CN109722426A - 一种纳豆激酶的制备方法 - Google Patents
一种纳豆激酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109722426A CN109722426A CN201910170443.8A CN201910170443A CN109722426A CN 109722426 A CN109722426 A CN 109722426A CN 201910170443 A CN201910170443 A CN 201910170443A CN 109722426 A CN109722426 A CN 109722426A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid
- nattokinase
- obtains
- molecular weight
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940086319 nattokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 112
- 108010073682 nattokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 150
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 78
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 52
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 39
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 31
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 48
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 47
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 43
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 36
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 30
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 21
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 16
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 8
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000004576 sand Substances 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 12
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 12
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 5
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 2
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种纳豆激酶的制备方法，涉及发酵技术领域。所述纳豆激酶的制备方法包括以下步骤：将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。本发明技术方案中，通过采用连续化膜分离‑大孔吸附树脂法纯化‑真空低温微波干燥的工艺流程来制备纳豆激酶，实现了产业化生产高纯度、高活性纳豆激酶。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，特别涉及一种纳豆激酶的制备方法。
背景技术
纳豆激酶是由一条相对分子质量约为28kda单链肽构成的具有纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶，具有显著的溶解血栓、抗血小板聚集、降血脂等功效，在预防及治疗心脑血管疾病方面有广泛的应用。
随着纳豆激酶在高端保健食品和医药领域的更为广泛应用，对纳豆激酶的纯度和活性均提出了更高的要求，目前，纳豆激酶生产主要通过固态或液态发酵，然后通过盐析、凝胶柱层析等方法制备纯化纳豆激酶，但盐析法存在纳豆激酶回收率低、纯度不达标及酶活不高的缺陷，从而使得纳豆激酶在高端产品的应用中受到限制，而柱层析法存在操作步骤繁琐复杂、成本高、不易产业化等问题，也使得其很难在纳豆激酶的工业化生产中推广。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种纳豆激酶的制备方法，旨在解决纳豆激酶生产存在的纯度低、酶活不高以及不易工业化生产的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种纳豆激酶的制备方法，所述纳豆激酶的制备方法包括以下步骤：
将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；
将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；
用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；
将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。
优选地，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤中，
所述离心时，转速为8000～12000r/min，离心时间为10～15min；
所述过滤时，采用砂滤棒过滤。
优选地，所述将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液的步骤中，包括：
将所述粗酶液通过陶瓷膜过滤，得一级透过液；
将所述一级透过液通过一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
优选地，所述陶瓷膜截留的分子量为90～100KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为45～50KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为15～10KDa；所述纳滤膜截留的分子量为1～5KDa。
优选地，所述用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液的步骤中，所述超滤法精细提纯包括：
将所述洗脱液通过截留分子量为1～5KDa的超滤膜浓缩，收集浓缩液。
优选地，所述将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品的步骤中，所述真空低温微波干燥的温度为30～40℃，干燥时间为24～48h。
优选地，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤之前，还包括以下步骤：
从纳豆制品或纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，测定所述菌液的产酶能力，并挑选出最大酶活的菌株作为出发菌株；
将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落；
挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的种子液；
将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液。
优选地，所述将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落的步骤中，
所述斜面培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L，NaCl 9～10g/L以及琼脂粉1.5～1.8％；和/或，
所述培养的时间为22～24h。
优选地，所述挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的菌液的步骤，包括：
挑取单菌落接种于液体种子培养基中，于25～40℃温度下培养12～16h，得种子液；
将所述种子液按体积比0.5％～1％接种于所述液体种子培养基中，于25～40℃温度下继续培养12～16h，得扩大培养的种子液；
其中，所述液体种子培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L以及NaCl 9～10g/L，且所述液体种子培养基pH为7.0～8.0；和/或，
所述培养时的转速为150～500r/min。
优选地，所述将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液的步骤，包括：
将所述扩大培养的种子液按体积比0.5％～5％接种于发酵培养基中，于25～40℃温度下培养24～72h，得纳豆菌发酵液；
其中，所述发酵培养基包括：蔗糖18～30g/L，黄豆粉9～15g/L，甘油0～6g/L，KH2PO4 1.5～3g/L，K2HPO4·3H2O 10～18g/L，CaCl2 0～0.5g/L以及MgSO4 0～0.5g/L。
本发明技术方案中，通过采用连续化膜分离-大孔吸附树脂法纯化-真空低温微波干燥的工艺流程来制备纳豆激酶，其中，连续化膜分离工艺的应用不仅使经过多级膜分离的浓缩液中纳豆激酶的纯度更高，而且膜可以重复使用，从而可以适用于工业化生产中，实现连续化生产；大孔吸附树脂法提纯效果好且不会对酶活造成影响，从而进一步保证了最终产品的高纯度及高活性；真空低温微波干燥技术实现了对纳豆激酶的快速干燥，且与常规冷冻干燥工艺相比，大大降低了设备投入和运行成本。本发明提供的制备方法实现了产业化生产高纯度、高活性纳豆激酶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的纳豆激酶的制备方法的一实施例的流程示意图；
图2为本发明提出的纳豆激酶的制备方法的另一实施例的流程示意图；
图3为本发明提出的纳豆激酶的制备方法的又一实施例的流程示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前，纳豆激酶生产主要通过固态或液态发酵，然后通过盐析、凝胶柱层析等方法制备纯化纳豆激酶，但盐析法存在纳豆激酶回收率低、纯度不达标及酶活不高的缺陷，从而使得纳豆激酶在高端产品的应用中受到限制，而柱层析法存在操作步骤繁琐复杂、成本高、不易产业化等问题，也使得其很难在纳豆激酶的工业化生产中推广。鉴于此，本发明提出一种纳豆激酶的制备方法，简单易操作、成本低、可以用于工业化生产，且生产出的纳豆激酶具有高纯度及高活性，实现了产业化生产高纯度、高活性纳豆激酶，突破了纳豆激酶的发展瓶颈。
图1至图3为本发明提出的制备方法的实施例。
请参阅图1，本发明提出的纳豆激酶的制备方法包括以下步骤：
步骤S10、将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液。
为提高纳豆激酶的纯度，在对纳豆菌发酵液进一步纯化处理之前，需要先对其进行固液分离，除去其中的发酵残渣和纳豆杆菌等大部分杂质。除杂过程可以通过自然沉降、过滤、抽滤或者离心的方式进行，在本实施例中，优选为，先采用分离效果更佳的离心分离其中的菌体以及培养基成分，取上清液后，用砂滤棒过滤进一步除去不溶性杂质，且离心分离时的工艺参数分别为转速为8000～12000r/min，离心时间为10～15min。
除此之外，在步骤S10实施时，纳豆菌发酵液可以直接选用通过培养纳豆菌种得到的发酵液，也可以自行以纳豆制品或纳豆激酶制品为原料制备得到，在本发明提供的另一实施例中，请参阅图3，在步骤S10之前，还包括以下步骤：
步骤S10a、从纳豆制品或纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，测定所述菌液的产酶能力，并挑选出最大酶活的菌株作为出发菌株；
步骤S10b、将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落；
步骤S10c、挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的种子液；
步骤S10d、将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液。
枯草芽孢杆菌联产纳豆激酶和γ-聚谷氨酸，γ-聚谷氨酸可作为纳豆激酶的保护剂，使得纳豆激酶的活性得以保障，而且枯草芽孢杆菌对纳豆激酶高表达，本发明选用纳豆制品或纳豆激酶制品作为原材料，分离出枯草芽孢杆菌并培养得到菌液，并挑选出其中最大酶活的菌株作为出发菌株，提高了纳豆激酶的初始酶活。其中，测定所述菌液的产酶能力可以通过纤维蛋白平板法进行，出现在纤维蛋白平板上的具有最大溶解圈的菌株即为最大酶活的菌株，可以作为出发菌株。
纳豆激酶的发酵方式主要有固体发酵和液体发酵两种，其中，液体发酵具有规模易扩大、易于工业化的优点。步骤S10b、S10c以及S10d详述了对出发菌株的发酵培养过程，在这一过程中，发酵采用的培养基、发酵温度、发酵时间以及发酵时的搅拌转速都会影响到菌的生长情况，进而影响酶活性。
其中，所述斜面培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L，NaCl 9～10g/L以及琼脂粉1.5～1.8％；所述液体种子培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L以及NaCl 9～10g/L，且所述液体种子培养基pH为7.0～8.0；所述发酵培养基包括：蔗糖18～30g/L，黄豆粉9～15g/L，甘油0～6g/L，KH2PO4 1.5～3g/L，K2HPO4·3H2O 10～18g/L，CaCl2 0～0.5g/L以及MgSO4 0～0.5g/L。
具体来说，步骤S10b中，培养的时间优选为22～24h。步骤S10d中，接种量优选为发酵培养基的0.5％～5％(体积比)，发酵温度优选为25～40℃，发酵时间优选为24～72h。步骤S10c可以分成两次发酵进行，包括：挑取单菌落接种于液体种子培养基中，于25～40℃温度下培养12～16h，得种子液；将所述种子液按体积比0.5％～1％接种于所述液体种子培养基中，于25～40℃温度下继续培养12～16h，得扩大培养的种子液；其中，所述培养时的转速为150～500r/min。
步骤S20、将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液。
粗酶液中除纳豆激酶之外，还含有其他组分，要提高纳豆激酶纯度就得先除去这些其他组分。膜分离技术以压差为驱动力，通过膜孔大小起到分离作用，这一过程中无相变化，因此并不会影响到纳豆激酶的酶活性，对制备高活性纳豆激酶有积极作用，而且由于滤膜可以反复多次使用、处理量大且处理时间短，因此，采用膜分离技术可以用于连续化生产。而根据纳豆激酶的分子量大小，选用孔径由大到小的多级膜进行分离，可以提高纳豆激酶的纯度。
在步骤S20实施时，可以选择两层、三层或者更多层的滤膜逐级分离，直至得到高纯度的浓缩液。为进一步优化这一步骤，降低损失的纳豆激酶量、提高除杂率，在本发明提供的另一实施例中，请参阅图2，步骤S20包括：
步骤S210、将所述粗酶液通过陶瓷膜过滤，得一级透过液；
步骤S220、将所述一级透过液通过一级超滤膜过滤，得二级透过液；
步骤S230、将所述二级透过液通过二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
步骤S240、将所述一级浓缩液通过纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
需要说明的是，比膜孔小的物质和溶剂一起通过膜，即为透过液；比膜孔大的物质被截留，即为浓缩液。也就是说，收集粗酶液中分子量小于陶瓷膜及一级超滤膜截留分子量的部分，再收集这一部分中分子量大于二级超滤膜及纳滤膜的部分，即能得到提纯效果最好的浓缩液。
而由于纳豆激酶的分子量在10～50KDa的范围内，因此，在本实施例中，所述陶瓷膜截留的分子量优选为90～100KDa；所述一级超滤膜截留的分子量优选为45～50KDa；所述一级超滤膜截留的分子量优选为15～10KDa；所述纳滤膜截留的分子量优选为1～5KDa。这样一来，大部分纳豆激酶会被截留在一级浓缩液中，部分透过二级超滤膜的纳豆激酶也能被纳滤膜截住。
步骤S30、用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液。
其中，所述超滤法精细提纯包括：
将所述洗脱液通过截留分子量为1～5KDa的超滤膜浓缩，收集浓缩液。
与常规层析分离方法比较，大孔吸附树脂法具有下列优点：纯化效果好；处理时间短；树脂可再生，节约成本，利于产业化；条件温和，能最大程度地保留酶活性。
步骤S40、将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。
其中，所述真空低温微波干燥的温度为30～40℃，干燥时间为24～48h。
经过上述多次纯化，纳豆激酶的纯度已达到最高，再经干燥即能得到干品，但温度过高会导致酶失活，因此，多选用冷冻干燥法，而本发明提出的真空低温微波干燥与冷冻干燥相比，不仅可以对纳豆激酶快速干燥，而且设备投入和运行成本都大大降低。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)菌株的筛选
从纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，用纤维蛋白平板法测定菌液的产酶能力，挑选出在纤维蛋白平板上溶解圈最大的菌株作为出发菌株。
(2)制备培养基
按以下组分分别制备斜面培养基、液体种子培养基以及发酵培养基：
斜面培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉1.6％；
液体种子培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.0；
发酵培养基：蔗糖24g/L，黄豆粉12g/L，甘油4g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4·3H2O16.4g/L，CaCl2 0.2g/L，MgSO4 0.3g/L。
(3)菌株的发酵培养
将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基中培养24h后，形成菌落；
从菌落中挑取单菌落于5ml液体种子培养基中，于28℃，180r/min的恒温摇床中培养12h，然后按照1％的接菌量转接于500ml液体种子培养基中，相同条件下继续培养12h，得扩大培养的种子液；
将扩大培养的种子液按体积比2％的接种量转接入发酵培养基中，在发酵罐中培养48h，得纳豆菌发酵液，其中，发酵罐的温度为30℃，搅拌转速为250r/min。
(4)发酵液的预处理
将纳豆菌发酵液用离心机以10000r/min转速离心10min，取上清液用砂滤棒过滤，得粗酶液。
(5)膜分离
将粗酶液通过截留的分子量为100KDa的陶瓷膜过滤，收集一级透过液；
将所述一级透过液通过截留的分子量为50KDa的一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过截留的分子量为10KDa的二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过截留的分子量为2KDa的纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
(6)大孔吸附树脂层析纯化
采用HPD-400大孔吸附树脂做进一步纯化。大孔吸附树脂柱的规格为内径20cm，高50cm；处理后的树脂采用10ml/min的流速使样液流过柱体，上样后待所述浓缩液进入柱床时加入体积浓度为40％的乙醇溶液以10ml/min的流速进行洗脱，将洗脱液通过核酸蛋白检测仪，将同一出峰范围内的洗脱液合并；
再将洗脱液通过截留分子量为2k Da的超滤膜浓缩，得精酶液。
(7)干燥
将精酶液在30℃条件下真空低温微波干燥24h，得纳豆激酶干品，并于4℃条件下保藏。
对制得的纳豆激酶干品进行检测：
经SDS-PAGE电泳分析，其电泳图谱中仅呈现单一条带，说明制得的纳豆激酶具有高纯度；
根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法检测纳豆激酶的酶活力以及蛋白含量，测得酶活力为6430FU/g，蛋白含量为220mg/g。
实施例2
(1)菌株的筛选
从纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，用纤维蛋白平板法测定菌液的产酶能力，挑选出在纤维蛋白平板上溶解圈最大的菌株作为出发菌株。
(2)制备培养基
按以下组分分别制备斜面培养基、液体种子培养基以及发酵培养基：
斜面培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉1.5％；
液体种子培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.0；
发酵培养基：蔗糖24g/L，黄豆粉12g/L，甘油4g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4·3H2O16.4g/L，CaCl2 0.2g/L，MgSO4 0.3g/L。
(3)菌株的发酵培养
将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基中培养24h后，形成菌落；
从菌落中挑取单菌落于5ml液体种子培养基中，于28℃，180r/min的恒温摇床中培养12h，然后按照1％的接菌量转接于500ml液体种子培养基中，相同条件下继续培养16h，得扩大培养的种子液；
将扩大培养的种子液按体积比2％的接种量转接入发酵培养基中，在发酵罐中培养48h，得纳豆菌发酵液，其中，发酵罐的温度为30℃，搅拌转速为250r/min。
(4)发酵液的预处理
将纳豆菌发酵液用离心机以10000r/min转速离心15min，取上清液用砂滤棒过滤，得粗酶液。
(5)膜分离
将粗酶液通过截留的分子量为90KDa的陶瓷膜过滤，收集一级透过液；
将所述一级透过液通过截留的分子量为45KDa的一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过截留的分子量为15KDa的二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过截留的分子量为2KDa的纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
(6)大孔吸附树脂层析纯化
采用HPD-400大孔吸附树脂做进一步纯化。大孔吸附树脂柱的规格为内径20cm，高50cm；处理后的树脂采用10ml/min的流速使样液流过柱体，上样后待所述浓缩液进入柱床时加入体积浓度为40％的乙醇溶液以10ml/min的流速进行洗脱，将洗脱液通过核酸蛋白检测仪，将同一出峰范围内的洗脱液合并；
再将洗脱液通过截留分子量为2k Da的超滤膜浓缩，得精酶液。
(7)干燥
将精酶液在40℃条件下真空低温微波干燥24h，得纳豆激酶干品，并于4℃条件下保藏。
对制得的纳豆激酶干品进行检测：
经SDS-PAGE电泳分析，其电泳图谱中仅呈现单一条带，说明制得的纳豆激酶具有高纯度；
根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法检测纳豆激酶的酶活力以及蛋白含量，测得酶活力为6130FU/g，蛋白含量为215mg/g。
实施例3
(1)菌株的筛选
从纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，用纤维蛋白平板法测定菌液的产酶能力，挑选出在纤维蛋白平板上溶解圈最大的菌株作为出发菌株。
(2)制备培养基
按以下组分分别制备斜面培养基、液体种子培养基以及发酵培养基：
斜面培养基：酵母提取物6g/L，胰蛋白胨9g/L，NaCl 9g/L，琼脂粉1.8％；
液体种子培养基：酵母提取物6g/L，胰蛋白胨9g/L，NaCl 9g/L，pH＝7.5；
发酵培养基：蔗糖30g/L，黄豆粉15g/L，甘油6g/L，KH2PO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O10g/L。
(3)菌株的发酵培养
将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基中培养22h后，形成菌落；
从菌落中挑取单菌落于5ml液体种子培养基中，于37℃，150r/min的恒温摇床中培养16h，然后按照1％的接菌量转接于500ml液体种子培养基中，相同条件下继续培养16h，得扩大培养的种子液；
将扩大培养的种子液按体积比5％的接种量转接入发酵培养基中，在发酵罐中培养72h，得纳豆菌发酵液，其中，发酵罐的温度为40℃，搅拌转速为250r/min。
(4)发酵液的预处理
将纳豆菌发酵液用离心机以8000r/min转速离心13min，取上清液用砂滤棒过滤，得粗酶液。
(5)膜分离
将粗酶液通过截留的分子量为100KDa的陶瓷膜过滤，收集一级透过液；
将所述一级透过液通过截留的分子量为50KDa的一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过截留的分子量为10KDa的二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过截留的分子量为1KDa的纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
(6)大孔吸附树脂层析纯化
采用HPD-400大孔吸附树脂做进一步纯化。大孔吸附树脂柱的规格为内径20cm，高50cm；处理后的树脂采用10ml/min的流速使样液流过柱体，上样后待所述浓缩液进入柱床时加入体积浓度为40％的乙醇溶液以10ml/min的流速进行洗脱，将洗脱液通过核酸蛋白检测仪，将同一出峰范围内的洗脱液合并；
再将洗脱液通过截留分子量为1k Da的超滤膜浓缩，得精酶液。
(7)干燥
将精酶液在40℃条件下真空低温微波干燥48h，得纳豆激酶干品，并于4℃条件下保藏。
对制得的纳豆激酶干品进行检测：
经SDS-PAGE电泳分析，其电泳图谱中仅呈现单一条带，说明制得的纳豆激酶具有高纯度；
根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法检测纳豆激酶的酶活力以及蛋白含量，测得酶活力为6430FU/g，蛋白含量为219mg/g。
实施例4
(1)菌株的筛选
从纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，用纤维蛋白平板法测定菌液的产酶能力，挑选出在纤维蛋白平板上溶解圈最大的菌株作为出发菌株。
(2)制备培养基
按以下组分分别制备斜面培养基、液体种子培养基以及发酵培养基：
斜面培养基：酵母提取物5.5g/L，胰蛋白胨9.2g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉1.7％；
液体种子培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨9g/L，NaCl 9g/L，pH＝8.0；
发酵培养基：蔗糖18g/L，黄豆粉9g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4·3H2O 18g/L，CaCl20.5g/L，MgSO4 0.5g/L。
(3)菌株的发酵培养
将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基中培养23h后，形成菌落；
从菌落中挑取单菌落于5ml液体种子培养基中，于25℃，500r/min条件下在发酵罐中培养14h，然后按照1％的接菌量转接于500ml液体种子培养基中，相同条件下继续培养14h，得扩大培养的种子液；
将扩大培养的种子液按体积比5％的接种量转接入发酵培养基中，在发酵罐中培养72h，得纳豆菌发酵液，其中，发酵罐的温度为25℃，搅拌转速为250r/min。
(4)发酵液的预处理
将纳豆菌发酵液用离心机以12000r/min转速离心10min，取上清液用砂滤棒过滤，得粗酶液。
(5)膜分离
将粗酶液通过截留的分子量为100KDa的陶瓷膜过滤，收集一级透过液；
将所述一级透过液通过截留的分子量为50KDa的一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过截留的分子量为10KDa的二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过截留的分子量为5KDa的纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
(6)大孔吸附树脂层析纯化
采用HPD-400大孔吸附树脂做进一步纯化。大孔吸附树脂柱的规格为内径20cm，高50cm；处理后的树脂采用10ml/min的流速使样液流过柱体，上样后待所述浓缩液进入柱床时加入体积浓度为40％的乙醇溶液以10ml/min的流速进行洗脱，将洗脱液通过核酸蛋白检测仪，将同一出峰范围内的洗脱液合并；
再将洗脱液通过截留分子量为5k Da的超滤膜浓缩，得精酶液。
(7)干燥
将精酶液在37℃条件下真空低温微波干燥36h，得纳豆激酶干品，并于4℃条件下保藏。
对制得的纳豆激酶干品进行检测：
经SDS-PAGE电泳分析，其电泳图谱中仅呈现单一条带，说明制得的纳豆激酶具有高纯度；
根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法检测纳豆激酶的酶活力以及蛋白含量，测得酶活力为6530FU/g，蛋白含量为230mg/g。
实施例5
(1)菌株的筛选
从纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，用纤维蛋白平板法测定菌液的产酶能力，挑选出在纤维蛋白平板上溶解圈最大的菌株作为出发菌株。
(2)制备培养基
按以下组分分别制备斜面培养基、液体种子培养基以及发酵培养基：
斜面培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉1.6％；
液体种子培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.0；
发酵培养基：蔗糖20g/L，黄豆粉11g/L，甘油3g/L，KH2PO4 2.5g/L，K2HPO4·3H2O14g/L，CaCl2 0.2g/L，MgSO4 0.2g/L。
(3)菌株的发酵培养
将出发菌株接种于新鲜的斜面培养基中培养24h后，形成菌落；
从菌落中挑取单菌落于5ml液体种子培养基中，于40℃，220r/min的恒温摇床中培养12h，然后按照1％的接菌量转接于500ml液体种子培养基中，相同条件下继续培养12h，得扩大培养的种子液；
将扩大培养的种子液按体积比0.5％的接种量转接入发酵培养基中，在发酵罐中培养24h，得纳豆菌发酵液，其中，发酵罐的温度为25℃，搅拌转速为250r/min。
(4)发酵液的预处理
将纳豆菌发酵液用离心机以10000r/min转速离心10min，取上清液用砂滤棒过滤，得粗酶液。
(5)膜分离
将粗酶液通过截留的分子量为100KDa的陶瓷膜过滤，收集一级透过液；
将所述一级透过液通过截留的分子量为50KDa的一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过截留的分子量为10KDa的二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过截留的分子量为2KDa的纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
(6)大孔吸附树脂层析纯化
采用HPD-400大孔吸附树脂做进一步纯化。大孔吸附树脂柱的规格为内径20cm，高50cm；处理后的树脂采用10ml/min的流速使样液流过柱体，上样后待所述浓缩液进入柱床时加入体积浓度为40％的乙醇溶液以10ml/min的流速进行洗脱，将洗脱液通过核酸蛋白检测仪，将同一出峰范围内的洗脱液合并；
再将洗脱液通过截留分子量为2k Da的超滤膜浓缩，得精酶液。
(7)干燥
将精酶液在30℃条件下真空低温微波干燥24h，得纳豆激酶干品，并于4℃条件下保藏。
对制得的纳豆激酶干品进行检测：
经SDS-PAGE电泳分析，其电泳图谱中仅呈现单一条带，说明制得的纳豆激酶具有高纯度；
根据日本纳豆激酶协会建立的酶活测定方法检测纳豆激酶的酶活力以及蛋白含量，测得酶活力为6810FU/g，蛋白含量为252mg/g。
综上所述，本发明提供的制备方法制备的纳豆激酶具有高纯度、高活性。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种纳豆激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；
将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；
用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；
将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。
2.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤中，
所述离心时，转速为8000～12000r/min，离心时间为10～15min；
所述过滤时，采用砂滤棒过滤。
3.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液的步骤中，包括：
将所述粗酶液通过陶瓷膜过滤，得一级透过液；
将所述一级透过液通过一级超滤膜过滤，得二级透过液；
将所述二级透过液通过二级超滤膜浓缩，得一级浓缩液；
将所述一级浓缩液通过纳滤膜浓缩，得最后的浓缩液。
4.如权利要求3所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述陶瓷膜截留的分子量为90～100KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为45～50KDa；所述一级超滤膜截留的分子量为15～10KDa；所述纳滤膜截留的分子量为1～5KDa。
5.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液的步骤中，所述超滤法精细提纯包括：
将所述洗脱液通过截留分子量为1～5KDa的超滤膜浓缩，收集浓缩液。
6.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品的步骤中，所述真空低温微波干燥的温度为30～40℃，干燥时间为24～48h。
7.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤之前，还包括以下步骤：
从纳豆制品或纳豆激酶制品中进行枯草芽孢杆菌菌株的分离和纯化后，经液体发酵得到菌液，测定所述菌液的产酶能力，并挑选出最大酶活的菌株作为出发菌株；
将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落；
挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的种子液；
将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液。
8.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述出发菌种接种于斜面培养基中培养，形成菌落的步骤中，
所述斜面培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L，NaCl 9～10g/L以及琼脂粉1.5～1.8％；和/或，
所述培养的时间为22～24h。
9.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述挑取单菌落接种于液体种子培养基中培养，形成扩大培养的菌液的步骤，包括：
挑取单菌落接种于液体种子培养基中，于25～40℃温度下培养12～16h，得种子液；
将所述种子液按体积比0.5％～1％接种于所述液体种子培养基中，于25～40℃温度下继续培养12～16h，得扩大培养的种子液；
其中，所述液体种子培养基包括：酵母提取物5～6g/L，胰蛋白胨9～10g/L以及NaCl 9～10g/L，且所述液体种子培养基pH为7.0～8.0；和/或，
所述培养时的转速为150～500r/min。
10.如权利要求7所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将所述扩大培养的种子液接种于发酵培养基中培养，得纳豆菌发酵液的步骤，包括：
将所述扩大培养的种子液按体积比0.5％～5％接种于发酵培养基中，于25～40℃温度下培养24～72h，得纳豆菌发酵液；
其中，所述发酵培养基包括：蔗糖18～30g/L，黄豆粉9～15g/L，甘油0～6g/L，KH2PO41.5～3g/L，K2HPO4·3H2O 10～18g/L，CaCl2 0～0.5g/L以及MgSO4 0～0.5g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910170443.8A CN109722426A (zh) | 2019-03-06 | 2019-03-06 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910170443.8A CN109722426A (zh) | 2019-03-06 | 2019-03-06 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109722426A true CN109722426A (zh) | 2019-05-07 |
Family
ID=66301955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910170443.8A Pending CN109722426A (zh) | 2019-03-06 | 2019-03-06 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109722426A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111394405A (zh) * | 2019-05-14 | 2020-07-10 | 江苏臻大天园健康科技有限公司 | 一种纳豆发酵液中维生素k2提取工艺 |
| CN111820420A (zh) * | 2020-08-01 | 2020-10-27 | 武汉真福医药股份有限公司 | 一种高活性富硒纳豆粉的制备方法 |
| CN115094053A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979530A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-23 | 湖北国力生物技术开发有限公司 | 一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法 |
-
2019
- 2019-03-06 CN CN201910170443.8A patent/CN109722426A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979530A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-23 | 湖北国力生物技术开发有限公司 | 一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 胡宜亮等: "纳豆激酶高产菌株产酶特点及其干燥工艺的研究", 《河南科学》 * |
| 陈景鑫等: "超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化", 《食品科技》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111394405A (zh) * | 2019-05-14 | 2020-07-10 | 江苏臻大天园健康科技有限公司 | 一种纳豆发酵液中维生素k2提取工艺 |
| CN111820420A (zh) * | 2020-08-01 | 2020-10-27 | 武汉真福医药股份有限公司 | 一种高活性富硒纳豆粉的制备方法 |
| CN115094053A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高效分离纯化纳豆激酶的方法及其在制备纳豆激酶粉中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109722426A (zh) | 一种纳豆激酶的制备方法 | |
| CN110317783A (zh) | 脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法和护肤品 | |
| CN110272932B (zh) | 一种灵芝孢子粉多糖肽的制备方法 | |
| CN104774182B (zh) | 麦角硫因的提取及纯化方法 | |
| CN109722427B (zh) | 一种纳豆激酶冻干粉的制备方法 | |
| CN104387488B (zh) | 一种微生物发酵提取仙草多糖的方法 | |
| CN109824796A (zh) | 燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法 | |
| CN109082382A (zh) | 冬虫夏草中国被毛孢zjb18002及其应用 | |
| CN112813001B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用 | |
| CN101385523A (zh) | 猕猴桃提取物制备方法及由该方法提取的提取物和饮料 | |
| CN110438027B (zh) | 产多种酶类的解淀粉芽孢杆菌菌株gutu06及其筛选方法 | |
| CN105400858A (zh) | 一种北虫草多肽的制备方法 | |
| CN116617271A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物及其制备方法和应用 | |
| CN108191991A (zh) | 一种杏鲍菇多糖的提纯方法 | |
| CN108441535A (zh) | 三酶一酵桑蚕肽的生产方法 | |
| CN105200102B (zh) | 从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法 | |
| CN114250216A (zh) | 一种纳豆激酶的分离纯化方法 | |
| CN108570016A (zh) | 一种pf1022a分离纯化的方法 | |
| CN106490520A (zh) | 一种具有降压功能的扇贝裙边发酵产物的制作方法 | |
| KR20130044460A (ko) | 스테비아를 이용한 생균제 제조방법 | |
| CN112841659A (zh) | 一种蛹虫草肽冲剂及制备方法 | |
| CN105309872A (zh) | 一种纳豆菌粉的制备方法 | |
| CN101353648A (zh) | 一种提取杂交酸模超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN115895916B (zh) | 一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN111549083B (zh) | 侧耳木霉菌株zj-03在工业大麻精深加工中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190507 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |