CN1281894A - 转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法、产品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含人内皮抑素(Endostatin)基因的具有原核表达元件的质粒通过改进的基因转导方法转入到乳酸菌类菌株中得到一种转人Endostatin基因乳酸菌类,如转基因乳酸杆菌、转基因双歧杆菌和转基因乳酸链球菌,并按不同比例混合制备成转基因乳酸菌类口服制剂,用于治疗血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和治疗内皮细胞过量刺激或异常刺激引起的疾病,如实体肿瘤、血管纤维瘤、肿瘤转移、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。

Description

转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法、产品及其应用

本发明涉及一种含人内皮抑素(Endostatin)基因的具有原核表达元件的质粒通过改进的PEG法、氯化钙法及其它常规基因转导方法转入到乳酸菌类菌株中得到一种转人Endostatin基因乳酸菌，再经继代选择性培养，获得含有人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒的转基因乳酸菌，如转人Endostatin基因乳酸杆菌、转人Endostatin基因双歧杆菌和转人Endostatin基因乳酸链球菌，并按不同比例混合制备成转基因乳酸菌类口服制剂——口服液、散剂(包括颗粒剂)、片剂、胶囊或肠溶胶囊，用于治疗血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和治疗内皮细胞过量刺激或异常刺激引起的疾病。

血管生成是指组织器官生长新的血管，并包括内皮细胞增殖。在正常生理条件下，人只是在相当特殊的环境下才涉及血管生成，例如，正常的血管生成一般见于创伤愈合，胎儿和胚胎的发育，黄体、子宫内膜和胎盘的形成。而持续的、未受调节控制的血管内皮细胞异常增殖和血管生成则仅出现于大量病理状态、肿瘤生长和转移以及内皮细胞异常生长疾病中，从而形成血管生成介导性、依赖性或相关性疾病和内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病。这些疾病以往的治疗方法不一，而采用通过抑制内皮细胞的异常增殖这样一种抗血管生成疗法来抑制血管的生成，达到治疗目的这种疗法较少，例如，人实体肿瘤临床上目前常用的手术、化疗、放疗方法，绝大部分是针对肿瘤细胞进行治疗，用抑制剂或阻断剂来抑制或阻断实体肿瘤的血管再生和血液供应方面的这种肿瘤抗血管生成疗法应用较少。

常规基因工程方法一般采用大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、人细胞系作为受体，极少使用乳酸菌类中的乳酸杆菌，双歧杆菌和乳酸链球菌等作为受体。

本发明的目的是改变重组人Endostatin在大肠杆菌中表达纯化得到的针剂剂型方法，通过将含有人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒载体，如温控质粒载体pBV220，采用改进的转基因转化方法导入到在人体中既不产生内毒素又不产生外毒素的有益生理菌——乳酸菌类菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌中，从而制备成转人Endostatin基因乳酸菌类口服制剂。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

本发明的方法是以含人外源基因，如人Endostatin基因的具有原核表达元件的基因质粒，如温控质粒pBV220，作为转化载体，以乳酸菌类菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌作为受体，采用溶菌酶处理后的PEG法、氯化钙法及其它基因质粒常规转化方法进行转化处理，再将经转化处理后的转基因乳酸菌类菌株经继代选择性培养，从而获得转人Endostatin基因乳酸菌。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法，其特征是：

a：按常规方法，将专利申请号为97107112．8中的人Endostatin基因经酶切转移到具有原核表达元件的质粒载体中，对含这种转化载体的基因质粒菌株进行扩增，并从中提取纯化制得含人Endostatin基因的质粒载体；

b：将作为受体的乳酸菌类菌株、如乳酸杆菌、双歧杆菌如乳酸链球菌培养到对数生长期，分别制得便于接受外源基因的乳酸菌类受体。采用适合于原核表达元件的改进的基因质粒转化方法——PEG法、氯化钙法及其它常规转化方法，用a所述的质粒载体对乳酸菌类菌株受体进行转化处理。经上述转化处理的乳酸菌类菌株经复苏培养后，涂布于含有青霉素的常规固体培养基平板上培养48-84小时，然后挑取单菌落培养于常规液体培养基中扩增培养，再扩增培养至继代培养不低于30代。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌，其特征是有氧培养下的转人Endostatin基因乳酸杆菌和厌氧培养下的转人Endostatin基因双歧杆菌分别扩增培养后，经冻干成菌粉，分别计数活菌数后，以活菌数不同比例混合，可按0-50％的转基因乳酸杆菌和100％-50％的转基因双歧杆菌冻干菌粉混合后，根据最终产品活菌数的要求加入赋型剂脱脂奶粉和1-5％的低聚糖，制备成转基因乳酸菌口服制剂。

一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌口服制剂，其特征是用于治疗由血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和过程以及治疗内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病。

以下结合实施例对本发明作进一步说明：

(1)用常规基因克隆方法从专利申请号为97107112．8中的人Endostatin基因序列，采用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，或用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，同时将pBV220载体用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，按常规基因克隆方法将经酶切的人Endostatin基因插入到pBV220载体中，经转导入大肠杆菌DH5α中，用SmaⅠ和BamHⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ，或BglⅡ和BamHⅠ酶切鉴定后按常规方法扩增，采用常规质粒提取方法纯化得到含人Endostatin基因的pBV220质粒。

(2)将乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)在常规乳酸杆菌培养液中扩增培养到OD600为0．4-0．5时，离心集菌，用10mmol／L Tris-Hcl缓冲液洗一遍，用1mg／ml溶菌酶37℃处理1．5小时，离心去除溶菌酶，换上4℃保存的乳酸杆菌液体培养基置于冰上，制备成便于接受外源基因的乳酸杆菌受体。

(3)采用适合于原核表达元件的基因质粒常规转导方法，例如：PEG法、氯化钙法及其它常规转导转染方法，将含人Endostatin基因的pBV220质粒对乳酸杆菌受体进行转化处理。

(4)将经上述转基因转导处理后的乳酸杆菌扩增培养后，涂布于含100μg／ml青霉素和1．5％琼脂的常规乳酸杆菌固体培养平板上，37℃培养48-72小时，挑取单一菌落于常规乳酸杆菌液体培养基中培养18-20小时，再涂布于含100μg／ml青霉素和1．5％琼脂糖的常规乳酸杆菌固体培养基平板上，37℃培养48-72小时，然后再挑取单一菌落于常规乳酸杆菌液体培养基中培养18-20小时，然后再扩增培养至继代培养不低于30代(30个周期)，每代常规提取质粒后，1．5％琼脂糖DNA电泳鉴别所含基因质粒和经表达处理后SDS凝胶电泳鉴定重组人Endostatin表达情况，分别在4．2KB处有质粒电泳带和18KD处有特异蛋白带，然后可作为种子批冻干保存，所扩增培养的菌种加1％灭菌烘干牛肉粉保存于4℃中分别作为1级和2级保藏菌种。

(5)转人Endostatin基因双歧杆菌的方法按专利申请号98111517．9的方法进行。

(6)将乳酸链球菌(Streptococcus Lactis Lohnis)在乳酸菌培养液，即牛肉膏0．5克，葡萄糖1克，蛋白胨1克，氯化钠0．5克，酵母浸膏0．5克，乳糖0．5克，水100毫升，pH6．8这样的液体培养基中有氧培养到OD600为0．35-0．4时，离心集菌，用10mmol／L Tris-Hcl配制的1mg／ml溶菌酶100微升37℃处理1小时，离心去除溶菌酶，换上4℃保存的上述乳酸菌培养液，置于冰上30分钟，加入含人Endostatin基因的pBV220质粒5微升，对乳酸链球菌进行转化处理，37℃培养10分钟，置于冰上5分钟，42℃培养2分钟，立刻置冰上30分钟。加入4℃保存的上述乳酸菌培养液，37℃扩增培养18小时，3000g离心5分钟，菌体涂布于含100μg／ml青霉素和2％琼脂的上述乳酸菌固体培养基平板上37℃培养60-72小时，挑取单一菌落于上述乳酸菌液体培养基中培养18-20小时，经常规提取基因质粒，1．5％琼脂糖DNA电泳鉴别所含基因质粒和经42℃表达处理后SDS凝胶电泳鉴定重组人Endostatin表达情况后，将上述含有转人Endostatin基因乳酸链球菌按原始保藏菌种、1级和2级保藏菌种方法保藏菌种，并扩增传代30代作稳定性试验。

转人Endostatin基因乳酸杆菌的优点是不需厌氧培养，基因导入较双歧杆菌容易些，且转人Endostatin基因乳酸杆菌培养方法简便，活菌存活时间长，并可与转人Endostatin基因双歧杆菌按不同的配比，如1∶1配比混合制备成转基因乳酸菌食品、保健品和药品时，产品稳定性比单纯转人Endostatin基因双歧杆菌口服制剂大大提高，保存时间可延长，作用也明显提高，作为调节肠道菌群平衡的作用和重组人Endostatin的量均比单纯转人Endostatin基因双歧杆菌要更好些。所以本发明在转入Endostatin基因双歧杆菌基础上增加转人Endostatin基因乳酸杆菌使之成为一个复合产品，必要时还可加入转人Endostatin基因乳酸链球菌，成为三种转基因菌复合产品，即在转基因乳酸杆菌和转基因双歧杆菌混合菌粉中再加入0％-50％的转人Endostatin基因乳酸链球菌冻干粉制备成含三种复合转基因菌的转基因乳酸菌类口服制剂。更有利于调节肠道菌群平衡，在降低培养成本的同时提高了产品质量和疗效，这比单独用转基因双歧杆菌效果要好。所以下述转人Endostatin基因乳酸菌类时如无特殊说明则指转人Endostatin基因乳酸杆菌和转人Endostatin基因双歧杆菌按不同配比复合形成的产品。在报批人Endostatin转基因乳酸菌食品、保健品、药品研究中，将2级保藏菌种进行常规扩增培养，并按温控质粒表达方法经诱导表达，制备成转人Endostatin基因乳酸杆菌和转人Endostatin基因双歧杆菌口服液，活菌数应大于每毫升菌液100万个，转人Endostatin基因乳酸杆菌或／和转入Endostatin基因双歧杆菌菌液经冻干后加入赋型剂脱脂奶粉和1％-5％低聚糖制备成散剂(包括颗粒剂)、片剂、胶囊或经微囊化处理或其它处理后制备成肠溶胶囊，每克产品活菌数不低于1亿。经质控鉴定，常规药效学、药理学、毒理学试验和鸡胚血管抑制检测实验、药代动力学试验等国家规定的常规各种试验后报批转人Endostatin基因乳酸菌类菌株口服制剂的食品、保健品批准文号和药品批准文号，临床剂量按每天早晚二次，每次空腹服用各50ml转人Endostatin基因乳酸杆菌或／和转人Endostatin基因双歧杆菌活菌口服液制剂，散剂(包括颗粒剂)、片剂、胶囊或肠溶胶囊口服制剂的剂量也按每天早晚2次空腹服用，每次散剂(包括颗粒剂)、片剂、和胶囊按口服液活菌数转换成每天早晚2次空腹服用，每次服用含3克菌粉产品的剂量，1个月为1个疗程。

本发明方法利用了在固体培养基中加入青霉素作为选择性固体培养基。转人Endostatin基因乳酸杆菌、双歧杆菌或乳酸链球菌能在这种选择性固体培养基中生长成单一菌落，未转入人Endostatin基因的乳酸杆菌、双歧杆菌或乳酸链球菌则不能在这种选择性固体培养基上生长。这样就能鉴别乳酸杆菌、双歧杆菌或乳酸链球菌是否转入人Endostatin基因。同时在非常低剂量的青霉素浓度，如含10μg／ml青霉素的液体培养基中则完全抑制了转人Endostatin基因的乳酸杆菌、转人Endostatin基因双歧杆菌或转人Endostatin基因乳酸链球菌的生长，使之不在人体内产生明显的抗青霉素抗药性。

所以本发明的转人Endostatin基因乳酸菌类菌株口服制剂具有很好的安全性，无明显毒副作用。

本发明方法适合于乳酸菌类各类菌株，适合于具有其他外源人的基因克隆转入乳酸菌类菌株中，从而获得转人源基因的乳酸菌类菌株，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌。所以通过本发明可以建立稳定的乳酸菌转化体系，用基因工程的方法改良乳酸菌菌种，并可将许多人体中存在的生理功能十分重要的一些基因克隆入具有原核表达元件的质粒载体中，再通过基因质粒转导方法。将含人体基因的温控质粒转导入乳酸菌类的菌株中，对一些分子量小的人体基因表达产物通过这种转基因方法可直接制备成转基因乳酸菌类菌株形成口服剂型，如乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌携带这些基因及基因表达产物进入人体肠道，并定植于肠粘膜繁殖，通过肠粘膜的选择性吸收直接作用于人体达到类似于基因治疗的目的，这样既有人体基因起作用的一个方面，又有作为携带基因的乳酸杆菌、双歧杆菌和乳酸链球菌本身的调节肠道微生态的作用，双重作用更具有优越性。这一发明方法比现在通行的大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统制备的针剂剂型相比，口服制剂具有使用安全方便、毒副作用小，生产工艺简单和成本低等突出优点。

本发明作为一种抗血管生成疗法，(1)用于治疗血管生成介导性、依赖性或相关性疾病：包括但不限于良性肿瘤如血管瘤；实体肿瘤；血生肿瘤如白血病；肿瘤转移；听觉神经瘤；神经纤维瘤；毛细血管扩张；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成疾病如糖尿病性视网膜病，早熟性视网膜病，黄斑变性，新血管性青光眼，晶状体后的纤维组织形成；蚀斑新血管化；冠状侧突；大脑侧突；动静脉畸形；局部缺血性肢血管生成；血友病患者关节病；血管纤维瘤；生脓性肉芽肿；瘢痕瘤。(2)也用于治疗内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病，例如：动脉粥样硬化；硬皮病；肠粘连；肥大性疤痕；猫抓病；幽门螺旋杆菌引起的胃溃疡。

Claims (4)

1、一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌的方法，其特征是：

a：按常规方法，将专利申请号为97107112．8中的人Endostatin基因经酶切转移到具有原核表达元件的质粒载体中，对含这种转化载体的基因质粒菌株进行扩增，并从中提取纯化制得含人Endostatin基因的质粒载体；

b：将作为受体的乳酸菌类菌株、如乳酸杆菌、双歧杆菌如乳酸链球菌培养到对数生长期，分别制得便于接受外源基因的乳酸菌类受体。采用适合于原核表达元件的改进的基因质粒转化方法——PEG法、氯化钙法及其它常规转化方法，用a所述的质粒载体对乳酸菌类菌株受体进行转化处理。经上述转化处理的乳酸菌类菌株经复苏培养后，涂布于含有青霉素的常规固体培养基平板上培养48-84小时，然后挑取单菌落培养于常规液体培养基中扩增培养，再扩增培养至继代培养不低于30代。

2、一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌，其特征是有氧培养下的转人Endostatin基因乳酸杆菌和厌氧培养下的转人Endostatin基因双歧杆菌分别扩增培养后，经冻干成菌粉，分别计数活菌数后，以活菌数不同比例混合，可按0-50％的转基因乳酸杆菌和100％-50％的转基因双歧杆菌冻干菌粉混合后，根据最终产品活菌数的要求加入赋型剂脱脂奶粉和1-5％的低聚糖，制备成转基因乳酸菌口服制剂。

3、根据权利要求2所述的转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌，其特征是在转基因乳酸杆菌和转基因双歧杆菌混合菌粉中再加入0％-50％的转人Endostatin基因乳酸链球菌冻干粉制备成含三种复合转基因菌的转基因乳酸菌类口服制剂。

4、一种转人内皮抑素(Endostatin)基因乳酸菌口服制剂，其特征是用于治疗由血管生成介导性、依赖性或相关性的疾病和过程以及治疗内皮细胞的过量刺激或异常刺激引起的疾病。