CN102181383B - 一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌。本发明提供的一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌，其为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)CV56，其保藏号为CGMCC No.4537。本发明的实验证明，本发明分离出一株新的乳酸乳球菌CV56，其可以分泌细菌素抑制阴道内相关病原菌，并且对阴道上皮细胞有一定的黏附作用，有利于其在阴道环境中的定植，并能产生乳酸降低阴道pH值，从而从多方面发挥阴道微生态环境的维护及益生作用。

Description

一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌。

背景技术

微生态是指正常微生物菌群与其周围的生物和非生物环境条件相互作用构成的微观生态系统。正常情况下微生态处于一个波动的状态，微生物的种类和数量都不会发生质的变化。健康妇女阴道内存在着多种微生物，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统。当阴道这个系统平衡被破坏时，会出现由于阴道菌群失调引起的多种疾病，如细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎等。目前治疗阴道感染的措施主要是运用抗生素、灭滴灵、雌激素以及酸化阴道的制剂等来杀灭阴道内的病原微生物。值得注意的是，上述疗法在某种程度上会抑制正常的菌群，引起致病菌或条件致病菌的过度繁殖，从而造成反复感染或多重感染，增加治疗的的难度和成本。许多研究表明，利用阴道正常微生态中的乳酸菌制成的制剂对阴道感染的预防和治疗都具有良好的疗效。

乳酸菌在阴道微生态中发挥作用的机制推测为：黏附上皮细胞，形成空间位阻，阻止病原菌初始黏附；分泌有机酸，主要是水解糖原产生的乳酸；产生细菌素抑制病原菌等。

黏附是微生物与宿主相互关系的先决条件之一，是定植的第一步，是其发挥生物屏障功能的基础。乳酸菌的黏附是由乳酸菌细胞壁中的脂磷壁酸、细菌表面蛋白等黏附素与宿主细胞表面的受体相结合的过程，并且在黏附的过程中还受到环境因素的影响。乳酸菌黏附后通过形成生物学屏障，或是通过分泌的有机酸或细菌素等起到抑制病原菌，维持机体健康的效果。

阴道的酸性环境有利于乳酸菌发挥自身生物学效应，有利于其生长以及增强其与阴道上皮细胞受体结合的能力，从而增强对阴道上皮细胞的黏附。酸性环境也有利于维持乳酸菌产生细菌素类物质的活性。因此，利用乳酸菌产乳酸酸化阴道环境，恢复阴道微生态系统的生理特征，有利于乳酸菌的生长和发挥微生态调节的机能。

乳酸菌产生多种抑菌物质，如细菌素、细菌素样物质和表面活性物质。细菌素是细菌在伴随着核糖体合成过程中产生的一类分泌到细胞外的小分子蛋白质或多肽代谢物，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可以产生细菌素，对同源以及近源的微生物，甚至对生活在同一个生态环境下其他种类的微生物也具有杀伤作用。一些细菌素如乳酸链球菌素nisinA在酸性环境可发挥更强的杀菌作用。

目前，从人体阴道分离的乳酸菌中，乳酸杆菌所占比例较大，而具有一定黏附作用的乳酸乳球菌则鲜见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌。

本发明提供的菌，其为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)CV56，其保藏号为CGMCC No.4537。

本发明的另一个目的是提供一种生产细菌素的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)CV56CGMCC No.4537，收集发酵产物，即得到细菌素。

所述发酵所用的培养基为优化的MRS液体培养基，按照如下方法配制：将酪蛋白胨10.0克；牛肉膏10.0克；酵母提取物5.0克；葡萄糖20.0克；乙酸钠5.0克；柠檬酸氢二胺2.0克；吐温801.0mL；磷酸氢二钾2.0克；七水硫酸镁0.58克；一水硫酸锰0.25克；加蒸馏水至1.0升，pH6.8。

所述发酵的温度为35℃-37℃，所述发酵的温度具体为35℃、36℃或37℃。

所述发酵时间为12h-16h，所述发酵时间具体为12h、14h或16h。

所述的菌在制备抑菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌具体为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黄色微球菌(Micrococcus flavus)、肺炎链球菌(Streptococcuspenumoniae)、李斯特氏菌(Listeriosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

所述产品为药物或菌剂。

所述的菌在制备治疗阴道感染产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述产品为药物或菌剂。

菌株CV56于2011年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4537，其分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。

本发明的实验证明，本发明分离出一株新的乳酸乳球菌CV56，其可以分泌细菌素抑制阴道内相关病原菌，并且对阴道上皮细胞有一定的黏附作用，有利于其在阴道环境中的定植，并能产生乳酸降低阴道pH值，从而从多方面发挥阴道微生态环境的维护及益生作用。

附图说明

图1为乳酸乳球菌CV56生长曲线

图2为乳酸乳球菌CV56所产细菌素Tricine-SDS-PAGE电泳结果。

图3为乳酸乳球菌CV56所产细菌素质谱鉴定结果

图4为乳酸乳球菌CV56及乳酸乳球菌MG1363对宫颈癌上皮Hela细胞的黏附作用(1000×)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、来源于妇女生殖道产细菌素的益生乳酸菌的分离、筛选及鉴定

一、菌株的分离筛选

1、细菌的分离、纯化

将一次性无菌棉拭子伸入阴道口6cm深处，刮取样本。立即放入装有10mL含0.5％蛋白胨的无菌生理盐水中。充分搅拌，使棉拭子上的样本完全溶解取出棉拭子，盖上试管塞，2h内送实验室分析。将样本进行10倍梯度稀释至10^-6，充分混匀，取不同稀释度各100μL分别接种于改良MRS平板上，涂布均匀，置于37℃，厌氧培养48h。根据菌落形态，挑取不同的单菌落，划线分离于普通MRS平板上，37℃厌氧培养48h。重复上述划线分离步骤，得到260株细菌纯培养物。

2、黄色微球菌抑菌实验

(1)将上述分离的260株菌接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养16h，取发酵液上清液。

(2)含指示菌的平板的制备：用S1固体培养基(胰蛋白胨8g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，Na₂HPO₄ 2g，NaCl 5g，吐温201mL，琼脂粉12g，加蒸馏水至1.0升，pH为自然)平板培养Micrococcus flavusNCIB 8166菌株，挑取一环菌体于生理盐水中，悬浮混匀，取0.5mL悬浮液加入融化的20mL固体琼脂培养基中混匀，倒入Ф90mm的培养皿中，平放。

(3)抑菌活性的测定：用直径7mm的打孔器在含目标菌的平板上打孔，每孔加入30μl各菌株的发酵液上清液，30℃培养16h，观察抑菌圈，抑菌圈直径大于10mm认为有抑菌活性。

结果为第56号菌株有明显的抑菌活性，抑菌圈直径为16mm，将第56号菌株命名为CV56。

3、分离株镜检

将分离得到的CV56菌株取多菌落涂片，经革兰氏染色后，在油镜下检查。

结果为革兰氏阳性菌。

4、触酶反应

将上述分离的CV56菌株进行触酶反应。触酶即过氧化氢酶，能催化H₂O₂分解为水和氧气。取一环纯培养的细菌，涂于干净的玻璃板上，然后在其上滴加一滴3％的H₂O₂，如果有气泡产生则为阳性反应，否则为阴性。

结果为阴性。

5、乳酸测定

(1)发酵液样品预处理

培养上述分离的CV56菌株，得到发酵液，取适量发酵液样品5000r/min离心10min，以除去菌体和碳酸钙沉淀，取上清液适当稀释，吸取稀释液2mL于洁净离心管中，加入2mL钨酸溶液，混匀，室温(25℃)静置，直至溶液中出现明显絮状物，10000r/min离心10min，取上清液置于10mL洁净离心管中，60℃水浴保温30mi n左右，冷却待用，即为待测液。

(2)吸光度测定

精确吸取5mL上述(1)得到的待测液于10mLEP管中，加入0.05g氢氧化钙，混匀，然后加入0.8mL 20％(质量百分含量)硫酸铜水溶液，迅速混匀，沸水浴3min，水浴冷却，3000r/min离心5min，取上清液0.5mL入10mLEP管中；加入6mL浓硫酸，混匀，沸水浴加热5min，取出后冰水浴冷却；加入1.5％对羟基联苯溶液0.125mL，充分混匀，静置15min；置于沸水浴中加热5min，冰水浴冷却，以蒸馏水为参比液，在565nm处测吸收。

(3)标准曲线的制作

0.5mg/mL乳酸标准液(精确称取无水乳酸锂53.25mg，溶于50mL蒸馏水中，加0.5mol/L硫酸10mL，后加蒸馏水定容至100mL)与发酵液同样预处理后，取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mL处理液，分别加进8支预先编号的试管，再用蒸馏水补足体积至5mL，按上述步骤操作，分别测定吸光度。以乳酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到标准曲线。

结果为CV56菌株产乳酸10.3mg/mL。

二、菌株的鉴定

1、CV56的生理生化鉴定

1)油镜和肉眼观察CV56的个体形态、菌落形态、革兰氏染色、孢子的形成。

2)CV56的运动性：用直针穿刺接种CV56菌于半固体MRS培养基内，置于37℃恒温箱中培养18～24h。如培养物透过光目测只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。如培养物生长由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘模糊呈云雾状，表示试验菌有运动性。

溶血性实验：将CV56菌接种于羊血平板上，用接种针在已接种过的血平板上扎2～3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35℃孵育过夜。观察结果：在接种针穿刺过处，羊红细胞完全溶解，形成无色透明区，为β溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为α溶血。不溶解无溶血环为γ溶血。

3)过氧化氢酶的活性(方法同上述的触酶反应)。

4)精氨酸脱羧酶实验：将CV56菌种分别接种到添加L-精氨酸的培养基试管和未加氨基酸的空白对照培养基试管中，37℃恒温箱中培养18～24h，培养基呈紫色者为氨基酸脱羧酶试验阳性；培养基呈黄色者为该项试验阴性。

5)葡萄糖产气：在液体MRS培养基内添加6g/L的琼脂做成软琼脂柱。分装试管，高度4-5厘米。为便于观察产酸情况，在培养基内加入1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL指示剂。用较大量的新鲜活力强的CV56菌种进行穿刺接种，置于37℃恒温箱中培养18～24h，培养基中指示剂变黄表示产酸，软琼脂柱内产生气泡表示产气。

6)产过氧化氢：将CV56菌接种在含有0.25mg/mL四甲基联苯胺及0.01mg/mL辣根过氧化物酶的MRS固体培养基上，置于37℃恒温箱中培养18～24h，待长出菌落后，将培养基置于空气中暴露30分钟，菌落由白色变为蓝色表明有过氧化氢产生，完全不变色为阴性。

7)温度敏感性：将CV56菌液在60℃培养30分钟，与未处理的对照组同时稀释成适当浓度，吸1mL加到融化温度达50度的15mL的MRS琼脂培养中混匀使其凝固，置37℃孵育18～24h，取出进行菌落计数，每个平板菌落数乘稀释倍数得到每mL中细菌数量。

8)葡萄糖降解产物(方法与上述乳酸测定相同)。

9)在不同培养条件的生长状况：在温度为10℃、40℃、45℃下分别培养，在MRS液体培养基、含有4％NaCl的MRS液体培养基、含有6.5％NaCl的MRS液体培养基中分别培养，在pH值为9.2的MRS液体培养基中培养。

以上1)-9)的检测结果具体见表1所示：

表1为CV56形态与生理学特性

2.菌基因组DNA的提取及16S rDNA序列的测定比对

(1)取处于对数生长期的CV56菌液，5000r/min离心10min。用TE洗涤后，再离心，菌体重悬于TE溶液。加入50mg/mL溶菌酶溶液，37℃保温30min。加入RNase(10mg/mL)和10％SDS溶液，37℃保温1h。加入蛋白酶K(20mg/mL)，然后55℃保温1.5h。加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10000r/min，离心5min，2～3次。将上清液中加入醋酸钠和预冷的无水乙醇，12000r/min离心5min，管底出现DNA沉淀。加入TE溶解DNA，-20℃保存。基因组DNA的纯度检测及浓度测定配制0.8％琼脂糖凝胶，用1×TAE作为电泳缓冲液。以1kb plus DNA ladder(分子量为：300、500、800、1500、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10000bp)为分子量标准，80V电压(5V/cm)恒压电泳。分光光度计测定基因组DNA的纯度和浓度。

(2)根据不同种属的细菌的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物：

引物1(fD1primer)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

引物2(rP1primer)：ACGGTTACCTTGTTACGACTT

引物1共20bp碱基，G+C含量为50.00％。

引物2共21bp碱基，G+C含量为42.86％。

(3)PCR反应条件

PCR 50μl反应体系：30μl ddH2O，5μl 10×PCR反应缓冲液，4μl四种dNTP，3μl MgCl₂，1μl上游引物(引物1)，1μl下游引物(引物2)，4μl模板DNA，1μlTaqTM DNA聚合酶。PCR反应步骤：①94℃热启动变性5min。②94℃变性30s。③57℃退火40s。④72℃延伸90s。⑤重复步骤3、4、5、29次。⑥72℃延伸10min，使扩增产物完整。

(4)16S rDNA序列的测定

将PCR反应扩增出的16S rDNA片段送至上海生工生物技术公司，先进行PCR产物的纯化后再进行测序。结果为该PCR产物具有序列表中的序列1所示的核苷酸序列，序列1全长为1407bp。

(5)16S rDNA序列的比对，确定菌的种属使用NCBI网站对CV56菌的16S rDNA序列与数据库中各种菌的16S rDNA序列进行比对。登陆NCBI网站(美国国立生物技术中心网站)，使用BLASTN在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性搜索。

结果为，CV56菌与Lactococcus lactis subsp.lactis strain IMAU 10068之间16S rDNA序列相似性为99％，说明CV56为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lac tococcus lactissubsp.lactis)。

菌株CV56于2011年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4537，其分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lac tococcus lactis subsp.lactis)。

3、生长曲线测定

(1)种子液制备

取斜面乳酸乳球菌乳酸亚种(Lac tococcus lactis subsp.lactis)CV56CGMCCNo.45371支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入MRS培养液中，静止培养18h作种子培养液。

(2)标记编号

取盛有50mL无菌MRS培养液的250mL三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。

(3)接种培养

用2mL无菌吸管分别准确吸取2mL种子液加入已编号的11个三角瓶中，于37℃下静止培养。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。

(4)生长量测定

将未接种的MRS培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10-0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

(5)结果

以时间为横坐标，同时间点的菌液光密度值OD₆₀₀值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。结果如图1所示，0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h的OD₆₀₀值分别为0.08、0.0821、0.3229、0.5681、0.957、1.081、1.161、1.125、1.1098、1.1108、1.113。

实施例2、菌株的应用

一、细菌素的获得及鉴定

1.细菌素的获得

方法一：

将乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)CV56CGMCCNo.4537在500mL优化的MRS液体培养基(其配方为酪蛋白胨10.0克；牛肉膏10.0克；酵母提取液5.0克；葡萄糖20.0克；乙酸钠5.0克；柠檬酸氢二胺2.0克；吐温801.0mL；磷酸氢二钾2.0克；七水硫酸镁0.58克；一水硫酸锰0.25克；加蒸馏水至1.0升，pH6.8)中37℃培养16h，得到发酵液。

方法二：

与方法一基本相同，不同的是，发酵温度为35℃，发酵时间为12h。

方法三：

与方法一基本相同，不同的是，发酵温度为36℃，发酵时间为14h。

吸附解析法：将方法一得到的发酵液在70℃，25min将菌体灭活后调至最适吸附pH6.5，30℃摇床震荡2h，离心收集细胞，用与吸附pH值相同的磷酸钠缓冲液洗细胞1～2次，重悬于20mL的NaCl(0.1mol/L)溶液中，用5％(体积百分含量)的磷酸凋至最佳解吸pH值2.0，4℃磁力搅拌12h，8000rpm/min，离心20min，上清液即为细菌素提取物。将用吸附解析法制备的细菌素装入2000D的透析袋中，4℃下去离子水透析过夜并冻干。

将干燥物复溶于0.5mL灭菌去离子水中。将所得制备物以C18柱(大连依利特分析仪器有限公司，SinoChrom ODS-BP 5μm)为固定相，乙腈/水(5％-50％乙腈线性递增)为流动相，经反相HPLC纯化，收集保留时间为25-29分钟的峰、洗脱流速为1mL/min，洗脱总时间为40min)，得到纯化产物。

2.Tricine-SDS-PAGE初步确定细菌素分子量及纯度

将上述纯化产物(S)和超低分子量标准蛋白(M，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，B023)在30V电泳1h，提高电压到100V电泳约4h，待溴酚兰接近胶边缘时，结束电泳，结果如图2所示，得到3.3KD的蛋白。

3.质谱鉴定细菌素分子量

将上述1得到的纯化产物经MALDI-TOF质谱仪测定，结果如图3所示，该纯化产物的分子量为3372Da，这与上述电泳结果基本一致。

4.细菌素氨基酸序列测定

将纯化产物经Edman降解及质谱测序，解析出其氨基酸序列，结果为序列表中的序列2所示。

与GenBank上的编号为AAA25189.1的nisin A蛋白第24-57位氨基酸一致，该纯化产物为细菌素nisin A。

二、菌株发酵液抑菌谱测定

(1)含指示菌的平板的制备：分别接种革兰氏阳性菌：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis CGMCC 1.2429)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusCGMCC 1.2155)、黄色微球菌(Micrococcus flavus NCIB 8166)、肺炎链球菌(Streptococcus penumoniae CGMCC 1.1692)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenesCICC 21536)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC 1.1087)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis CGMCC 1.130)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichia Coli CMCC44104)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae CGMCC No.1.1869)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis CGMCC No.1.1859)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium CGMCC1.1174)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CGMCC 1.860)、真菌：白色念珠菌(Candida albicans CGMCC 2.2086)，以上菌株均能从上述各保藏中心购得。

其中表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis CGMCC 1.2429)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CGMCC 1.2155)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae CGMCCNo.1.1869)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis CGMCC No.1.1859)在37℃，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CGMCC 1.860)在30℃用营养肉汁培养基培养。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium CGMCC 1.1174)在37℃用BPY培养基培养。肺炎链球菌(Streptococcuspenumo niae CGMCC 1.1692)在37℃用Penessay培养基培养。李斯特氏菌(Listeriosis CICC 21536)在30℃用TSA-YE培养基培养。大肠杆菌(Escherichia Coli CMCC44104)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC 1.1087)在37℃用LB培养基培养。白色念珠菌(Candida albicans CGMCC 2.2086)在37℃用沙堡培养基培养。

营养肉汁培养基：蛋白胨10克，牛肉膏3克，NaCl 5克，加蒸馏水至一升。pH7.0。

BPY培养基：牛肉膏1.5克，蛋白胨10克，酵母提取物5克，葡萄糖5克，NaCl 5克，加蒸馏水至一升，pH7.0。

Penessay培养基：牛肉膏1.5克，酵母提取物1.5克，胰蛋白胨5克，葡萄糖1克，NaCl 3.5克，磷酸氢二钾4.8克，磷酸二氢钾1.32克，加蒸馏水至一升，pH7.2。

TSA-YE培养基：胰蛋白胨17克，酪蛋白胨3克，酵母膏6克，NaCl 5克，磷酸氢二钾2.5克，葡萄糖2.5克，加蒸馏水至一升，pH7.2。

LB培养基：胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl 10克，加蒸馏水至一升，pH7.0。

沙堡培养基：蛋白胨10克，葡萄糖40克，加蒸馏水至一升，pH7.0。

分别挑取一环菌体于生理盐水中，悬浮混匀，取0.5mL悬浮液加入融化的20mL加入固体琼脂的上述各种液体培养基中混匀，倒入Ф90mm的培养皿中，平放；得到含目标菌的平板。

(3)抑菌活性的测定：用直径7mm的打孔器在上述含目标菌的平板上打孔，每孔加入30μl上述一方法一得到的发酵液，30℃培养16h，观察抑菌圈，抑菌圈直径大于10mm认为有抑菌活性。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表2所示：

表2为乳酸乳球菌CV56所产细菌素的抑菌谱

抑菌实验使用菌株	结果	抑菌圈大小(cm)
			革兰氏阳性菌
表皮葡萄球菌	+	11.2
			金黄色葡萄球菌	+	10.8
黄色微球菌	+	15.9
			肺炎链球菌	+	11.5
李斯特氏菌	+	11.7
			枯草芽孢杆菌	+	12.1
粪肠球菌	+	10.4
			革兰氏阴性菌
大肠杆菌	-	0
			痢疾志贺氏菌	-	0
猪霍乱沙门氏菌	-	0
			鼠伤寒沙门氏菌	-	0
铜绿假单胞菌	-	0
			白色念珠菌	-	0

+有抑菌活性

-无抑菌活性

采用同样的方法检测方法二和方法三得到的发酵液，结果与方法一无显著差异。

三、黏附测定

(1)Hela细胞的复苏

HeLa细胞源自妇女的子宫颈癌细胞，被人类乳突状瘤病毒转型成癌细胞，它具有阴道上皮细胞的特征，增殖迅速，常用作阴道上皮细胞的替代细胞用于体外研究。从液氮中取出冻存Hela细胞(北京康为世纪生物科技有限公司，CW2038)的细胞的冻存管，迅速放入盛有37℃温水的保温杯后在细胞操作室中将冻存的细胞接种到盛有37℃预温的含10％小牛血清(北京百灵克生物科技有限责任公司，16010-159)，10U/mL的青霉素及10微克/mL的链霉素(北京百灵克生物科技有限责任公司，0339-5g，0382-5g)的DMEM细胞培养液(北京百灵克生物科技有限责任公司，12100-046)中，置于37℃含5％CO₂培养箱中培养。每隔天更换细胞培养液一次。

(2)转接Hela细胞

待Hela细胞长满细胞培养瓶后，用1mL0.25％胰蛋白酶溶液(0.25克胰蛋白酶溶解到100mLPBS磷酸缓冲液(NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g)，加蒸馏水至容积为1升，pH 7.4)中)消化2min，轻轻捶打使细胞脱离培养瓶，用5mLDMEM细胞培养液洗涤细胞，吸管吹打均匀。取六孔细胞培养板，每孔加入一个无菌盖玻片以及1mLDMEM细胞培养液，然后向每孔加入1mL上述细胞悬浮液。将细胞培养板用胶带粘住两边后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(3)黏附用细胞的前处理

待细胞培养板中盖玻片上的Hela细胞长满80％时，换用无青霉素及链霉素的DMEM细胞培养液培养24h。黏附实验前，用PBS洗涤细胞三次。

(4)黏附用乳酸菌的制备

乳酸乳球菌乳酸亚种(Lac tococcus lactis subsp.lac tis)CV56CGMCC No.4537及乳酸乳球菌乳脂亚种(Lac tococcus lactis subsp.cremoris)MG1363CGMCC No.1.9重悬于PBS磷酸缓冲液中并用磷酸缓冲液洗涤三次(8000rpm，10分钟/次)。用无小牛血清的DMEM细胞培养液悬浮菌体并调整细菌浓度为5×10⁵个/mL，分别得到两种乳酸菌悬浮液。

(5)黏附

在细胞培养板中按每孔加入1mL无青霉素及链霉素和小牛血清的DMEM细胞培养液，分别和1mL乳酸菌悬浮液。轻柔晃动细胞培养板，使乳酸杆菌分散均匀。胞培养板用胶带粘住两边后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2.5h。

(6)黏附附效果观察

从细胞培养板中取出盖玻片，用冷PBS洗涤三遍，置于室温(25℃)下自然干燥，甲醇固定10分钟，革兰氏染色，油镜下观察细菌在Hela细胞上的黏附情况。

结果如图4所示，可以看出乳酸乳球菌CV56(L.lactis CV56)对Hela细胞有一定的黏附作用，而乳酸乳球菌MG1363(L.lactis MG1363)几乎没有黏附作用。

Claims (10)

1.乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)CV56，其保藏号为CGMCC No.4537。

2.一种生产细菌素的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)CV56CGMCC No.4537，收集发酵产物，即得到细菌素。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述发酵的温度为35℃-37℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述发酵的温度为35℃、36℃或37℃。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述发酵时间为12h-16h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述发酵时间为12h、14h或16h。

7.权利要求1所述的菌在制备抑菌产品中的应用；

所述抑菌体现在抑制革兰氏阳性菌，所述革兰氏阳性菌为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、黄色微球菌(Micrococcus flavus)、肺炎链球菌(Streptococcus penumoniae)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述产品为药物或菌剂。

9.权利要求1所述的菌在制备治疗阴道感染产品中的应用；

所述阴道感染为革兰氏阳性菌引起的，所述革兰氏阳性菌为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、黄色微球菌(Micrococcus flavus)、肺炎链球菌(Streptococcus penumoniae)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述产品为药物或菌剂。

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