KR20030084098A - 혈전용해제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈전용해제에 관한 것으로 특히 혈전용해제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

식생활이 서구화 되면서 심장 및 혈관계질환이 급증하고 있다.심혈관계질환은 발병되면 대개 사망률이 높거나 반신불수 되는 아주 무서운 병으로 예방만이 대책이다. 경구용으로 혈전용해제가 일본 전통식품인 나토에서 발견 되었으나 대량생산이 어려워 현재 까지 실용가치가 없었다. 이에 본 발명은 B.subtilis KCCM 12512(IF03335)균주를 배양조건의 최적화를 통해 실용화 단계에 도달한 혈전용해제의 제조방법에 관한것이다.

Description

혈전용해제 및 그 제조방법{Fibrinolytic enzyme and it's preparation}

본 발명은 혈전을 용해시키는 효소의 제조에 관한 것으로 특히 혈전용해제 및 그 제조방법에 관 한 것이다.

식생활이 서구화 되면서 심장 및 혈관계 질환이 급증하고 있다.심혈관계 질환은 전세계적으로 사망률 1위를 차지하고 있으며 심혈관계 질환을 치료 하는 의약품등이 다양하게 개발 시판되고 있의나 부작용 및 경제적인 측면에서 문제점이 대두 되고 있다. 특히 심혈관계질환은 발병되면 대개 사망률이 높거나 반신불수 되는 경우가 매우 높은 질병이다. 예방만이 대책이나 대개 마땅한 의약품이나 치료제가 없다. 이에 따라 뇌졸중, 심근경색, 혈전증 등을 평상시 식품으로 섭취하여 예방을 통해 방지 하거나 개선시킬 수 있는 기능성소재가 절실히 필요하다. 1987년 일본의 스미박사는 일본의 전통식품인 나토에서 혈전용해효소를 발견하고 나토키나제 (Nattokinase)라 명명하였다. 나토키나제는 대두에는 없지만 콩을 발효시킬 때 나토균이 대두의 영양성분을 섭취, 생육하면서 만들어 내는 혈전용해효소이다.

이효소를 생산 하는 미생물은 Bacillus subtilis 또는 Bacillus nato로 동정 및 명명 되었다.

또한 국내에서도 전통 발효식품인 청국장이 일본의 나토와 마찬가지로 콩을 원료로 하여 발효시켜 섭취해온점에 착안하여 청국장으로부터 혈전용해능이 있는 균주를 분리 하여 특허등록(97-593)되여 혈전용해제의 새로운 가능성을 보여 주었다.

그러나 이러한 노력에도 불구하고 혈전용해제 즉 나토키나제는 그 생산량이 적어 지속적인 공급과 가격적인 면에서 많은 어려움이 있다.

즉 뇌혈전증, 뇌졸중, 심근경색, 혈전증 과 같은 심혈관계질환은 그 예방이 절대적으로 필요하며 평상시 꾸준한 장복으로 즉 식품으로 섭취하여 미연에 방지 하거나 개선 시켜야만 되면 특히 기존 의약품은 주사제로서 사용이 불편하며 일반인의 예방차원과는 거리가 있었는데 경구투여가 가능한 혈전용해제의 출현이 매우 필요하였다.

현재까지 식품으로 즉 경구투여가 가능한 혈전용해능이 있는 것으로는 나토키나제, 구인동결건조분말등 이며 그 외 보고는 거의 없는 형편이다.

따라서 본 발명자들은 일본의 나토에서 분리한 나토키나제를 기능성식품소재로서 대량생산 할 필요가 있고 효소의 분리 정제 방법을 개선하여 경제성 및 실효성이 있는 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 B.subtilis KCCM 12512 (IFO 3335)를 이용하여 혈전용해능이 우수한 효소 (나토키나제)를 대량생산하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 혈전용해능이 있는 효소를 생산하는 B. subtilis KCCM 12512를 배지조성, 온도, 등 최적조건을 조성하여 효소 생산을 최적화하고 그 효소의 정제 수율을 높였다. 최적 배양조건을 조사하기 위해 탄소원으로 glucose, fructose, lactose, mannose, soluble starch , sucrose, maltose, galactose, arabinose 등을 사용하였으며 질소원으로는 Bacto-beef extract, Bactopeptone, Yeast-extract , 탈지대두분, Bactosoytone, 등 을 사용하였으며 배양온도는 25도 에서 40도까지 조사 하였다. 특히 산소 요구량은 균체량(cell mass)에 많은 영향을 주는 요소로 shaker Incubator 상 에서 100-300rpm 까지 조사하였다.

(실시예 1)

본 발명의 균주 B. subtilis CCM12512 (IFO 3335)를 영양한천 배지에 도말하고 24시간 배양후 각 colony를 액체 배지에 각각 한 백금이씩 접종하고 37C에서 흔들어 주면서 24시간 배양후 원심분리하여 그 상등액을 혈전용해활성 시험하였다. 혈전용해 활성 시험 방법은 다음과 같다.

100mM 붕산염 완충용액(ph7.8)에 피브리노겐을 1.0%가 되도록 용해시키고 완전히 용해된 피브리노겐 10ml를 10mm인 petri dish에 놓는다.

여기에 트롬빈(50unit/ml) 0.1ml를 첨가하여 혼합한 후 좌우로 흔들어 준 뒤 10-30분간 방치하여 고화시킨다. 각 시료 30ul를 취하여 피브린 평판위에 방울의 모양이 유지되도록 조심스럽게 점적하고 흔들리지 않게 37C에서 18시간 배양한다.

피브린 평판이 녹아서 투명해진 원의 지름을 측정하고 평균 지름을 구한다.

(실시예 2)

B. subtilis KCCM12512를 대조군 영양배지 20ml에 접종하고 본 발명배지이하 바이오 배지 (glucose 0.5%, 탈지대두분2,0%, yeast-extrat,0.5%)20ml에 각각 접종한후 20시간 동안 37C에서 300rpm으로 교환하면서 배양후 원심분리 (10,000rpm, 30분)하여 균체를 제거하고 0.45u/ml의 필터를 통과 시켰다. 이 배양액을 위에서 기술한 활성측정 방법으로 혈전용해 활성도를 측정하여 다음 표 1에 나타내었다. 그 결과 영양배지를 대 조구로 하였을 경우보다 본 발명 배지에서 생산한 배양액에서 20배의 높은 혈전용해 활성을 나타내었다.

(실시예 3)

B. subtilis KCCM12512를 37도에서 종배양후 7L바이오배지를 조제후 10L 발효(한국발효기기)에 넣고 자체 살균후 종배양을 접종하고 37도에서 1.0vvm , 100rpm 으로 교반하면서 24시간 배양후 원심분리 하여 균체를 제거하고 0.45um의 필터를 통과시켜 배양액 6.5L를 얻었다. 상기 배양액을 UF멤브레인 시스템(sartocon MWCN: 10,000)으로 4도에서 24시간 정치하여 배양액의 단백질을침전시켰다. 그후 원심분리하여 상등액을 여과 농축 시킨뒤 농축액 2L를 얻었다. 상기 농축액에 3배의 에탄올(ethanol)을 첨가후 제거하고 남은 침전물을 다시 증류수에 용해하여 침전물을 제거후 -70도에서 동결 시킨후 진공건조 하였다. 이와 같은 방법으로 혈전용해능을 갖은 혈전용해제 65g을 얻었다.

(실시예 4)

실시예 3)과 같이 B.subtilis KCCM12512 (IFO 3335)를 바이오배지 70L를 100L발효조(한국발효기기) 에 넣고 121도 60분간 살균후 37C에서 24시간 배양하였다. 이때 공기량은 1,000m, 100rpm 이였다. 배양후 원심분리하여 균체를 제거하고 0,45um의 필터를 통과시켜 배양액 65L를 얻었다. 상기 배양액을 UF system을 이용하여 20L로 농축하였다. 농축액에 3배의 에탄올 (ethanol)을 첨가후 4C에서 24시간 정치하여 배양액의 단백질을 침전시켰다.

원심분리하여 상등액을 제거후 침전물을 다시 증류수에 용해후 -70C에서 동결시킨후 진공건조하였다. 혈전용해제 700g을 얻었다.

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Claims (1)

1. B. subtilis KCCM12512 (IFO 3335)균주를 포도당 0,2-1,0%, 탈지대두분 1,0-5,0%, 효모추출물 0.2-5,0% 배지에 접종후 37C에서 24시간 배양후 배양액을 UF system으로 농축후 3배량의 에탄올로 침전시켜 -7OC에서 진공건조하여 혈전용해능이 있는 효소를 제조하는법