CN111820420A - 一种高活性富硒纳豆粉的制备方法 - Google Patents
一种高活性富硒纳豆粉的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，包括以下步骤：配制富硒培养基、灭菌、接种发酵、发酵液离心、微滤除菌、超滤浓缩、喷雾干燥。本发明的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法通过在菌种培养发酵的过程中添加硒元素，使得菌种的发酵产物纳豆粉中含有有机硒，实现了将无机硒生物转化为更易于被人体吸收的有机硒，并与纳豆激酶结合，兼具硒和纳豆激酶的功效。制得的富硒纳豆粉不仅酶活性高，而且该制备方法发酵周期短、生物利用度高、制备工艺简单、便于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是，本发明涉及一种高活性富硒纳豆 粉的制备方法。
背景技术
纳豆粉中含有非常丰富的营养成分，具有改善便秘、调节血糖、溶解血栓、 预防心脑血管疾病等功效。而纳豆粉中起溶栓作用的就是纳豆激酶。纳豆激酶是 一种由纳豆枯草芽孢杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，其具有很强的纤溶活性，能 直接作用于纤维蛋白，也能激活人体内的纤溶酶原，与其他溶栓类药物相比，纳 豆激酶具有安全性好、成本低、纤溶活性强、可口服、作用时间长等优点。
硒被称为人体微量元素中的“防癌之王”，硒在维持动物和人体生命活动 中起着非常重要的作用。硒在动物体内主要以硒蛋白的形式发挥作用，主要表现 在抗氧化、抗癌、提高免疫力、解毒等方面。
富硒纳豆粉是硒与纳豆激酶相结合，兼具元素硒及纳豆激酶的特性。首先， 硒具有很强的抗氧化性，可以清除自由基，而自由基是引起血栓形成的重要原因， 因此硒可以有效的防止血栓的形成。其次，纳豆激酶具有很强的溶栓功效，安全 性高、溶栓效果好、半衰期长、无副作用等。因此富硒纳豆粉可以在防栓和溶栓 两个方面起到双重作用，对血栓类疾病具有很好的疗效，具有较好的研究和开发 前景。而现有技术中的富硒纳豆粉的酶活通常较低，利用度低，且生产周期较长， 生产成本高。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高活性富硒纳豆 粉的制备方法。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，包括以下步骤：配制富硒培养基、灭菌、 接种发酵、发酵液离心、微滤除菌、超滤浓缩、喷雾干燥。
优选地，所述富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨2wt％～3wt％、无水 葡萄糖2.5wt％～3.5wt％、Na2SeO3 1×10-6mol/L～2×10-6mol/L、Na2HPO4·12H2O 1wt％、NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O 0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡 剂0.1wt％；培养液的pH 7～7.5。
优选地，所述接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)保藏，位于湖北武汉，其保藏编号为CCTCC NO:M 203078，保藏日期为2003年11月17日。
优选地，所述接种发酵包括以下步骤：
制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培养温度 37±1℃，摇床转速为100r/min～200r/min，培养周期12h～24h；
制备二级种子液：将所述一级种子液按0.1wt％～0.3wt％接种到种子罐中，种 子罐中培养基为所述富硒培养基，培养温度37±1℃，通气量1VVM，罐压 0.05MPa，溶氧30％关联转速的条件下培养5h～8h，OD值4.0～6.0；
接种发酵：将所述二级种子液按1wt％～3wt％接种到发酵罐中，发酵罐中培 养基为所述富硒培养基，发酵温度37±1℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶 氧30％关联转速的条件下发酵19h～24h，溶氧50％-60％。
优选地，所述发酵液离心步骤为：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机 中离心，保持压力在0.2MPa～0.4MPa，收集上清液。
优选地，所述微滤除菌步骤为：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整 蠕动泵流速2L/min～4L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.2MPa以下。
优选地，所述超滤浓缩步骤为：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备 中，控制进料泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液 流速为1.0L/min～2.0L/min，收集截留液，浓缩8～10倍。
优选地，所述喷雾干燥步骤为：在浓缩液中加入5％～6％的麦芽糊精并搅拌 均匀后接入喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为190℃～200℃，出风 温度控制在68℃～74℃。
优选地，所述灭菌条件为：110℃～115℃保持20min。
优选地，制备的富硒纳豆粉的酶活达到140000IU/g～165000IU/g，硒含量达 到8000ppm～10000ppm。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
本发明的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法通过在菌种培养发酵的过程中 添加硒元素，使得菌种的发酵产物纳豆粉中含有有机硒，实现了将无机硒生物转 化为更易于被人体吸收的有机硒，并与纳豆激酶结合，兼具硒和纳豆激酶的功效。 制得的富硒纳豆粉不仅酶活性高，而且该制备方法发酵周期短、生物利用度高、 制备工艺简单、便于工业化生产。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说 明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外 不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观 点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设 备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤 前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方 法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方 法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范 围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发 明可实施的范畴。
本发明实施例提供一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制富硒培养基：富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨2wt％～ 3wt％、无水葡萄糖2.5wt％～3.5wt％、Na2SeO3 1×10-6mol/L～2×10-6mol/L、 Na2HPO4·12H2O1wt％、NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O 0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡剂0.1wt％；培养液的pH 7～7.5。
(2)灭菌：灭菌条件为110℃～115℃保持20min。
(3)接种发酵：接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型 培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 203078。接种发酵具体包括 以下步骤：
(31)制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培 养温度37±1℃，摇床转速为100r/min～200r/min，培养周期12h～24h；
(32)制备二级种子液：将一级种子液按0.1wt％～0.3wt％接种到种子罐中， 种子罐中培养基为富硒培养基，培养温度37±1℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa， 溶氧30％关联转速的条件下培养5h～8h，OD值4.0～6.0；
(33)接种发酵：将二级种子液按1wt％～3wt％接种到发酵罐中，发酵罐中 培养基为富硒培养基，发酵温度37±1℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧 30％关联转速的条件下发酵19h～24h，溶氧50％-60％。接种时二级种子液刚好处 于菌种生长的对数生长期，接种后菌种可在发酵罐中快速增殖，可在短时间内获 得大量的发酵产物。
(4)发酵液离心：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机中离心，保持 压力在0.2MPa～0.4MPa，收集上清液。
(5)微滤除菌：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整蠕动泵流速2 L/min～4L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.2MPa以下。
(6)超滤浓缩：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备中，控制进料 泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液流速为1.0L/min ～2.0L/min，收集截留液，浓缩8～10倍。
(7)喷雾干燥：在浓缩液中加入5％～6％的麦芽糊精并搅拌均匀后接入喷 雾干燥设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为190℃～200℃，出风温度控制在 68℃～74℃。
通过本发明实施例的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法制备的富硒纳豆粉 的酶活达到140000IU/g～165000IU/g，硒含量达到8000ppm～10000ppm。
本发明实施例将副作用大、吸收率低的无机硒转化为更易于被人体吸收利用 的有机硒，同时将硒和纳豆激酶结合，使得富硒纳豆粉兼具硒和纳豆激酶的功效。 本发明发酵周期短，工艺简便，产物营养更丰富，利用度更高，大大降低了生产 成本。
纳豆激酶酶活的测定方法参照Astrup法制备琼脂糖纤维蛋白平板，将不同 浓度的尿激酶标准品(20、40、80、160、320、640IU/ml)点样于新配制的平板 上，置于37℃培养18h，测定溶纤圈的垂直直径，计算溶纤圈面积，制作标准曲 线。取制备的的纳豆激酶10μl点纤维蛋白平板，置37℃培养18h，计算溶纤圈 面积，利用尿激酶标准曲线求得相应的酶活。
富硒纳豆粉中硒含量的测定按GB 5009.93规定的方法检测。
以下结合具体实施例做进一步说明。
实施例1
(1)配制富硒培养基：富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨2wt％、无 水葡萄糖3wt％、Na2SeO3 1×10-6mol/L、Na2HPO4·12H2O 1wt％、NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O 0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡剂0.1wt％；培养液的pH 7.2。
(2)灭菌：灭菌条件为110℃～115℃保持20min。
(3)接种发酵：接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型 培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 203078。接种发酵具体包括 以下步骤：
(31)制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培 养温度37℃，摇床转速为180r/min，培养周期20h；
(32)制备二级种子液：将一级种子液按0.1wt％接种到种子罐中，种子罐 中培养基为富硒培养基，培养温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧 30％关联转速的条件下培养7h，OD值5.0；
(33)接种发酵：将二级种子液按1wt％接种到发酵罐中，发酵罐中培养基 为富硒培养基，发酵温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧30％关联 转速的条件下发酵20h，溶氧56％停罐。
(4)发酵液离心：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机中离心，保持 压力在0.3MPa，收集上清液。
(5)微滤除菌：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整蠕动泵流速3 L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.15MPa。
(6)超滤浓缩：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备中，控制进料 泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液流速为1.5L/min， 收集截留液，浓缩10倍。
(7)喷雾干燥：在浓缩液中加入5％的麦芽糊精并搅拌均匀后接入喷雾干燥 设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为195℃，出风温度控制在72℃。测得富硒 纳豆粉的酶活为145000IU/g，硒含量为8500ppm。
实施例2
(1)配制富硒培养基：富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨3wt％、无 水葡萄糖2.5wt％、Na2SeO3 2×10-6mol/L、Na2HPO4·12H2O 1wt％、NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O 0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡剂0.1wt％；培养液的pH 7.4。
(2)灭菌：灭菌条件为110℃～115℃保持20min。
(3)接种发酵：接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型 培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 203078。接种发酵具体包括 以下步骤：
(31)制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培 养温度37℃，摇床转速为200r/min，培养周期12h；
(32)制备二级种子液：将一级种子液按0.3wt％接种到种子罐中，种子罐 中培养基为富硒培养基，培养温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧 30％关联转速的条件下培养8h，OD值5.5；
(33)接种发酵：将二级种子液按3wt％接种到发酵罐中，发酵罐中培养基 为富硒培养基，发酵温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧30％关联 转速的条件下发酵24h，溶氧60％停罐。
(4)发酵液离心：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机中离心，保持 压力在0.3MPa，收集上清液。
(5)微滤除菌：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整蠕动泵流速3 L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.15MPa。
(6)超滤浓缩：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备中，控制进料 泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液流速为1.5 L/min，收集截留液，浓缩8倍。
(7)喷雾干燥：在浓缩液中加入6％的麦芽糊精并搅拌均匀后接入喷雾干燥 设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为193℃，出风温度控制在70℃。测得富硒 纳豆粉的酶活为160000IU/g，硒含量为9800ppm。
实施例3
(1)配制富硒培养基：富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨2.5wt％、 无水葡萄糖2.5wt％、Na2SeO3 1.5×10-6mol/L、Na2HPO4·12H2O 1wt％、 NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O 0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡剂0.1wt％； 培养液的pH 7.5。
(2)灭菌：灭菌条件为110℃～115℃保持20min。
(3)接种发酵：接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型 培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 203078。接种发酵具体包括 以下步骤：
(31)制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培 养温度37℃，摇床转速为100r/min，培养周期24h；
(32)制备二级种子液：将一级种子液按0.2wt％接种到种子罐中，种子罐 中培养基为富硒培养基，培养温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧 30％关联转速的条件下培养5h，OD值4.2；
(33)接种发酵：将二级种子液按2wt％接种到发酵罐中，发酵罐中培养基 为富硒培养基，发酵温度37℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧30％关联 转速的条件下发酵19h，溶氧50％停罐。
(4)发酵液离心：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机中离心，保持 压力在0.3MPa，收集上清液。
(5)微滤除菌：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整蠕动泵流速3 L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.15MPa。
(6)超滤浓缩：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备中，控制进料 泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液流速为1.5L/min， 收集截留液，浓缩10倍。
(7)喷雾干燥：在浓缩液中加入5.6％的麦芽糊精并搅拌均匀后接入喷雾干 燥设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为196℃，出风温度控制在73℃。测得富 硒纳豆粉的酶活为140600IU/g，硒含量为8300ppm。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是 依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均 应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：配制富硒培养基、灭菌、接种发酵、发酵液离心、微滤除菌、超滤浓缩、喷雾干燥。
2.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述富硒培养基中含有以下成分：大豆蛋白胨2wt％～3wt％、无水葡萄糖2.5wt％～3.5wt％、Na2SeO3 1×10-6mol/L～2×10-6mol/L、Na2HPO4·12H2O 1wt％、NaH2PO4·H2O 0.05wt％、MgSO4·7H2O0.05wt％、CaCl2 0.02wt％、消泡剂0.1wt％；培养液的pH 7～7.5。
3.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述接种发酵使用的菌种为Bacillus subtilis QK02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 203078。
4.如权利要求3所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述接种发酵包括以下步骤：
制备一级种子液：取斜面保存菌种于LB液体培养基中活化培养，培养温度37±1℃，摇床转速为100r/min～200r/min，培养周期12h～24h；
制备二级种子液：将所述一级种子液按0.1wt％～0.3wt％接种到种子罐中，种子罐中培养基为所述富硒培养基，培养温度37±1℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧30％关联转速的条件下培养5h～8h，OD值4.0～6.0；
接种发酵：将所述二级种子液按1wt％～3wt％接种到发酵罐中，发酵罐中培养基为所述富硒培养基，发酵温度37±1℃，通气量1VVM，罐压0.05MPa，溶氧30％关联转速的条件下发酵19h～24h，溶氧50％-60％。
5.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述发酵液离心步骤为：发酵结束的发酵液经管道压入蝶式离心机中离心，保持压力在0.2MPa～0.4MPa，收集上清液。
6.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述微滤除菌步骤为：离心后的上清液经微滤膜进一步除菌，调整蠕动泵流速2L/min～4L/min，控制过滤膜滤芯压力在0.2MPa以下。
7.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩步骤为：将透过过滤膜的透过液压入超滤浓缩膜设备中，控制进料泵压力为0.2±0.05MPa；透过液压力为0.04±0.01MPa；透过液流速为1.0L/min～2.0L/min，收集截留液，浓缩8～10倍。
8.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥步骤为：在浓缩液中加入5％～6％的麦芽糊精并搅拌均匀后接入喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，进风温度设置为190℃～200℃，出风温度控制在68℃～74℃。
9.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，所述灭菌条件为：110℃～115℃保持20min。
10.如权利要求1所述的一种高活性富硒纳豆粉的制备方法，其特征在于，制备的富硒纳豆粉的酶活达到140000IU/g～165000IU/g，硒含量达到8000ppm～10000ppm。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115094053A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080193973A1 (en) * | 2005-04-30 | 2008-08-14 | Chengdu Di'ao Jiuhong Pharmaceutical | Bacillus Subtilis Strain and its Use in Preparing Pharmaceuticals for Treating Thrombosis |
| CN102586141A (zh) * | 2012-02-08 | 2012-07-18 | 陕西科技大学 | 一种纳豆激酶发酵菌剂的制备方法 |
| CN103602651A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-26 | 北京燕京啤酒股份有限公司 | 一种纳豆激酶生产方法 |
| CN108977388A (zh) * | 2018-08-09 | 2018-12-11 | 黄铭坚 | 一种富硒纳豆芽孢杆菌的生产方法及其所用培养基 |
| CN109722426A (zh) * | 2019-03-06 | 2019-05-07 | 武汉轻工大学 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
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2020
- 2020-08-01 CN CN202010763693.5A patent/CN111820420A/zh active Pending
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