KR20080008393A

KR20080008393A - 신규 고초균주 및 혈전증 치료용 약물의 제조에 있어서의그 용도

Info

Publication number: KR20080008393A
Application number: KR1020077028140A
Authority: KR
Inventors: 준 첸; 기 웨이; 페이 지앙; 즈홍그롱 리우; 야나 라이; 준롱 헤; 보강 리
Original assignee: 청두 디아오 지우 홍 파마슈티칼 팩토리
Priority date: 2005-04-30
Filing date: 2006-04-30
Publication date: 2008-01-23
Also published as: CN101316608B; WO2006116949A8; US20080193973A1; EP1927365A4; KR100978648B1; CN101316608A; CN1857722A; EP1927365A1; WO2006116949A1; KR20100049699A

Abstract

본 발명은 신규 고초균주 및 혈전증 치료용 의약물의 제조에 있어서의 그 용도를 제공한다. 본 발명은 특히, 혈전증 치료용 의약물 제조시 고초균에 의하여 생산되는 피브린 용해 효소의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 피브린 용해 효소 (나토키나아제)를 생산하는 방법을 개시한다. 대량 산업적 생산에 적절하도록 본 발명의 신규 고초균주를 사용하여 나토키나아제를 제조하는 것은 효율적이고 비용 효과가 높다.

고초균주, 혈전증, 피브린 용해소, 나토키나아제

Description

신규 고초균주 및 혈전증 치료용 약물의 제조에 있어서의 그 용도{A NEW BACILLUS SUBTILIS STRAIN AND ITS USE IN PREPARING MEDICINE FOR TREATING THROMBOSIS}

본 발명은 신규 고초균 ( Bacillus subtilis )주 및 혈전증 치료용 약물을 제조함에 있어서의 그 용도, 특히 혈전증 치료용 약물 제조시 고초균에 의하여 생산되는 피브린 용해소 (fibrinolysin)의 용도에 관한 것이다. 대체적으로, 본 발명은 생물학적 의약물 분야에 속한다.

혈전증은 사람의 건강을 위험하게 하는 주요한 질병 중의 하나이다. 예컨대, 뇌혈전증과 급성 심근경색증으로 인한 사망률이 40 %를 초과하여, 혈전증은 사망률이 가장 높은 질병이 되었다. 혈전 용해는 이러한 질병을 치료하는 중요한 방법이다. 그러나, 스트렙토키나아제 (SK), 우로키나아제 (UK) 및 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제 (rt-PA)와 같은, 임상 시험 관리 기준에 따라 혈전증을 치료하는데 현재 사용되는 혈전 용해 약은 모두 독성이 강하고, 부작용이 심각하며, 생체 내에서의 반감기가 짧고, 고가인 점 등의 결점을 가진다.

나토키나아제 (NK)는 나토라 불리는 전통 일본 음식으로부터 추출한 세린 단백질 분해 효소의 일종이다. 이 플라스민은 275개의 아미노산으로 이루어진 것으로 독성 및 부작용이 없다. 이의 상대적인 분자량은 27,728로, 우로키나아제의 분자량에 비하여 휠씬 작다. 그러므로, 약으로서 신체에 흡수되기가 용이하다. 등전 초법 전기 영동(isoelectric focusing electrophoresis)의 수치는 8.6±0.3으로서 pH 6.0 내지 12.0의 조건 하에서 안정하지만 pH 값이 5.0보다 낮을 때 불안정해질 것이다. 인간 생체 실험은 나토키나아제가 혈전 용해에 직접적인 영향을 줄 뿐 아니라 플라스미노겐 및 프로-우로키나아제를 활성화시켜 혈전을 각각 피브린 용해소 및 우로키나아제 내로 용해시킬 수 있다는 것을 보여준다. 동시에, 우리는 또한 나토키나아제가 혈장 내에서 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA)의 생산을 활성화시켜 혈전 용해에 간접적인 활성을 부여할 수 있다는 것을 알게 되었다. NK가 빠르고 지속적인 치료 효과를 보인다는 것이 시험으로 입증된다.

나토키나아제의 조제물의 경구 투여 및 피브린 용해능 시험은 의약물을 섭취한 지 4시간 후 용해능이 최대치에 도달한다는 것을 보여주었다. 그런 후에 용해능은 감소되기 시작하였고, 8시간 경과될 때까지 일정 용해능이 유지되었다. 한편, 내부의 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA)의 양도 증대되는 것으로 드러났는데, 이것은 그 자신의 피브린 용해능 이외에, 나토키나아제가 또한 창자를 통하여 혈관으로 흡수된 후에 혈액 내피 세포의 활성화에 의하여 내인성 피브린 용해능이 증대되어 t-PA를 생산하게 된다는 것을 보이는 것이었다. 또한, 나토키나아제는 인간의 신체 내에서 피브리노겐 대신 가교 피브린을 직접적으로 파괴하고, 그 피브리노겐 가수분해의 활성이 플라스민 및 우로키나아제의 것에 비하여 훨씬 낮으며 대체로 t-PA의 것과는 동일하게 되는데, 이것은 나토키나아제가 피브린 용해능을 보일 때 출혈에 대한 저항성인 것을 나타낸다.

기존의 연구 작업은 나토로부터 분리되는 나토키나아제를 생산하는 박테리아가 주로 고초균이라는 것을 보여준다. 예컨대, 중국 특허 (CN 02116667.6)는 나토키나아제를 생산하는 고초균주가 각각 액체 발효의 조건 하에서 밀리그램당 200 UK 유닛의 가장 높은 효소 활성을 보이고, 고체 발효 조건 하에서 밀리그램당 20 UK 유닛의 효소 활성을 보이는 것을 개시하였다. 또 하나의 중국 특허 (CN 00107589.6)는 또한 나토키나아제를 생산하는 고초균주를 개시하였다. 또한 몇 문헌들은 고초균주가 교반 베드 조건 하에서 970 IU/ml의 나토키나아제 활성을 보이고, 발효조 내의 최적화된 조건에서, 활성이 1314 IU/ml까지 증가되었던 것을 보고한 Mei Lehe 등과 같이 고초균 나토( Bacillus subtilis natto )의 선별 및 발효 조건의 최적화를 보고하였다 (Mei Lehe, Hu Sheng, Xu Jing, et al. Screening of Bacillus subtilis natto and optimization of nattokinase fermentation. Journal of Zhejiang University (Engineering Science). 2004, 38(10): 1355-1360.).

또한, Xiong Xiaohui 등은 5 리터 발효조 내의 상청액 중에서 나토키나아제 2250 IU/ml를 수득한 것은 최적의 조건에서 고초균 나토에 의한 액체 발효를 이용하여 얻은 결과라고 보고하였다 (Xiong Xiaohui, Liang Jianguang, Xiong Qiang. Optimization of Nattokinase Production Using Liquid Fermentation . Food and Fermentation Industries. 2004, 30(1): 62-66.). 또한, Xie Qiuling 등은 나토로부터 1종의 박테리아 균주를 분리시켰고, 이 균주는 발효 4일째에 밀리리터당 787.1 우로키나아제 유닛이라는 가장 높은 효소 활성을 보였다 (Xie Qiuling, Guo Yong. The optimization of fermetation conditions of nattokinase . Journal of South China University of Technology (Natural Science). 1999, 27(5): 127-131.). Bao Yianxia 등은 나토키나아제를 생산하는 고체 발효 방법을 제시하였는데, 이는 콩 앙금과 밀 겨로 이루어진 배지 및 초기 함습도가 65 %이고, 초기 pH 값이 8.0이며, 온도가 35 ℃인 배양 조건 하에서 균주를 키울 때, 나토키나아제 활성이 1577 U/g까지 올라가도록 한다 (Bao Yanxia, Chen Jun, Qian Zhiyu, et al. Optimization of the technique of solid Fermentation of Nattokinase . Journal of Shenyang Pharmaceutical University. 2004, 21(6): 468-471.). Li Limin 등은 나토키나아제 분리 및 정제 방법, 즉 CaCl₂ 및Na₂CO₃의 첨가의 전처리, 원심 분리, 한외 여과, 응축 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 상당히 정제된 아포치마아제(apozymase)를 얻었고, 이는 SDS-PAGE 상의 단일 밴드를 보였다고 보고하였다 (Li Limin, Hui Hongwen, Wang Mingfang. Study on purification of nattokinase from the B. natto fermented broth [ liquor ]. Journal of Inner Mongolia Agricultural University. 2003, 24(4): 51-54.).

Lu Ying 등은 나토로부터 추출한 나토키나아제를 암모늄 술페이트 분획 침전，소수성 상호작용 칼럼 및 이온 교환 칼럼으로 정제하는 방법을 설명하였다．효소 단백질은 SDS-PAGE에 의한 분자량이 28 KD인 단일의 균질 성분인 것으로 보였다 (Lu Ying, Zhang Lu, Feng Lei, et al. Purification and Characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis . Food and Fermentation Industries. 2004, 30(3): 122-124.). Bai Zhen 등은 생리적 식염수를 이용하여 나토로부터 나토키나아제 (NK)를 추출한 후 이를 (NH₄)₂SO₄ 분획 침전, 친화 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과로 분리시키고, 정제된 NK는 SDS-PAGE 상에 단일의 날카로운 밴드를 보인다고 지적하였다 (Bai Zhen, Xu Mei, Han Siqin, et al. Purification and characterization of Nattokinase . Journal of Northeast Agricultural University. 2004, 35(6): 667-673.).

고초균 효소의 수율은 일반적으로 종래의 기술에 의할 때 높지 않고, 지금까지 시장에서 그로부터 제조된 효과적인 경구 약에 관한 보고는 없다.

본 발명의 요약

본 발명의 하나의 목적은 혈전증 치료용 약물의 제조에 있어서 신규 고초균주를 사용하도록 하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 혈전증 치료용 플라스미노키나아제, 특히 신규 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 혈전증 치료용 약물의 제조에 있어 신규 고초균주 및 혈전증 치료용 약물을 제조하는데 있어서 신규 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소(즉 나토키나아제)의 용도를 제공한다.

본 발명자들은 상업적으로 입수가능한 나토로부터, 바실루스 속(Bacillus sp.) 균주 1507를 분리하였는데, 이것의 효소 생산력은 502 IU/ml이었고, 발효 조건이 최적화되었을 때에는 753 IU/ml까지 증가할 수 있으나, 아직은 산업적 생산용 수치를 보이지는 못했다. 돌연변이 육종에 의한 신규 바실루스 속 균주 1507를 얻었고, 그 외관과 생리적 및 생화학적 특성은 다음과 같다:

시험 항목	결과	시험 항목	결과
그람 염색	＋	α-D-락토오스	＋/－
세포 형태	막대 형태	말토비오스	＋
세포 직경 >1.0㎛	＋	D-만니톨	－
내생포자의 형성	＋	D-멜리지토오스	－
포자 형성	서브폴라 (subpolar)	D-멜리비오스	－/＋
휴면포자낭 팽창 (Sporangiocyst intumescence)	－	β-메틸-D-글루코시드	－
무성아 구형	타원 형태	D-알루로오스	－
반포자체 (parasporal crystal)	－	D-멜리트리오스	－
카탈라아제	＋	살리신	＋/－
산화 효소	－	D-소르보오스	－
녹말가수분해	＋	수크로오스	＋
젤라틴 액화	＋	D-트레할로오스	＋
D-글루코오스	＋	자일리톨	－
D-크실로오스	－	아세트산	＋
L-아라비노오스	－	α-하이드록시부틸산	－
D-만노오스	＋	β-하이드록시부틸산	－
만난	＋	피루브산-메틸	＋
트윈 80	－	숙시네이트-메틸	－
D- 아라비톨	－	프로판산	－
D-셀로비오스	－	파이로라세미산	＋
D-프락토오스	＋	호박산	－
푸코오스	－	L-알라닌	－
구연산염	＋	글리세롤	＋
질산염 환원	＋	가수분해 카세이노겐	＋
D-갈락토오스	－/＋	우리딘	＋
겐티오비오스	－	m-이노시톨	－

고초균에 의한 나토키나아제와 관련된 종래의 문헌에 많은 종류의 발효 기술이 보고되어 왔지만, 공지된 균주의 대부분은 효소를 생산하는 능력이 낮다. 반면에, 기타의 문헌들은 효소를 생산하는 능력이 높은 고초균으로부터 발효 생성물을 설명하고 있지만, 측정 조건의 불확실성 때문에 이들 공지된 효소들의 능력을 평가하기 어렵다. 본 발명의 고초균주는 30 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 속도가 180 내지 220rpm인 교반 베드로 발효시켰고, 효소 생산의 최대치는 그 다음날 효소 활성 1600 IU/ml로 얻었으며, 이는 최적화된 조건 하에서 1697 IU/ml까지 증가될 수 있다. 건조시킨 정제전 생성물의 효소 활성은 10 kg을 공급한 고체 발효에서 5000-10000 IU/g에 도달할 것이다. 효소 활성 생산은 생산 규모를 크게 한 후에 크게 증가될 것으로 생각된다. 그러므로, 이것은 산업적 응용 가치가 높다. 따라서, 우리는 고초균주 (번호 디아오 1502)가 종래의 문헌에서 보고된 나토키나아제는 생산하는 어떠한 고초균과 비교하여도 차별성이 있는, 새로이 개발된 것이라고 생각한다.

초기 문서를 보면, 본 발명의 균주는 바실루스 세레우스 ( Bacillus cereus )로 확인되었고, 이는 그 형태와 생리학적 및 생화학적 특성에 따라 CCTCC (China Center for Type Culture Collection (기탁 번호 CCTCC M204092)에 기탁되었다. DNA 서열화는 그후에 CCTCC에서 수행되었고 그 결과는 다음과 같다 (16S rRNA 서열):

CTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGC

그러므로, 본 발명의 균주는 마침내 고초균으로 동정되었고 고초균 디아오 1502으로 칭하여졌다.

본 발명에 의하여 제공되는, 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소, 나토키나아제는 다음과 같은 HPLC 분광 사진의 특성을 보인다.

HPLC 검출 조건:

크로마토그래피 칼럼: Waters Protein-Pak™ 60 7.8×300 mm

이동상: 0.2 mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH (95:5)

유량: 1 ml/분

검출 파장: 220 nm

나토키나아제 생산의 최대 농도는 7 내지 9 분에 나타난다.

본 발명에 의하여 제공되는, 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소, 나토키나아제는 다음과 같은 SDS-PAGE 전기 영동도 (electrophorogram)를 보인다.

Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV C, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 의하면, 나토키나아제는 SDS-PAGE의 28 KD 내지 14.4 KD에 다중 단백질 밴드를 보였고, 이중 A, B, C 및 D 밴드가 가장 선명하다. 자세한 내용은 도 3의 Ⅰ 참조.

본 발명에 의하여 제공되는, 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소, 나토키나아제는 다음과 같은 등전 초법 전기 영동의 전기 영동도를 보인다.

나토키나아제의 등전 초법 전기 영동은 Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV D, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 따라 수행될 것이다. 자세한 내용은 도 4의 Ⅰ 참조.

본 발명의 나토키나아제는 다음의 방법에 의하여 제조된다.

a). 발효용 균주 종자액으로서 고초균 디아오 1502（CCTCC 번호 M204092）배양;

b). a) 단계에서 얻은 균주 종자액을 액상 발효 또는 고상 발효로 발효시켜 나토키나아제를 얻는다.

여기서, 액상 발효 과정은 다음과 같다.

균주 종자액을 발효 배지 내에 접종하여 5 % 내지 20 % (v/v, 배지의 부피는 벤치마크로서 취한다)가 되도록 하고, 교반 플라스크 내에서 24 내지 72 시간 동안 30 내지 40 ℃ 및 회전 속도 180 내지 220 rpm으로 배양하며, 원심 분리 후, 여과 막을 순차적으로 사용하여 상청액으로부터 나토키나아제를 분리하고 건조시킨다.

액상 발효 배지는 탄소원 5 내지 35 g/L, 질소원 5 내지 45 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 0.5 내지 3 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.5 내지 4 g/L, CaCl₂ 0.05 내지 1 g/L 및 MgSO₄·7H₂O 0.05 내지 1.5 g/L를 함유하고, pH 7.5±1.0 및 121 ℃에서 20분간 멸균시킬 것이다.

여기서, 탄소원 (수크로오스)은 글루코오스, 글리세롤, 수용성 녹말 및 당밀에 의하여 대체될 수 있고, 질소원 (콩 펩톤)은 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물, 소고기 추출물, 펩톤 (식물성 단백질 또는 동물성 단백질) 및 두유에 의하여 대체될 수 있다.

마그네슘 스테아레이트, β-사르딩거 덱스트린, 젤라틴, 분리 콩 단백질 및 덱스트린과 같은 하나 또는 몇몇의 보조제는 전술한 분무 건조 과정에서 20 % 내지 40 %（W/V)로 첨가되어야 한다.

전술한 고상 발효:

콩 앙금 영양 배지 (중량비: 20 내지 120 ml/1000 g)를 100 ℃에서 가열하여서 영양 배지를 얻은 후, 미리 제조한 균주 종자액을 접종 부피 5 % 내지 20 % (V/W)로 냉각 발효 배지에 접종하고, 30 내지 45 ℃ 및 습도 ≥ 80 %로 12 내지 56 시간 동안 배양하였다. 마침내, 건조시켜 나토키나아제를 생산하였다.

여기서, 고상 발효 배지는 pH 7.5±1.0에서 글리세롤 50 내지 300 g/L, 펩톤 50 내지 300 g/L, 소고기 추출물 50 내지 100 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 5 내지 20 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 5 내지 20 g/L , CaCl₂ 0.5 내지 10 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5 내지 10 g/L를 함유한다.

또한, 본 발명은 나토키나아제를 제조하는 방법을 제공한다.

a. 균주 종자액의 제조 방법

분해 피브린 작용으로 본 발명의 균주를 발효 식품으로부터 분리시켰다. 고초균 디아오 1502로서 CCTCC에 의하여 확인되고 동정된 균주를 CCTCC에 기탁하였다 (기탁 번호 CCTCC M204092).

실시 종자 로트(lot)의 개방 균주를 몇몇 영양 한천 (NA) 배지 플레이트에서 배양한 후, NA 시료 튜브의 경사면에서 유지시켰다. 종자 세포의 형태, 순도 및 생산력을 확인한 후에 이들을 생산을 위한 질적 측면에서 판단할 것이고, (즉, NA 시험 튜브의 경사면에서 소수의 도말 배양을 취하고, 그람 염색 후 현미경으로 관찰한다. 형태학상 균일하고 기타의 미생물 오염이 없는 모든 균주 종자는 보증된 종자로서 선택될 수 있다. 생산력 시험의 목적은 실험실 규모에 있어서 발효에 의한 균주의 생산력을 확인하는 것으로서, 즉, 배지의 효소 활동도는 밀리리터당 액체 배지로 얻어진다. 생산력이 1000 IU/ml를 초과하는 모든 균주 종자는 보증된 종자로서 선택되었다.) 그런 후에, 이들을 30 내지 40 ℃ 및 회전 속도 180 내지 220 rmp으로 8 내지 24 시간 동안 교반 배양하도록 NB 배지에 두어 제1 클래스 종자를 얻고, 그런 후에 NB 배지 (영양 배양액)에 5 % 내지 10 %의 접종량으로 접종하고, 30 내지 40 ℃ 및 180 내지 220 rpm으로 8 내지 24 시간 동안 교반 배양하여 제2 클래스 종자 또는 발효에 사용하는 균주 종자액을 얻는다.

b. 발효

설명한 발효는 액상 발효 또는 고상 발효일 수 있다.

본 발명에서 설명하는 배양 배지는 교반 배양을 위한 영양 배양액 (NB)의 영양 배지, 플랫 플레이트 및 경사면을 위한 영양 배지 영양 한천 (NA), 단기간 균주의 보존을 위하여 0.5 % 한천을 함유하는 영양 배양액 (NB)의 영양 배지를 포함한다.

여기서, NB 영양 배지는 펩톤 10 g/L, 소고기 추출물 5 g/L 및 염화나트륨 5 g/L으로 이루어지는데, 이것은 121 ℃ 및 pH 7.1±0.2에서 20분간 멸균될 것이다.

여기서, NA 영양 배지는 펩톤 10 g/L, 소고기 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L 및 한천 13 g/L으로 이루어지는데, 이것은 121 ℃ 및 pH 7.1±0.1에서 20분간 멸균될 것이다.

액상 발효

액상 발효 배지는 탄소원 (수크로오스) 5 내지 35 g/L, 질소원 (콩 펩톤) 5 내지 45 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 0.5 내지 3 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.5 내지 4 g/L, CaCl₂ 0.05 내지 1 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.05 내지 1.5 g/L을 함유하고, 이것은 121 ℃ 및 pH 7.5±1.0에서 20분간 멸균될 것이다.

여기서, 탄소원은 글루코오스, 글리세롤, 수용성 녹말 및 당밀로 대체될 수 있고, 반면에 질소원은 옥수수 침지액, 효모 추출물, 소고기 추출물, 펩톤 (식물성 단백질 또는 동물성 단백질) 및 두유로 대체될 수 있다.

제조된 균주 종자액을 발효 배지에 5 % 내지 20 %의 접종량으로 접종하고, 교반 플라스크 내에서 온도 30 내지 40 ℃ 및 회전 속도 180 내지 220 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양한 후, 8000 Da의 분자량 차단 막으로 농축, 보조제 첨가 및 분무 건조를 순차적으로 수행하여 혈전 용해능을 갖는 나토키나아제를 상청액으로부터 분리시켰다.

보조제의 첨가는 기본적으로 분무 건조의 필요를 충족시키는 것이고, 보조제는 마그네슘 스테아레이트, β-사르딩거 덱스트린, 젤라틴, 분리 콩 단백질 및 덱스트린 중 1종 이상을 20 % 내지 40 % (W/V)의 양으로 포함한다.

고상 발효

고상 발효 배지의 영양 유체는 다음을 함유한다: pH 7.5±1.0에서 글리세롤 50 내지 300 g/L, 펩톤 50 내지 300 g/L, 소고기 추출물 50 내지 100 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 5 내지 20 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 5 내지 20 g/L, CaCl₂ 0.5 내지 10 g/L 및 MgSO₄·7H₂O 0.5 내지 10 g/L.

신선한 콩 앙금을 영양 유체 (중량비: 20 내지 120 ml/1000 g)와 함께 분무시키고, 100 ℃로 가열하여 영양 배지를 얻은 후, 제조한 균주 종자액을 5 % 내지 20 %의 접종량으로 영양 유체와 혼합시킨 냉각 발효 배지 내로 접종하고, 30 내지 45 ℃, 습도 ≥ 80 %에서 12 내지 56 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 건조시켜 본 발명의 나토키나아제를 얻었다. 발효 과정 중 환기로 습도 및 온도를 유지하는 것이 중요한데, 이것은 발효 과정에서 온도, 습도 및 영양 유체가 나토키나아제의 수율에 영향을 미치는 중요한 요인이기 때문이다.

본 발명의 나토키나아제 (NK)는 고초균주에 의하여 생산되는 피브린 용해소이고, 이는 고초균주가 풍부한 식품 나토로부터 분리되고 정제된다. 종래의 실험은 나토키나아제의 활성이 pH 값이 6.0 내지 12.0일 때 안정하고, pH 값이 5.0 보다 낮을 때 불안정하며, 그 활성은 56 ℃ 이하의 온도에서 30분간 배양되는 경우 기본적으로 변하지 않고 유지된다는 것을 보였다. 이것의 pI는 등전 초법 전기 영동에 의하여 8.6±0.3이다. 그러나, 경구 투여의 치료 효과는 낮은데, 이는 나토키나아제의 활성이 위 내에서의 낮은 pH 값에서 불안정하기 때문이다. Fujita M 등은 쥐의 십이지장 내에 투여 후, 나토키나아제 (NK) 및 그것의 피브리노겐의 용해제와의 복합체가 혈장(plasma) 내에서 검출될 수 있고, 이는 NK가 소화관으로부터 혈액으로 흡수된 후 혈전 용해 역할을 여전히 수행할 수 있다는 것을 제시한다고 보고하였다 (Fujita M, Hong K, Ito Y, et al . Transport of Nattokinase across the rat intestinal tract. Biol. Pharm. Bull. 1995, 18(9):1194-6.). 5 % NaHCO₃로 제조한 본 발명의 NK는 위 내의 낮은 pH 값에서의 NK의 불안정성을 극복한 후에 경구 투여에 있어서의 상당한 치료 효과를 갖는 혈전증용 약의 제조에 사용된다. 그러므로, 본 발명은 임상 시험 관리 기준에 있어서 신규 혈전증용 약으로서 선택할 수 있도록 하고, 물론, 이는 분자량이 작기 때문에 주사 및 기타의 투여 방법에 의할 수 있다.

NK를 쥐의 위 내에 투여하는 것에 의한 급성 독성 시험은 LD₅₀이 6.0 g/kg 보다 더 높다는 것을 보이고, 쥐에 있어서의 목동맥 혈전증 시험은 5 % NaHCO₃에 의하여 제조된 NK가 일정 투여량의 효과와 4 내지 100 mg/kg의 유효 투여량의 넓은 범위와의 관계를 보이면서 분명한 항혈전 효과를 가진다는 것을 지적하였다. 동시에, 단일의 고초균주는 또한 쥐의 목동맥 혈전증 시간을 어느 정도 연장시킨다는 것을 보여준다.

본 발명의 신규 고초균주는 높은 효소 생산율을 보이고, 효소 생산의 최대치는 그 다음날 발효 배양액에서 1600 IU/ml의 NK 활성으로 얻어질 수 있다. 이것은 발효 조건이 최적화된 후 1697 IU/ml까지 여전히 증가될 수 있다. 정제전 생성물의 NK 활성은 10-kg 클래스 고상 발효에서 건조시킨 후 5000-10000 IU/g이고, 이는 생산 규모를 확대하게 되면 크게 향상될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 신규 고초균주를 사용하여 나토키나아제를 제조하는 것은 발효 시간의 단축, 절차상의 편리, 저비용 및 고생산성으로 인하여 산업적 생산에 응용될 수 있다.

도 1은 실시예 2에서 제조한 나토키나아제 (NK)의 HPLC 분광 사진이고, 여기서, 가로축은 체류 시간을 나타내고, 세로축은 흡수 수치를 나타낸다.

도 2는 실시예 3에서 제조한 나토키나아제 (NK)의 HPLC 분광 사진이고, 여기서, 가로축은 체류 시간을 나타내고, 세로축은 흡수 수치를 나타낸다.

도 3은 실시예 2 (I) 및 실시예 3 (II)에서 제조한 나토키나아제 (NK)의 SDS-PAGE 전기 영동도이고, 여기서 M은 마커를 나타내고, I는 액상 발효로 정제된 NK 예이며, II는 고상 발효로 정제된 NK 예이다.

도 4는 실시예 2 (I) 및 실시예 3 (II)에서 제조한 나토키나아제 (NK)의 등전 초법 전기 영동 전기 영동도이고, 여기서, M은 마커를 나타내고, I는 액상 발효로 정제된 NK 예이며, II는 고상 발효로 정제된 NK 예이다.

다음은 본 발명의 추가 효과를 보이는 특정 실시 일례들이다. 그러나, 이것은 본 발명을 제한하는 것으로서 작용하지는 않을 것이다. 본 발명과 균등한 기술적 의미 및 범위 내에서 가능한 모든 수정, 대체 및 교체가 본 발명에 포함된다.

실시예 1 종자액의 제조

실시 종자 로트의 개방 균주를 영양 한천 (NA) 배지 플레이트 2 내지 3편(片)에서 배양하고, 각각을 배양한 후 8 내지 10개의 전형적인 콜로니를 선택하여 NA 시료 튜브의 경사면에서 보존하였다. 종자를 형태, 순도 및 생산력의 측면에 한정하여 시험한 후 생산에 활용하였다.

일부 배양 물질을 한정 균주의 경사면으로부터 취하고, NB 배지 20 ml에 두어 37 ℃에서 회전 속도 200 rpm로 20 시간 동안 교반 배양하여 제1 클래스 종자를 얻은 후, 이를 접종량이 5 %가 되도록 NB 배지 400 ml에 접종하고, 교반 플라스크에서 37 ℃, 회전 속도 180 내지 220 rpm으로 18 시간 동안 배양하여 발효 종자액을 얻었다.

실시예 2 액상 발효 방법에 의한 나토키나아제의 제조

발효 배양 배지는 수크로오스 5 g/L, 콩 펩톤 12 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 0.50 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 2 g/L，CaCl₂ 0.08 g/L 및 MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L으로 구성되는데，이는 121 ℃ 및 pH 7.5에서 20분간 멸균시켜야 한다. 여기서, 수크로오스는 옥수수 침지액, 효모 추출물, 소고기 추출물, 펩톤 (식물성 단백질 또는 동물성 단백질) 및 두유 등에 의한 글루코오스, 글리세롤, 수용성 녹말 및 당밀 및 콩 펩톤으로 대체될 수 있다.

제조된 균주 종자액 250 ml를 발효 배지 내에 접종 부피 12 %로 접종하고, 37 ℃에서 회전 속도 180 rpm으로 50 시간 동안 교반 배양한 후, 4000 rpm에서 30 분간 원심 분리시켜 엽상체를 제거하였다. 그런 후 상청액을 차단 분자량이 8000 Da인 필터 막으로 원 부피의 10 %로 농축시켰다. 그런 후 마그네슘 스테아레이트 및 젤라틴과 같은 보조제를 가하여 이 용액 내의 고체 함량이 20 %가 되도록 하였다. 마지막으로, 140 ℃에서 분무 건조시켜 본 발명의 플라스미노키나아제 생산물을 얻었다.

나토키나아제의 정제

배양액을 5000 rpm에서 20분간 원심 분리시켰다. 상청액을 취한 후, pH 7.0에서 20 mM PB-1.5 M (NH₄)₂SO₄ 로 조절한 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow의 소수성 상호작용 칼럼 내로 옮기기 전에 암모늄 술페이트 [(NH₄)₂SO₄]를 가하였다. 마지막으로, 혼성 단백질을 제거하기 위하여 750 mM PB로 용출시키고, 다시 20 mM PB로 용출시켜 용리액을 얻으며, 냉동 건조 후 정제된 생성물을 얻었다.

HPLC 시험

냉동 건조 전에 전술한 용리액 또는 정제 생성물 (20 mM PB을 함유하는 1 mg/ml 용액으로 제조)을 HPLC 검출에 사용하였다.

HPLC 검출 조건

크로마토그래피: Waters 600 ＋ 996, 크로마토그래피 칼럼: Waters Protein-Pak™ 60 7.8×300 mm, 이동상: 0.2 mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH (95:5), 유량: 1 ml/분, 검출 파장: 220 nm.

나토키나아제 생산의 최대치는 7 내지 9 분에 보인다. 자세한 내용은 도 1 참조.

SDS - PAGE 시험

Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV C, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 의하면, 나토키나아제는 SDS-PAGE의 28 KD 내지 14.4 KD에 다중 단백질 밴드를 보이고, 여기서 A, B, C 및 D 밴드가 가장 선명하다. 자세한 내용은 도 3의 Ⅰ 참조.

등전 초법 전기 영동 시험

등전 초법 전기 영동 시험은 Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV D, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 따라 수행된다. 자세한 내용은 도 4 Ⅰ 참조.

배양액 내의 나토키나아제의 활성은 검출시 1600 IU/ml까지 나올 수 있다.

생산된 나토키나아제는 배양액을 건조시키거나 용리액을 취하여 얻을 수 있다.

실시예 3 고상 발효 방법에 따른 나토키나아제의 제조

영양 유체 (g/L): pH 7.5±1.0에서 글리세롤 100 g/L, 펩톤 150 g/L, 소고기 추출물 80 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 18 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 15 g/L, CaCl₂ 10 g/L 및 MgSO₄·7H₂O 5 g/L.

신선한 콩 앙금 1000 g에 영양 유체 100 ml를 분무시킨 후 100 ℃에서 30분간 가열하였다. 미리 준비한 균주 종자액을 접종 부피 20 % (V/W)로 냉각 발효 배 지에 접종하고, 40 ℃에서 80 %와 등가이거나 그 이상의 습도로 40 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 건조시켜 나토키나아제 생성물을 얻었다.

나토키나아제의 정제

얻어진 나토키나아제 생성물을 10배 부피의 일반 식염수로 분리시키고, 20분간 초음파 처리하며, 여과시켜 상청액을 얻었는데, 이는 후에 최종 농도가 20 mM PB (pH 8.0)인 용액으로 제조되었다. DEAE Sepharose™ Fast Flow 칼럼을 20 mM PB (pH 8.0)의 PB 완충 용액으로 조절한 후, 로딩시켰다. DEAE Sepharose™ Fast Flow 칼럼을 관통한 용액을 취하여 그 pH 값을 6.5에 맞추고, 그런 후에 20 mM PB (pH 8.0)의 PB 완충 용액으로 조절한 CM Sepharose™ Fast Flow 칼럼에 로딩시켰다. 그런 후에 200 mM PB 완충 용액으로 용출시킨 용액을 취하고, 용액의 농도가 1.5mol/L가 될 때까지 고체 암모늄 술페이트 [(NH₄)₂SO₄]를 첨가하였다. 그런 후에 pH 7.0에서 20 mM PB-1.5 M (NH₄)₂SO₄ 완충 용액으로 조절한 Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow의 소수성 상화작용 칼럼으로 옮기고, 750 mM PB로 용출시켜 혼성 단백질을 제거하며, 다시 20 mM PB로 용출시켰다. 마지막으로, 용리액을 취하고, 냉동 건조 후 정제된 나토키나아제를 얻었다.

HPLC 시험

냉동 건조 전의 전술한 용리액 또는 정제 생성물을 HPLC 검출에 사용하도록 20 mM PB를 함유하는 1 mg/ml 용액으로 제조하였다.

HPLC 검출 조건

크로마토그래피: Agilent 1100 시리즈, 크로마토그래피 칼럼: Waters Protein-Pak™ 60 7.8×300 mm, 이동상: 0.2 mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH (95:5), 유량: 1 ml/분, 검출 파장: 220 nm.

나토키나아제 생산의 최대치는 7 내지 9 분에 보인다. 자세한 내용은 도 2 참조.

SDS - PAGE 시험

Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV C, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 의하면, 나토키나아제는 SDS-PAGE의 28 KD 내지 14.4 KD에 다중 단백질 밴드를 보이고, 여기서 A, B, C 및 D 밴드가 가장 선명하다. 자세한 내용은 도 3의 II 참조.

등전 초법 전기 영동 시험

등전 초법 전기 영동 시험은 Pharmacopoeia of the People's Republic of China의 부록 IV D, III부, 2005 개정판에 특정된 방법에 따라 수행된다. 자세한 내용은 도 4 II 참조.

고상 발효 배지(발효 후) 또는 취한 용리액 (정제 용액)을 건조시킨 후, 본 발명의 최종 나토키나아제 생성물을 얻는다.

10-Kg 클래스의 고상 발효 실험의 다중 배취(batch)는 건조 후 개략적으로 얻은 효소 활성 수율이 최대 5000-10000 IU/g일 수 있음을 제시하였다.

다음은 본 발명의 잇점을 더 설명하기 위하여 쥐의 목동맥 혈전증에 대한 나토키나아제 냉동 건조 분말의 연구이다.

시험 의약물

나토키나아제의 냉동 건조 분말:

정제전 약, Chengdu Di'ao Pharmaceutical Group Company Limited의 미생물 그룹 내의 Chen Jun에 의하여 제공된, 배취(batch) 번호 20040617이고, 수용성인 진한 주황색의 분말.

제조 방법: 5 % NaHCO₃를 사용하여 모액을 20 mg/ml로 만든 후, 쥐의 위 내 투여를 위한 기하학적 비율에 따라 5 % NaHCO₃를 사용하여 0.8 mg/ml 용액으로 희석시켰다.

투여량: 소량, 중간량 및 다량의 투여량은 각각 4, 20 및 100 mg/kg로 정하였다.

투여량 설정 근거: 임상 환자에 대한 최대 투여량은 매일 3.0g, 즉 3000 mg/60 kg=50 mg/kg으로 정하였는데, 이는 쥐에 대한 9.26 mg/kg의 등가 투여량과 등가량이다. 그에 대한 2배의 정수 (20 mg/kg)는 쥐에 있어서의 약동력학적 효과를 일으키는 중간 투여량으로서 사용되었다. 그룹 내의 시간은 5로 설정되어 치료를 위한 투여량의 적절한 범위를 편리하게 이용할 수 있도록 다량, 중간량 및 소량의 투여량의 범위로 확장된다.

제조의 근거: 나토키나아제-유사 약물은 pH 값이 6.0 내지 12.0인 경우에 안 정하고 pH 값이 5.0 미만인 때에 불안정하다고 보고되어 왔다. 일반적으로, 소화관의 pH 값은 위장에서 0.9 내지 1.5이고, 작은 창자에서 6.0 내지 6.8이며, 결장에서 6.5 내지 7.5이다. 그러므로, 일반적인 용액 보조제를 같이 사용하여 제조한 나토키나아제 함유 약물을 위 내에 직접 투여하는 것은 불안정하고 파괴되기 쉽다. 5 % NaHCO₃로 제조한 나토키나아제를 위한 예비 시험은 실온에서 4일간 둔 후 활성의 감소가 명백하지 않다는 것을 보여주었다.

아스피린의 장용정 (entric-coated tablets):

중국의 Shijiazhuang Pharmaceutical Group OUYI Pharma Co., Ltd에 의하여 생산된 아스피린 장용정 (배취 번호:040401)는 쥐에 있어서의 위 내 투여를 위하여 증류수를 사용하여 8 mg/ml의 약물 용액으로 제조하였다.

투여량의 근거: 80 내지 300 mg/kg/1일, 무게가 60 kg인 성인에 대하여 1.33 내지 5 mg/kg/1일로 계산되고, 쥐를 위한 투여량으로 계산하면 8 내지 30 mg/kg/1일이 될 것이다. 이 실험에서 쥐에 대한 아스피린의 투여는 전술한 투여량과 공지의 시험 경험에 따라 40 mg/kg/1일로 정하였다.

스타필로키나아제

Chengdu Di'ao Pharmaceutical Group Company Limiteddp 의하여 제공되는 수용성의 배취 번호 20040301이고 5 mg/앰플인 백색의 냉동 건조 분말. 냉동 건조 분말 앰플을 증류수를 사용하여 쥐의 정맥 내에 주사하기 위한 0.3 mg/ml 약물 용액으로 제조하였다.

투여량 근거: 일반적으로, 15 mg은 성인을 위한 단일 투여량, 즉 15 mg/60 kg=0.25 mg/kg이다. 쥐를 위한 등가 투여량으로 전환하면, 이는 1.35 내지 1.5 mg/kg의 범위가 되고, 이 시험에서는 투여량으로 1.5 mg/kg을 취하였다.

실험 동물: 무게가 250 내지 320 g인 수컷 SD 쥐 84 마리를 중국의 Henan Medical University의 동물 센터로부터 구입하였다.

실험 장비: 중국의 Baotou Medical Unversity의 심장 혈관 연구부에 의하여 개발된 Experimental Intracorporeal Thrombosis Surveyor BT87-3.

실험 방법:

84마리의 수컷 SD 쥐를 그들의 체중에 따라서 무작위로 7개의 실험 그룹으로 나누었다 (각 그룹당 12마리의 쥐). 나토키나아제 냉동 건조 분말과 양성 약물 아스피린을 시험 그룹에 주었으며, 대조군에는 연속 7일간 매일 0.5 ml/100 g의 투여량에 따라 위 내 투여의 방법으로 5 % NaHCO₃와 함께 투여하였다. 양성 약물 스타필로키나아제를 7일째에 정맥 내에 주사하였다.

시험 쥐들의 목동맥을 종래의 문헌에 기술된 방법에 따라 마지막 위 내 투여 후 1시간 또는 정맥 내 주사 후 15분 후에 분리시켰다. 직류 (2 mA)로 7분간 연속 자극 후, 목동맥의 동맥 내막 손상이 시험 쥐에 있어서 혈전증을 점차적으로 형성하였다. 실험 장비는 혈관이 막힐 때 자동 경보 기능을 갖고 혈전 형성 시간을 기록하였다.

실험 결과

1. 7일간의 투여 후 모든 그룹의 시험 쥐의 무게 변화를 보이면 다음과 같다 (자세한 내용은 표 1 참조).

번호	그룹	동물 번호	투여 전	7일간 투여 후
A	음성 대조군	12	293±20	307±21
B	양성 대조군 (아스피린)	12	296±15	316±20
C	양성 대조군 (스타필로키나아제)	12	293±22	316±21
D	본 발명의 나토키나아제 소량 투여	12	298±18	315±20
E	본 발명의 나토키나아제 중간량 투여	12	296±19	316±21
F	본 발명의 나토키나아제 다량 투여	12	291±23	311±23
G	고초균 균주	12	295±16	328±20

결과는 투여 전 그룹과 7일간의 투여 후 그룹의 시험 쥐의 무게에 있어서 어떠한 의미있는 차이도 보이지 않았고, 모든 그룹 내의 시험 쥐의 무게는 천천히 증가하여 어떠한 의미있는 차이도 보이지 않았다. 각 그룹의 쥐들은 모두 투여 기간 동안에 정상적으로 먹고 마시고 행동하였고, 기타의 현성 독성도 보이지 않았다. 결론적으로, 5 % NaHCO₃로 제조된 나토키나아제 약은 이를 7일간의 기간 동안 위 내 투여로 쥐에게 주었을 때 어떠한 분명한 독성도 나타내지 않았다.

2. 혈전 형성 시간 (2차)을 비교하면 다음과 같다 (자세한 내용은 표 2 참조):

그룹	음성 대조군	아스피린	스타필로키나아제	본 발명의 나토키나아제의 소량인 투여량	본 발명의 나토키나아제의 중간량인 투여량	본 발명의 나토키나아의 다량인 투여량	고초균주
해당 번호	12	8	10	11	11	10	9
평균 값	943	1379**	1224*	1237*	1287*	1309**	1198*
보증된 값	164	285	196	275	327	219	234
P 값		0.0049	0.0132	0.0446	0.0181	0.006	0.0289

실험 결과는 음성 대조군과 대비시 나토키나아제의 냉동 건조 분말을 모든 군에 소량, 중간량 및 다량으로 투여하면 쥐에 있어서 목동맥 혈전증 시간을 상당히 연장시키는 것을 보여준다 (P < 0.05 또는 P < 0.01). 상당한 투여량과 효과간에 관계가 없음에도 불구하고 상이한 투여량 그룹간에 일정 투여 효과 경향이 있음이 보였다. 양성 아스피린과 대비시, 상이한 투여량의 그룹은 의미있는 차이를 보이지 않았다.

또한, 단일의 고초균주도 쥐의 목동맥 혈전증 시간에 있어서의 일정 연장을 보여주었다 (P < 0.05).

대체로, 균주 자체 또는 본 발명에서 이에 의하여 얻어지는 나토키나아제는 혈전증 치료용 약에 관한 신규 선택을 제공한다.

본 발명의 신규 고초균주는 높은 효소 생산율을 보이고, 효소 생산의 최대치는 2번째 날에 얻어질 수 있다. 그러므로, 현재의 신규 고초균주를 사용하여 나토키나아제를 생산하는 것은 발효 시간을 줄이고, 절차의 편리, 저비용 및 고생산성을 부여하므로 나토키나아제 약을 산업적으로 생산하거나 제조하는 신규 방법을 제공한다.

<110> CHENGDU DI'AO JIUHONG PHARMACEUTICAL FACTORY <120> A NEW BACILLUS SUBTILIS STRAIN AND ITS USE IN PREPARING MEDICINE FOR TREATING THROMBOSIS <130> KP-CH-077779 <150> CN200510020836.9 <151> 2005-04-30 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1467 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 cttgttacga cttcacccca atcatctgtc ccaccttcgg cggctggctc ctaaaaggtt 60 acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 120 cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca 180 gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc 240 ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 300 atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt 360 gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 420 catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg 480 acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 540 tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 600 gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc 660 ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 720 ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg 780 ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc 840 tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc 900 acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt 960 gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta 1020 ccgtcaaggt accgccctat tcgaacggta cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg 1080 atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa 1140 gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga 1200 tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgttg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc 1260 taatgcgccg cgggtccatc tgtaagtggt agccgaagcc accttttatg tttgaaccat 1320 gcggttcaaa caaccatccg gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag 1380 gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaaca tcagggagca agctcccatc 1440 tgtccgctcg acttgcatgt attaggc 1467

Claims

혈전증 치료용 약물의 제조에 있어서, CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 기탁 번호 CCTCC M204092로 기탁한 신규 균주 고초균 디아오 1502(Bacillus subtilis Diao 1502)의 용도.
제1항에 있어서, 혈전증 치료용 약물의 제조에 있어서, 기탁 번호가 CCTCC M204092인 고초균 디아오 1502에 의하여 생산된 나토키나아제의 용도.
제2항에 있어서, 상기 나토키나아제의 HPLC 분광 사진은 도 1에 도시한 특징적인 흡수 피크를 보이고, 크로마토그래피 조건은 다음과 같은 것인 용도:

크로마토그래피 칼럼: Waters Protein-Pak™ 60 7.8×300 mm

이동상: 0.2 mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH (95:5)

유량: 1 ml/분

검출 파장: 220 nm

나토키나아제의 최대 농도는 7분과 9분 사이에 나타남.
도 1에 도시한 HPLC 분광 사진을 가지는 한 종류의 나토키나아제로서, 상기 HPLC 분광 사진은 하나의 특징적인 흡수 피크를 보이고, 크로마토그래피 조건은 다 음과 같은 것인 나토키나아제:

크로마토그래피 칼럼: Waters Protein-Pak™ 60 7.8×300 mm

이동상: 0.2 mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH (95:5)

유량: 1 ml/분

검출 파장: 220 nm

나토키나아제의 최대 농도는 7분과 9분 사이에 나타남.
제4항에 있어서, 상기 나토키나아제는 SDS-PAGE 상의 28 KD 내지 14.4 KD에서 다중 단백질 밴드를 보이는 것인 나토키나아제.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 나토키나아제는

a). 발효용 균주 종자액으로서 고초균 디아오 1502（CCTCC 번호 M204092）를 배양하고,

b). a) 공정에서 얻은 균주 종자액을 액상 발효 또는 고상 발효로 발효시켜 나토키나아제를 얻는

방법에 의하여 제조되는 것인 나토키나아제.
a). 발효용 균주 종자액으로서 고초균 디아오 1502（CCTCC NO.M204092）를 배양하고,

b). a) 공정에서 얻은 균주 종자액을 액상 발효 또는 고상 발효로 발효시켜 나토키나아제를 얻는

공정을 포함하는, 제4항 또는 제5항의 나토키나아제의 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 액상 발효는

균주 종자액을 발효 배지에 5 % 내지 20 % (v/v)로 접종하고,

상기 균주 종자액을 교반 플라스크에서 30 내지 40 ℃의 온도와 180 내지 220 rpm의 회전 속도로 24 내지 72 시간 동안 배양하며,

원심 분리 및 배양에서 얻은 상청액을 필터막을 통과시켜 농축시키고,

건조시켜 나토키나아제를 얻는

공정을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 액상 발효의 배지는 pH 7.5±1.0에서 탄소원 5 내지 35 g/L, 질소원 5 내지 45 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 0.5 내지 3 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.5 내지 4 g/L, CaCl₂ 0.05 내지 1 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.05 내지 1.5 g/L를 함유하고, 여기서 상기 탄소원은 수크로오스, 글루코오스, 글리세롤, 수용성 녹말 및 당밀로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 질소원은 동물성 펩톤, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물, 소고기 추출물, 식물성 펩톤 및 두유로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 고상 발효는

중량 비율이 20 내지 120 ml/1000 g인 콩 앙금 영양 배지를 100 ℃로 가열하여 영양 배지를 얻고,

균주 종자액을 접종 부피 5 % 내지 20 % (V/W)로 냉각 영양 배지에 접종하며, 30 내지 45 ℃, 습도 ≥ 80 %로 12 내지 56 시간 동안 배양하고,

그 배양물을 건조시켜 나토키나아제를 얻는

공정을 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 고상 발효 배지는 pH 7.5± 1.0에서 글리세롤 50 내지 300 g/L, 펩톤 50 내지 300 g/L, 소고기 추출물 50 내지 100 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 5 내지 20 g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 5 내지 20 g/L, CaCl₂ 0.5 내지 10 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5 내지 10 g/L를 함유하는 것인 방법.