CN101979530A - 一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，涉及治疗血栓病的纳豆激酶的分离提取技术领域，解决了目前纳豆激酶纯化工艺复杂，不适合工业化生产的问题。采用乙醇沉淀粗提、阴阳离子交换树脂层析和HPD-400大孔吸附树脂精制来分离纯化得到纳豆激酶纯品，本发明采用适于工业化生产的柱层析填充材料，代替了常用的昂贵的凝胶等材料，收率可达59％，纯度95％以上，具有收率高、成本低、可以进行规模化生产的特点，基本解决了工业化生产中纳豆激酶分离纯化的瓶颈问题，为高效率分离得到高纯度、高酶活的纳豆激酶创造了条件，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法

技术领域

本发明主要是涉及一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法。属于分离纯化技术领域。

背景技术

血栓疾病包括动脉血栓疾病和静脉血栓疾病，其已成为世界人口死亡和致残的主要原因之一，世界各国的科研人员都在针对如何攻克血栓性疾病这一顽症而积极的开展各项工作，因此溶栓药物有巨大的市场潜力。

现阶段普遍使用的抗血栓药物主要分为抗血小板类药物、抗凝血药物和溶血栓药物三大类。目前所使用的溶栓药物在带来一定疗效的同时，也带来相应的毒副作用。纳豆激酶作为新一代溶栓药物具有药理作用直接且多元化、体内半衰期长、分子量相对较小可直接通过胃肠系统被人体吸收、安全性高、价格便宜等诸多优点。因此，纳豆激酶的研究开发工作得到进一步的重视和关注。

分离纯化技术一直是制约纳豆激酶开发应用的关键问题，目前常用的分离纯化方法包括盐析，膜分离、柱层析等。刘跃金等发明的纳豆激酶纯化工艺及冻干粉针中采用硫酸铵分级沉淀，凝胶柱过滤，虽然取得很好的效果，但操作容量有限，生产成本高。陈景鑫等直接采用超滤技术对纳豆激酶粗液进行提取，达到分离纯化的目的，减少了酶蛋白的损失，但是超滤系统的稳定性较低，难以进行工业化生产。陆丽霞等通过硫酸铵分级盐析法和PhenylSepharose疏水柱层析进行分离纯化，纯化倍数14.82，比活力达到47098.04IU/mg，回收率为44.03％。该技术纯化效果较好，但目前仅适合于实验室规模。总之目前的分离纯化方法都存在工业生产困难和收率低等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，在前处理中改进传统的硫酸铵分级沉淀法，采用了乙醇沉淀法取得了很好的分离效果，同时与膜分离等分离技术相比，不仅经济适用，而且更适合工业化大生产的实际操作。在纯化过程中采用了适合工业化生产的离子交换树脂和大孔吸附树脂进行纯化，避免了常规的凝胶柱不适合大规模纯化的缺点，可以反复再生利用，成本较低，生产周期较短，使提纯能力大大提高，工艺更加稳定、可靠。

一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，采用如下步骤：

(1)发酵液的预处理：发酵所得的约10L发酵液放罐后立即进行板框过滤。转移至沉淀罐。将研细的(NH₄)₂SO₄按照20％饱和度加入到沉淀罐中，4℃下保存过夜，弃去沉淀，收集上清液备用。将上清液移至另一沉淀罐，加乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀，用10mmol/LpH9.0的磷酸缓冲液溶解。定容到1L。

(2)阴离子交换树脂去杂：阴离子交换柱采用的树脂是Styrene-DVB大孔强碱性苯乙烯系，其操作步骤为：装柱、10mmol/LpH 9.0的磷酸缓冲液平衡、上样、收集滤过液、浓缩。

(3)阳离子交换介质分离：阳离子交换树脂选择Styrene-DVB大孔强酸性苯乙烯系，其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡、上样、磷酸缓冲液洗柱、含1.0mol/LNaCI的磷酸盐缓冲液洗脱、分部收集、测定各部分活性和纯度、收集合并活性部分、浓缩。

(4)大孔吸附树脂层析纯化：大孔吸附树脂层析时采用HPD-400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)，其操作步骤为：装柱、平衡、上样、40％乙醇洗脱；分部收集，测定酶活和纳豆激酶含量，合并高酶活和高含量的洗脱液。

(5)冷冻干燥：采用薄膜浓缩法对洗脱液进行除菌和浓缩，冷冻干燥，得到纳豆激酶纯品。

在上述纯化方法中，步骤(1)所述将纳豆菌发酵液采用板框过滤去除杂质，或采用离心去杂，转速8000～12000r.min^-1，离心时间5～10min。

在上述纯化方法中，步骤(2)所述的阴离子交换层析柱的规格为内径5～7.5cm，高20～30cm；或内径10～15cm，高40～60cm。

在上述纯化方法中，步骤(3)所述的阳离子交换层析柱的规格为内径5～7.5cm，高20～30cm；或内径10～15cm，高40～60cm。

在上述纯化方法中，步骤(4)所述的大孔吸附树脂柱的的规格为内径10～15cm，高30～50cm；或内径20～30cm，高50～70cm。

在上述纯化方法中，步骤(5)所述的滤膜为0.22μm滤膜。

在上述纯化方法中，步骤(5)所述的冷冻干燥条件为：冷冻温度-40℃，真空干燥温度5～10℃，冷冻干燥时间24～36h。

经过纯化的纳豆激酶采用纤维蛋白平板法测定活性为36000IU/mg。经SDS-PAGE考马斯亮蓝法(Braford)电泳分析显示得到单一条带的纳豆激酶产品，分子量为27.7kD，这与文献报道的NK的精确分子量27782相符。

本发明的积极效果是：1、采用乙醇沉淀分离纳豆激酶，最大限度的保存酶的活力，避免了盐析处理降低酶活力的缺点以及膜分离在操作过程中容易使膜孔堵塞等不利于连续化生产的缺点，同时省去了耗时较长的透析脱盐过程。2、采用离子交换层析柱和大孔吸附树脂等材料层析，与传统方法采用的层析介质相比，填料价格低廉，且易于活化再生，能够反复使用。此外采用的层析柱柱体载样量大，而凝胶过滤的处理量十分有限，不适合处理大量的酶液，所以本研究能够一次处理大量的酶液，易于工业化放大生产，使得纳豆激酶的分离纯化成本大大降低，所得的纳豆激酶纯品经SDS-PAGE电泳检验为单一条带，最终的纯化倍数为10.4，酶活回收率为59％，可见此方法为纳豆激酶的工业化生产奠定了基础。而目前分离纯化方法中主要的瓶颈在于效率和纯度很难统一。如果要得到高纯度的酶，就必须经过若干分离纯化的步骤，消耗较多的时间；如果要得到大量的酶，又无法得到高的纯度。而本研究与同类方法相比，通过优化离子交换介质及洗脱条件，回收率得到了进一步的提高，分离工艺更加稳定、可靠，比活也有较大幅度的提高，可以得到高纯度的纳豆激酶。同时采用适合批量生产的层析方法，使柱层析处理量大大增加，而且能够实现连续化生产，该方法尤其适用于工业化规模制备高纯度纳豆激酶。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

1、发酵液的预处理

发酵所得约10L发酵液放罐后立即进行板框过滤。转移至沉淀罐。将研细的(NH₄)₂SO₄按照20％饱和度加入到沉淀罐中，4℃下保存过夜，弃去沉淀，收集上清液备用。将上清液移至另一沉淀罐，加乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀，用10mmol/LpH 9.0的磷酸缓冲液溶解。定容到1L，测定各项指标。

2、阴离子交换树脂去杂

用Styrene-DVB大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂)去除杂质和色素等。阴离子交换层析柱的规格为内径7.5cm，高30cm；树脂先用10mmol/LpH 9.0的磷酸缓冲液平衡好，然后调节上柱溶液的离子浓度，以10mL/min的流速将其加入柱中，收集滤过液。

3、阳离子交换树脂分离

选择Styrene-DVB大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂做为离子交换的介质。柱规格为内径7.5cm，高30cm；树脂先用10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡好，调节所得滤过液的离子浓度，以12mL/min的流速上样，用磷酸缓冲液洗柱后，用含1.0mol/L NaCI的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。

4、大孔吸附树脂层析分离

采用HPD-400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)作进一步纯化。大孔吸附树脂柱的的规格为内径10cm，高30cm；处理后的树脂采用上样量6mL/min的速度流过柱体，上样后待样液进入柱床，并与柱床基本平齐时加入40％体积浓度的乙醇溶液进行洗脱；以6mL/min的速度进行洗脱，分部收集，并进行活性及纳豆激酶含量测定。

5、冷冻干燥

将纳豆激酶洗脱液采用0.22μm滤膜进行过滤除菌，然后在冷冻温度为-40℃下，真空干燥温度为5℃条件下冷冻干燥36h，获得纳豆激酶纯品。

纳豆激酶精品经SDS-PAGE电泳分析呈单条带，纤维蛋白平板法测酶活力为35380IU/mg，检测蛋白质含量为193.5μg/kg。

实施例2

1、发酵液的预处理

发酵罐所得发酵液约10L放罐后立即进行离心，转速8000r/min，离心时间10min。收集上清液备用。将研细的(NH4)₂SO₄按照20％的饱和度加入到上述上清液中，4℃下保存过夜，再在10000r/min下离心30min，弃去沉淀。取上清液约7L加乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜后10000r/min下离心30min，弃去上清液，沉淀用10mmol/LpH 6.4的磷酸缓冲液溶解。定容到500mL。分别用上清液和沉淀溶解液点样测定酶活。

2、阴离子交换树脂去杂

用Styrene-DVB大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂去除杂质和色素等。阴离子交换层析柱的规格为内径5cm，高20cm；树脂先用10mmol/L pH 9.0的磷酸缓冲液平衡好；调节上柱溶液的离子浓度，以8mL/min的流速将其加入柱中，收集滤过液。

3、阳离子交换树脂分离

选择Styrene-DVB大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂做为离子交换的介质。柱规格为内径5cm，高20cm；树脂先用10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡好；调节所得滤过液的离子浓度，以8mL/min的流速上样。用磷酸缓冲液洗柱后，用含1.0mol/LNaCI的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。

4、大孔吸附树脂层析分离

采用HPD-400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)作进一步纯化。大孔吸附树脂柱的的规格为内径15cm，高40cm；处理后的树脂采用上样量8mL/min的速度流过柱体。上样后待样液进入柱床，并与柱床基本平齐时加入40％体积浓度的乙醇溶液进行洗脱；以8mL/min的速度进行洗脱，分部收集，并进行活性及纳豆激酶含量测定。

5、冷冻干燥

将纳豆激酶洗脱液采用0.22μm滤膜进行过滤除菌，然后在冷冻温度为-40℃下，真空干燥温度为8℃条件下冷冻干燥30h，获得纳豆激酶纯品。

纳豆激酶精品经SDS-PAGE电泳分析呈单条带，纤维蛋白平板法测酶活力为36400IU/mg，测蛋白质含量为183.2μg/kg。

Claims (7)

1.一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，包括以下步骤：

(1)发酵液的预处理：发酵所得约10L发酵液放罐后立即进行板框过滤或离心去杂，滤液转移至沉淀罐。将研细的(NH₄)₂SO₄按照20％饱和度加入到沉淀罐中，4℃下保存过夜，弃去沉淀(沉淀为初步分离的杂蛋白)，收集上清液备用。将上清液移至另一沉淀罐，加入乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀，用10mmol/L pH9.0的磷酸缓冲液溶解残渣，定容到1L，测定各项指标。

(2)阴离子交换树脂去杂：用Styrene-DVB大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂)去除杂质和色素。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 9.0的磷酸缓冲液平衡、上样、收集滤过液、浓缩。

(3)阳离子交换介质分离：选择Styrene-DVB大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂做为离子交换的介质。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡、上样、磷酸缓冲液洗柱、含1.0mol/L NaCI的磷酸盐缓冲液洗脱、分部收集、测定各部分活性和纯度、收集合并活性部分、浓缩。

(4)大孔吸附树脂层析纯化：采用HPD-400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)进一步纯化以得到95％以上的纯品。其操作步骤为：装柱、平衡、上样、40％乙醇洗脱；分部收集，测定酶活和纳豆激酶含量，合并高酶活和高含量的洗脱液。

(5)冷冻干燥：采用薄膜浓缩法对洗脱液进行除菌和浓缩，冷冻干燥，得到纳豆激酶纯品。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(1)所述将纳豆菌发酵液采用板框过滤去除杂质。或采用离心去杂，采用高速冷冻离心机，转速8000～12000r/min，离心时间5～10min。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(2)所述的阴离子交换所用的树脂是取1.2kg用15倍于树脂量的0.5mol/L HCl浸泡30～120分钟，以水清洗至pH7.0，之后用0.5mol/L HCl浸泡30～120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡，装成柱体积为2L的层析柱。

4.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(3)所述的阳离子交换树脂柱是取1.2kg用15倍于树脂量的0.5mol/L NaOH浸泡30～120分钟，以水清洗至pH 7.0，之后用0.5mol/LHCl浸泡30～120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡，装成柱体积为2L的层析柱。

5.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(4)所述的树脂的预处理采用如下方法：称取1.6kg的树脂，加2％的NaOH浸泡过夜，用蒸馏水洗至中性，再加95％乙醇浸泡2h，然后用蒸馏水洗至乙醇完全除尽，置于50℃恒温烘箱中烘干备用。

6.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(5)所述的滤膜为0.22μm滤膜。

7.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(5)所述的冷冻干燥条件为：冷冻温度-40℃，真空干燥温度5～10℃，冷冻干燥时间24～36h。