼슘, 인, 마그네슘 철, 셀레늄, 망간, 구리, 아이오딘, 소듐, 포타슘, 클로라이드 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 미생물, 특히, 효모 및 박테리아는 또한 편리한 경구 또는 직장 투여를 위한 엘릭서 또는 용액으로서 또는 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내 경로에 의한 비경구 투여에 적절한 용액으로서 제형화될 수 있다. 추가적으로, 뉴클레오시드 유도체는 또한 활성 성분만을 방출하거나 일부 경우에 장관의 특정 부분에서, 예를 들어, 효율성을 추가로 향상시키는 연장된 기간 또는 장기간에 걸쳐 활성 성분을 방출하는 투여량 형태를 포함하는 지속 또는 장기간 방출 투여량 형태로서의 제형화에 매우 적합하다. 이러한 투여량 형태의 코팅, 외피 및 보호 매트릭스는 예를 들어, 약학 분야에 잘 알려진 중합체성 물질 또는 왁스로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학 투여량 형태, 예컨대, 로젠지, 트로키 또는 파스틸을 포함한다. 이들은 전형적으로 적합하게 향미된 베이스에 활성 성분을 함유하는 원반-형상의 고체이다. 베이스는 딱딱한 설탕 캔디, 글리세린화된 젤라틴, 또는 설탕과 이를 형성하기에 충분한 점액질을 조합일 수 있다. 트로키는 구강에 위치하며 여기서 이들은 천천히 용해되어, 자유롭게 되어 활성 성분이 점막과 직접 접촉한다.
본 발명의 트로키 실시양태는, 예를 들어, 유연한 덩어리가 형성될 때까지 분말 활성제, 분말 설탕 및 검의 혼합물에 물을 천천히 첨가함으로써 제조될 수 있다. 7% 아카시아 분말을 사용하여, 덩어리에 충분한 점착성을 제공할 수 있다. 덩어리를 펴고 평평한 덩어리로부터 트로키 조각을 자르거나, 덩어리를 실린더로 롤링하거나 분할할 수 있다. 잘린 또는 분할된 각각의 조각은 형상이 지정되고 건조되어 트로키 투여량 형태를 형성한다.
활성 성분이 열 불안정한 경우, 압축에 의해 로렌지 제제로 만들 수 있다. 예를 들어, 제제의 과립화 단계는 임의의 압축 정제에 사용되는 것과 유사한 방식으로 수행된다. 로젠지는 투여량 형태가 구강에서 천천히 용해되거나 붕해되는 것이 바람직하기 때문에 보통보다 더 단단한 정제를 제공하기 위해 무거운 압축 장비를 사용하여 만들어진다. 성분은 일부 경우에 느린-용해 특성화를 촉진하기 위해 선택된다.
본 발명의 특정 제형에서, 미생물은 사전-젤라틴화된 전분 및 가교된 폴리 (아크릴산)을 함유하는 생체점착성 담체에 혼입되어, 협측 적용에 적합한 (즉, 장기간 생체점착력 및 지속된 약물 전달을 갖는) 생체점착성 정제 및 생체점착성 겔을 형성한다.
대안적인 실시양태에서, 발명에 따른 비-병원성 및 비-침습성 박테리움의 분말 혼합물, 생체점착성 중합체 (전호화 전분 및 분무 건조를 통해 공동가공된 가교된 폴리 (아크릴산)), 소듐 스테아릴 푸마레이트 (윤활제), 및 이산화규소 (활택제)를 정제 (중량: 100 mg; 직경: 7 mm)로 가공한다. 이러한 정제의 생산 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 다양한 약물 (미코나졸, 테스토스테론, 플루오라이드, 시프로플록사신)을 함유하는 생체점착성 정제의 성공적인 개발을 위해 이전에 설명되었다 (Bruschi M. L. and de Freitas O., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31:293-310). 모든 부형제 재료는 약학 등급으로 상업적으로 이용가능하다.
제형을 최적화하기 위해, 정제의 약물 부하 및 전분 및 폴리 (아크릴산) 사이의 비율은 다양할 것이다. 이전 연구에 기반하여, 공동가공된 생체점착 담체의 최대 약물 부하는 약 60% (w/w)이고, 전분/폴리 (아크릴산) 비율은 75/25 및 95/5 (w/w) 사이에서 다양할 수 있다. 최적화 연구 동안에, 정제의 생체점착 특성 및 정제로부터의 약물 방출이 주요 평가 매개변수이고, 표준 정제 특성 (경도, 마손도)이 이차 평가 기준이다.
박테리아는 전호화 전분 및 가교 폴리 (아크릴산)의 수성 분산액에 혼입된다. 이 중합체 분산액은 고 전단 혼합기를 사용하는 표준 절차를 통해 제조된다.
정제와 유사하게, 겔의 약물 부하 및 전분/폴리 (아크릴산) 비율은 식도 점막에 대한 최적의 부착을 갖는 겔을 수득하기 위해 최적화될 필요가 있다. 겔의 경우, 분산액 중 중합체 농도는 겔의 점도를 결정하여 점막-점착 특성을 결정하므로 추가적인 변수이다.
식도의 점막에 대한 중합체 분산물의 생체점착 특성을 스크리닝하는 모델은 Batchelor et al. (Int. J. Pharm., 238: 123- 132, 2002)에 의해 상세히 기재되어 있다.
다른 투여 경로 및 형태는 살아있는 미생물을 함유하는 식품 제제를 포함한다. 일부 예에서, 생체활성 폴리펩티드-발현 미생물은 유제품에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 선택된 투여량 형태를 제형화하거나 제조하기 위한 임의의 알려진 또는 달리 효과적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 경구 정제, 캡슐, 스프레이, 로젠지, 처리된 기질 (예컨대, 경구 또는 국부 면봉, 패드, 또는 일회용, 본 발명의 조성물로 처리된 소화불가능한 기질); 경구 액체 (예컨대, 현탁액, 용액, 에멀젼), 분말, 좌약, 또는 임의의 다른 적합한 투여량 형태로 형성된 일반적인, 예컨대, 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 부형제 및 희석제와 함께 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 다음을 포함한다: IL-10 유전자 및 CeD-특이적 항원 유전자를 함유하는 (또는 IL-10 및 CeD-특이적 항원을 발현할 수 있는) 미생물 (예컨대, 비-병원성 박테리움)을 약학적으로 허용가능한 담체와 접촉시켜, 약학 조성물을 형성하는 단계. 일부 예에서, 방법은 다음을 추가로 포함한다: 배지에서 미생물을 성장시키는 단계. 방법은 미생물을 함유하는 액체를 동결-건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 액체는 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
유닛 투여량 형태
본 개시내용은 식품-등급 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 임의로 조합된 특정 양의 비-병원성 미생물을 포함하는 유닛 투여량 형태를 추가로 제공하며, 여기서 상기 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 다음을 포함한다: IL-10 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산; 및 CeD-특이적 항원 (예컨대, 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA)-DQ2-특이적, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 펩티드)을 코딩하는 외인성 핵산. 예시적인 유닛 투여량 형태는 약 1×103 내지 약 1×1014 개의 콜로니 형성 유닛 (cfu)의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 함유한다. 다른 예시적인 유닛 투여량 형태는 약 1×104 내지 약 1×1013 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움), 또는 약 1×104 내지 약 1×1012 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 함유한다. 다른 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×105 내지 약 1×1012 개의 cfu, 또는 약 1×106 내지 약 1×1012 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×108 내지 약 1×1012 개의 cfu, 또는 약 1×109 내지 약 1×1012 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×109 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×109 내지 약 1×1010 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×107 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×108 내지 약 1×1010 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 포함한다. 일부 예에서, 유닛 투여량은 약 1×104 내지 약 1×1012 개의 콜로니-형성 유닛 (cfu)의 sAGX0868을 함유한다. 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×108 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1010 내지 약 1×1011 개의 cfu, 또는 약 1×1011 개의 cfu의 sAGX0868을 함유한다.
또 다른 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 약 1×109 내지 약 1×1010 개의 cfu, 또는 약 1×109 내지 약 100×109 개의 cfu의 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)을 포함한다.
유닛 투여량 형태는 임의의 물리적 형태 또는 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유닛 투여량 형태는 경구 투여에 적합하다. 이들 실시양태에 따른 일부 예에서, 유닛 투여량 형태는 캡슐, 정제 또는 과립의 형태이다. 예시적인 캡슐은 미세-과립으로 충전된 캡슐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여량 형태에 함유된 비-병원성 미생물 (예컨대, 비-병원성 그람-양성 박테리움)은 건조-분말 형태이다. 예를 들어, 미생물은 임의로 압축 및 코팅되는 동결-건조된 분말 형태이다.
조성물 및 방법은 뒤따르는 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있지만, 당업자는 이들이 단지 넘버링된 실시양태 및 뒤따르는 실시양태에서 보다 완전하게 기재된 바와 같이 발명을 예시한다는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 공개물이 인용된다. 이들 공개물의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다.
실시예
실시예 1: 마우스에서 셀리악 질환의 치료
이 실험은 생체내 중재 연구, 즉, 글루텐 치료를 사용하여 질환의 개시 후 L. 락티스 치료를 출발하는 것을 설명한다. 이 실험은 CeD에 대한 마우스 모델에서 글루텐에 대한 경구 내성을 회복시키기 위해 L. 락티스 균주를 발현하는 탈아미드화된 HLA-DQ8-특이적-에피토프 ("dDQ8")의 효험을 평가한다. 인간 CeD 환자는 주로 HLA-DQ2.5 대립유전자를 발현한다. 그러나, HLA-DQ2.5는 마우스에서 발현되지 않으며, 전형적인 CeD 특징을 나타내는 인간화 DQ2 모델이 이용가능하지 않기 때문에, HLA DQ8-제한 마우스 모델에서 대용 dDQ8-분비 L. 락티스 균주를 사용하여 개념-증명을 추구하였다. 대용 dDQ8-분비 L. 락티스 균주는 분비된 에피토프를 제외하고 제안된 dDQ2-분비 L. 락티스 임상 균주와 동일한 유전적 특질을 갖는다.
재료 및 방법
다음의 설명에 사용된 약어의 비-포괄적인 목록이 표 6에 제공된다.
표 6
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실험의 개요
DQ8-IL15LPxIEC 마우스를 30 일 동안 글루텐에 (식단 및 위관영양법에 의해) 노출시키고, 글루텐-프리 식단 (GFD)으로 30 일 동안 회복한 다음, 매일 L. 락티스의 4 개의 균주 중 하나를 투여하고, 마우스를 21 일 동안 GFD로 유지시켰다. 그런 다음, 매일 L. 락티스 치료를 계속하면서 21 일 동안 글루텐-함유 식단으로 마우스를 재-챌린지하였다. 각각의 실험의 종료시, 마우스를 안락사시키고, 상피내 림프구 (IEL) 활성화 마커에 대한 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석을 위한 조직학 (병리학을 위한 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색, IEL 계수를 위한 CD3 면역염색), 점막고유층 (LP) 및 상피 단리를 위해 소장을 가공하였다. 상피 스트레스 마커 및 세포독성 분자에 대한 유전자 발현 수준을 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 평가하였다.
마우스
사용된 CeD의 마우스 모델은 모든 조직에서 염증성 사이토카인 IL-15를 과발현하는 HLA-DQ8 인간화 마우스이며, 특히, 장 상피 및 점막고유층 둘 모두에서 IL-15 발현은 Dd 및 빌린 프로모터에 의해 구동된다. 마우스는 DQ8-IL15LPxIEC로서 지칭된다. DQ8-IL15LPxIECL 마우스는 C57BL/6 배경에 있으며, DQ8-IL15LP 마우스를 DQ8-IL15IEC 마우스와 교차시킴으로써 생성하였다 (Kim et al, 원고 준비 중).
DQ8-IL15LPxIEC 마우스는 식이 글루텐에 노출되었을 때, 인간 상황에서 볼 수 있는 바와 같이 T 세포 침윤 및 장 조직 파괴를 발달시킨다. 따라서, 이 마우스 모델은 AG017 대용 L. 락티스 균주의 치료적 가능성을 테스트할 수 있는 우수한 기회를 제공한다.
DQ8-IL15LPxIEC 마우스는 실험 출발시 9 주령이었고, 수컷 및 암컷 마우스 둘 모두를 사용하였다. 마우스를 실험 출발까지 GFD (연구 식단, AIN-76A)로 유지하였으며, 이때 글루텐이 식단에 도입되어 CeD를 유도하였다. GFD 이외에, 이 식단 동안에 격일로 마우스에 대략 20 mg의 글리아딘 (Sigma, G3375)을 위관영양법으로 투여하였다.
모든 동물 절차는 시카고 대학의 지역 윤리 위원회, ACUP 71966에서 검토되었다.
락토코커스 락티스 균주 및 배양
공동-분비된 hIL-2 또는 hIL-10를 포함하거나 포함하지 않고, 탈아미드화된 HLA-DQ8 펩티드를 분비하는 L. 락티스 균주의 효험 (표 7)을 조사하였다.
표 7
Figure pct00019
L. 락티스-pT1NX는 빈 벡터 pT1NX (GenBank: HM585371.1)를 함유하는 MG1363 균주이며, 대조군으로서 역할을 한다. 플라스미드-구동된 L. 락티스 균주 MG1363[pAGX2263]은 플라스미드 pAGX2263을 함유한다. pAGX2263에서, hllA 프로모터 (PhllA)는 ps356 엔도리신 유전자 분비 리더 (SSps356, SL#21)와 탈아미드화된 HLA-DQ8-펩티드를 코딩하는 단편의 융합을 코딩하는 유전자의 발현을 구동하여, 탈아미드화된 HLA-DQ8-펩티드의 발현 및 분비를 허용하였다. 플라스미드 pAGX2263을 야생형 L. 락티스 아종 크레모리스 균주 MG1363으로 전기천공하였다.
플라스미드-구동된 L. 락티스 균주 sAGX0487[pAGX2263]은 위에 기재된 플라스미드 pAGX2263을 함유한다. 플라스미드 pAGX2263을 sAGX0487에 전기천공하였다. sAGX0487 (L. 락티스 아종 크레모리스 MG1363: ΔthyA; eno>>SSusp45-hil-10; usp45>>otsB; ΔtrePP; PhllA>>trePTS; ptcC-)에서:
- 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)가 부재하여, 환경적 봉쇄를 보장하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)가 부재하여, 외인성으로 첨가된 트레할로스의 축적을 허용하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)는 usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치하여, 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하였다. otsB 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역 (IR)의 사용에 의해 usp45에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
- HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터는 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305, 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하여, 트레할로스 흡수를 강화하였다.
- 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 (ptcC; 유전자 ID: 4796893)가 붕괴되었다 (446의 코돈 위치 30에서 tga; tga30). 이 돌연변이는 축적 후 트레할로스 잔류를 확인한다.
- 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 P2A를 코딩하는, hil-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45)의 융합을 코딩하는 유전자는 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에 위치하여, hIL-10의 발현 및 분비를 허용하였다. hil-10 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
트레할로스의 존재 하에 성장하는 경우, sAGX0487은 담즙산 독성으로부터 보호를 제공하는 트레할로스를 축적 및 보유한다. 게다가, sAGX0487은 hIL-10을 구성적으로 발현 및 분비한다.
플라스미드-구동된 L. 락티스 균주 sAGX0526[pAGX2263]은 플라스미드 pAGX2263 (위에 기재됨)을 함유한다. 플라스미드 pAGX2263을 sAGX0526에 전기천공하였다. sAGX0526 (L. 락티스 아종 크레모리스 MG1363: ΔthyA; eno>>SSusp45-hil-2; usp45>>otsB; ΔtrePP; PhllA>>trePTS; ΔptcC)에서:
- 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)가 부재하여, 환경적 봉쇄를 보장하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)가 부재하여, 외인성 트레할로스의 축적을 허용하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)는 미식별된 분비된 45-kDa 단백질 유전자 (usp45; 유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치하여, 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하였다.
- HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터는 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 ptsI 및 ptsII; LLMG_RS02300 3 및 LLMG_RS02305, 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하여, 트레할로스 흡수를 강화하였다.
- 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 ptcC (유전자 ID: 4796893)가 결실되어, 트레할로스 잔류를 증가시켰다.
- 인간 인터류킨-2 (hIL-2; UniProt: P60568, aa 21-153)를 코딩하는, hil-2 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45)의 융합을 코딩하는 유전자는 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에 위치하여, hIL-2의 발현 및 분비를 허용하였다. hil-2 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
트레할로스의 존재 하에 성장하는 경우, sAGX0526은 담즙산 독성으로부터 보호를 제공하는 트레할로스를 축적 및 보유한다. 게다가, sAGX0526은 hIL-2를 구성적으로 발현 및 분비한다.
10 마이크로리터 (μl)의 박테리아 스톡과 함께 GM17TE 브로쓰(broth) (리터당 39.1 그램 (g/l)의 M17 브로쓰, 0.5% (w/v)의 글루코스, 200 마이크로몰 (μM)의 티미딘 및 밀리리터당 5 마이크로그램 (μg/ml) 에리트로마이신)를 접종하여 밤새 배양물 (30℃에서 12-16 시간, 정치 배양물)을 제조하였다. 이들 배양물을 4℃에서 10 분 동안 4,000 g으로 스핀 다운시키고, 그 후 펠릿을 2 ml BM9T 배지 (1x M9 염, 0.5% 카시톤, 0.5% 글루코스, 30 mM의 NaHCO3, 20 mM의 Na2CO3, 2 mM의 MgSO4, 100 μM의 CaCl2 및 200 μM의 티미딘)에서 재현탁하고 잘 혼합하였다. 마우스는 매일 경구 위관영양법당 100 μl의 투약 용액을 받았다 (109 개의 콜로니-형성 유닛 (CFU)). 품질 제어는 M9 완충액으로 만든 5 개의 희석액을 플레이팅하여 밀리리터당 CFU (CFU/ml)를 일주일에 1-2x 회 결정함으로써 수행하였다.
마우스 해부 및 세포 단리
마우스를 경추 탈구로 희생시켰다. 장간막 림프절을 추출하고, 가공하기 전에 소장으로부터 Peyer의 패치를 제거하였다. 십이지장 및 공장의 시작부로부터 5 밀리미터 (mm) 및 회장의 마지막 5 mm를 채취하여, 조직학을 위해 10% 포르말린에 넣었다. 소장을 다음과 같이 세포 추출에 사용하였다: 1% 투석된 태아 소혈청 (FBS), 2 mM의 EDTA 및 1.5 mM의 MgCl2가 보충된 15 ml의 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640에서, 37℃ 및 220의 분당 회전수 (RPM)에서 20 분 동안 단편화된 소장을 2 회 진탕함으로써 IEL을 분리하였다. 상피 세포를 배지에서 회수하고, 100 μm의 스트레이너를 통해 여과하고, 4℃에서 1600 RPM으로 스핀 다운시키고, 차가운 FACS 완충액 (2% FBS를 포함하는 PBS)에 재현탁하였다.
고유점막층 림프구 (LPL)를 20% FBS 및 100 U/ml의 콜라게나제 VIII (Sigma, C2139)가 보충된 RPMI 1640 배지에서 20 분 동안 2 회 항온처리하여 단리하였다. 그 다음, 40% 퍼콜(Percoll) (GE Healthcare, 17-0891-01)에서 IEL 및 LP 세포를 12 분 동안 20℃에서 3,000 RPM에서 가속/저속 (1/1)으로 원심분리하였다. 펠렛을 FACS 완충액에 재현탁하고, IEL 및 LPL 세포를 계수하였다.
병리학
5 μM 두께의 회장 절편을 자르고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 하고, 블라인드 방식으로 스코어링하였다. 단순 위축 점수는 0 (위축이 없거나 경미한 위축) 또는 2 (중증 또는 부분 융모 위축)였다. 융모 높이/음와 깊이 비율을 6 개의 잘-배향된 융모의 형태학적 측정으로부터 수득하였다. 융모 높이 대 음와 깊이 비율은 융모 높이를 상응하는 음와 깊이로 나누어 계산하였다. 융모 높이의 측정은 융모의 상단으로부터 어깨까지 또는 리베르쿤의 음와의 상단까지 이루어졌다. 음와 깊이는 리베르쿤의 음와의 상단으로부터 음와의 가징 깊은 수준까지의 거리로서 측정하였다. 융모 위축을 융모 높이 대 음와 깊이 비율 ≤ 2에 의해 입증하였다.
상피내 림프구 (IEL)의 양은 다음과 같이 염색된 회장 절편에서 100 개 이상의 장 상피 세포 중에서 CD3+ IEL의 양을 계수함으로써 결정하였다: 조직 절편을 탈파라핀화하고, 자일렌을 통해 재수화시키고, 에탄올을 증류수로 연속 희석하였다. 이들을 항원 회수 완충액 (S1699, DAKO)에서 항온처리하고, 20 분 동안 97℃ 초과의 스티머에서 가열하였다. 항-CD3 (1:60, Abcam, ab16669, 토끼 IgG)를 습도 챔버에서 실온에서 1-시간 항온처리하기 위해 조직 절편에 적용하였다. TBS 세척 후, 조직 절편을 실온에서 30 분 동안 비오틴화된 항-토끼 IgG (1:200, 카탈로그 번호 BA-1000, Vector Laboratories)와 함께 항온처리하였다. 항원-항체 결합을 Elite® ABC HRP 키트 (카탈로그 번호 PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 및 DAB (Agilent DAKO, K3468) 시스템에 의해 검출하였다. 조직 절편을 대조염색을 위해 헤마톡실린에 잠시 담그고, 덮개 유리로 덮었다.
항체 및 유세포 분석
백만 개의 IEL을 살아있는/사멸 세포 마커 및 다음의 접합된 항체로 염색하였다: CD45, TCRαβ, TCRγδ, CD8α, CD8β, CD4, NKG2D, NKG2A.B6 및 CD94.
백만 개의 LPL을 살아있는/사멸 세포 마커 및 다음의 접합된 항체로 염색하였다: CD45, TCRαβ, CD8α, CD8β, CD4, Tbet, Foxp3, Rorγt. 사용된 항체는 표 8에 명시되어 있다.
표 8
Figure pct00020
세포를 먼저 FACS 완충액 중 Fc 블록 (1:300)과 함께 10 분 동안 항온처리한 다음, FACS 완충액 (200 μl, 1,600 RPM, 4℃에서 5 분)에서 세척 및 스핀 다운하였다. PBS (1:50), 10 분, 4℃에서 살아있는/사멸 염색을 수행한 다음, 세척 단계를 수행하였다. 표면 염색은 50 μl의 FACS 완충액에서 4℃에서 25 분 동안 수행한 후, 세척하였다. 세포내 염색의 경우, 세포를 먼저 200 μl의 투과/고정 용액 (Invitrogen)에서 4℃에서 20 분 동안 고정한 다음, 투과/세척 완충액에서 2 단계 세척을 수행하였다. 그런 다음, 세포를 4℃에서 30 분 동안 (투과/세척 완충액 중) 항체와 함께 항온처리한 후, 세척하였다. 세포를 200-400 μl의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 유세포 분석법을 BD (Becton, Dicking & Company) 분석기로 수행하고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star Inc.)를 사용하여 분석하였다. 분석을 다음과 같이 게이팅함으로써 수행하였다: 림프구, 살아있는 세포, CD45+ 세포, TCRαβ+ 세포, CD8αβ+CD4-, NKG2D+NKG2A-. 세포의 절대 수를 CD8αα+CD8αβTCRαβ+TCRγδ+NKG2D+NKG2A-의 분획에 조직학에서 발견된 CD3+ 세포의 수를 곱하여 계산하였다.
RNA 단리 및 qPCR
제조사의 지침에 따라 Qiagen 미니 키트를 사용하여 RNA 추출을 위해 상피 분획 (퍼콜 분리 전의 세포 분획)으로부터 단리된 2백만 개의 세포를 사용하였다. IEL에 의한 세포독성 분자 퍼포린의 발현을 퍼콜 분리 후 세포 분획에서 평가하였다. Promega GoScript™ (Promega, Madison, WI)를 사용하여 200 ng의 RNA를 cDNA로 전사하였다. SYBR 그린 (TaKaRa Clontech)을 사용하여 LightCycler® 480 (Roche, Indianapolis, IN)에서 qPCR을 수행하였다. 발현 수준을 Gapdh로 정규화하였다. 프라이머는 표 9에 나열되어 있다.
표 9
Figure pct00021
ELISA
고-결합 ELISA 96-웰 플레이트 (Corning)를 4℃에서 밤새 100 mM의 Na2HPO4 중의 50 μl의 100 μg/ml의 케모-트립신 (CT) 소화된 글리아딘 또는 탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 0.05% Tween 20으로 3 회 세척하고, 실온에서 2 시간 동안 PBS 0.05% Tween 20 중의 200 μl의 2% BSA로 차단하였다. 표지되지 않은 IgG2c 또는 IgG (SouthernBiotech)를 7 개의 농도 (50 ng/ml 최고 농도, 2-배 희석)의 양성 대조군으로서 사용하였다. 혈청을 1:100 희석액으로 중복으로 판정하였다. 혈청을 4℃에서 밤새 항온처리하고, 플레이트를 PBS 0.05% Tween 20으로 3 회 세척하였다. 차단 완충액 (1/500 희석에서 50 μl) 중의 항-마우스 IgG2c, 또는 IgG-홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) (SouthernBiotech)를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 5 회 세척하였다. HRP 기질 TMB (50 μl)를 첨가하고, 50 μl의 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 항-글리아딘 및 항-DGP 항체의 수준을 OD 값으로 표현하였다.
통계적 분석
데이터를 먼저 D'Agostino 및 Pearson 옴니버스 정규성 테스트를 사용하여 정규 분포에 대해 분석하였다. 정규 분포 데이터를 단일 비교의 경우 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-테스트를 사용하고 다중 비교의 경우 일원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. ANOVA 분석에 이어 Tukey의 사후 테스트가 뒤따랐다. 정규 분포가 아닌 데이터를 단일 비교를 위해 쌍을 이루지 않은 양측 Mann-Whitney U-테스트를 사용하거나 2 개 초과의 그룹을 비교하기 위해 Dunn의 다중 비교 테스트와 함께 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 분석하였다. 사용된 통계적 테스트 및 P-값을 각각의 도면 범례에 표시하였다. <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. *P < 0.05. 모든 테스트를 GraphPad Prism 버전 7.04 (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com)에서 수행하였다.
결과
(dDQ8을 단독으로, 또는 IL-2 또는 IL-10과 함께 발현하는) L. 락티스의 상이한 균주가 글루텐에 대한 경구 내성을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, DQ8-IL15LPxIEC 마우스에 글루텐-함유 식단을 섭식하고, CeD를 유도하기 위해 30 일 동안 글리아딘을 격일로 위관영양하였다. 그런 다음, 회복하기 위해 마우스에 30 일 동안 글루텐-프리 식단 (GFD)으로 다시 스위칭한 후, GFD로 21-일 매일 L. 락티스 투여를 출발하였다. 그런 다음, 마우스를 L. 락티스 치료 없이 21 일 동안 글루텐 함유 식단으로 재-챌린지하였다.
마우스를 DQ8 수준에 기반하여 유전자형으로 분류하고 그룹 중에 동등하게 분포시켰다. 배치 및 그룹당 마우스의 수를 표 10에 도시하였다. L. 락티스 치료 동안에, 동물에서 관찰된 치료-관련된 이환율 또는 사망률은 없었다.
표 10
Figure pct00022
병리학
인간에서 CeD의 한가지 중요한 결정은 소장 생검의 조직병리학적 판정이다 (Rubio-Tapia et al., 2013, Am. J. Gastroenterol. 108: 656-676). 따라서, 융모 위축 단순 점수로 표시되는 융모 위축의 존재 (VA) 또는 부재 (VA 없음)를 판정하기 위해 H&E 염색된 절편에서 육안적 병리학을 판정하였다. 0 점은 위축이 없거나 경미한 위축이고, 2 점은 중증의 또는 부분적 융모 위축이다. 이 스코어링을 블라인드 방식으로 수행하였다. 도 1a는 빈 벡터 L. 락티스 또는 dDQ8을 발현하는 L. 락티스로 치료된 마우스의 50%, 및 LL-[dDQ8]+IL-2 그룹의 마우스의 70%가 융모 위축을 가졌음을 도시한다. 특히, 융모 위축의 발생률을 LL-[dDQ8]+IL-10으로 치료된 마우스에서 25%까지 낮추었다.
융모 높이 대 음와 깊이 비율 (Vh/Cd; 도 1b에서 "V/Cr")을 절편당 최대 6 개의 잘-배향된 융모의 융모 및 음와 길이를 측정함으로써 결정하였다 (도 1b). LL-빈 벡터 또는 LL-[dDQ8]을 받은 마우스는 비슷한 수준의 융모 위축 및 V/Cr을 가졌다. V/Cr은 LL-[dDQ8]+IL10으로 치료된 마우스에서 더 높았지만, LL-[dDQ8]+IL2로 투여된 그룹은 가장 낮은 전체 값을 가졌다 (통계적으로 유의하지 않음). 회장 절편의 관찰로부터 수득된 결과는 융모 위축의 지표로서 컷-오프 ≤2.0이 사용된 음와 깊이에 대한 융모 높이의 형태학적 판정으로부터 수득된 결과와 일맥상통하였다 (도 1b): 각자 LL-빈 벡터 55%, LL-[dDQ8] 25%, LL-[dDQ8]+IL2 60%, 및 LL-[dDQ8]+IL10 25%.
CeD의 다른 특징은 상피내 림프구증가증이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여 상이한 LL 균주로 치료된 마우스에서 유의적이지는 않지만 전반적으로 CD3+ IEL의 저하가 있었다.
유세포 분석법
CeD에서의 조직 파괴는 상피 세포의 표면 상에 비고전적인 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 활성화 NK 수용체, 예컨대, NKG2D를 발현하는 세포독성 CD8+ IEL에 의해 매개되는 것으로 생각된다 (예컨대, H
Figure pct00023
e, et al. 2004, "A Direct Role for NKG2D/MICA Interaction in Villous Atrophy during Celiac Disease," Immunity 21: 367-377; Meresse, et al, 2006, Reprogramming of CTLs into natural killer-like cells in celiac disease. J. Exp. Med. 203: 1343-1355 참고). 도 3에 도시된 바와 같이, CD8αβ+ 세포에서 NKG2D를 활성화시키는 빈도는 빈 벡터 대조군에 비해 모든 LL-[dDQ8] 처리군에서 저하하였다. 이 상이함은 LL-[dDQ8] 및 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 세포의 백분율 및 절대 수 둘 모두에 의해 가장 명확하였다 (도 3a 및 3b). 이들 데이터는 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 세포용해성 T 세포의 저하를 나타내는 경향을 시사한다. 그러나, 그룹 간의 상이함은 통계적으로 유의하지 않았다. CD4 세포 구획 (도 3c 및 3d)에서 유사한 경향이 관찰되었으며, 여기서 상이함이 또한 유의하지 않았다.
조절 T 세포 마커 Foxp3뿐만 아니라 TH1 세포 마커 Tbet의 발현을 또한 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 모든 LL-[dDQ8]-처리군은 Foxp3+Tbet- 세포의 증가된 빈도를 가졌으며 (도 4a), Foxp3-Tbet+ 세포의 더 낮은 수준을 가졌다 (도 4b). Foxp3+Tbet- 대 Foxp3-Tbet+ 세포의 비율 (도 4c)은 모든 LL-[dDQ8]-처리군, 특히 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 증가하였다. 따라서, 전-염증성 T 세포에 비해 관용성 T 세포의 증가 경향이 관찰되었다. 그러나, 그룹 간에 통계적으로 유의한 상이함은 발견되지 않았다.
qPCR
RNA를 단리된 상피 세포로부터 추출하고, qPCR을 수행하여, IEL에 의해 발현된 NK 수용체를 활성화하기 위한 상피 스트레스 마커 및 리간드인 Qa-1, 및 Rae-1 및 Mult1을 코딩하는 유전자의 발현 수준뿐만 아니라 세포독성 분자 퍼포린 (Prf1)을 평가하였다. 도 6a는 Qa-1의 발현 수준이 LL-[dDQ8]+IL-2 및 LL-[dDQ8]+IL-10으로 투여된 그룹에서 더 높았지만, LL-[dDQ8] 및 대조군에 대해 변경되지 않은 것으로 보임을 도시한다. 반면에, Rae-1 및 Mult1의 발현 수준은 모든 LL-[dDQ8]-처리된 마우스, 특히, LL-[dDQ8]+IL-10-처리군에서 감소하였다 (각자 도 6b 및 6c). 퍼포린은 다른 그룹과 비교하여 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 하향-조절되는 것으로 밝혀졌다 (도 6d).
ELISA
항-글리아딘 IgG2c 항체뿐만 아니라 항-탈아미드화된 글루텐 펩티드 (DGP) IgG의 존재를 ELISA에 의해 혈청에서 평가하였다. 그룹 간의 항체 수준에서 현저한 상이함은 관찰되지 않았다 (각자 도 6a 및 6b).
논의
이 연구의 목적은 일반적으로 HLA-dDQ8을 발현하는 유전자 변형된 L. 락티스 균주가 CeD의 마우스 모델에서 글루텐에 대한 경구 내성을 회복할 수 있는지 테스트하는 것이었다. dDQ8 단독으로 또는 hIL-2 또는 hIL-10과 함께 발현하는 L. 락티스의 상이한 균주를 사용하고, 빈 벡터를 함유하는 대조군 L. 락티스와 비교하였다.
프로토콜의 출발시, 마우스는 30 일 동안 글루텐 함유 식단을 받은 다음, GFD로 30 일 동안 회복하였다. 그런 다음, 마우스를 총 42 일 동안 4 개의 L. 락티스 균주 (표 7) 중 하나로 매일 1 회 치료하였으며; 처음 21 일은 GFD와 조합하고, 그 다음 21 일은 식단 및 글리아딘 위관영양법을 통해 글루텐과 조합하였다. 이 치료는 LL-[dDQ8]로 치료된 경우 50%, LL-[dDQ8]+IL-2로 치료된 경우 70%, 및 LL-[dDQ8]+IL-10로 치료된 경우 25%와 비교하여 마우스의 50%의 대조군 (LL-빈 벡터로 치료됨)에서 위축을 야기하였다 (도 2a). 이러한 데이터는 후자의 치료가 글루텐-유도된 위축의 발병을 예방하는 데 가장 성공적임을 나타낸다. 융모 길이 및 음와 깊이를 정량화하고, Vh:Cd 비율로서 표현하였다 (도 1b에서 "V/Cr"로 표지됨). 이 비율은 LL-[dDQ8]+IL-10 처리된 마우스에서 더 높은 Vh:Cd 비율로 표시된 바와 같이 단순화된 위축 점수와 일치하였다. 전반적으로, 조직학 데이터는 LL-[dDQ8]+IL-10 처리된 동물에서 융모 위축의 저하를 도시한다.
CeD는 또한 상피내 림프구의 증가를 특징으로 한다. LL-[dDQ8]+IL-10 처리된 마우스에서 관찰된 융모 위축의 저하된 발생률과 일치하게, CD3+ 상피내 림프구의 감소된 침윤이 또한 LL-[dDQ8]+IL-10 처리된 마우스에서 관찰되었다.
상피 구획 및 점막고유층 구획의 분리는 각자의 구획에 존재하는 세포 유형을 염색 및 분석할 수 있도록 한다. 활성화 및 억제 NK 수용체 NKG2D 및 NKG2A의 존재를 각자 분석할 때, NKG2D를 발현하는 CD8αβ+ 및 CD4+ 세포 (각자 도 3a 및 3b, 및 도 3c 및 3d)의 더 낮은 백분율 및 양이 LL 대조군과 비교한 3 개의 모든 LL-[dDQ8] 처리군에서 관찰되었다. 게다가, 조절 T 세포의 빈도에서의 전반적인 증가가 모든 LL-[dDQ8] 처리군에서 관찰된 반면 (도 4a 및 4c), 염증성 CD4+Tbet+ 세포 빈도는 저하하였다 (도 4b). TH1 세포에서 Treg 세포로의 이동은 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 보다 분명하였다 (도 4c).
함께, 이들 데이터는 활성화 NKG2D를 발현하는 세포독성 T 세포가 LL-[dDQ8]+IL-2 및 LL-[dDQ8]+IL-10으로 치료된 마우스에서 저하된다는 것을 도시한다. 동시에, 염증성 T 세포는 덜 풍부하고, 조절 T 세포로 대체되어, 활성화보다 내성이 생기기 쉬운 환경을 나타낸다. 흥미롭게도, LL-[dDQ8]+IL-2로 치료된 마우스는 위축에 의해 결정된 바와 같은 전반적으로 가장 불리한 조직학적 결과를 가졌다.
Qa-1은 활성화된 림프구를 표적화하는 CD94/NKG2A에 우선적으로 결합하는 HLA-E MHC 클래스 I 분자의 뮤린 상동체이다 (Yu et al., 2018, Recent advances in CD8+ regulatory T cell research. Oncol. Lett. 15: 8187-8194). 따라서, Qa-1의 mRNA 발현을 판정하였다. Qa-1 발현은 대조군과 비교하여 LL-[dDQ8]+IL-2 및 LL-[dDQ8]+IL-10 처리군에서 증가하였다 (도 4a).
Rae1 및 Mult1은 NKG2D 리간드이다 (Vivier, et al, 2002, Lymphocyte activation via NKG2D: towards a new paradigm in immune recognition? Curr. Opin. Immunol. 14: 306-311; Samarakoon et al., 208 09, Murine NKG2D ligands: "Double, double toil and trouble", Mol. Immunol. 46: 1011-1019). Rae1 및 Mult1의 발현 수준은 LL-빈 벡터 대조군과 비교하여 모든 LL-[dDQ8] 치료군에서 하향 조절되었다 (도 4b 및 4c).
퍼포린은 세포독성 분자이다 (Golstein, et al. 2018, An early history of T cell-mediated cytotoxicity, Nat. Rev. Immunol. 18: 527-535; Voskoboinik, et al., 2015, Perforin and granzymes: function, dysfunction and human pathology, Nat. Rev. Immunol. 15: 388-400). 따라서, Prf1의 발현을 또한 판정하였다. Prf1은 LL-[dDQ8]+IL-10으로 치료된 마우스에서 하향-조절된 반면, 다른 그룹은 대조군 값과 대체로 비슷하였다 (도 4d).
전체적으로, 및 세포독성 림프구의 양의 저하와 일치하여, 이들 바이오마커 발현 결과는 상피 수준에서 활성화 역치를 낮추는 LL-[dDQ8] 투여의 유익한 효과를 지적한다.
결론적으로, 이들 데이터는 LL-[dDQ8]+IL-10이 다른 그룹과 비교하여 치료된 DQ8-IL15LPxIEC 동물에서 질환 부담을 감소시킬 수 있었고, 가장 지지적인 인자는 감소된 융모 위축임을 나타낸다. Foxp3+ Treg의 백분율이 증가하면서 CD4+ 및 CD8αβ+ 집단에서 활성화 NKG2D를 갖는 저하된 세포가 관찰되었다. 전사 수준에서, NKG2D 억제 인자 Qa-1의 증가된 발현, 및 NKG2D 활성화 인자 (Rae1, Mult1)의 저하된 수준뿐만 아니라 저하된 Prf1 수준이 관찰되었으며, 이는 LL-[dDQ8]+IL-10 치료군에서 가장 분명하였다. 결과가 통계적 유의성을 달성하지는 못하였지만, 분석된 대부분의 매개변수는 LL-[dDQ8]+IL-10 치료가 유익할 수 있으며 많은 양의 글루텐 (정상 식단에서 발견되는 유사한 것)으로 장기간 챌린지된 글루텐-프리 식단 (GFD)의 CeD 환자를 모방한 치료적 계획에서 융모 위축을 예방할 가능성을 가짐을 시사한다. LL-[dDQ8] 치료가 글루텐 챌린지 후 융모 트로피(trophy)를 어느 정도 예방할 수 있었지만, 이 효과는 LL-[dDQ8]+IL-10 치료보다 덜 두드러졌다. 게다가, 테스트된 염증성 마커 중 임의의 것에도 뚜렷한 효과가 없었다.
실시예 2: 마우스에서 셀리악 질환의 치료
이 실험은 추가 생체내 중재 연구, 즉, 글루텐 치료를 사용하여 질환의 개시 후 L. 락티스 치료를 출발하는 것을 설명한다. 이 마우스 모델에 대한 이전 연구는 LL-[dDQ8]+IL10이 융모 위축을 예방하는 데 가장 효과적임을 나타냈다. 본 연구에서, LL을 42 일 동안 투여한 이전 연구와 유사한 결과를 달성하기에 21 일 치료가 충분하고 충분한지 추가로 조사하였다. 게다가, IL10만을 발현하는 LL을 포함하여, 글루텐에 대한 경구 내성 회복에서의 dDQ8의 필요성을 평가하고, 이에 따라 DQ8-IL15LPxIEC 마우스에서 CeD-유사 병리학의 반복을 예방하였다.
재료 및 방법
이 실시예에 사용된 약어는 실시예 1의 표 6에 제시되어 있다.
실험적 개요
DQ8-IL15LPxIEC 마우스를 30 일 동안 글루텐에 노출시키고, 글루텐 프리 식단 (GFD)으로 30 일 동안 회복한 다음, 매일 L. 락티스의 3 개의 균주 중 하나를 투여하고, 마우스를 21 일 동안 GFD로 유지시켰다. 그런 다음, LL 치료 없이 21 일 동안 글루텐-함유 식단으로 마우스를 재-챌린지하였다.
실시예 1에서와 같이, 각각의 실험의 종료시, 마우스를 안락사시키고, 상피내 림프구 (IEL) 활성화 마커에 대한 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석을 위한 조직학 (병리학을 위한 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색, IEL 계수를 위한 CD3 면역염색), 점막고유층 (LP) 및 상피 단리를 위해 소장을 가공하였다. 상피 스트레스 마커 및 세포독성 분자에 대한 유전자 발현 수준을 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 평가하였다.
마우스
이 실험에 사용된 DQ8-IL15LPxIEC 마우스는 실시예 1에 설명되어 있다.
DQ8-IL15LPxIEC 마우스는 실험 출발시 9 주령이었고, 수컷 및 암컷 마우스 둘 모두를 사용하였다. 마우스를 실험 출발까지 글루텐 프리 식단 (연구 식단, AIN-76A)로 유지하였으며, 이때 글루텐이 식단에 도입되어 CeD를 유도하였다. 글루텐-함유 식단 이외에, 이 식단 동안에 격일로 마우스에 대략 20 mg의 글리아딘 (Sigma, G3375)을 위관영양법으로 투여하였다.
모든 동물 절차는 시카고 대학의 지역 윤리 위원회, ACUP 71966에서 검토되었다.
락토코커스 락티스 균주 및 배양
공동-분비된 탈아미드화된 HLA-DQ8 펩티드를 포함하거나 포함하지 않고, IL-10을 분비하는 L. 락티스 균주의 효험 (표 11)을 조사하였다.
표 11
Figure pct00024
L. 락티스-pT1NX는 실시예 1에 사용된 것과 동일하며; 이는 빈 벡터 pT1NX를 함유하는 MG1363 균주이며 대조군으로서 역할을 한다.
sAGX0487 (L. 락티스 아종 크레모리스 MG1363: ΔthyA; eno>>SSusp45-hil-10; usp45>>otsB; ΔtrePP; PhllA>>trePTS; ΔptcC-)에서:
- 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)가 부재하여, 환경적 봉쇄를 보장하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)가 부재하여, 외인성으로 첨가된 트레할로스의 축적을 허용하였다.
- 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)는 usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치하여, 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하였다. otsB 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역 (IR)의 사용에 의해 usp45에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
- HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353; 유전자좌 태그 LLMG_RS02525)의 구성적 프로모터는 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 llmg_0453 및 llmg_0454; 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하여, 트레할로스 흡수를 강화하였다.
- 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 (ptcC; 유전자ID: 4796893)가 붕괴되었다 (446의 코돈 위치 30에서 tga; tga30). 이 돌연변이는 축적 후 트레할로스 잔류를 확인한다.
- 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 P2A)을 코딩하는, hil-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45)의 융합을 코딩하는 유전자는 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에 위치하여, hIL-10의 발현 및 분비를 허용하였다.
트레할로스의 존재 하에 성장하는 경우, sAGX0487은 담즙산 독성으로부터 보호를 제공하는 트레할로스를 축적 및 보유한다. 게다가, sAGX0487은 hIL-10을 구성적으로 발현 및 분비한다.
플라스미드-구동된 L. 락티스 균주 sAGX0487[pAGX2263]은 실시예 1에 사용된 것과 동일하다.
균주 배양 조건은 실시예 1에 기재된 것과 동일하다.
이 실시예에 사용된 마우스 해부 및 세포 단리, 병리학, 항체 및 유세포 분석법, RNA 단리 및 qPCR 방법은 실시예 1에 기재된 것과 동일하다.
통계적 분석
데이터를 먼저 D'Agostino 및 Pearson 옴니버스 정규성 테스트를 사용하여 정규 분포에 대해 분석하였다. 정규 분포 데이터를 단일 비교의 경우 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-테스트를 사용하고 다중 비교의 경우 일원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. ANOVA 분석에 이어 Tukey의 사후 테스트가 뒤따랐다. 사용된 통계적 테스트 및 P-값을 각각의 도면 범례에 표시하였다. <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. *P < 0.05. **P,0.01. 모든 테스트를 GraphPad Prism 버전 7.04 (GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com)에서 수행하였다.
결과
(IL-10을 단독으로 또는 dDQ8과 함께 발현하는) L. 락티스의 상이한 균주가 글루텐에 대한 경구 내성을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, DQ8-IL15LPxIEC 마우스에 글루텐-함유 식단을 섭식하고, CeD를 유도하기 위해 30 일 동안 글리아딘을 격일로 위관영양하였다 (0-30 일차). 그런 다음, 회복하기 위해 마우스에 30 일 동안 GFD로 다시 스위칭한 후, GFD로 21-일 매일 L. 락티스 투여를 출발하였다 (60-81 일차). 그런 다음, 마우스를 L. 락티스 치료 없이 21 일 동안 글루텐 함유 식단으로 재-챌린지하였다.
DQ8 수준에 기반하여 마우스를 유전자형으로 분류하고 그룹 중에 동등하게 분포시켰다. 배치 및 그룹당 마우스의 수를 표 12에 도시하였다. L. 락티스 치료 동안에, 동물에서 관찰된 치료-관련된 이환율 또는 사망률은 없었다.
표 12
Figure pct00025
병리학
인간에서 CeD의 한가지 중요한 결정은 소장 생검의 조직병리학적 판정이다 (Rubio-Tapia et al., 2013, Am. J. Gastroenterol. 108:656-676). 따라서, 융모 위축 단순 점수로 표시된 존재 (VA) 또는 부재 (VA 없음)를 판정하기 위해 H&E 염색된 절편에서 육안적 병리학을 판정하였다. 0 점은 위축이 없거나 경미한 위축이고, 2 점은 중증의 또는 부분적 융모 위축이다. 이 스코어링을 블라인드 방식으로 수행하였다.
융모 위축 데이터를 도 7a에 묘사하였다. 글루텐을 전혀 받지 않은 2 개의 그룹에서, 위축은 각자 비히클 또는 LL-[dDQ8]+IL10으로 치료된 마우스의 0% 및 33%에 존재하였다. 글루텐-개시를 받았지만 최종 글루텐-챌린지는 받지 않은 마우스 중 40%에서 위축이 발달하였다. 글루텐 개시 및 최종 글루텐 챌린지를 받은 마우스 중, 비히클-치료된 및 LL-빈 벡터 치료된 대조군에서 위축이 각자 55% 및 40%로 존재하였다. 글루텐 개시, LL-IL10을 이용한 치료 및 최종 글루텐 챌린지를 받은 마우스 중 20%에서 위축이 존재하였다. 특히, 글루텐 개시, LL-[dDQ8]+IL10을 이용한 치료 및 최종 글루텐 챌린지를 받은 마우스에서 위축이 존재하지 않았다.
융모 높이 대 음와 깊이 비율 (V/Cr)을 절편당 최대 6 개의 잘-배향된 융모의 융모 및 음와 길이를 측정함으로써 결정하였다. 데이터는 도 7b에 도시하였다. 회장 절편의 관찰로부터 수득된 결과는 융모 위축의 지표로서 컷-오프 ≤2.0이 사용된 음와 깊이에 대한 융모 높이의 형태학적 판정으로부터 수득된 결과와 일맥상통하였다. 이는 글루텐을 전혀 받지 않은 마우스에서 그룹당 다음의 위축 수준을 초래하였다: 비히클 0%, LL-[dDQ8]+IL10 33%. 글루텐을 받은 마우스에서 이는 다음과 같다: 각자 GFD 40%, 비히클 55%, LL-빈 벡터 40%, LL-IL10 20% 및 LL-[dDQ8]+IL10 0%.
CeD의 다른 특징은 상피내 림프구증가증이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 조직학적 섹션의 CD3 계수의 데이터는 그룹 간에 임의의 명확한 상이함을 보이지 않는다.
유세포 분석법
CeD에서의 조직 파괴는 상피 세포의 표면 상에 비고전적인 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 활성화 NK 수용체, 예컨대, NKG2D를 발현하는 세포독성 CD8+ IEL에 의해 매개되는 것으로 생각된다 (예컨대, H
Figure pct00026
e, et al. 2004, Immunity 21: 367-377; Meresse, et al, 2006 J. Exp. Med. 203:1343-1355 참고). 도 9a에 도시된 바와 같이, CD8+NKG2D+ 세포의 절대 수 (조직학에 의한 CD3+ 세포의 수 및 FACS의 빈도에 의해 결정됨)는 최종 글루텐 챌린지를 받은 마우스에서 그렇지 않은 마우스보다 더 높았지만, LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스에서 더 낮은 수에 대한 명확한 경향이 없었고 상이함은 통계적으로 유의하지 않았다. CD4+의 NKG2D+ 집단은 글루텐이 없는 마우스 및 글루텐을 받은 마우스 사이에서 변경되지 않았으며, 대조군 및 LL-치료된 마우스 사이에 명확한 상이함이 없었다 (도 9b). 마지막으로, CD8+ 세포에 의한 그랜자임 B의 발현은 글루텐을 전혀 받지 않은 마우스에서 낮았고, 출발 및 최종 글루텐 챌린지 둘 모두에서만 글루텐을 받은 마우스에 비해 더 높았다 (도 9c). 대조군, 및 LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스 간에 명확한 상이함이 관찰되지 않았다.
조절 T 세포 마커 Foxp3뿐만 아니라 TH1 세포 마커 Tbet의 발현을 또한 유세포 분석법에 의해 평가하였다. Foxp3+Tbet- T 세포 (도 10a) 또는 Foxp3-Tbet+ CD4+ 집단 (도 10b) 또는 Foxp3+Tbet- 오베(ove) Foxp3-Tbet+ CD4+ 세포의 비율 (도 10c)에서 명확한 경향이 검출가능하지 않았다. 그룹 간에 통계적으로 유의한 상이함이 없었다.
qPCR
RNA를 단리된 상피 세포 (퍼콜 분리 전 세포 분획)로부터 추출하고, qPCR을 수행하여, IEL에 의해 발현된 NK 수용체를 활성화하기 위한 상피 스트레스 및 리간드인 Qa-1, 및 Rae-1 및 Mult1을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 평가하였다. IEL에 의한 세포독성 분자 퍼포린의 발현을 퍼콜 분리 후 세포 분획에서 평가하였다. 데이터를 도 11에 도시하였다.
도 11a는 Qa-1의 발현 수준이 비히클 치료된 그룹과 비교하여 LL로 투여된 그룹에서, 및 또한 LL-빈 벡터에 비해 LL-IL-10 및 LL-[dDQ8]+IL10 그룹에서 약간 상승하였음을 도시한다. 검출된 유일한 유의한 상향-조절은 GFD 그룹 및 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 동물 사이에 있었다. Rae-1의 발현 수준은 모든 LL-치료된 마우스에서 저하하였지만, LL-IL10 및 LL-[dDQ8]+IL10 그룹 대 LL-빈 벡터를 비교할 때 유의한 상이함이 검출되지 않았다 (도 11b). LL-[dDQ8]+IL10 그룹의 발현은 LL-빈 벡터 치료된 마우스와 비교하여 약간 더 높았다. Mult1 발현은 최종 글루텐 챌린지가 수행되지 않은 모든 그룹 (GFD 그룹) 또는 글루텐을 전혀 받지 않은 모든 그룹과 비교하여 글루텐-치료된 마우스에서 증가하였다 (도 11c). Mult1 발현은 비히클 치료된 마우스뿐만 아니라 LL-빈 벡터와 비교할 때 LL-IL10 및 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스에서 저하하였고; 저하는 비히클 치료군과 비교할 때 유의한 LL-IL10 치료군에서 가장 두드러졌다 (도 11c). 전반적으로, 어떤 그룹도 글루텐을 전혀 받지 않았거나 최종 글루텐 챌린지를 받지 않은 마우스에서 볼 수 있는 낮은 수준의 Mult1 발현에 도달하지 못하였다. 도 11d는 Prf1 데이터의 발현을 묘사한다. Prf1의 발현은 글루텐을 전혀 받지 않은 마우스 또는 글루텐 프리 챌린지를 받지 않은 마우스 (GFD 그룹)에서 낮았다. 글루텐-치료는 모든 그룹에서 Prf1 발현을 증가시켰고, 발현 수준은 비히클 대조군 및 3 개의 LL-수용 마우스 그룹 중 임의의 것 사이에서나, 또는 LL-빈 벡터 그룹 및 LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10 그룹 중 어느 하나 사이에서도 유의하게 변경되지 않았다.
논의
이 연구의 목적은 hIL10을 단독으로 또는 HLA-dDQ8과 함께 발현하는 유전자 변형된 L. 락티스 균주가 CeD의 마우스 모델에서 글루텐에 대한 경구 내성을 회복할 수 있는지 여부를 테스트하는 것이었다. 이 제2 PD 연구에서, 초점은 LL을 이용한 21 일 치료의 효험에 있었던 반면, PD-1 (실시예 1)에서는 42-일 치료를 평가하였다. 빈 벡터를 함유하는 대조군 L. 락티스 이외에, 비히클 치료된 마우스가 포함되었다.
프로토콜의 출발시, 마우스는 30 일 동안 글루텐 함유 식단을 받은 다음, GFD로 30 일 동안 회복하였다. 그런 다음, GFD로 총 21 일 동안 마우스를 L. 락티스 균주 (표 11)로 매일 1 회 치료하였다. 그런 다음, 식단 및 글리아딘 위관영양법을 통해 마우스에 21 일 동안 글루텐을 재-챌린지하였다. 추가의 실험을 위해, 글루텐을 전혀 받지 않은 (가짜 섭식(sham fed)) 마우스 및 글루텐을 받지 않고 LL-[dDQ8]+IL10이 투여된 그룹에 대해 RNAseq 분석을 수행할 수 있다.
결과는 LL-빈 벡터 대조군 균주로 치료될 때 40%와 비교하여 55%의 비히클 치료된 대조군에서의 융모 위축의 존재를 나타낸다. LL-IL10을 이용한 치료는 마우스의 위축을 20%로 감소시켰고, 위축은 LL-[dDQ8]+IL10으로 치료된 마우스에서 존재하지 않았으며 (도 7a), 이는 후자의 치료가 글루텐-유도된 융모 위축의 발병을 예방하는 데 가장 성공적임을 나타낸다. 글루텐을 전혀 받지 않은 마우스에서, 비히클 치료된 마우스는 위축이 발달하지 않은 반면, LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스에서는 3 마리 중 1 마리에서 융모 위축이 발달하였으며; 후자의 결과는 IL-15를 과발현하는 마우스의 유전적 배경을 고려할 때 발생할 수 있다. 최종 글루텐 챌린지를 받지 않은 GFD 그룹에서, 5 마리 중 2 마리가 여전히 위축을 가졌다.
융모 길이 및 음와 깊이를 정량화하고, V:Cr 비율로서 표현하였으며, 이 비율은 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스에서 더 높은 V:Cr 비율로 표시되는 단순화된 위축 점수와 일치하였다 (도 7b). 전반적으로, 조직학 데이터는 LL-IL10 및 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 동물에서 융모 위축의 저하를 도시하며, 후자 그룹에서 가장 높은 효험을 갖는다.
CeD는 또한 상피내 림프구의 증가를 특징으로 하지만, 이 연구에서 조직학에 대한 CD3+ IEL의 명확한 상이함은 발견되지 않았다.
상피 구획 및 점막고유층 구획의 분리는 각자의 구획에 존재하는 세포 유형을 염색 및 분석할 수 있도록 한다. 활성화 및 억제 NK 수용체 NKG2D 및 NKG2A의 존재를 각자 분석할 때, LL 대조군과 비교하여 LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10 치료군에서 NKG2D를 발현하는 CD8αβ+ 및 CD4+ 세포의 수의 상이함 (도 9a 및 9b)은 발견되지 않았다. 그랜자임 B를 또한 분석하여, 글루텐을 받지 않은 마우스 및 글루텐 챌린지를 받은 마우스 사이에서만 명확한 상이함을 보였다. 치료군 (LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10)의 그랜자임 B+ CD8 세포는 비히클 및 LL-빈 벡터 대조군과 수가 상이하지 않았다 (도 9c).
점막고유층 림프구에서, 조절 T 세포의 빈도에서의 매우 작은 증가가 LL-IL10 및 LL-[dDQ8]+IL10 치료군에서 관찰된 반면 (도 10a 및 10c), 염증성 CD4+Tbet+ 세포 빈도는 다소 저하하였으며, 이는 치료에 바람직한 결과를 나타낸다 (도 10b). LL 치료 지속기간이 42 일인 실시예 1에서, NKG2D+ 세포의 다소 강한 감소 및 Foxp3+ 세포의 증가 (도 4a-4c)가 관찰되었지만, 이 실시예와 유사하게 통계적으로 유의한 결과는 검출되지 않았다.
활성화된 림프구를 표적화하는 CD94/NKG2A에 우선적으로 결합하는 HLA-E MHC 클래스 I 분자의 뮤린 상동체인 Qa-1의 mRNA 발현을 판정하였다. Qa-1 발현은 비히클 치료와 비교하여 및 또한 LL-빈 벡터 치료된 마우스에 비해 LL-IL10 및 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 그룹에서 약간 증가하였다 (유의하지 않음; 도 11a). NKG2D 리간드인 Rae1의 발현 수준은 비히클 대조군과 비교하여 모든 LL-치료군에서 하향 조절되었지만, 대조군 LL 균주 (LL-빈 벡터) 및 LL-IL10 또는 LL-[dDQ8]+IL10 사이에 발현에 상이함이 없었다 (도 11b). 다른 NKG2D 리간드인 Mult1은 또한 비히클-치료된 마우스에 비해 LL-치료군에서 저하하였다. 이러한 저하는 LL-IL10 치료군에서 및 또한 LL-빈 벡터에 비해 가장 분명하며; 이러한 저하는 LL-[dDQ8]+IL10 치료된 마우스에 또한 존재하지만 덜 두드러진다 (도 11c). 마지막으로, 퍼콜 정제 후 IEL 분획에서 세포독성 분자 퍼포린의 발현을 판정하였다. Prf1은 글루텐을 받은 적이 없거나 글루텐 챌린지를 받지 않은 마우스에서 낮다 (도 11d). 글루텐을 받은 마우스 간에는 명확하거나 통계적으로 유의한 상이함이 없었다 (도 11d). 전반적으로, 이들 바이오마커의 발현에 대한 LL-[dDQ8]+IL10의 효과는 실시예 1에서, 특히, LL-빈 벡터 대조군에 비해 관찰된 결과보다 덜 강력하였다. 실시예 1에서는 통계적으로 유의한 상이함이 검출되지 않았지만, Qa-1, 및 Rae1 및 Mult1 발현의 경향이 약간 더 명확하였다.
결론적으로, 이들 데이터는 LL-[dDQ8]+IL10이 다른 그룹과 비교하여 치료된 DQ8-IL15LPxIEC 동물에서 질환 부담을 감소시킬 수 있었고, 가장 지지적인 인자는 감소된 융모 위축임을 나타낸다. CD8+ 및 CD4+ T 세포에 대한 활성화 NKG2D의 저하는 42 일의 더 긴 치료 기간 후에 검출되지 않았지만 (실시예 1), 전사 수준에서 NKG2D 억제 인자 Qa-1의 증가된 발현 및 NKG2D 활성화 인자 (Rae1, Mult1)의 저하된 수준이 발견되었으며, 이는 LL-[dDQ8]+IL10 치료군에서 가장 분명하였다. LL-IL10 치료는 글루텐 챌린지 후 융모 트로피를 감소시켰지만, 이 효과는 LL-[dDQ8]+IL10 치료보다 덜 현저하여, dDQ8의 공동-제시에 의한 추가 내성화 또는 면역 비활성화에 대한 가능한 요구사항을 나타낸다.
결과가 통계적 유의성을 달성하지는 못하였지만, 분석된 대부분의 매개변수는 LL-[dDQ8]+IL10 치료가 유익하고 글루텐으로 챌린지된 GFD의 CeD 환자를 모방하는 치료적 계획에서 융모 위축을 예방할 가능성을 가짐을 시사하였다.
실시예 3: L. 락티스 균주에서 DQ2 및 dDQ2 에피토프에 대한 분비 리더
HLA-DQ2 에피토프에 대한 분비 리더의 적절한 조합의 식별은 HLA-제한 에피토프, DQ2 및 dDQ2를 효율적으로 발현하기 위한 임상 균주의 설계 및 개발에 중요한 인자이다. 이 실험은 적합한 적절한 분비를 갖는 분비 리더를 식별하고, 또한 미식별된 분비된 45 kDa 단백질 전구체 (Usp45; UniProt P22865)로부터의 분비 리더 (SSusp45)에 비해 개선된 분비를 갖는 분비 리더를 식별할 수 있는지 알아보기 위한 것이다.
이 실험은 HLA-DQ2 에피토프에 대한 분비 리더를 식별하기 위해 설계하였다. DQ2.5의 면역우세 부위는 α2-글리아딘 (알파-글리아딘, UniProt Q9M4L6_wheat)에 있다. 부위는 6 개의 중첩 DQ2.5 제한된 에피토프를 갖는 프로테아제-저항성 33-mer (LQLQPFPQP Q LPYPQPQLPYPQP Q LPYPQPQPF (서열번호 3); DQ2)이다. HLA-DQ2 제한된 T-세포 반응의 대부분은 탈아미드화된 33-mer (LQLQPFPQP E LPYPQPQLPYPQP E LPYPQPQPF (서열번호 7); dDQ2)에 대한 것이다. DQ2 및 dDQ2 펩티드 서열 둘 모두를 표 13에 도시된 바람직한 L. 락티스 코돈 사용빈도를 사용하여 DQ2 및 dDQ2 코딩 서열을 수득하기 위해 역번역하였다. 서열을 합성 DNA로서 생산하였다.
표 13
Figure pct00027
테스트를 위한 후보 분비 리더 서열을 세포외일 것으로 예측되는 공개 데이터베이스에서 L. 락티스 MG1363 단백질을 식별함으로써 획득하였고; 공개 데이터베이스는 다음과 같다: PSORTdb (db.psort.org/browse/genome?id=8347)(Peabody et al, 2016, PSORTdb: expanding the bacteria and archaea protein subcellular localization database to better reflect diversity in cell envelope structures, Nucleic Acids Res. 44(D1):D663-8; Yu et al., 2011, PSORTdb--an expanded, auto-updated, user-friendly protein subcellular localization database for Bacteria and Archaea, Nucleic Acids Res. 39:D241-244 (Database issue); Rey et al, 2005, PSORTdb: A Database of Subcellular Localizations for Bacteria, Nucleic Acids Res. 33:D164-168 (데이타베이스 이슈) 및 신호 펩티드 서열을 갖는 것으로 예측된 L. 락티스 MG1363에서 서열을 검색하기 위한 UniProt 데이터베이스. 36 개의 예측된 분비 리더 (SL) 서열을 식별하였다. 모 단백질의 서열 및 UniProt 번호 및 명칭은 표 14에 제공된다. A2RHV3의 돌연변이 버전 및 P22865의 2 개의 돌연변이를 또한 식별하였다. 이론에 제한되지 않고, 합성 DNA의 오류는 아마도 단리될 수 있도록 재조합 분자에 선택적인 이점을 제공하였다고 여겨진다. A2RIG7 (번호 15 및 18)을 부주의로 목록에 2 회 포함하였고 중복으로 테스트하였다. P22865의 2 개의 돌연변이를 또한 식별하였다.
표 14
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
DQ2 및 dDQ2 코딩 서열은 36 개의 선택된 L. 락티스 분비 리더의 집합체의 3' 단부의 코딩 서열에 프레임-내 연결 (즉, 작동가능하게 연결)되어, 구성 SL::DQ2 및 SL::dDQ2를 형성하였다. SL::DQ2 및 SL::dDQ2 코딩 서열을 L. 락티스 hllA 유전자 프로모터 (PhllA)의 적절한 거리의 다운스트림에 위치시켜, PhllA>> SL::DQ2 및 PhllA>> SL::dDQ2를 수득하여, DQ2 및 dDQ2의 발현 및 분비를 위한 모듈을 생성하였다. 이들 모듈을 에리트로마이신 선택가능한 L. 락티스 플라스미드에 클로닝하고, L. 락티스로 형질전환시켜, 각자 pAGX2211 및 pAGX2212로서 지정된 LL[PhllA>> SL::DQ2] 및 LL[PhllA>> SL::dDQ2]를 수득하였다. SL::DQ2를 발현하는 플라스미드를 포함하는 L. 락티스 균주이며 여기서 SL은 SSusp45이고 발현은 프로모터 P1 (P1>>SSusp45-DQ2)의 제어 하에 있는, MG1363[pAGX0043]을 양성 대조군으로서 사용하였다.
L. 락티스의 벌크 형질전환 후에 대략 6000 개의 콜로니를 수득하였고, ELISA에 의한 DQ2 또는 dDQ2 분비에 대해 각각 6 개의 96 웰 플레이트를 사용하여 대략 600 개의 클론을 테스트하였다. 가설적으로, 각각의 96-wll 플레이트는 6 개의 상이한 분비 리더 풀을 함유한다 (표 Ex. J 및 K 참고). 간단히 말해서, Nunc MaxiSorp™ F96 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; #442404)를 조질의 상청액으로 코팅하고 밤새 항온처리하였다. PNS에서 0.1% 카제인으로 차단한 후, 토끼 DQ2 항혈청 (Thermo # OR245368_2), 항-토끼 HRP (Southern Biotech #4030-05) 및 TMB 크로모겐 용액 (Thermo Fisher Scientific #002023)을 검출에 사용하였다. 1M 염산 (HCl)을 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 흡광도를 측정용 450 nm, 참조로서 595 nm에서 판독하였다. MG1363[pAGX0043]을 양성 대조군 (각각의 96 웰 플레이트 상의 A1)으로서 사용하였고, MG1363[pT1NX] (이는 플라스미드 백본을 갖는 L. 락티스 균주, 즉, 빈 벡터를 갖는 L. 락티스임)을 음성 대조군 (각각의 96-웰 플레이트 상의 A2)으로서 사용하였다. 이 검정에서 높은 분비 클론을 시퀀싱을 위해 선택하였다. 이들 실험에서, 토끼 DQ2 항혈청은 더 낮은 특이성을 갖는 것으로 나타났으며, 따라서 "고 분비물"을 분비가 배경보다 약 3x 더 높은 클론으로서 식별하였다 (웰 A2는 각각의 플레이트의 배경으로서 역할을 함). 총 228 개의 콜로니가 DQ2에 대한 고 분비물로서 식별되었고, 225 개의 콜로니가 dDQ2에 대한 고 분비물로서 식별되었다.
ELISA 테스트에서 6 개의 96-웰 플레이트 각각에 잠재적으로 존재하는 분비 리더의 요약 및 100% 정확한 서열을 갖는 클론의 수가 DQ2 클론의 경우 표 15에 제공되고, dDQ2 클론의 경우 표 16에 제공된다. 표 둘 모두에서, P22865* 및 P22865** (표 14에서 각자 SL 후보 번호 35 및 36에 상응함)는 잘 알려진 최첨단 분비 리더인 usp45의 분비 리더 (SSusp45)의 변이체를 나타낸다. 이전에 언급된 바와 같이, A2RIG7을 중복하였다 (플레이트_3 참고).
표 15: 플레이트 번호별로 분류된 DQ2 클론의 시퀀싱 데이터
Figure pct00032
표 16: 플레이트 번호별로 분류된 dDQ2 클론의 시퀀싱 데이터
Figure pct00033
표 15 및 16에서, 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 검증된 각각의 분비 리더의 클론 수를 또한 나타내었다. 이로부터, 웨스턴 블롯에 대한 추가 검증을 위해 대표적인 수의 클론을 선택하였다. 구체적으로, 16 개의 상이한 분비 리더를 나타내는 23 개의 개별 클론을 DQ2에 대해 테스트하였고, 10 개의 상이한 분비 리더를 나타내는 15 개의 개별 클론을 dDQ2에 대해 테스트하였다.
웨스턴 블롯을 통상적인 방법을 사용하여 준비하였다. 웨스턴 블롯에서, 배양 상청액 1 ml의 등가물을 사용하였다. 면역블롯은 DQ2 및 dDQ2 둘 모두와 반응하는 DQ2 항체 OR245368_2 (Thermo)로 밝혀졌다. DQ2 후보 분비 리더에 대한 결과를 도 12에 도시하고, dDQ2 후보 분비 리더에 대한 결과를 도 13에 도시하였다.
웨스턴 블롯 결과에 기반하여, 선택된 분비 리더를 DQ2 및 dDQ2에 대해 선정하였다. DQ2 및 dDQ2에 대해 선택된 분비 리더의 웨스턴 블롯을 각자 도 14 및 도 15에 도시하였다. DQ2 및 dDQ2 둘 모두에 대해, 분비 리더 #21 (A2RJJ4)을 임상 등급 균주의 작제에 사용하기 위한 주요 분비 리더로서 식별하였다.
실시예 4: dDQ2 에피토프 및 hIL10을 분비하는 임상 등급 L. 락티스 의 작제물
밀 글리아딘 및 인간 IL-10으로부터 탈아미드화된 DQ2 에피토프 (dDQ2) 둘 모두를 분비하는 락토코커스 락티스 균주 (sAGX0868)를 이전에 기재된 방법을 사용하여 dDQ2 및 인간 IL-10에 대한 발현 카세트의 도입에 의해 MG1363 모 균주에서 생성하였다. 예컨대, Steidler L. et al., Nat. Biotechnol. 2003; 21:785-789; and Steidler L, Rottiers P; Annals of the New York Academy of Sciences 2006; 1072:176-186 참고. L. 락티스 염색체에 변화를 도입하는 방법은 이중 상동 재조합을 사용한다. pORI19로부터 유래되고 에리트로마이신 선택 마커를 함유하는 조건부 복제 담체 플라스미드를 repA+ L. 락티스 균주 LL108에서 작제하였다. 담체 플라스미드를 관심 카고가 박테리아 염색체의 야생형 서열에 플랭킹된 구역과 동일한 최대 1 kb의 교차 (XO) 구역 사이에 클로닝되도록 설계하였다. 이 플라스미드를 MG1363 또는 이의 유도체 중 임의의 것 (repA-)에 도입하였다. 에리트로마이신을 함유한 한천 플레이트에서 저항성 콜로니를 선택하고, 5' 또는 3' 표적 부위에서 제1 상동 재조합을 PCR 스크리닝으로 검증하였다. 에리트로마이신 선택의 방출은 5' 또는 3' 표적 부위에서 제2 상동 재조합에 의해 박테리아 염색체로부터 담체 플라스미드의 절제를 가능하게 하였다. 임상-등급 균주의 최종 유전자 구조를 Sanger 및 Illumina 전체 게놈 시퀀싱 둘 모두에 의해 광범위하게 문서화하였다. 최종 임상 균주에는 플라스미드 또는 잔류 에리트로마이신 저항성이 없다. 예컨대, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789 참고.
sAGX0868은 락토코커스 락티스 (L. 락티스) MG1363의 유도체이다. sAGX0868에서:
● 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)가 부재하여, 환경적 봉쇄를 보장하였다 (Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789).
● 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)가 부재하여, 외인성으로 첨가된 트레할로스의 축적을 허용하였다.
● 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)는 usp45 (유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 위치하여, 트레할로스-6-포스페이트의 트레할로스로의 전환을 용이하게 하였다. otsB 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역 (IR)의 사용에 의해 usp45에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
● HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터는 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305, 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하여, 트레할로스 흡수를 강화하였다.
● 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 ptcC (유전자 ID: 4796893)가 결실되었다 (ΔptcC). 이 돌연변이는 축적 후 트레할로스 잔류를 확인한다.
● 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에, 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 P2A [1])을 코딩하는, hil-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45) 융합을 코딩하는 단편의 삽입. hIL-10의 발현 및 분비를 허용하기 위해, hil-10 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
● hil-10 유전자의 다운스트림에, 6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프 (UniProt: Q9M4L6_wheat, 아미노산 57-89, 위치 66 및 80에서 글루타민 탈아미드화)를 기반으로 하는 프로테아제-저항성 33-mer인 탈아미드화된 DQ2 (ddq2)를 코딩하는 단편과 ps356 엔도리신 유전자 (ps356; 유전자 ID: 4798697) 분비 리더 (SSps356)의 융합을 코딩하는 단편의 삽입. dDQ2의 발현 및 분비를 허용하기 위해, ddq2 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034)를 선행하는 IR의 사용에 의해 hil-10에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다.
sAGX0868의 모든 유전적 특질은 박테리아 염색체에 상주한다. sAGX0868의 유전적 배경은 다음을 보장한다:
● hIL-10의 구성적 분비.
● dDQ2의 구성적 분비.
● 성장 및 생존을 위해 외인성으로 첨가된 티미딘에 대한 엄격한 의존성.
● 트레할로스를 축적하고 보유하는 능력으로 담즙산 독성에 저항하는 능력을 획득함.
도 16은 기재된 바와 같은 sAGX0868의 관련 유전적 유전자좌의 개략적인 개요를 도시한다: eno>>hil-10>>ddq2, ΔthyA, otsB, trePTS, ΔtrePP, ΔptcC, (/절삭된/) 유전적 특성, 유전자간 영역 (IR), PCR 증폭 산물 크기 (bp).
trePTS, Δ trePP
트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP; 유전자 ID: 4797140)의 결실. 트레할로스 오페론 (trePTS; 각자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305; ptsI 및 ptsII; 유전자 ID: 4797778 및 유전자 ID: 4797093)에서 추정 포스포트랜스퍼라제 유전자에 선행하는 HU-유사 DNA-결합 단백질 유전자 (PhllA; 유전자 ID: 4797353)의 구성적 프로모터의 삽입. ptsI 및 ptsII 사이에 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역의 삽입. (도 17).
otsB
미식별된 분비된 45-kDa 단백질 유전자 (usp45; 유전자 ID: 4797218)의 다운스트림에 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제 유전자 (otsB; 유전자 ID: 1036914)의 삽입. usp45 및 otsB 사이에 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L30 유전자 (rpmD; 유전자 ID: 4797873)에 선행하는 유전자간 영역의 삽입. (도 18).
ΔptcC
셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소를 코딩하는 유전자 (ptcC; 유전자 ID: 4796893)의 결실. (도 19).
ΔthyA
티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA; 유전자 ID: 4798358)의 결실. (도 20).
eno>>hil-10>>ddq2
hIL-10의 발현 및 분비를 가능하게 하는, 포스포피루베이트 하이드라타제 유전자 (eno; 유전자 ID: 4797432)의 다운스트림에 인간 인터류킨-10 (hIL-10; UniProt: P22301, aa 19-178, 변이체 P2A; Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789)을 코딩하는, hIL-10 유전자와 usp45 분비 리더 (SSusp45)의 융합을 코딩하는 유전자의 삽입. hil-10 발현 유닛은 IRrpmD의 사용에 의해 eno에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다. (도 21a-21c).
6 개의 중첩 α1- 및 α2-글리아딘 에피토프 (UniProt: Q9M4L6_wheat, 아미노산 57-89, 위치 66 및 80에서 글루타민 탈아미드화)를 기반으로 하는 프로테아제-저항성 33-mer인 탈아미드화된 DQ2 (ddq2)를 코딩하는 단편과 ps356 분비 리더 (SSps356)의 융합을 코딩하는 유전자가 hil-10 유전자의 다운스트림에 위치하여, dDQ2의 발현 및 분비를 허용하였다. ddq2 발현 유닛은 고도로 발현된 L. 락티스 MG1363 50S 리보솜 단백질 L14 유전자 (rplN; 유전자 ID: 4799034)에 선행하는 IR의 사용에 의해 hil-10에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다. (도 21c 및 21d).
실시예 5: dDQ2 에피토프 및 hIL10을 분비하는 L. 락티스 에 대해 고려되는 실시양태
다양한 추가 실시양태가 대안적인 균주 작제를 위한 CeD-특이적 항원 및 IL-10 발현 유닛에 대해 고려된다. 발현 유닛은 바람직하게는 고도로 발현되는 내인성 유전자의 다운스트림에 있는 발현 유닛(들)의 통합을 포함한다. 고도로 발현된 내인성 유전자를 예를 들어, 프로테오믹 및/또는 RNAseq 분석 및 리포터 유전자 작제물, 예컨대, P유전자X>>유전자X>>GUS의 사용에 의한 후속 검정에 의해 식별할 수 있다. 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이 ">>"는 프로모터의 유전자: P유전자X>>유전자X에 대한 직접 융합 또는 유전자간 영역: 유전자X>>유전자Y를 통한 2 개의 유전자의 커플링과 같은 적합한 발현 링크를 나타낸다.
묘사된 카세트는 임의로 본원에 기재된 구성요소를 추가로 포함한다. 예를 들어, 카세트는 예컨대, CeD-특이적 항원을 내인성 유전자에 전사적으로 커플링하는 하나 이상의 유전자간 영역을 추가로 포함할 수 있다. 카세트는 각각의 CeD-특이적 항원 및 IL-10에 대한 5'에 분비 리더를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 분비 리더는 폴리펩티드, 즉, CeD-특이적 항원에 전사적으로 및 번역적으로 커플링되었다. 따라서, 묘사된 카세트에서, "IL-10"은 IL-10에 융합된 분비 리더를 포함하는 융합 폴리펩티드의 코딩 서열을 나타낼 수 있고, "ddq2"는 ddq2에 융합된 분비 리더를 포함하는 융합 폴리펩티드를 나타낼 수 있다.
이들 실시예에 사용된 CeD-특이적 항원은 ddq2이지만, 실시양태는 ddq2로 제한되지 않는다.
고도로 발현된 내인성 유전자의 다운스트림의 (즉, 이에 대한 3'에서의) 박테리아 염색체로 통합된 조합된 발현 유닛에 대한 예시적인 실시양태를 표 17에 도시하였다.
다음의 유전자는 하기를 참조한다:
Figure pct00034
표 17: 내인성 유전자를 포함하는 조합된- 폴리시스트론 발현 카세트
Figure pct00035
고도로 발현된 내인성 유전자의 다운스트림의 (즉, 이에 대한 3'에서의) 박테리아 염색체로 각각 통합된 2 개의 별개의 발현 유닛에 대한 예시적인 실시양태를 표 18에 도시하였다.
표 18: 내인성 유전자를 포함하는 분리된 발현 카세트
Figure pct00036
연관된 내인성 유전자가 없는 내인성 프로모터를 포함하는 실시양태가 또한 고려된다. 이러한 실시양태는 다중-카피 플라스미드에서 프로모터로부터 강력한 발현으로 인해 발생하는 불안정성으로 인해 작제하기 어려울 수 있다. 이러한 문제는 균주 작제에 사용되는 중간 구성요소의 생성 및 전파에 영향을 줄 수 있다.
고도로 발현된 내인성 프로모터의 다운스트림의 (즉, 이에 대한 3'에서의) 박테리아 염색체로 통합된 조합된 발현 유닛에 대한 예시적인 실시양태를 표 19에 도시하였다.
표 19: 내인성 프로모터를 포함하는 조합된- 폴리시스트론 발현 카세트
Figure pct00037
고도로 발현된 내인성 프로모터의 다운스트림의 (즉, 3'에서의) 박테리아 염색체로 각각 통합된 2 개의 별개의 발현 유닛에 대한 예시적인 실시양태를 표 20에 도시하였다.
표 20: 분리된 발현 카세트
Figure pct00038
Figure pct00039
내인성 프로모터 및 내인성 유전자 둘 모두를 포함하는 발현 유닛, 예컨대, 표 18에서의 것들과 내인성 프로모터만을 포함하는 발현 유닛, 예컨대, 표 20에서의 것들의 조합이 추가로 고려된다.
비-제한적인 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00040
염색체 상의 하나의 발현 유닛 (즉, IL-10) 및 에피솜 상의 다른 발현 유닛 (즉, ddq2)을 포함하는 위에 기재된 바와 같은 발현 유닛뿐만 아니라 에피솜 상의 둘 모두의 발현 유닛을 포함하는 실시양태가 추가로 고려되며, 여기서 에피솜은 영양요구성을 통한 식품 등급, 비-항생제 선택에 의해 안정화된다.
본 개시내용에 지칭된 유전자 중 일부의 요약을 표 21에 제공하였다.
표 21.
Figure pct00041
Figure pct00042
예시적인 실시양태
실시양태 1. 락트산 박테리움 (LAB)으로서,
(i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산, 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
실시양태 2. 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 상기 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 상기 글리아딘 폴리펩티드 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하는, LAB.
실시양태 4. 실시양태 1 또는 3에 있어서, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는, LAB.
실시양태 5. 실시양태 1, 3 또는 4에 있어서, 상기 LAB가 상기 hIL-10 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 구성적으로 발현 및 분비하는, LAB.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드가 다음을 포함하는, LAB:
(a) HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되고; 또는
(b) 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는, LAB: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 33).
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드, 및 SL#17, SL#21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는, LAB.
실시양태 10. 실시양태 1, 3, 4 또는 5에 있어서,
다음의 염색체로 통합된 폴리시스트론 발현 카세트를 포함하고:
a. eno 유전자의 5'에 위치한 eno 프로모터, 제1 유전자간 영역, hIL-10 분비 리더 서열, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산; 제2 유전자간 영역, 글리아딘 폴리펩티드 분비 리더 서열, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론 발현 카세트;
b. usp45 프로모터, usp45, 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산, 및 임의로 상기 usp45 및 상기 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 상기 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역, 예컨대, rpmD를 포함하는 제2 폴리시스트론 발현 카세트; 및
c. hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한 하나 이상의 트레할로스 수송체를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 폴리시스트론 발현 카세트;
및 다음을 포함하도록 유전자 변형된, LAB:
d. 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP)의 비활성화 또는 결실;
e. 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (ptcC)를 코딩하는 유전자의 비활성화 또는 결실; 및
f. 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA)의 결실.
실시양태 11. 실시양태 10에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드가 다음을 포함하는, LAB:
(a) HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되고; 또는
(b) 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다.
실시양태 12. 실시양태 1에 있어서, sAGX0868인, LAB.
실시양태 13. 조성물로서,
(a) 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 락트산 박테리움 (LAB); 또는
(b) 인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 외인성 핵산을 함유하는 제1 LAB; 및
하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB를 포함하되,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 조성물.
실시양태 14. 셀리악 질환의 치료에서 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 LAB 또는 실시양태 13의 조성물의 용도.
실시양태 15. 셀리악 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 LAB 또는 실시양태 13의 조성물의 용도.
실시양태 16. 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열:
(a) 다음을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛:
(i) hIL-10을 코딩하는 핵산, 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 핵산은 상기 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하며; 또는
(b) 다음을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터
(i) 제1 유전자간 영역,
(ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임,
(iii) 제2 유전자간 영역, 및
(iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임,
여기서 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다.
실시양태 17. 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법으로서, (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 락트산 박테리움 (LAB)의 치료적 유효량을 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 IL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되어, 경구 내성을 유도하는 것인, 방법.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서, 상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
실시양태 19. 실시양태 17 또는 18에 있어서, 상기 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체가 위험 인자를 나타내고, 위험 인자가 유전적 소인인 것인, 방법.
실시양태 20. 실시양태 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 내성-유도 림프구를 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 21. 실시양태 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포를 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 22. 실시양태 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 23. 실시양태 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 글루텐에 대한 노출시 융모 위축의 발달이 상기 대상체에서 예방, 억제 또는 최소화되는 것인, 방법.
실시양태 24. 셀리악 질환으로 진단된 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법으로서, (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 LAB의 치료적 유효량을 융모 위축을 갖는 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 LAB는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 55% 이상의 감소를 발생시키는 것인, 방법.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
실시양태 26. 실시양태 24 또는 25에 있어서, 융모 위축이 장내 글루텐 노출로 인해 존재하는 것인, 방법.
실시양태 27. 실시양태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 LAB가 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 감소를 발생시키는 것인, 방법.
실시양태 28. 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가
a. 상기 대상체에 투여하기 전의 상피내 림프구증가증과 비교하여 상기 대상체의 상피내 림프구증가증을 감소시키고/시키거나 투여 단계 전에 상기 대상체로부터 수득된 샘플에 존재하는 CD3+ IEL과 비교하여 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수준을 감소시키거나;
b. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 세포독성 CD8+ IEL과 비교하여 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ IEL의 수를 감소시키거나;
c. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포의 수준을 감소시키고/시키거나 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 점막고유층 림프구의 샘플에서 Foxp3+Tbet-CD4+ T 세포의 수준을 증가시키거나;
d. 글루텐에 대한 노출시 상기 대상체에서 융모 위축 반복을 예방, 억제 또는 최소화하거나;
e. 상기 대상체에서 융모 높이 (Vh)-대-음와 깊이(crypt depth) (Cd) 비율을 개선하고/하거나 상기 대상체에서 Vh/Cd 비율을 정상 범위로 회복하는 것인, 방법.
실시양태 29. 실시양태 17 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 LAB가 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 상기 LAB인 것인, 방법.
실시양태 30. 실시양태 17 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 LAB가 하루당 약 104 개의 콜로니 형성 유닛 (cfu) 내지 약 1012 개의 cfu, 하루당 약 106 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu, 또는 하루당 약 109 개의 cfu 내지 약 1012 개의 cfu를 포함하는 유닛 투여량 형태로 투여되는 것인, 방법.
실시양태 31. 실시양태 17 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 LAB가 sAGX0868인 것인, 방법.
추가의 예시적인 실시양태
실시양태 101. 락트산 박테리움 (LAB)으로서,
(i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산, 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
실시양태 102. 실시양태 101에 있어서, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산이 상기 hIL-10 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하는, LAB.
실시양태 103. 실시양태 102에 있어서, 상기 hIL-10이 상기 분비 리더 없이 성숙한 hIL-10으로서 분비되는, LAB.
실시양태 104. 실시양태 103에 있어서, 상기 hIL-10이 성숙한 서열의 위치 2에서 프롤린 (Pro) 대신 알라닌 (Ala)을 포함하는, LAB.
실시양태 105. 실시양태 101에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 상기 글리아딘 폴리펩티드 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하는, LAB.
실시양태 106. 실시양태 105에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 107. 실시양태 105에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 108. 실시양태 105에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드가 HLA-DQ2 특이적 에피토프를 포함하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 109. 실시양태 105에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드가 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프를 포함하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 110. 실시양태 102에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드가 α1- 및/또는 α2-글리아딘 에피토프를 포함하는, LAB.
실시양태 111. 실시양태 102에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는, LAB: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 33).
실시양태 112. 실시양태 102에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하고, SL#17, SL#21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 추가로 코딩하는, LAB.
실시양태 113. 실시양태 101에 있어서, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는, LAB.
실시양태 114. 실시양태 113에 있어서, 상기 폴리시스트론 발현 유닛이
(i) 내인성 유전자의 내인성 유전자 프로모터,
(ii) 내인성 유전자 프로모터의 3'에 위치한 내인성 유전자,
(iii) 유전자간 영역 및
(iv) 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산이 상기 hIL-10 코딩 서열에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 내인성 유전자 및 상기 hIL-10을 코딩하는 상기 외인성 핵산이 상기 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링되는, LAB.
실시양태 115. 실시양태 114에 있어서, 상기 폴리시스트론 발현 유닛이
(i) 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산의 3'에 위치한 제2 유전자간 영역, 및
(ii) 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
여기서 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산이 상기 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산 및 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산이 제2 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링되는, LAB.
실시양태 116. 실시양태 113에 있어서, 상기 폴리시스트론 발현 유닛이
(i) 내인성 유전자의 내인성 유전자 프로모터,
(ii) 내인성 유전자 프로모터의 3'에 위치한 내인성 유전자,
(iii) 유전자간 영역 및
(iv) 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
여기서 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산이 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 내인성 유전자 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산이 상기 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링되는, LAB.
실시양태 117. 실시양태 116에 있어서, 상기 폴리시스트론 발현 유닛이
(i) 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산의 3'에 위치한 제2 유전자간 영역, 및
(ii) 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산을 추가로 포함하며,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산이 상기 hIL-10 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산이 제2 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링되는, LAB.
실시양태 118. 실시양태 101에 있어서, 상기 LAB가 상기 hIL-10 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 구성적으로 발현 및 분비하는, LAB.
실시양태 119. 실시양태 101에 있어서,
다음의 염색체로 통합된 폴리시스트론 발현 카세트를 포함하고:
f. eno 유전자의 5'에 위치한 eno 프로모터, 제1 유전자간 영역, hIL-10 분비 리더 서열, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산; 제2 유전자간 영역, 글리아딘 폴리펩티드 분비 리더 서열, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론 발현 카세트;
g. usp45 프로모터, usp45, 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산, 및 임의로 상기 usp45 및 상기 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 상기 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역, 예컨대, rpmD를 포함하는 제2 폴리시스트론 발현 카세트; 및
h. hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한 하나 이상의 트레할로스 수송체를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 폴리시스트론 발현 카세트;
다음을 포함하도록 유전자 변형된, LAB:
i. 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP)의 비활성화 또는 결실;
j. 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (ptcC)를 코딩하는 유전자의 비활성화 또는 결실; 및
k. 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA)의 결실.
실시양태 120. 실시양태 119에 있어서, 상기 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제가 대장균 otsB인, LAB.
실시양태 121. 실시양태 119 또는 120에 있어서, 제3 폴리시스트론 발현 카세트가 트레할로스 수송체 유전자 LLMG_RS02300 및 LLMG_RS02305를 포함하는, LAB.
실시양태 122. 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 상기 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
실시양태 123. 실시양태 122에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
실시양태 124. 실시양태 122 또는 123에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는, LAB: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 33).
실시양태 125. 실시양태 122에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드, 및 SL#17, SL#21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는, LAB.
실시양태 126. 실시양태 101 내지 125 중 어느 하나의 LAB를 포함하는 조성물.
실시양태 127. 조성물로서,
인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 외인성 핵산을 함유하는 제1 LAB; 및
하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB를 포함하는, 조성물.
실시양태 128. 다음을 포함하는 조성물:
(a) 다음을 포함하는 락트산 박테리움 (LAB):
(i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산, 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합됨; 또는
(b) 인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 외인성 핵산을 함유하는 제1 LAB; 및
하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합됨; 또는
(c) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 락트산 박테리움 (LAB)이되, 여기서 상기 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합된다.
실시양태 129. 셀리악 질환의 치료에서 실시양태 1 내지 121 중 어느 하나의 LAB 또는 실시양태 C 또는 실시양태 CC의 조성물의 용도.
실시양태 130. 셀리악 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 실시양태 1 내지 121 중 어느 하나의 LAB 또는 실시양태 C 또는 실시양태 CC의 조성물의 용도.
실시양태 131. 다음을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열:
(i) hIL-10을 코딩하는 핵산 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 핵산은 상기 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩함.
실시양태 132. 실시양태 131에 있어서, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 및 상기 hIL-10을 코딩하는 핵산이 유전자간 영역에 의해 전사적으로 및 번역적으로 커플링되는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 133. 실시양태 132에 있어서, hIL-10을 코딩하는 상기 외인성 핵산에 대해 5'에 위치하는 L. 락티스 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산이 상기 L. 락티스 프로모터에 의해 전사적으로 제어되는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 134. 실시양태 133에 있어서, 상기 L. lactis 프로모터가 eno 프로모터, P1 프로모터, usp45 프로모터, gapB 프로모터, thyA 프로모터 및 hllA 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 135. 다음을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열:
(i) 제1 유전자간 영역,
(ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임,
(iii) 제2 유전자간 영역, 및
(iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임,
여기서 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다.
실시양태 136. 실시양태 135에 있어서, 제1 오픈 리딩 프레임 및 제2 오픈 리딩 프레임 중 하나가 hIL-10을 코딩하고, 제1 오픈 리딩 프레임 및 제2 오픈 리딩 프레임 중 다른 하나가 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 137: 실시양태 136에 있어서, 제1 오픈 리딩 프레임이 제1 치료적 단백질에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 제2 오픈 리딩 프레임이 제2 치료적 단백질에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 138: 실시양태 135 내지 137 중 임의의 것에 있어서, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역에 전사적으로 커플링된 하나 이상의 유전자간 영역의 5' 및 3' 단부에 플랭킹된 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서 5' 플랭킹 핵산이 통합 표적 유전자의 3' 단부에서 코딩 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열.
실시양태 139: 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열:
(a) 다음을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛:
(i) hIL-10을 코딩하는 핵산 및
(ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,
여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 핵산은 상기 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고; 또는
(b) 다음을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터:
(i) 제1 유전자간 영역,
(ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임,
(iii) 제2 유전자간 영역, 및
(iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임,
여기서 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다.
실시양태 140. 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법으로서, (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 락트산 박테리움 (LAB)의 치료적 유효량을 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 IL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되어, 경구 내성을 유도하는 것인, 방법.
실시양태 141. 실시양태 140에 있어서, 상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
실시양태 142. 실시양태 140에 있어서, 상기 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체가 위험 인자를 나타내고, 여기서 위험 인자가 유전적 소인인 것인, 방법.
실시양태 143. 실시양태 140에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 내성-유도 림프구를 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 144. 실시양태 140에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포를 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 145. 실시양태 140에 있어서, 상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 증가시키는 것인, 방법.
실시양태 146. 실시양태 140에 있어서, 글루텐에 대한 노출시 융모 위축의 발달이 상기 대상체에서 예방, 억제 또는 최소화되는 것인, 방법.
실시양태 147. 실시양태 140 내지 146 중 어느 하나에 있어서, LAB가 실시양태 101 내지 121 중 어느 하나의 상기 LAB인 것인, 방법.
실시양태 148. 셀리악 질환으로 진단된 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법으로서, (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 LAB의 치료적 유효량을 융모 위축을 갖는 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 LAB는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 55% 이상의 감소를 생산하는 것인, 방법.
실시양태 149. 실시양태 148에 있어서, 상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
실시양태 150. 실시양태 148에 있어서, 상기 융모 위축이 장내 글루텐 노출로 인해 존재하는 것인, 방법.
실시양태 151. 실시양태 148에 있어서, 상기 LAB가 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않은 참조 LAB에 비해 융모 위축의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 감소를 생산하는 것인, 방법.
실시양태 152. 실시양태 148 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 LAB가 실시양태 101 내지 121 중 어느 하나의 상기 LAB인 것인, 방법.
실시양태 153. 실시양태 148 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여가
a. 상기 대상체에 투여하기 전의 상피내 림프구증가증과 비교하여 상기 대상체의 상피내 림프구증가증을 감소시키고/시키거나 투여 단계 전에 상기 대상체로부터 수득된 샘플에 존재하는 CD3+ IEL과 비교하여 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수준을 감소시키거나;
b. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 세포독성 CD8+ IEL과 비교하여 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ IEL의 수를 감소시키거나;
c. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포의 수준을 감소시키고/시키거나 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 점막고유층 림프구의 샘플에서 Foxp3+Tbet-CD4+ T 세포의 수준을 증가시키거나;
d. 글루텐에 대한 노출시 상기 대상체에서 융모 위축 반복을 예방, 억제 또는 최소화하거나;
e. 상기 대상체에서 융모 높이 (Vh)-대-음와 깊이 (Cd) 비율을 개선하고/하거나 상기 대상체에서 Vh/Cd 비율을 정상 범위로 회복하는 것인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> INTREXON ACTOBIOTICS NV <120> TREATMENT OF CELIAC DISEASE <130> 205350-0036-00-WO-605355 <140> <141> <150> 63/003,624 <151> 2020-04-01 <150> 62/907,350 <151> 2019-09-27 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 1 Met Val Arg Val Pro Val Pro Gln Leu Gln Pro Gln Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Gln Gln Pro Gln Glu Gln Val Pro Leu Val Gln Gln Gln Gln Phe Pro 20 25 30 Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro Gln 35 40 45 Pro Phe Pro Ser Gln Gln Pro Tyr Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln 50 55 60 Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln 65 70 75 80 Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe Arg Pro Gln Gln Pro Tyr Pro 85 90 95 Gln Ser Gln Pro Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Gln Pro Ile Ser Gln Gln 100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Gln Gln Gln Gln Gln 115 120 125 Gln Gln Gln Ile Leu Gln Gln Ile Leu Gln Gln Gln Leu Ile Pro Cys 130 135 140 Arg Asp Val Val Leu Gln Gln His Ser Ile 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63 <210> 115 <211> 102 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 115 atgaaactga acagcctgaa caaaaaattt gcgctggcga gcgtgagcct gctgaccatt 60 agcaccctgg cgggctttgg cggcctggtg aacgtgaacg cg 102 <210> 116 <211> 90 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 116 atgaacaaac tgaaagtgac cctgctggcg agcagcgtgg tgctggcggc gaccctgctg 60 agcgcgtgcg gcagcaacca gagcagcagc 90 <210> 117 <211> 90 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 117 atgaaattta aaaaactggg cctggtgatg gcgaccgtgt ttgcgggcgc ggcgctggtg 60 accctgagcg gctgcagcag cagcgatagc 90 <210> 118 <211> 81 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 118 atgaaaaaaa agattattag tgctatcttg atgagcacag ttatcttgag tgcggccgct 60 ccactatcag gggtatatgc t 81 <210> 119 <211> 84 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 119 atgaaaaaaa aaattattag cgcgattctg atgagcaccg tgattctgag cgcggcggcg 60 ccgctgagcg gcgtgtatgc gggc 84 <210> 120 <211> 81 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 120 atgaaaaaaa acattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60 ccgttgtcag 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1560 gaaattatcg caaatgtagg tggcgctgag aatgtcacaa aagttattca ctgtatcact 1620 cgtcttcgtt ttaccttgaa agacaaagat aaagcagata cggcggcgat tgaagcctta 1680 cctggtgtcg ctggagctgt ttataactca aacttgaatc aatatcaagt agttattgga 1740 caagctgtag aagatgttta tgacgaggtt gttgaacagc ttggagattc agttgttgat 1800 gaagatgcaa cggcgcaagc acttgctgca acagcaccgg ctagtggtaa aaaacaaaat 1860 ccaattgttc atgctttcca agtggttatt gggacaatta caggttcgat gattccaatt 1920 attggtttac ttgcggctgg tgggatgatt aatggattat taagtatctt tgttaaagga 1980 aatcgtttaa ttgaagtgat tgaccctgca agttcaactt acgtcattat ctcaactcta 2040 gcaatgacac cattttattt cttacctgtt ttagtaggat tttcagcagc aaaacaatta 2100 gcacctaaag atactgtttt acaatttatt ggtgctgctg ttggtggttt catgattaat 2160 ccagggatta ctaacttggt aaatgctcat gttggaacaa atgcggccgg taaaaatgtt 2220 gttgttgaag cagcagctcc agtagcaaat ttccttggag tcacttttaa tacaagttat 2280 tttggaattc cggttgcttt gccaagttat gcttatacaa ttttcccaat cattgtggcg 2340 gtagcaatcg ctaaaccttt gaatgcttgg ttgaaaaagg ttttaccact tgccttgcgt 2400 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aaggtaaaaa gatgtttaaa gcagtattgt ttgatttaga tggcgtaat 3289

Claims (31)

  1. 락트산 박테리움 (LAB)으로서,
    (i) 인간 인터류킨-10 (hIL-10)을 코딩하는 외인성 핵산, 및
    (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며,
    여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
  2. 락트산 박테리움 (LAB)으로서, 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드에, 프레임 내 융합된 분비 리더 서열을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 상기 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 락트산 박테리움 (LAB).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 상기 글리아딘 폴리펩티드 코딩 서열에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하는, LAB.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛을 포함하는, LAB.
  5. 제1항, 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 LAB가 상기 hIL-10 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 구성적으로 발현 및 분비하는, LAB.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25, SL#32, SL#35 및 SL#36, 및 1, 2 또는 3 개의 변이체 아미노산 위치를 갖는 이들의 변이체로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되는, LAB.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드가 다음을 포함하는, LAB:
    (a) HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되고; 또는
    (b) 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 다음을 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는, LAB: LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (서열번호 3) (DQ2), LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2) 또는 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 33).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산이 LQLQPFPQPELPYPQPQLPYPQPELPYPQPQPF (서열번호 7) (dDQ2)를 포함하거나 이로 이루어진 글리아딘 폴리펩티드, 및 SL#17, SL#21, SL#22 및 SL#23으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된 분비 리더를 코딩하는, LAB.
  10. 제1항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서,
    다음의 염색체로 통합된 폴리시스트론 발현 카세트를 포함하고:
    a. eno 유전자의 5'에 위치한 eno 프로모터, 제1 유전자간 영역, hIL-10 분비 리더 서열, 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산; 제2 유전자간 영역, 글리아딘 폴리펩티드 분비 리더 서열, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론 발현 카세트;
    b. usp45 프로모터, usp45, 및 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 외인성 핵산, 및 임의로 상기 usp45 및 상기 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 상기 외인성 핵산 사이의 유전자간 영역, 예컨대, rpmD를 포함하는 제2 폴리시스트론 발현 카세트; 및
    c. hllA 프로모터 (PhllA)의 3'에 위치한 하나 이상의 트레할로스 수송체를 코딩하는 핵산을 포함하는 제3 폴리시스트론 발현 카세트;
    및 다음을 포함하도록 유전자 변형된, LAB:
    d. 트레할로스-6-포스페이트 포스포릴라제 유전자 (trePP)의 비활성화 또는 결실;
    e. 셀로비오스-특이적 PTS 시스템 IIC 구성요소 (ptcC)를 코딩하는 유전자의 비활성화 또는 결실; 및
    f. 티미딜레이트 합성효소 유전자 (thyA)의 결실.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 글리아딘 폴리펩티드가 다음을 포함하는, LAB:
    (a) HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#24, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택되고; 또는
    (b) 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 및 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 상기 분비 리더가 SL#1, SL#6, SL#8, SL#9, SL#13, SL#15, SL#17, SL#20, SL#21, SL#22, SL#23, SL#25 및 SL#36으로 이루어진 분비 리더 군으로부터 선택된다.
  12. 제1항에 있어서, sAGX0868인, LAB.
  13. 조성물로서,
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 락트산 박테리움 (LAB); 또는
    (b) 인터류킨-10 (IL-10) 폴리펩티드를 코딩하고 IL-10 폴리펩티드를 발현하는 외인성 핵산을 함유하는 제1 LAB; 및
    하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 제2 LAB를 포함하되,
    여기서 상기 hIL-10을 코딩하는 외인성 핵산 및 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되는, 조성물.
  14. 셀리악 질환의 치료에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 LAB 또는 제13항의 조성물의 용도.
  15. 셀리악 질환의 치료용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 LAB 또는 제13항의 조성물의 용도.
  16. 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열:
    (a) 다음을 포함하는 폴리시스트론 발현 유닛:
    (i) hIL-10을 코딩하는 핵산, 및
    (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (i) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며,
    여기서 hIL-10을 코딩하는 상기 핵산은 상기 hIL-10에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하고, 상기 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 상기 글리아딘 폴리펩티드에 융합된 분비 리더 서열을 추가로 코딩하며; 또는
    (b) 다음을 포함하는 폴리시스트론 통합 벡터
    (i) 제1 유전자간 영역,
    (ii) 제1 치료적 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임,
    (iii) 제2 유전자간 영역, 및
    (iv) 제2 치료적 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임,
    여기서 상기 제1 유전자간 영역은 3' 단부에서 제1 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링되고, 제2 유전자간 영역은 제1 오픈 리딩 프레임의 3' 단부에 전사적으로 커플링되며, 제2 유전자간 영역은 3' 단부에서 제2 오픈 리딩 프레임에 전사적으로 커플링된다.
  17. 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에서 글루텐에 대한 경구 내성을 유도하는 방법으로서,
    (i) 인터류킨-10 (IL-10), 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2-특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 락트산 박테리움 (LAB)의 치료적 유효량을 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 IL-10을 코딩하는 상기 외인성 핵산 및 글리아딘 폴리펩티드를 코딩하는 상기 외인성 핵산은 LAB에 염색체로 통합되어 경구 내성을 유도하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 셀리악 질환의 위험이 있는 대상체가 위험 인자를 나타내고, 위험 인자가 유전적 소인인 것인, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 내성-유도 림프구를 증가시키는 것인, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포를 증가시키는 것인, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체에 상기 LAB의 치료적 유효량을 투여하는 단계가 상기 대상체의 점막고유층 세포의 샘플에서 Tbet를 발현하는 TH1 세포에 비해 CD4+ Foxp3+ 조절 T 세포의 비율을 증가시키는 것인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루텐에 대한 노출시 융모 위축의 발달이 상기 대상체에서 예방, 억제 또는 최소화되는 것인, 방법.
  24. 셀리악 질환으로 진단된 대상체에서 융모 위축을 감소시키는 방법으로서,
    (i) 인터류킨-10 (IL-10) 및 (ii) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프, 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프, 또는 (a) 하나 이상의 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ2 특이적 에피토프 및 (b) 하나 이상의 HLA-DQ8 특이적 에피토프 및/또는 하나 이상의 탈아미드화된 HLA-DQ8 특이적 에피토프의 조합을 포함하는 글리아딘 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 LAB의 치료적 유효량을 융모 위축을 갖는 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 LAB는 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않는 참조 LAB에 비해 융모 위축의 55% 이상의 감소를 발생시키는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 인터류킨-10이 인간 인터류킨-10 (hIL-10)인 것인, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 융모 위축이 장내 글루텐 노출로 인해 존재하는 것인, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAB가 셀리악 질환의 마우스 모델에서 IL-10 및 글리아딘 폴리펩티드를 발현하지 않는 참조 LAB에 비해 융모 위축의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 감소를 발생시키는 것인, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투여가
    a. 상기 대상체에 투여하기 전의 상피내 림프구증가증과 비교하여 상기 대상체의 상피내 림프구증가증을 감소시키고/시키거나 투여 단계 전에 상기 대상체로부터 수득된 샘플에 존재하는 CD3+ IEL과 비교하여 상기 대상체로부터 수득된 샘플에서 CD3+ 상피내 림프구 (IEL)의 수준을 감소시키거나;
    b. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 세포독성 CD8+ IEL과 비교하여 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ IEL의 수를 감소시키거나;
    c. 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포의 수준을 감소시키고/시키거나 투여 전에 상기 대상체의 샘플에 존재하는 상기 Foxp3-Tbet+CD4+ T 세포와 비교하여 상기 대상체의 점막고유층 림프구의 샘플에서 Foxp3+Tbet-CD4+ T 세포의 수준을 증가시키거나;
    d. 글루텐에 대한 노출시 상기 대상체에서 융모 위축 반복을 예방, 억제 또는 최소화하거나;
    e. 상기 대상체에서 융모 높이 (Vh)-대-음와 깊이(crypt depth) (Cd) 비율을 개선하고/하거나 상기 대상체에서 Vh/Cd 비율을 정상 범위로 회복하는 것인, 방법.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAB가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 LAB인 것인, 방법.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAB가 하루당 약 104 콜로니 형성 유닛 (cfu) 내지 약 1012 cfu, 하루당 약 106 cfu 내지 약 1012 cfu, 또는 하루당 약 109 cfu 내지 약 1012 cfu를 포함하는 유닛 투여량 형태로 투여되는 것인, 방법.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAB가 sAGX0868인 것인, 방법.
KR1020227013905A 2019-09-27 2020-09-25 셀리악 병의 치료 KR20220113674A (ko)

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