CN105441350B - 产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN‑01CGMCC No.9754菌株对人类和环境均无害，使用安全；该菌株能够产生具有溶解血栓活性、纳豆激酶活性(溶纤活性)和纤维素酶活性的代谢物，是一种能够产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌。在培养48h后，BUABN‑01菌株发酵液中的溶纤活性为3297.0IU/mL发酵液，纤维素酶活力为0.1IU/mL发酵液，血栓溶解率达到40％以上。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN‑01CGMCC No.9754培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
芽孢杆菌属于厚壁菌门(Firmicutes)，是能形成芽孢(内生孢子)的杆菌，它们对外界有害因子抵抗力强。目前，研究最多的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽杆菌(B.anthracis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、嗜气芽孢杆菌(B.aerophilus)等。其中，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是一种多功能的微生物，在饲料工业、污水处理、生物肥发酵和发酵床制作中具有广泛应用。
目前临床上治疗血栓的药物，都具有一定的局限性，如毒性强、副作用大、生产成本高、价格昂贵及体内半衰期比较短等。微生物具有体积小、结构简单、生长繁殖快、代谢旺盛等特征，如果能找到可以产生具有溶栓活性的代谢物且安全性好的细菌(如枯草芽孢杆菌)，就能开发新一代的溶栓剂或保健食品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用微生物制备具有多种酶活性的物质。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株枯草芽孢杆菌。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9754。该菌种已于2014年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落生长迅速。菌落表面初期光滑，后期粗糙不透明，白色至污白色，边缘初期光滑后变粗糙。菌株细胞大小为(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，着色均匀。培养24小时以上大量形成芽孢。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。
本发明所提供的菌剂，它的活性成分是所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754和/或所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01CGMCCNo.9754的代谢物。
所述菌剂具有下述1)-4)中的至少一种功能：
1)具有产溶栓活性(溶解血栓活性)的物质的功能；
2)具有产溶纤活性的物质的功能；
3)具有产纳豆激酶活性的物质的功能；
4)具有产纤维素酶活性的物质的功能。
所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754或所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的代谢物，或所述菌剂的下述1)-4)中至少一种应用：
1)在制备具有溶栓活性(溶解血栓活性)的物质中的应用；
2)在制备具有溶纤活性的物质中的应用；
3)在制备具有纳豆激酶活性的物质中的应用；
4)在制备具有纤维素酶活性的物质中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的方法。
本发明所提供的培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCCNo.9754的方法，包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754在用于培养枯草芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备所述菌剂的方法。
本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括将所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754和/或所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的代谢物作为活性成分，得到所述菌剂的步骤。
制备所述菌剂的方法，还可包括在液体培养基中培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的步骤。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的代谢物可从所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的发酵液中获得。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCCNo.9754，除去液体培养物(发酵液)中的所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01CGMCC No.9754即得到所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的代谢物。
上文中，所述液体培养基具体可为发酵培养基。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种发酵生产具有下述1)-4)中至少一种活性的物质的方法，包括在培养基中培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754，收集发酵液，得到具有下述1)-4)中至少一种活性的物质：
1)溶栓活性(溶解血栓活性)；
2)溶纤活性；
3)纳豆激酶活性；
4)纤维素酶活性。
上述一种发酵生产具有下述1)-4)中至少一种活性的物质的方法中，所述培养采用的培养温度可为20-50℃，具体可为30-40℃，进一步的，具体可为35-37℃；培养时间为24-96h，具体可为40-48h，进一步的，具体可为44-48h。
上述一种发酵生产具有下述1)-4)中至少一种活性的物质的方法中，所述培养基含有碳源和氮源。所述碳源可为葡萄糖、麦芽糖或淀粉，具体可为葡萄糖；所述氮源可为酵母提取物或蛋白胨，具体可为酵母提取物。
上述一种发酵生产具有下述1)-4)中至少一种活性的物质的方法中，每升所述培养基可按照如下方法配制：葡萄糖15g，酵母提取物5g，硫酸镁5g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钙1.2g，用水定容至l000mL，将pH值调为7.0-7.2。
实验证明，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCCNo.9754菌株对人类和环境均无害，使用安全；该菌株能够产生具有溶解血栓活性、纳豆激酶活性(溶纤活性)和纤维素酶活性的代谢物，是一种能够产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌。在培养48h后，BUABN-01菌株发酵液中的纳豆激酶活性(溶纤活性)为3297.0IU/mL发酵液，纤维素酶活力为0.1IU/mL发酵液，血栓溶解率达到40％以上。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
保藏说明
菌种名称：枯草芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus subtilis
菌株编号：BUABN-01
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年10月10日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9754
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株的菌落形态。
图2为光学显微镜下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCCNo.9754菌株的细胞形态(10*40)。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株的生长曲线。
图4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株的16SrDNA基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图中S为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株的16s rDNA基因的PCR扩增产物；M为DNA Marker。
图5为基于16S rDNA序列的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCCNo.9754菌株的系统发育分析图。
图6为芽孢杆菌遗传距离分析图。
图7为尿激酶标准曲线。
图8为葡萄糖标准曲线
图9为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01粗酶液体外溶栓活性测定。其中，A和B分别为对照组0h和5h溶栓情况，C和D分别为3号处理组0h和5h溶栓情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH7.0-7.2，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌30min，主要用于菌种分离与保藏。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH7.0-7.2，蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌30min。
发酵培养基：葡萄糖15g，酵母提取物5g，硫酸镁5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，氯化钙1.2g，pH值7.0-7.2，蒸馏水l000mL，121℃湿热灭菌30min。主要用于产纳豆激酶发酵。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株的分离及鉴定
一、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的分离
采取山西省大同市煤矿地区土壤，通过稀释土壤样品，利用加热稀释土壤溶液至亚致死温度和培养基中的高pH值作为筛选条件，初筛出具有一定抗逆性的菌株。将初筛获得的具有一定抗逆性的菌株，根据枯草芽孢杆菌能分泌纳豆激酶的特性，制作纤维蛋白平板，复筛出具有溶纤活性的菌株，编号为BUABN-01。
二、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的鉴定
1、形态学鉴定
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754(简称BUABN-01菌株)在牛肉膏蛋白胨培养基上进行培养，BUABN-01菌株的菌落形态如图1所示，菌落表面初期光滑，后期粗糙不透明，白色至污白色，边缘初期光滑后变粗糙。
将BUABN-01菌株在光学显微镜下观察，具体实验步骤如下：
1)涂片：取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14-16h的枯草芽孢杆菌斜面上挑取少量菌苔加入到水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
2)干燥：室温(20-25℃)自然干燥。
3)固定：固定时通过火焰2-3次即可，此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4)染色：滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)，先用吕氏碱性美蓝染色1-2min，再用石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。
5)水洗：倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。
6)干燥：自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7)镜检：涂片干燥后镜检。
结果如图2所示，BUABN-01菌株细胞大小为(0.7-0.8)μm×(2-3)μm，着色均匀。培养24小时以上大量形成芽孢。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
2、生长曲线的测定
将BUABN-01菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上37℃活化24h，然后接种到含有10mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，37℃在摇床中以180rpm的转速进行恒温培养，每隔4h取菌液进行OD600的测量，绘制菌株的生长曲线。
结果如表1和图3所示，BUABN-01菌株在牛肉膏蛋白胨液体培养基中经过9h的对数增长期后，达到稳定期。
表1、BUABN-01菌液不同时间点的OD600值
时间(h) 0 4 8 12 16
OD<sub>600</sub> 0 0.15 0.29 0.30 0.32
3、生理生化测定
1)糖醇利用试验
用生长18-24h的幼龄菌接种至4种不同碳源(D-葡萄糖、果糖、D-木糖和D-甘露醇)的培养基中，30℃培养7-14d观察指示剂颜色的变化，若变黄，则表示发酵产酸，试验重复三次。
2)生长温度范围试验
取新鲜菌划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，分别置于温度为4℃、20℃、30℃、40℃、45℃和50℃的培养箱中进行培养，以在30℃培养箱中进行培养的菌株为阳性对照，观察菌株能否生长，试验重复三次。
3)耐盐试验
将牛肉膏蛋白胨液体培养基中NaCl的质量浓度分别调至2％、5％、7％和10％，各取100μL菌液等量接种到含有不同质量浓度NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养3-7d，接种到含有不同质量浓度NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基中的菌株分别以不接种的含有与接种菌株相同质量浓度NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基为阴性对照，观察菌株生长情况，试验重复三次。
4)生长pH值范围试验
将牛肉膏蛋白胨液体培养基用pH计分别调节pH值至5.0、6.0、7.0和8.0，分装试管，每管5mL，灭菌备用。各取100μL菌液等量接种到不同pH值的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃培养7d，接种到不同pH值的牛肉膏蛋白胨液体培养基中的菌株分别以不接种的与接种菌株相同pH值的牛肉膏蛋白胨液体培养基为阴性对照，观察其生长情况，试验重复三次。
5)柠檬酸盐利用试验
取新鲜菌划线接种于柠檬酸盐培养基斜面上，30℃培养3-7d后观察结果。培养基呈现碱性颜色(指示剂蓝色或桃红色)表明菌株利用了有机酸，记为阳性，否则为阴性，试验重复三次。
6)V-P试验(甲基乙酰甲醇试验)
取100μL菌液接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，30℃培养7d，以不接种的磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基为阴性对照。检测时与质量浓度为40％的NaOH溶液等体积混合，再滴入200μL质量浓度为0.3％的肌酸溶液，猛烈振荡2-10min后，若培养液出现红色，即为V-P阳性反应，如未变色则为阴性，试验重复三次。
7)接触酶试验
取新鲜菌体划线接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，30℃培养24h，将体积百分浓度为3％的双氧水直接滴加于菌苔上，观察有无气泡产生，若30s内有气泡产生则为阳性，无气泡产生即为阴性，试验重复三次。
8)吲哚反应试验
取100μL菌液接种于胰蛋白胨水培养基中，30℃培养2-4d，检测时加入3-5mL的对二甲基氨基苯甲醛试剂，若在液层界面形成红色圆环，则表明有吲哚产生，记为阳性，否则记为阴性，试验重复三次。
9)淀粉水解试验
取新鲜菌以点接法接种于淀粉水解培养基平板上，30℃培养1-2d，检测时在平板上滴加碘液，覆盖到整个菌落，若菌落周围有无色透明圈出现，则说明淀粉被水解，记为阳性，试验重复三次。
10)卵磷脂酶试验
用75％的乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用经火焰灭菌的镊子将鸡蛋打一个孔，倾去蛋清，然后用5mL无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的琼脂培养基中，使卵黄体积含量为培养基总体积的2-3％，混匀后倒平板，点接菌种，30℃培养24h后观察，若菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性，试验重复三次。
11)苯丙氨酸脱氨酶试验
取新鲜菌划线接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于37℃培养8-24h观察结果。检测时在斜面上滴加4-5滴质量浓度为10％的FeCl3溶液，若培养基呈现出绿色，表明有苯丙酮酸产生，记为阳性，颜色不变记为阴性，试验重复三次。
12)酪氨酸试验
将待测菌以点接法接种于酪氨酸试验培养基平板上，30℃培养1-2d后观察，若酪氨酸变透明记为阳性，否则记为阴性，试验重复三次。
13)酪素水解试验
取新鲜菌以点接法接种于酪素培养基平板上，30℃培养24-48h，检测时观察有无水解圈产生，若有记为阳性，否则记为阴性，试验重复三次。
BUABN-01菌株的生理生化结果如表2所示。
表2、BUABN-01菌株的生理生化特征
注：“+”代表阳性或生长，“-”代表阴性或不生长。
4、分子鉴定
将BUABN-01菌株培养后提取DNA，进行16s rDNA的PCR扩增，具体步骤如下：用枪头挑取活化菌落，溶于100μL无菌水中，混匀后取1μL作为模板，并加入如下引物、dNTP、Taq酶和去离子水进行PCR扩增反应，引物序列如下：16(+)F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’，16(-)R：5’-TACGGCTACCTTGTTACG ACTTCACCCC-3’。反应体系如下：
PCR反应条件如下：
将BUABN-01菌株的16S rDNA序列的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示：得到约1.5Kb的DNA片段。测序后，通过Blast进行序列比对分析，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754与枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)GenBank Accession Number为AB018486.1的菌株相似性为99.7％，根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754的形态特征和16S rDNA序列，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。BUABN-01菌株的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列长度为1445bp。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754已于2014年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9754。
实施例2、利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株生产具有纳豆激酶活性(溶纤活性)的代谢物
实验重复三次，每次重复的实验方法如下：将BUABN-01菌株接一环于发酵培养基中，37℃培养24h得到种子液，以3％的接种量将种子液接到装有100mL发酵培养基的500mL的三角瓶中，37℃、180rpm(旋转半径20mm)振荡培养，分别于培养24h、48h、72h和96h时各取3个三角瓶中的发酵液，于12000rpm离心10分钟，取上清液，称为粗酶液，按照如下方法测定获得的BUABN-01菌株的粗酶液的纳豆激酶活性(溶纤活性)：
1)pH值7.2的磷酸盐缓冲液：将144mL浓度为0.2M的Na2HPO4溶液加入56mL浓度为0.2M的NaH2PO4溶液中，然后再加入1.8g NaCl，完全溶解后即配制成浓度为0.2M的磷酸盐缓冲液，pH值7.2。
2)将200mg纤维蛋白原(Sigma)溶解于20mL浓度为0.2M，pH值7.2的磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为10mg/mL的纤维蛋白原溶液，置于40℃水浴锅中备用。
3)将1000U凝血酶(Biotopped)溶解于5mL浓度为0.2M，pH值7.2的磷酸盐缓冲液中，配置成浓度为200U/mL的凝血酶溶液。
4)将1g琼脂糖溶解于50mL浓度为0.2M，pH值7.2的磷酸盐缓冲液中，加热使其溶解，配置成浓度为20mg/mL的琼脂糖溶液，置于60℃水浴锅中备用。
5)将50μL浓度为200U/mL的凝血酶溶液加入直径为90mm的无菌平皿中，并加入2mL浓度为0.2M，pH值7.2的磷酸盐缓冲液进行稀释；再取3mL浓度为10mg/mL的纤维蛋白原溶液与5mL浓度为20mg/mL的琼脂糖溶液混合，然后迅速摇匀倒入平皿中，溶液迅速凝固，生成乳白色薄层，即为纤维蛋白平板。
6)尿激酶标准曲线的制备：采用浓度为0.2M，pH值7.2的磷酸盐缓冲液将尿激酶(中国食品药品检定研究院)分别配置成浓度为155、310、620、1240和2480IU/mL的尿激酶溶液。在步骤5)制备的纤维蛋白平板上打五个孔，在每个孔中依次加入上述不同浓度的尿激酶溶液20μL，移入37℃恒温培养箱中，保温18h后取出，测定每个浓度的尿激酶溶解透明圈的互相垂直的两个直径，计算出半径，两半径乘积表示为溶解透明圈的面积，计算各溶解透明圈的面积。以溶解透明圈的面积(简称透明圈面积)为横坐标，以尿激酶酶活力的对数值为纵坐标作图，获得标准曲线(图7)。
7)在步骤5)制备的纤维蛋白平板上打四个孔，在每个孔中依次加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株发酵培养24、48、72和96h的粗酶液20μL，移入37℃恒温培养箱中，保温18h后取出，测定每个时间点粗酶液的溶解透明圈的互相垂直的两个直径，计算出半径，两半径乘积表示为溶解透明圈的面积，计算各溶解透明圈的面积，根据步骤6)的尿激酶标准曲线计算每个时间点的粗酶液中的纳豆激酶活性(溶纤活性)，得出BUABN-01菌株发酵培养24、48、72和96h的发酵液中的纳豆激酶活性(溶纤活性)。
实验结果见表3，在发酵培养48h时，BUABN-01菌株发酵液的纳豆激酶活性(溶纤活性)最高，为3297.0IU/mL发酵液，说明BUABN-01菌株能够产生具有纳豆激酶活性(溶纤活性)的代谢物。
表3、各时间点BUABN-01菌株发酵液的纳豆激酶活性
发酵时间(h) 24 48 72 96
酶活(IU/mL发酵液) 100.6 3297.0 1279.5 522.5
实施例3、利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株生产具有纤维素酶活性的代谢物
1、3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂配制
酒石酸钾钠18.2g，溶于50mL蒸馏水中，加热，得到酒石酸钾钠的水溶液，向加热的酒石酸钾钠的水溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，室温保存。
2、浓度为20mM、pH 6.8的磷酸盐缓冲液配制
取49mL浓度为0.2M的Na2HPO4溶液和51mL浓度为0.2M的NaH2PO4溶液，混匀得到浓度为0.2M、pH 6.8的磷酸盐缓冲液。以蒸馏水稀释10倍，即为浓度为20mM、pH6.8的磷酸盐缓冲液。
3、制作DNS标准曲线
将105℃烘干葡萄糖用浓度为20mM、pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，分别配置成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mM的葡萄糖溶液。以不同浓度葡萄糖溶液与DNS试剂等体积(250μL)混合，置于沸水中水浴5min，最后在流水下冷却至室温。测定不同浓度的葡萄糖溶液的吸光度值OD530，制作DNS标准曲线(图8)，得到标准曲线y＝2.420x+1.377。
4、纤维素酶活力测定
实验重复三次，每次重复的实验方法如下：将BUABN-01菌株接一环于发酵培养基中，37℃培养24h得到种子液，以3％的接种量将种子液接到装有100mL发酵培养基的500mL的三角瓶中，37℃、180rpm(旋转半径20mm)振荡培养48h,取3个三角瓶中的发酵液，于12000rpm离心10分钟，取上清液，称为粗酶液。
以100μL质量浓度为1％的羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶液为底物(用浓度为20mM，pH为6.8的磷酸盐缓冲液配置)，加入20μL粗酶液，置于50℃下反应30min，得到反应液。向反应液中加入250μL DNS试剂，并置于沸水中水浴5min，最后在流水下冷却至室温并加入130μL的去离子水摇匀，测定OD530。将等体积浓度为20mM，pH为6.8的磷酸盐缓冲液代替粗酶液得到的反应液作为对照。
纤维素酶的活力单位(IU)：在50℃，pH6.8的条件下，1min产生1μmol葡萄糖所需要的纤维素酶量为一个酶活力单位。
结果如表4所示，BUABN-01菌株发酵液中的纤维素酶活力为0.1IU/mL发酵液，说明BUABN-01菌株能够产生具有纤维素酶活性的代谢物。
表4、BUABN-01菌株发酵液的纤维素酶活力
编号 OD<sub>530</sub> 纤维素酶活力
对照组 1.269 0
BUABN-01菌株发酵液 1.413 0.1IU/mL发酵液
实施例4、利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BUABN-01 CGMCC No.9754菌株生产具有溶栓活性(溶解血栓活性)的代谢物
将BUABN-01菌株接一环于发酵培养基中，37℃培养24h得到种子液，以3％的接种量将种子液接到装有100mL发酵培养基的500mL的三角瓶中，37℃、180rpm(旋转半径20mm)振荡培养48h,取3个三角瓶中的发酵液，于12000rpm离心5分钟，取上清液，称为粗酶液。
取家兔动脉血自然凝血成块，用手术刀切成1.5g大小的凝血块(血块初始重量)，置于生理盐水中备用。将粗酶液用浓度为0.30M氯化钠溶液进行等体积稀释，制成等渗粗酶液。将等渗粗酶液与生理盐水(浓度为0.15M)进行混合，分别获得1号(6mL等渗粗酶液+14mL生理盐水)、2号(12mL等渗粗酶液+8mL生理盐水)和3号(18mL等渗粗酶液+2mL生理盐水)混合液，分别将1号、2号和3号混合液加入到9cm培养皿中，并加入上述1.5g大小的凝血块，室温下置于脱色摇床上70rpm震荡处理5h，观察凝血块的溶解效果并将处理后的凝血块取出称重(血块处理后重量)。以相同条件下，加入等体积生理盐水处理后的凝血块作为对照。
溶栓率＝(1-血块处理后重量/血块初始重量)×100％
结果如表5和图9所示，不同添加剂量的等渗粗酶液均具有良好的溶栓效果，均达到40％以上，说明BUABN-01菌株能够产生具有溶解血栓活性的代谢物。
表5、BUABN-01菌株发酵液的溶解血栓活性
编号 血块初始重量/g 血块处理后重量/g 溶栓率(％)
1 1.5 0.8965 40.2
2 1.5 0.8373 44.2
3 1.5 0.7435 50.4
对照组 1.5 1.3036 13.1

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的菌株号为BUABN-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9754。
2.一种菌剂，它的活性成分是权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的代谢物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述1)-4)的4种功能：
1)具有产溶栓活性的物质的功能；
2)具有产溶纤活性的物质的功能；
3)具有产纳豆激酶活性的物质的功能；
4)具有产纤维素酶活性的物质的功能。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌，或权利要求2或3所述菌剂的下述1)-4)的4种应用：
1)在制备具有溶栓活性的物质中的应用；
2)在制备具有溶纤活性的物质中的应用；
3)在制备具有纳豆激酶活性的物质中的应用；
4)在制备具有纤维素酶活性的物质中的应用。
5.培养权利要求1所述枯草芽孢杆菌的方法，包括将权利要求1所述枯草芽孢杆菌在用于培养枯草芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
6.制备权利要求2或3所述菌剂的方法，包括将权利要求1所述枯草芽孢杆菌和权利要求1所述枯草芽孢杆菌的代谢物作为活性成分，得到所述菌剂。
7.一种发酵生产具有下述1)-4)的活性的物质的方法，包括在培养基中培养权利要求1所述枯草芽孢杆菌，收集发酵液，得到具有下述1)-4)的活性的物质：
1)溶栓活性；
2)溶纤活性；
3)纳豆激酶活性；
4)纤维素酶活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养采用的培养温度为20-50℃，培养时间为24-96h。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述培养采用的培养温度为30-40℃，培养时间为40-48h。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述培养采用的培养温度为35-37℃，培养时间为44-48h。
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