CN100350049C

CN100350049C - 乳酸乳球菌的食品级载体

Info

Publication number: CN100350049C
Application number: CNB2004100938757A
Authority: CN
Inventors: 熊衍文; 徐建国
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2007-11-21
Anticipated expiration: 2024-12-09
Also published as: CN1648255A

Abstract

本发明提供一种乳酸乳球菌的食品级载体，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNO：1253；其构建了含有乳酸乳球菌MG1363 thyA基因选择标记、乳酸乳球菌乳脂亚种Wg2隐性质粒pWVO1复制子和pUC18质粒多克隆位点的食品级载体pSH91，为外源基因在乳酸乳球菌中的克隆和表达奠定了基础。

Description

乳酸乳球菌的食品级载体

一、技术领域

本发明涉及乳酸菌载体，尤其涉及一种乳酸乳球菌ΔthyA突变株的食品级载体pSH91。

二、背景技术

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌总称，它包括乳酸球菌，乳酸杆菌，双歧杆菌，肠球菌等二十几个属。乳酸菌是在食品中应用最广泛的重要工业菌株，很早就被人类用于制作泡菜、酱油，生产面包、奶酪、酸奶和其它奶制品；乳酸菌也存在于动物包括人类的肠道中，因而被公认为是安全的食品级微生物(generally regarded as safe，GRAS)。越来越多的研究表明，乳酸菌的某些菌株对人类的健康有重要促进作用，包括生物学屏障、合成多种维生素、控制内毒素血症、抑制腐败细菌在肠道中腐化、预防和治疗抗生素相关性腹泻、抗肿瘤、抗变应原、抗感染、降低胆固醇等。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)为兼性厌氧的革兰氏阳性菌，该菌是乳球菌属(Lactococcus)中最重要和最典型的一个种，通常被作为乳酸菌的模式菌(model LAB)。目前乳酸乳球菌IL1403菌株的全基因组序列测定已经完成。人们对乳酸菌的兴趣除染色体外，还包括染色体以外的遗传物质，即质粒和噬菌体。乳酸乳球菌中存在大量的染色体外物质，为其分子遗传学研究、分子生物学研究和基因载体系统的发展提供了极好的材料，比如可发展质粒载体，诱变无质粒菌株。由于乳酸乳球菌易于培养，生长迅速，易于进行实验室操作，为厌氧菌、革兰氏阳性菌的生理生化研究提供了简单代谢的模式菌，而且由乳酸乳球菌发展起来的许多遗传学工具，不需改进或稍加改进后便可用于其它乳酸菌。乳酸乳球菌的质粒复制子可以在许多其它乳酸菌中发挥作用。近年来，随着乳酸乳球菌内源性质粒的消除和电转化技术的建立以及乳酸乳球菌中表达信号的分离和克隆，已建立和发展了一系列具有不同用途的乳酸菌载体和受体系统。这些载体包括基本的克隆载体，含启动子、终止子和分泌信号等的表达载体以及各类整合载体。

但是，传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素)抗性的基因。虽然这为遗传操作时保存一定的选择压力，对载体的选择作用是有效的。但将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将带来生物安全性的严重后果。因此，这一类载体离实际应用还有一定的距离。为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是使用对人体和环境安全的食品级选择标记取代抗生素抗性标记，建立食品级选择标记的载体，这也是近年来乳酸菌基因表达载体和受体系统研究领域中的前沿和热点。乳酸菌食品级基因表达系统必须具备如下条件：(1)载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段，如抗生素抗性基因；(2)表达宿主必须是安全、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株。必须用先进的分类方法去鉴定宿主菌，用适当的分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增、DNA杂交等手段去确认表达宿主的遗传组成。此外，食品级系统的宿主菌在生产状况下，在食品中和进入人体后必须是足够稳定的；(3)诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳链菌肽等可被人类食用的物质。

目前已经成功地获得了许多可在乳酸乳球菌及其它乳酸菌中使用的食品级标记基因，所有这些标记基因都来源于乳酸菌或其它在食品中有长期安全使用史的细菌。把这些标记基因克隆到乳酸菌来源的质粒或整合到染色体中，即可建立起食品级载体系统。用于乳酸菌食品级载体系统的食品级选择标记主要可分为三类：(1)细菌代谢或生物表型的改变如糖类利用标记；(2)利用细菌营养缺陷型互补；(3)细菌素抗性或其它抗性标记。但各种不同的选择标记都具有各自的优缺点，特别是有的选择性标记存在选择压力局限问题。

细菌营养缺陷型互补的原理，即细菌的某些基因如管家基因编码的产物催化细菌的基本代谢反应，其突变或缺失后，导致细菌在外界环境中或基本培养基上不能正常生长，而需要相应的底物存在，称为细菌的营养缺陷型(auxotrophy)。营养缺陷型菌株在其质粒上克隆入同源或异源的、功能完整的基因后，可使受体菌恢复原始的生物表型。一般来讲，管家基因缺陷型菌株应该满足两点要求：(1)基因缺失或突变的位点是明确的，理论上不会发生回复突变；(2)缺陷型菌株在生长环境中所需的营养物质的含量很低，不足以满足其生长。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)由thyA基因编码，在生物体内的DNA合成中起关键作用。它催化dUMP转变为dTMP的甲基化，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。胸苷酸合成酶缺陷的突变株依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧啶核苷(thymidine)进行DNA的生物合成，如果突变株生存的环境不能提供足够浓度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突变株将因DNA合成受阻而停止生长或死亡。一般地，将细菌涂于含thymine或thymidine和抗叶酸的药物如三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、氨基喋呤(aminopterin)或氨甲喋呤(amethopterin)的培养基上，可以筛选出thyA基因突变的菌株。此外还可以通过同源重组的方法获得thyA基因缺失突变株。某些菌株的thyA基因可以对同种属或不同种属的thyA基因缺陷的菌株提供功能互补作用，使thyA基因缺陷株恢复野生型表型。目前已有不少文献报道以thyA基因为基础建立的染色体-质粒致死平衡系统(chromosome-plasmidbalanced lethal system)[Morona R，et al.Gene.1991；107(1)：139-144.Fu X，etal.Microbiol.Immunol.2000；44(7)：551-556]。这些研究结果为以thyA基因作为选择标记取代抗生素抗性标记，建立食品级载体系统提供了重要的依据。选择thyA基因作为选择标记，构建乳酸乳球菌的食品级载体系统，目前国内外尚无这方面的报道。

三、发明内容

本发明的主要目的在于克服现有产品存在的上述缺点，而提供一种乳酸乳球菌的食品级载体，选择使用对人体和环境安全的食品级选择标记取代抗生素抗性标记，建立食品级选择标记的载体，克服以抗生素抗性为选择压力的基因表达系统存在的缺陷。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明构建了一种乳酸乳球菌的食品级载体，其特征在于，其包括：来自乳酸乳球菌MG1363的thyA基因选择标记；来自乳酸乳球菌乳脂亚种Wg2隐性质粒pWV01的复制子(RepA、ORF C和ori⁺)和来自pUC18质粒的全部多克隆位点即Hind III、Sph I、Pst I、Sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I。

本发明构建的食品级载体pSH91具有互补ΔthyA突变株乳酸乳球菌MBP71菌株的功能。其中乳酸乳球菌MBP71菌株在改良SA培养基上不生长，而在含有胸苷酸的改良SA培养基上恢复生长。将食品级载体pSH91导入乳酸乳球菌MBP71菌株后，MBP71/pSH91菌株恢复在改良SA培养基上的生长能力。

本发明构建的食品级载体pSH91具有表6中所示的pSH91载体核苷酸序列的碱基序列。

本发明构建的乳酸乳球菌的食品级载体pSH91，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNO：1253。

本发明所述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其特征在于食品级选择标记thyA基因来自乳酸乳球菌MG1363菌株，并通过PCR方法获得的。

本发明所述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其特征在于多克隆位点来自pUC 18质粒。

本发明所述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其特征在于质粒的复制区来自乳酸乳球菌乳脂亚种Wg2的隐性质粒pWV01，并通过PCR方法获得的。

本发明乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其特征在于，(1)选择和获取食品级选择标记thyA基因；(2)构建重组质粒pUC18:thyA；(3)获取MCS-thyA片段；(4)获取质粒复制区Rep片段；(5)构建食品级载体pSH91。

前述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其中所述选择和获取食品级选择标记thyA基因是根据乳酸乳球菌MG1363的thyA基因序列设计特异性引物对(1)和(2)，通过PCR扩增获得的；所述构建重组质粒pUC18:thyA是thyA基因PCR扩增产物经HindIII限制性内切酶酶切后克隆至pUC18质粒后获得的；所述获取MCS-thyA片段是以重组质粒pUC18:thyA为模板，采用引物对(3)和(4)，进行PCR扩增获得的；所述获取质粒复制区Rep片段，是根据质粒pWV01序列，以质粒pWV01的衍生质粒pGK12为模板，采用引物对(5)和(6)进行PCR扩增获得的；所述构建食品级载体pSH91是采用PCR方法将MCS-thyA片段与Rep片段进行连接而成，即采用DNA胶回收试剂盒分别回收MCS-thyA PCR扩增片段和Rep PCR扩增片段；以回收纯化的MCS-thyA和Rep片段为模板，采用引物对(7)和(8)进行第一轮PCR扩增；取扩增产物作为模板，加入新引物对(9)和(10)进行第二轮PCR扩增，通过两轮PCR扩增使MCS-thyA和Rep片段被连接成环状，取第二轮PCR扩增混合物以CaCl₂法制备感受态细胞，转化大肠杆菌X51菌株，在CBT琼脂平板上筛选转化子，从平板上随机挑取部分菌落提取质粒鉴定，并将获得的质粒命名为pSH91。

前述的乳酸乳球菌的食品级载体的构建方法，其中所述引物1为5′-CG AAGCTTTTGGGAAATACTATTGAA-3′，其含有HindIII限制性内切酶位点，引物2为5′-CG AAGCTTTAGATTAATTTAAATTGC-3′，其含有HindIII限制性内切酶位点；所述引物3为5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′，引物4为5′-TTGGGAAATACTATTGAA-3′；所述引物5为5′-TGAAAGCCGATGACTGAATG-3′，引物6为5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′；所述引物7为5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′，引物8为5′-TCATGGTCATGAAAGCCGATGACTGAATG-3′；所述引物9为5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′，引物10为5′-CGAAGGGGGTTTGGGAAATACTATTGAA-3′。

四、附图说明

图1为本发明pUC18:thyA质粒构建示意图。

图2为本发明pSH91质粒构建示意图。

图3为本发明Lactococcus lactis MG1363 thyA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图中泳道M为DNA Marker；泳道1-2为thyA基因PCR产物。

图4为本发明pUC18:thyA重组质粒鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。

图中泳道M为DNA Marker、泳道1为pUC 18、泳道2为pUC18:thyA、泳道3为pUC18质粒HindIII酶切产物、泳道4为pUC18:thyA重组质粒HindIII酶切产物、泳道5为thyA基因PCR产物。

图5为本发明MCS-thyA片段和Rep片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图中泳道M为DNA Marker、泳道1为MCS-thyA片段PCR产物、泳道2为Rep片段PCR产物。

图6为本发明pSH91质粒酶切分析的琼脂糖凝胶电泳图。

图中泳道M为DNA Marker；

泳道1为pSH91质粒；

泳道2为pSH91质粒EcoR I酶切产物；

泳道3为pSH91质粒Sac I酶切产物；

泳道4为pSH91质粒Kpn I酶切产物；

泳道5为pSH91质粒Sma I酶切产物；

泳道6为pSH91质粒BamH I酶切产物；

泳道7为pSH91质粒Xba I酶切产物；

泳道8为pSH91质粒Sal I酶切产物；

泳道9为pSH91质粒Pst I酶切产物；

泳道10为pSH91质粒Sph I酶切产物；

泳道11为pSH91质粒HindIII酶切产物。

图7为本发明pSH91质粒转化Lactococcus lactis MBP71的琼脂糖凝胶电泳图。

图中泳道M为DNA Marker；泳道1为pSH91(阳性对照)；泳道2为MBP71(阴性对照)泳道3～5为MBP71/pSH91。

图8为本发明pSH91质粒转化Lactococcus lactis MBP71的Southern blot结果图。

图中泳道1为pSH91(阳性对照)；泳道2为MBP71(阴性对照)；泳道3～5为MBP71/pSH91。

图9A为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA+thymidine培养基上的菌落形态图。

图9B为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA培养基上的菌落形态图。

图中A为L.lactis MBP71、B为L.lactis CHCC373、C为L.lactisMBP71/pSH91。

图10为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的生长曲线(OD₆₀₀)图。

图11为本发明不同乳酸乳球菌菌株在GM17培养基中的生长曲线(OD₆₀₀)图。

图12为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)图。

图13为本发明不同乳酸乳球菌菌株在GM17中的酸化能力(pH值)图。

五、具体实施方式

近年来，基因工程疫苗的研制取得了飞速的发展，但还存在一些问题，即目前重组的细菌性保护性抗原的表达受体主要是活的、减毒的病原菌，其免疫效果有赖于所用受体菌的繁殖能力、侵袭能力、存活时间及相应抗原基因的表达水平，疫苗的免疫保护力往往与菌株的残余毒力成正比。所以人们一直在试图寻找能良好地表达外源性抗原基因且安全的菌株。理想的可直接食用的微生物菌种应该具备：1、不会使人和动物致病，不与病原微生物产生杂交种：2、在体内外易于繁殖，在体外繁殖速度快；3、在低pH值和胆汁中能够存活，并能植入肠粘膜；4、在发酵过程中能产生乳酸和过氧化氢等物质；5、能合成对沙门氏菌、葡萄球菌、致病性大肠杆菌、梭状芽孢杆菌等肠道致病菌的抑制物而不影响自己的活性；6、经加工后活菌存活率高，混入饲料后高温下稳定性好；7、最好来自人或动物自身肠道中；8、有利于促进宿主的生长发育及提高抗病能力。乳酸菌很早就被人类利用，被认为是安全的食品级微生物，其本身具有重要的健康促进作用及非特异性的抗感染能力，因此目前以乳酸菌为疫苗载体已引起人们的极大兴趣。

但是，已有报道的疫苗表达载体系统均以抗生素抗性作为外源性基因稳定表达的压力。以抗生素抗性为选择压力的基因表达系统存在着以下缺陷：1、在生产中需加入抗生素，以确保外源性基因的稳定表达，使生产成本增加；2、在缺乏抗生素的情况下质粒容易丢失；3、临床上，尤其是应用于农业和食品工业的菌株，如果含有位于质粒上的耐药性基因，有可能会造成耐药性基因的扩散，增加了向环境传播的可能性。近年来，人们选择使用对人体和环境安全的食品级选择标记取代抗生素抗性标记，建立食品级选择标记的载体。食品级载体的优点是不需要外加抗生素进行选择，因此具有重要的应用价值。目前建立的食品级载体有1、糖类利用标记，如Platteeuw等利用lacF基因作为选择标记构建食品级载体(Platteeuw C，et al.Appl.Environ.Microbiol.1996；62：1008-1013)；2、细菌营养缺陷型互补，如Bron等建立的以alr基因为选择标记的载体pGIP011和pGIP012(Bron PA，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；68：5663-5670)；3、细菌素抗性标记，如以nisin抗性基因nsr为选择标记的载体pVS40、pFM011和pFK012(Froseth BR，et al.Appl.Environ.Microbiol.1988；54：2136-2139；von Wright A，et al.Appl.Environ.Microbiol.1990；56：2029-2035)。

本发明选择胸苷酸合成酶(thymidylate synthase)thyA基因为食品级选择标记，thyA基因在生物体内的DNA合成中起关键作用。它催化dUMP(脱氧尿嘧啶单核苷酸)转变为dTMP(脱氧胸腺嘧啶单核苷酸)的甲基化，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。thyA基因缺失的突变株需要依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧啶核苷(thymidine)进行DNA的生物合成，如果突变株生存的环境不能提供足够浓度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突变株将因DNA合成受阻而停止生长或死亡。但是，如果在质粒中提供同源或异源的功能互补的thyA基因后，缺陷株在不含外源性胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的情况下也能恢复生长，此即细菌营养缺陷型互补的原理。

具体实施步骤：

(一)本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株和质粒。

①Escherichia coli X51[LE392，thyA^-，采用thyA突变株的筛选方法获得(Okada T，et al.Nature.1960；188：340-341)]；

②Lactococcus lactis MG 1363(NCDO712，plasmid free，Gasson MJ，J.Bacteriol.1983；154(1)：1-9)：

③Lactococcus lactis CHCC373(Chr.Hansen Culture Collection.Chr.HansenA/S，Hrsholm，Denmark)；

④Lactococcus lactis MBP71(CHCC373，ΔthyA，Pedersen MP，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；68(6)：3010-3023)；

⑤pUC18(Ampicillin^r，购自试剂公司)；

⑥pGK12(Chloromycetin^r，Erythromycin^r，Kok J，et al.Appl.Environ.Microbiol.1984；48(4)：726-731)；

(二)本发明实验中使用和涉及的培养基的配制。

①LB培养基：

胰蛋白胨 10.0g

酵母粉 5.0g

氯化钠 10.0g

加蒸馏水定容至1000ml，pH 7.2。

15lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

②CBT培养基：

5×M9盐溶液 200ml

葡萄糖 20.0g

酪蛋白胨 0.5g

色氨酸(10mg/ml) 1.0ml

维生素B 1(1mg/ml) 1.0ml

^*5×M9盐溶液的配制：

Na₂HPO₄·7H₂O 64.0g

KH₂PO₄ 15.0g

NaCl 2.5g

NH₄Cl 5.0g

加蒸馏水定容至1000ml，pH 7.2。

8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

③MRS培养基：

胰蛋白胨 10.0g

牛肉膏 10.0g

酵母粉 5.0g

葡萄糖 5.0g

乙酸钠 5.0g

柠檬酸铵 2.0g

Tween 80 1.0ml

K₂HPO₄ 2.0g

MgSO₄·7H₂O 0.2g

MnSO₄·H₂O 0.05g

加蒸馏水定容至1000ml，pH 6.8。

8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

④改良SA培养基，参考文献(Jensen PR，et al.Appl.Environ.Microbiol.1993；59：4363-4366)，并稍作改进。

A、20×氨基酸混合液：

缬氨酸 3.0g

谷氨酸 3.0g

蛋氨酸 2.5g

亮氨酸 2.0g

组氨酸 0.5g

异亮氨酸 1.0g

谷氨酰氨 1.0g

天冬酰氨 1.0g

^*将上述氨基酸溶于蒸馏水中，加入10N的NaOH溶液直至完全溶解，定容至500ml，4℃保存。

B.、20×SA盐溶液：

氯化钠 30.0g

乙酸钠 12.5g

氯化氨 5.0g

磷酸氢钾 2.0g

氯化镁 1.0g

硫酸钾 0.5g

硫酸铁 20.0mg

氯化钙 1.0mg

^*将上述盐溶于500ml蒸馏水中，分装后置于-20℃保存。

C、200×混合维生素溶液：

维生素B1 20.0mg

维生素B6 50.0mg

生物素 20.0mg

核黄素 20.0mg

泛酸钙 20.0mg

叶酸 20.0mg

烟酸 20.0mg

^*将上述维生素溶于100ml 0.067mol/L磷酸钾溶液中，4℃避光保存。

将上述A、B、C溶液混合至终浓度为1×，然后加入20.0g葡萄糖，0.5g酪蛋白胨，15.0g MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]，加蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0。

8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

⑤GM17培养基(Terzaghi BE，et al.Appl.Environ.Microbiol.1975；29：807-813)：

多价蛋白胨 5.0g

酪蛋白胨 5.0g

牛肉膏 5.0g

葡萄糖 5.0g

酵母粉 2.5g

维生素C 0.5g

MgSO₄·7H₂O 0.25g

GP(β-磷酸甘油钠) 19.0g

加蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0。

8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

⑥S-GM17培养基：

在GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L的Sucrose。

⑦GS-GM17培养基：

GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L的Sucrose和2％的Glycine。

⑧S-GM17/MC培养基：

在GM17培养基的基础上，加入0.3mol/L的Sucrose、20mmol/L的MgCl₂和2mmol/L的CaCl₂。

大肠杆菌使用LB或CBT培养基，而乳酸乳球菌使用MRS、GM17或改良SA培养基。如果需要，大肠杆菌使用抗生素的终浓度是氨苄青霉素100μg/ml，红霉素150μg/ml，而乳酸乳球菌使用的抗生素终浓度是红霉素10μg/ml。thymine和thymidine使用的终浓度为20μg/ml。

(三)本发明实验中使用和涉及的主要试剂。

Taq DNA Polymerase购自华美生物工程公司；

Pfu DNA Polymerase购自SANGON公司；

PCR产物及DNA酶切片段回收采用QIAGEN的QIAquick Gel ExtractionKit；

dNTPs，T4DNA Ligase，Hind III、Sph I、Pst I、Sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I等限制性内切酶，RNA酶，蛋白酶K，碱性磷酸酶等均购自Promega公司；

DNA探针标记及检测试剂盒为Roche DIG DNA Labeling and DetectionKit；

TMP，Thymine，Thymidine购自Sigma公司；

其余试剂均为市售的AR级试剂。

(四)本发明实验中使用和涉及的主要仪器。

离心机为Eppendorf Centrifuge 5415D和Beckman COULTER；

PCR仪为FeroTec Thermal cycler；

凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Doc 2000；

电击仪为Bio-Rad Gene Pulser；

分光光度计为上海分析仪器厂7230型；

pH计为HANNA HI98128。

(五)乳酸乳球菌ΔthyA株的食品级载体pSH91的具体构建步骤。

1、食品级选择标记thyA基因的选择和获取。

选择的thyA基因来自L.Lactis，根据已经发表的L.lactis thyA基因序列(Ross P，et al.Appl.Environ.Microbiol.1990；56(7)：2156-2163)，设计一对特异性引物(引物1和引物2)，并在两引物的5’末端均加上HindIII限制性内切酶位点。以L.lactis MG1363染色体DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物的大小为937bp。实验得到与预期大小相符的特异性DNA片段，如图3所示。

引物1：5′-CG AAGCTTTTGGGAAATACTATTGAA-3′(含HindIII限制性内切酶位点)

引物2：5′-CG AAGCTTTAGATTAATTTAAATTGC-3′(含HindIII限制性内切酶位点)

PCR反应体系(20μl)为：10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(终浓度为125μmol/L)，上下游引物各1μl(终浓度为0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶的量为1∶1)，以去离子水补至20μl。

PCR反应条件为：95℃预变性5′，94℃变性1′，50℃复性1′，72℃延伸1′，30个循环，末次循环72℃延伸7′。

2、重组质粒pUC18:thyA的构建。

thyA基因PCR扩增产物以QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化，用HindIII限制性内切酶消化，与经HindIII限制性内切酶消化并经去磷酸化处理的pUC18载体连接，以CaCl₂法制备感受态细胞，转化E.coliJM109，在含有Ampicillin及X-gal、IPTG的LB琼脂平板上挑选白色菌落。将获得的克隆子经质粒提取，HindIII酶切以及PCR扩增等鉴定，获得了含thyA基因的重组质粒，命名为pUC 18:thyA，如图1、图4所示。

DNA片段的回收参考试剂盒操作手册，质粒提取，DNA片段的酶切、去磷酸化和DNA片段的连接及质粒转化、筛选、鉴定等操作同一般的分子生物学方法。

3、MCS-thyA片段的获取。

以重组质粒pUC18:thyA为模板，采用pUC18-thyA引物对(引物3和引物4)，进行PCR扩增，扩增片段即为MCS-thyA片段，其长度为986bp，如图5所示。MCS-thyA片段包含了完整的pUC18多克隆位点(Multiple Cloning Site，MCS)以及不含酶切位点的thyA基因。

引物3：5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′

引物4：5′-TTGGGAAATACTATTGAA-3′

PCR反应体系(20μl)为：10×buffer 2μl，dNTPs 1.0μl(终浓度为125μmol/L)，上下游引物各1μl(终浓度为0.25μmol/L)，DNA模板1μl，Pfu DNA聚合酶0.5U，Taq DNA聚合酶0.5U(Pfu DNA聚合酶∶Taq DNA聚合酶的量为1∶1)，以去离子水补至20μl。

PCR反应条件为：95℃预变性5′，94℃变性1′，52℃复性1′，72℃延伸1′，30个循环，末次循环72℃延伸7′。

4、质粒复制区Rep片段的获取。

质粒pWV01为L.lactis subsp.cremoris Wg2的隐性质粒(cryptic plasmid)(Leenhouts KJ，et al.Plasmid.1991；26(1)：55-66)。pWV01为穿梭质粒，可以在革兰氏阳性菌如乳球菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌中存在。质粒pGK12含有完整的pWV01的复制子区。根据pWV01的序列(Leenhouts KJ，et al.Plasmid.1991；26(1)：55-66)，以质粒pGK12为模板，采用Rep引物对(引物5和引物6)进行PCR扩增，扩增片段即为Rep片段，其长度约为1536bp。Rep片段包含了pWV01中的ori⁺、RepA基因、ORF C区域及其两端的部分序列。RepA基因与质粒的自主复制有关，而ORF C则与维持质粒的拷贝数有关，因此选择二者作为拟构建质粒的复制子。

引物5：5′-TGAAAGCCGATGACTGAATG-3′

引物6：5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′

PCR反应条件为：95℃预变性5′，94℃变性1′，56℃复性1，72℃延伸1′30″，30个循环，末次循环72℃延伸10′。

5、食品级载体pSH91的构建。

将MCS-thyA片段与Rep片段连接起来，即为食品级载体pSH91，我们采用PCR方法将两个片段进行连接。具体步骤是用QIAGEN QIAquick GelExtraction Kit胶回收试剂盒(QIAGEN，Germany)分别回收MCS-thyA PCR扩增片段和Rep PCR扩增片段。以回收纯化的MCS-thyA和Rep片段为模板，采用引物对(引物7和引物8)进行第一轮PCR扩增；取1.0μl扩增产物作为模板，加入新的引物对(引物9和引物10)进行第二轮PCR扩增。由于两种引物对的5’末端均有一段10余个碱基组成的反向互补序列，因此经过两轮PCR扩增后，MCS-thyA和Rep片段被连接成环状，取2.0μl第二轮PCR扩增混合物以CaCl₂法制备感受态细胞，转化E.coli X51，在CBT琼脂平板上筛选转化子。

从平板上随机挑取部分菌落提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳后均发现有一大小约2.5kb的质粒条带。将此质粒分别以EcoR I，Sac I，KpnI，Sma I，BamH I，Xba I，SalI，Pst I，Sph I，HindIII限制性内切酶进行酶切，结果质粒均被切为线性，见附图6所示。说明该质粒存在上述酶切位点，将该质粒命名为pSH91，pSH91质粒构建示意图如附图2所示。

引物7：5′-ATGACCATGATTACGAAT-3′

引物8：5′- TCATGGTCATGAAAGCCGATGACTGAATG-3′

引物9：5-AAACCCCCTTCGACTTTCGT-3′

引物10：5′- CGAAGGGGGTTTGGGAAATACTATTGAA-3′

PCR反应条件为：95℃预变性5′，94℃变性1′，50℃复性1，72℃延伸2′，30个循环，末次循环72℃延伸10′。

对pSH91质粒进行了全序列测定，并将pSH91质粒的全序列与发表的原始序列进行了比对分析，结果发现：(1)pSH91质粒中的thyA基因编码序列与发表的序列完全一致；(2)pSH91质粒中的ori⁺、RepA基因、ORF C序列与发表的序列完全一致；(3)pSH91质粒中含有完整的来自pUC18质粒的多克隆位点。其碱基序列见表6所示的序列表。

测序主要由SANGON完成，测序仪为ABI PRISM 377 DNASEQUENCER。测序结果采用DNA Star软件进行序列拼接，并与原始序列进行比对分析。

(六)质粒pSH91性能的测定。

1、质粒pSH91对乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71的转化和互补作用。

L.lactis MBP71为ΔthyA精确缺失株，由Dr.Martin B.Pedersen构建(Pedersen MP，et al.Appl.Environ.Microbiol.2002；68(6)：3010-3023)。采用电转化方法(见后)，将质粒pSH91转化L.lactis MBP71，在改良SA的琼脂培养基上筛选转化子，结果获得了大量转化子。随机挑取部分转化子提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳后发现转化菌含有与对照质粒pSH91大小一致的条带，而出发菌株无此条带，如附图7所示。以pSH91全质粒标记探针，与转化子进行Southern杂交分析，结果转化子均出现了与对照质粒pSH91一致的杂交条带，而出发菌株无杂交条带，如图8所示。因此质粒pSH91已被成功的转化到L.lactis MBP71中，所获得的重组菌株称为MBP71/pSH91。

质粒pSH91可以对乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71进行良好的功能互补。MBP71经导入pSH91后，恢复了在改良SA琼脂平板上的生长能力，其菌落形态与野生株CHCC373完全相似，也与MBP71在含thymidine的改良SA琼脂平板上的菌落形态完全相似，菌落形态如图9A、图9B所示。

乳酸乳球菌的电转化方法。

乳酸乳球菌的电转化方法主要参考Holo等(Holo H，et al.Appl.Environ.Microbiol.1989；55：3119-3123)，并稍作修改。

(1)感受态细胞的制备：

①将-80℃冻存的L.lactis MBP71菌种接种至MRS琼脂平板，培养24～36小时，至平板上出现大小适中的单菌落；

②从MRS平板上挑取单菌落至S-GM17液体培养基，并加入thymidine至终浓度20μg/ml，30℃静置培养过夜(约12小时)；

③将过夜培养的菌液按1％的比例接种至GS-GM17液体培养基，并加入thymidine至终浓度20μg/ml，30℃静置培养4～5小时，至OD₆₀₀约为0.4～0.6；

④将培养物置冰浴中10～20分钟；

⑤集菌，12000rpm室温快速离心30秒，收集1.5～3.0ml菌液(以下所有操作除离心步骤外均在冰上进行)；

⑥弃上清，加入1ml 4℃预冷的电击缓冲液(*电击缓冲液的配制：10mmol/L HEPES，0.5mol/L Sucrose，以0.22μm的滤器过滤除菌)，重新悬浮细菌，12000rpm室温快速离心30秒；

⑦重复上述步骤2次；

⑧去除残留液体，最后以50μl的电击缓冲液重悬细菌，置冰上；

⑨加入2～5μl外源DNA，置冰上约5分钟。

(2)电击转化：

①将含有外源DNA的上述细菌悬液加入预冷的无菌电击杯中(选用的电击杯内径为0.2cm)，轻轻敲击电击杯，确保液体位于电击杯底部，置冰上；

②电击的操作步骤按电击仪的要求进行；

③电击时选择的参数是：电压为1.8kV；电容为25μF；电阻为200Ω；时间常数t通常为4.5～4.8msec；

④电击完成后，将电击杯置冰上约5分钟，加入1ml S-GM17/MC培养基至电击杯中；

⑤将电击杯中的电击混合物与培养基转移至无菌玻璃试管中，并补充S-GM17/MC培养基至5ml，30℃静置培养2.5～3.5小时；

⑥取50～100μl菌液，加入改良SA琼脂平板，用无菌玻璃涂棒将细菌均匀涂布到整个平板表面；

⑦待平板干燥后，倒置放在30℃温箱中培养36～48小时；

⑧观察平板上转化子出现的情况，并将转化子作进一步的鉴定。

2、质粒pSH91对乳酸乳球菌ΔthyA株MBP71的转化效率及稳定性。

以质粒pGK12为参照比较了质粒pSH91对L.lactis MBP71的转化效率，前者在含Erythromycin的MRS琼脂平板上筛选转化菌落，而后者在改良SA琼脂平板上筛选转化菌落。结果pSH91转化效率比pGK12略高，在本发明的实验条件下，质粒pSH91对L.lactis MBP71的转化效率约为10⁵/μg DNA。说明thyA基因同Chloromycetin或Erythromycin等抗性基因一样，可以作为有效的选择标记。

MRS培养基为营养丰富培养基，其中含的thymidine能够满足L.lactisMBP71菌株的正常生长，因此可以认为含pSH91质粒的L.lactis MBP71菌株生长在MRS培养基中不存在选择压力。将含pSH91质粒的L.lactis MBP71接种至5ml MRS液体培养基中，每隔12小时按1％的比例将菌液接种至新鲜的5ml MRS液体培养基，如此进行传代，每5代取部分菌液分别涂改良SA琼脂平板(只有含pSH91质粒的MBP71菌株能够生长，并随机挑选部分菌落作质粒提取鉴定)和改良SA+thymidine琼脂平板(所有菌株均能生长)，计算平板上的菌落数。以改良SA琼脂平板上出现的菌落数除以改良SA+thymidine琼脂平板上出现的菌落数，即可计算出pSH91质粒在MBP71菌株中的稳定性，如表5所示。

3、质粒pSH91对L.lactis MBP71菌株在不同培养基中生长速率的影响。

为了观察L.lactis MBP71在导入质粒pSH91后，其在不含或者含微量thymidine的培养基中的生长情况，本发明采用改良SA培养基和GM17培养基进行了生长速率的测定，其结果见表1、图10和表3、图12所示。

4、质粒pSH91对L.lactis MBP71菌株在不同培养基中酸化能力的影响。

乳酸菌最典型的特征之一就是它能产生大量的乳酸，同时引起环境或培养基的酸化，pH值降低。为了了解含pSH91质粒的L.lactis MBP71菌株产酸的能力是否受到影响，本发明采用改良SA培养基和GM17培养基，测定了乳酸乳球菌不同菌株在不同时间的pH值，来反映乳酸乳球菌的产酸能力。结果见表2、图11和表4、图13所示。

本发明将L.lactis MG1363的thyA基因克隆到质粒pUC18中，获得了重组质粒pUC 18:thyA。将pUC 18:thyA质粒转化大肠杆菌thyA-株X51，结果E.coliX51恢复了在不含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的CBT培养基上的生长。说明我们选择的乳酸乳球菌thyA基因可以对大肠杆菌thyA-株X51进行有效的功能互补，为进一步在乳酸乳酸菌中使用该基因取代抗生素抗性基因建立食品级载体系统奠定了基础。

本发明构建的载体pSH91包括3个部分，来自L.lactis MG1363的thyA选择标记；来自L.lactis subsp.cremoris Wg2隐性质粒pWV01的复制子(RepA、ORF C和ori⁺)和来自pUC18质粒的全部多克隆位点(HindIII、Sph I、Pst I、Sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpn I、Sac I、EcoR I)。pWV01及其衍生质粒pGK12为穿梭质粒，在许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均能复制。同样，pSH91能够在乳酸乳球菌和大肠杆菌中存在，因此pSH91也属于穿梭质粒，这为利用大肠杆菌作为中间受体菌进行外源基因的克隆提供了方便。质粒pSH91除多克隆位点来自pUC18质粒外，选择性标记thyA和复制子均来自食品级微生物乳酸乳球菌，同时它不含有任何抗生素抗性选择标记和其它的外源DNA成份，因此可以将质粒pSH91看作为食品级的克隆载体。

pSH91转化L.lactis ΔthyA株MBP71后，其在不含thymine和thymidine的改良SA培养基上恢复了正常生长，说明质粒中的thyA基因提供了功能互补作用。进一步的测定发现，含pSH91的L.lactis MBP71与出发菌株MBP71在含thymidine的改良SA培养基中的生长速度和酸化能力基本相同。同时与野生株L.lactis CHCC373在改良SA培养基的生长速度和酸化能力也基本相同。

本发明乳酸乳球菌ΔthyA突变株的食品级载体pSH91的有益效果：本发明建立的这套乳酸乳球菌食品级载体系统同其它传统克隆载体一样，可以在此载体的基础上进行基因的克隆，但又避免了传统载体带有抗生素抗性基因而不能直接应用的缺点。因此本发明建立的这套乳酸乳球菌食品级载体系统为进一步在乳酸乳球菌中进行外源性抗原基因的克隆和表达奠定了很好的基础，为发展新型、有效的疫苗表达系统提供可靠的工具，该系统的建立具有很高的实际应用价值。

表1为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的生长速率(OD₆₀₀)。

时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91
时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91	012345	0.0500.0540.0710.0890.1160.160	0.2160.3440.4020.4450.4620.471	0.0500.0590.0740.1430.3140.746	0.0500.0780.1100.2170.4831.125	0.0500.0690.1120.1900.4500.943

6789101112

0.1620.1700.1820.1900.2080.2030.192

0.4930.4810.4890.4960.5190.5330.538

1.4611.6831.8181.9982.1842.2262.218

1.9212.5042.4302.4882.4882.4262.402

1.6992.3482.4882.4162.3942.3882.374

^*将培养过夜(约12h)的菌液按1％稀释后接种

^**将培养过夜(约12h)的菌液按10％稀释后接种

表2为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)。

时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91
时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91	0123456789101112	7.006.946.926.906.876.876.786.786.806.796.786.776.76	6.896.846.786.736.686.646.566.556.546.506.466.416.34	7.006.946.916.886.816.666.015.235.124.834.604.524.33	7.006.936.906.866.736.395.034.534.434.344.314.294.24	7.006.936.906.876.746.515.414.614.454.364.364.274.23

^*将培养过夜(约12h)的菌液按1％稀释后接种

^**将培养过夜(约12h)的菌液按10％稀释后接种

表3为本发明不同乳酸乳球菌菌株在GM17中的生长速率(OD₆₀₀)

时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91
时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91	0123456	0.0810.0820.1240.2460.3790.5330.602	0.4650.5620.9671.3471.3471.2010.928	0.0810.0810.1770.4280.9551.8543.010	0.0800.0800.1780.5061.0651.9593.112	0.0810.0810.1820.4930.9911.8863.050

789101112

0.7350.5620.5020.4740.4280.396

0.7620.6180.5390.4830.4580.424

4.1014.1944.3324.2964.2604.260

3.7803.8523.9304.0413.8763.780

3.8763.7323.8043.9873.7113.711

^*将培养过夜(约12h)的菌液按1％稀释后接种

^**将培养过夜(约12h)的菌液按10％稀释后接种

表4为本发明不同乳酸乳球菌菌株在改良SA中的酸化能力(pH值)

时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91
时间(h)	^*MBP71	^**MBP71	^*MBP71(Thymidine)	^*CHCC373	^*MBP71/pSH91	0123456789101112	7.006.946.926.906.876.876.786.786.806.796.786.776.76	6.896.846.786.736.686.646.566.556.546.506.466416.34	7.006.946.916.886.816.666.015.235.124.834.604.524.33	7.006.936.906.866.736.395.034.534.434.344.314.294.24	7.006.936.906.876.746.515.414.614.454.364.364.274.23

^*将培养过夜(约12h)的菌液按1％稀释后接种

^**将培养过夜(约12h)的菌液按10％稀释后接种

表5为本发明质粒pSH91稳定性分析。

传代数	CFU		质粒稳定性(％)
	CFU			改良SA	改良SA+Thymidine
	510152025303540	37632530427222816515290		改良SA	改良SA+Thymidine	383361369382350369402378	98.1790.0082.3871.2065.1444.7237.8123.81

4550

6536

382348

17.0210.34

表6为pSH91载体核苷酸序列

<110>熊衍文，徐建国

<120>乳酸乳球菌的食品级载体

<160>1

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>2337

<212>DNA

<400>1

tgaaagccga tgactgaatg aaataataag cgcagcgccc ttctatttcg gttggaggag 60

gctcaaggga gtatgaggga atgaaattcc ctcatgggtt tgattttaaa aattgcttgc 120

aattttgccg agcggtagcg ctggaaaatt tttgaaaaaa atttggaatt tggaaaaaaa 180

tggggggaaa ggaagcgaat tttgcttccg tactacgacc ccccattaag tgccgagtgc 240

caatttttgt gccaaaaacg ctctatccca actggctcaa gggtttaagg ggtttttcaa 300

tcgccaacga atcgccaacg ttttcgccaa cgttttttat aaatctatat ttaagtagct 360

ttattgttgt ttttatgatt acaaagtgat acactaactt tataaaatta tttgattgga 420

gttttttaaa tggtgatttc agaatcgaaa aaaagagtta tgatttctct gacaaaagag 480

caagataaaa aattaacaga tatggcgaaa caaaaaggtt tttcaaaatc tgcggttgcg 540

gcgttagcta tagaagaata tgcaagaaag gaatcagaac aaaaaaaata agcgaaagct 600

cgcgttttta gaaggatacg agttttcgct acttgttttt gataaggtaa ttatatcatg 660

gctattaaaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat tatatcctga ctcaattcct 720

aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta tggctgtcag tcctttacac 780

gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta gtgatgttat acgaaatgga 840

aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg cacgaaatcc tgtaacaata 900

gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata gttcagttgc tcatgttgag 960

atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc atgaatcaaa ggacgctatt 1020

gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga acattaatga ttttgatatt 1080

gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat tgaagaattt acttttagat 1140

atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa tggcttttat tcgccttagg 1200

ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag atattgtttc aacaaactct 1260

agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg gatatagagc aagttatgca 1320

aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa caaagaaaaa gagttatttg 1380

ctgaataatg aggaattaaa aaagatagga aaatttcatg acttacgcag atcaagtttt 1440

taaacaaaat atccaaaata tcctagataa tggtgttttt tcagaaaatg caagaccaaa 1500

gtataaggat ggtcaaatgg cgaatagcaa atatgtcact ggttcattcg ttacttatga 1560

tttgcaaaag ggggagtttc caattaccac tttgcgtcca attccaatca aatctgctat 1620

taaagaattg atgtggatat accaagacca aacaagtgaa ctttctgttc tcgaagagaa 1680

gtatggagtc aaatactggg gagaatgggg aattggtgat ggtacgattg ggcaacgtta 1740

tggtgcaaca gtcaaaaaat ataatatcat tggtaaatta ttagaaggct tggccaaaaa 1800

tccatggaat cgtcgtaata tcatcaacct ttggcagtat gaagattttg aggaaacaga 1860

aggtctttta ccatgtgctt tccaaacgat gtttgatgtc cgtcgagaaa aagatggtca 1920

gatttatttg gatgccacac tgattcaacg ttcaaacgat atgcttgtag cccaccatat 1980

caatgcgatg caatatgttg ctttgcaaat gatgattgca aaacattttt cttggaaagt 2040

tgggaaattc ttttattttg taaataattt acatatttat gataatcagt ttgagcaggc 2100

aaatgaatta atgaagcgaa cagcttctga aaaagaacct cgtttggtcc ttaatgttcc 2160

tgatggtaca aactttttcg atattaaacc tgaagatttt gaacttgtgg actatgagcc 2220

agtaaaacct caattgaaat ttgatttagc aatttaaatt aatctaaagc ttgcatgcct 2280

gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcat 2337

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1、一种乳酸乳球菌的食品级载体，其特征在于，其由来自乳酸乳球菌MG1363的thyA选择标记，来自质粒pWV01的复制子和来自质粒pUC18的多克隆位点Hind III、Sph I、Pst I、Sal I、Xba I、BamH I、Sma I、Kpnz I、Sac I、EcoR I组成，所述质粒pWV01是乳酸乳球菌乳脂亚种Wg2的隐性质粒，所述的乳酸乳球菌的食品级载体为表6所示的核苷酸序列。