CN116064302B - 底部脱硫弧菌sg127及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了底部脱硫弧菌SG127及其应用，该底部脱硫弧菌SG127的分类学命名为Fundidesulfovibrio sp.，于2022年09月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62821。在本发明中，发明人首次发现并分离得到的一株Fundidesulfovibrio属新菌种Fundidesulfovibrio SG127，该菌株为严格厌氧、革兰氏阴性、运动、顶端单生鞭毛。且该菌株具有固氮菌功能和产生碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚‑AS‑BI‑磷酸水解酶、酶脂和类脂酯酶的能力，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及底部脱硫弧菌SG127及其应用。
背景技术
水稻是中国的第一大粮食作物，而氮是水稻产量的主要限制因子之一。目前，水稻生长主要氮素来源主要依靠化学氮肥和生物固氮。
近年来，化学氮肥的施用显著的提高了水稻的产量，但化学氮肥的生产是利用Haber-Bosch工艺合成氨，该过程须在高温高压过程中进行，据统计，这一过程对于能源的消耗约占全球总能源消耗的1％，但却释放出占全球二氧化碳排放总量1.4％的二氧化碳，而且长期施用大量氮肥会造成一定程度的环境污染。此外，长期施用化学肥料也会致使水稻土壤微生物群落结构发生改变，从而降低了水稻田固氮菌多样性。有研究发现，关键固氮微生物菌群在长期不施肥的环境下呈系统发育聚集状态，而施肥条件下则呈现随机性状态，从而导致了其生物固氮功能逐渐退化。
生物固氮是水稻田的一种重要过程，是在微生物固氮酶的作用下将环境中的N2转化为植物可以直接吸收利用的NH4 +，该过程能维持水稻田淹水状态下氮素的平衡，减少化学肥料施用，降低环境污染。研究表明，生物固氮是可持续环境友好的，被认为是植物氮素来源的最佳选择。生物固氮在生态系统中普遍存在，占全球固氮量的50％以上。
底部脱硫弧菌属(Fundidesulfovibrio)是脱硫弧菌科下的一类严格厌氧、革兰氏阴性细菌。目前，已发现的底部脱硫弧菌属仅包含2个有效种，关于底部脱硫弧菌属资源研究报道甚少。全球可培养微生物约为1％，而厌氧微生物纯培养物占全球可培养微生物不到0.1％，大部分厌氧微生物处于未培养状态。因此，挖掘具有固氮菌功能的微生物新种是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种底部脱硫弧菌SG127及其应用。在本发明中，发明人从水稻土壤中发现并分离得到了一株底部脱硫弧菌SG127，经多相分类(生理生化、化学和基因型特性)分析证明该SG127菌株为Fundidesulfovibrio属的新种，命名为Fundidesulfovibrio sp.。且通过试验发现，该菌株具有较好的固氮特性和产酶效果。
本发明的第一个方面，提供一种底部脱硫弧菌(Fundidesulfovibriosp.)SG127，所述底部脱硫弧菌SG127的分类学命名为Fundidesulfovibrio sp.，于2022年09月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO:62821。
保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127为革兰氏阴性细菌。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127菌落形状为圆形，边缘光滑，表面光滑，菌落灰白色。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127是基于无氧条件下的R2A培养基培养得到。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的生长温度范围为20～37℃。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的最适生长温度范围为30℃。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的pH适应范围为5.0～9.0。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的最适pH适应范围为7.0～8.0。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的NaCl浓度适应范围为0～0.2％(w/v)。
在本发明的一些实施方式中，所述底部脱硫弧菌SG127的最适NaCl浓度适应范围为0％。
在本发明中，发明人通过验证发现，底部脱硫弧菌SG127具有运动能力。
在本发明中，所述底部脱硫弧菌SG127具有固氮菌功能，为严格厌氧、革兰氏阴性、运动、顶端单生鞭毛。菌落为灰白色、圆形。接触酶和氧化酶反应为阴性。硫酸钠为电子受体，乙酸钠、丙酸钠、富马酸钠、乙醇、乳酸钠、苹果酸钠和丙酮酸钠能作为电子供体，但半胱氨酸和H2不能作为电子供体。
在本发明的一些实施方式中，在以乳酸钠作为电子供体时，硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和富马酸钠可以作为电子受体，而硝酸盐、氧气、硫、MnO2不能作为电子受体。在缺乏电子受体时，底部脱硫弧菌SG127菌株的生长速度明显下降，生长缓慢。而以富马酸钠和丙酮酸钠作为底物时，可观测到底部脱硫弧菌SG127菌株有微弱生长，但在以苹果酸盐和乳酸钠作为电子供体的情况下则未见底部脱硫弧菌SG127菌株生长。且SG127菌株具有产碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶和萘芬-AS-BI-磷酸水解酶的能力。
且经过基因组分析，发现SG127菌株与最相近模式菌株Fundidesulfovibrioputealis DSM16056T的16S rRNA基因相似性为97.3％。基因组DNAG+C含量为64.6％，与最相近模式菌株的ANI和dDDH分别为79.9％和23.2％，主要脂肪酸为anteiso-C15:0,anteiso-C17:1ω9c,C18:0,iso-C14:0,iso-C15:0,iso-C16:0,iso-C16:1H,iso-C18:1H和Summed Feature 9，主要呼吸醌组分为MK-7。上述结果均表明菌株SG127为Fundidesulfovibrio的新种。
本发明的第二个方面，提供一种微生物产品，所述微生物产品中含有本发明第一个方面的底部脱硫弧菌SG127。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品的剂型包括琼脂菌剂、液体菌剂、冻干菌粉、固体草炭粉剂、油干菌剂、颗粒接种剂、真空渗透接种剂。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他剂型进行使用。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品是以本发明第一个方面的底部脱硫弧菌SG127为主要活性物质的微生物产品。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品中还含有其他辅剂。
在本发明的一些实施方式中，所述辅剂包括填料、粘结剂、分散剂、润湿剂、崩解剂、稳定剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物产品包括微生物菌剂、微生物发酵产品。
当然，本领域技术人员也可以基于该底部脱硫弧菌SG127的菌种特性，开发得到其他类型的微生物产品，包括但不限于上述微生物菌剂和微生物发酵产品。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的底部脱硫弧菌SG127在固氮发酵中的应用。
在本发明中，发明人通过验证发现底部脱硫弧菌SG127的基因组中含有固氮酶核心基因元件nifHDK，且经过PCR扩增可获得nifH基因片段。基于乙炔还原法测定也表明具有较高的固氮酶活性，能够将氮气还原为作物可利用的氮肥。从而能够进一步驱动其在农业生产中用于水稻促长等应用，从而减少化学氮肥施用、降低环境污染，具有良好的应用前景。
在本发明的一些实施方式中，所述固氮发酵包括土壤固氮和有机物发酵。
在本发明中，基于底部脱硫弧菌SG127的固氮和发酵效果，该底部脱硫弧菌SG127还可以进一步用于制备菌肥，从而用于促进水稻增产或其他农业生产活动中。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的底部脱硫弧菌SG127在生物制酶中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述酶选自碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、酶脂和类脂酯酶。
在本发明中，发明人通过试验验证，底部脱硫弧菌SG127具有产生碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，但不会产生类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶。
本发明的有益效果是：
1.在本发明中，发明人首次发现并分离得到的一株Fundidesulfovibrio属新菌种Fundidesulfovibrio SG127，该菌株为严格厌氧、革兰氏阴性、运动、顶端单生鞭毛；菌落为灰白色、圆形；接触酶和氧化酶反应为阴性。硫酸钠为电子受体，乙酸钠、丙酸钠、富马酸钠、乙醇、乳酸钠、苹果酸钠和丙酮酸钠能作为电子供体，但半胱氨酸和H2不能作为电子供体。
2.本发明中的Fundidesulfovibrio SG127具有固氮菌功能，能够将氮气还原为作物可利用的氮肥，从而能够进一步驱动其在农业生产中用于水稻促长等应用，从而减少化学氮肥施用、降低环境污染，具有良好的应用前景。
3.本发明中的Fundidesulfovibrio SG127具有产生碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、酶脂(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，从而可以有效作为生物制酶的有效备选菌株或母体，以用于进行生物制酶产业的开发和利用。
附图说明
图1为本发明中的Fundidesulfovibrio SG127的基于16S rRNA基因的系统发育树图。
图2为本发明中的Fundidesulfovibrio SG127的细胞色素光谱图(A)及色素荧光图像(B)。
图3为本发明中的Fundidesulfovibrio SG127的固氮基因PCR扩增结果图。
图4为本发明中的Fundidesulfovibrio SG127的固氮酶活性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
在下述实施例中，所用的固体R2A培养基(R2A平板)的具体成分为：每升固体R2A培养基中，含有0.5g酵母浸出粉，0.5g蛋白胨，0.5g酪蛋白水解物，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g磷酸二氢钾，0.024g无水硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，15.0g琼脂，pH 7.0。制备方法为：将上述成分混合后加入蒸馏水1000mL，充分溶解，高温灭菌后即可使用。
所用的液体R2A培养基成分为：每升液体R2A培养基中，含有0.5g酵母浸出粉，0.5g蛋白胨，0.5g酪蛋白水解物，0.5g葡萄糖，0.5g可溶性淀粉，0.3g磷酸二氢钾，0.024g无水硫酸镁，0.3g丙酮酸钠，pH7.0。蒸馏水1000mL，制备方法为：将上述成分混合后加入蒸馏水1000mL，充分溶解，高温灭菌后即可使用。
所使用的基础淡水培养基的的具体成分为：每升基础淡水培养基中，含有3.0gNa2SO4，0.3g KCl，0.3g NH4Cl，1.2g NaCl，0.4g MgCl2·6H2O，0.2g KH2PO4，0.1gCaCl2·2H2O，1mL矿物质溶液(含有12.8g/L的氮川三乙酸，1.35g/L FeCl3·6H2O，0.1g/L MnCl2·4H2O，0.024g/L CoCl2·6H2O，0.1g/L CaCl2·2H2O，0.1g/L ZnCl2，0.025g/LCuCl2·2H2O，0.01g/L H3BO3，0.024g/L Na2MoO4·2H2O，1.0g/L NaCl，0.12g/L NiCl2·6H2O，4.0mg/L Na2SeO3·5H2O，4.0mg/L Na2WO4，pH 6.5)，10mM的乳酸钠，2.5g NaHCO3，4mL维生素溶液(含有2mg/L维生素H，2mg/L叶酸，10mg/L盐酸吡哆醇，5mg/L盐酸硫胺素，5mg/L烟酸，5mg/L氨基苯甲酸，5mg/L泛酸钙，0.01mg/L维生素B12，5mg/L硫辛酸)，1.0g酵母提取物和0.2g Na2S·9H2O，pH为7.4。制备方法为：将上述成分混合后加入蒸馏水1000mL，充分溶解，高温灭菌后即可使用。
实施例1
1.底部脱硫弧菌SG127菌株的分离与纯化：
取200μL梯度稀释的新鲜土壤悬浮液(土壤取样自福建省福州市仓山区上下店路15号福建农林大学实验水稻田(26.9450N,119.3771E)，由无氧无菌水稀释得到悬浮液)，涂布于含有40mM富马酸钠的R2A平板上，30℃严格厌氧培养10d。挑取平板上菌落，采用连续划线法进行纯化，直至获得单个纯培养物。所有纯化的菌株使用10％ DMSO保菌液于-80℃保藏。其中，要求所有操作均是在厌氧手套箱工作台中进行，以保证厌氧环境。
在含有40mM富马酸钠的R2A平板培养7天后对平板内的培养物进行观察，既能够发现目标菌株SG127。该SG127菌株的菌落形状为圆形，边缘光滑，表面光滑，菌落灰白色，菌落直径在0.5～1mm。
2.底部脱硫弧菌SG127菌株的生物学特性和生理生化特征检测：
采用革兰氏染色液(试剂盒，购自索莱宝)对分离得到的SG127菌株进行革兰氏染色，具体操作为：取对数期的SG127菌液一滴滴于载玻片上，通过火焰进行固定，滴加结晶紫染色液停留1分钟，水洗。滴加碘液染色1分钟，水洗。滴加脱色液，摇动玻片脱色20～60s(本实施例中为40s)。最后滴加番红染色液停留1分钟，水洗。空气中晾干后，油镜观察。
在镜检中，菌株SG127被染色成红色，说明其为革兰氏阴性细菌。
对底部脱硫弧菌SG127菌株分别进行温度适应性、pH适应性、NaCl浓度适应性进行检测，具体步骤为：
a.温度适应性：
吸取3μL SG127菌液点样至R2A培养基平板上，一式三份，分别放置于6、10、16、20、25、30、35、37、40和42℃，每个温度设置3个平行，培养两周后，测量菌落的直径。
b.pH适应性：
配置不同pH的R2A液体培养基(pH范围为5.0～11.0，梯度为0.5)，接种5％(v/v)的SG127菌液于不同pH的R2A培养基中，一式三份，培养两周后，测定菌液的吸光度(OD600)的变化。
c.NaCl浓度适应性：
配置含有0～1％(w/v，梯度为0.1％)NaCl浓度的R2A平板，吸取3μL SG127菌液点样至平板上，一式三份，两周后，测量菌落的直径。
通过对不同条件(温度、pH、NaCl浓度)下的SG127菌株进行观察与测定，发现SG127菌株的生长温度范围为20～37℃，最佳30℃；pH适应范围为5.0～9.0，最佳pH7.0～8.0；NaCl浓度适应范围为0～0.2％(w/v)，最佳0％。
进一步测定底部脱硫弧菌SG127菌株的需氧性，具体步骤为：将SG127菌株划线于R2A平板上，放置于30℃恒温培养箱好氧培养两周。
培养结束后，可以观察菌株SG127未在平板上生长形成菌落，表明在氧气条件下SG127菌株不能进行生长。
测定底部脱硫弧菌SG127菌株的运动能力，具体步骤为：利用悬滴法，取对数生长期的SG127菌液于盖玻片上，后用凹形载玻片倒置于盖玻片上，用少许玻璃胶固定，放置于光学显微镜下镜检。
排除菌做无规则的分子运动后，通过镜检可以清晰的观察到，SG127菌株具有运动能力。
测定底部脱硫弧菌SG127菌株的产酶特性，具体采用API ZYM试剂条进行检测(操作步骤见使用说明书)。
结果表明，SG127菌株具有产生碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、酯酶(C4)和类脂酯酶(C8)的能力，但不会产生类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶。
测定底部脱硫弧菌SG127菌株的电子供体与电子受体。在电子供体试验中，均以20mM的硫酸盐作电子受体，测试不同电子供体的可适用性。在电子受体试验中，均以10mM的乳酸钠作电子供体，测试不同电子受体的可适用性。具体测定方法为：将SG127菌株接种至无氧的无菌基础淡水培养基中，30℃下培养，测定生物量的变化，从而计算电子受体和供体的利用能力。
结果发现，在电子供体试验中，在以硫酸盐为电子受体的情况下，乙酸钠、丙酸钠、富马酸钠、乙醇、乳酸钠、苹果酸钠和丙酮酸钠能作为电子供体，但半胱氨酸和氢气不能作为电子供体。在电子受体试验中，在以乳酸钠作为电子供体时，硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和富马酸钠可以作为电子受体，而硝酸盐、氧气、硫、MnO2不能作为电子受体。
进一步测定底部脱硫弧菌SG127菌株的发酵生长效果：分别探究其在不加入电子受体、加入富马酸钠、乳酸钠、苹果酸钠或丙酮酸钠作为电子供体的情况下的发酵生长情况，环境及培养条件同电子供体与电子受体测试实验。
结果发现，在缺乏电子受体时，底部脱硫弧菌SG127菌株的生长速度明显下降，生长缓慢。而以富马酸钠和丙酮酸钠作为底物时，可观测到底部脱硫弧菌SG127菌株有微弱生长，但在以苹果酸盐和乳酸钠作为电子供体的情况下则未见底部脱硫弧菌SG127菌株生长。
实施例2
1.底部脱硫弧菌SG127菌株的16S rRNA基因鉴定：
使用细菌16S rRNA基因通用引物27F，序列为：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQID NO:1)和1492R，序列为：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)对底部脱硫弧菌SG127菌株进行PCR扩增。其中，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
取5μL PCR扩增产物，点样于1％的琼脂糖凝胶中，以2000bp Marker作为标准分子量，在120V电压条件下电泳15min，用凝胶成像系统观察电泳结果。其中，对检测出有条带的菌株PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。采用ContigExpress软件对测序获得的16S rRNA基因序列进行校对，去除头尾两端杂乱碱基，将获得的有效序列提交至EZBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net/)和NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行序列比对分析。若比对结果表明16S rRNA基因相似性高于98.65％，则初步判断认定其与最相近菌株处于同一种水平分类地位；反之，则判断为潜在新分类单元。
结果表明，本发明中获得的SG127菌株与最相近模式菌株Fundidesulfovibrioputealis DSM16056T的16S rRNA基因相似性为97.3％，低于原核生物种界定阈值98.65％，因此，可以判定本发明中的SG127菌株为Fundidesulfovibrio属的潜在新种。
2.底部脱硫弧菌SG127菌株的系统发育分析：
基于上述实施例中的EZBioCloud和NCBI数据库比对结果，下载数据库与分离菌株相近的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用MEGA 11软件，采用Kimura 2-parameter法计算进化距离、构建最大自然法(Maximum Likelihood)系统进化树，进行Bootstrap值为1000次重复验证。
其中，构建得到的系统进化树如图1所示，其再次印证了本发明中的SG127菌株为Fundidesulfovibrio属的潜在新种。
3.底部脱硫弧菌SG127菌株的基因组ANI和dDDH分析：
使用GGDC(Genome-to-Genome Distance Calculator)在线计算软件估算底部脱硫弧菌SG127菌株的数字DNA-DNA杂交(dDDH)情况，利用ANI Calculator计算细菌与其模式菌株间的平均核苷酸一致性(ANI)。
结果发现SG127菌株与最相近模式菌株Fundidesulfovibrio putealisDSM16056T的ANI和dDDH分别为79.9％和23.2％，低于原核生物种界定阈值96％和70％。因此，该结果表明SG127菌株是Fundidesulfovibrio属的1个新种。同时，也测得SG127菌株的基因组大小为3904129bp，DNA中G+C含量为64.6％。且基于基因组功能分析，发现SG127菌株具有固氮酶核心基因nifHDK，推测该菌株具有固氮功能。
实施例3
1.对SG127菌株进行脂肪酸检测：
具体步骤为：
挑取约40mg对数期(培养3d)的SG127菌体放入带有螺旋盖的试管中(规格13mm×100mm)。向试管中加入1.0mL的皂化试剂(45g NaOH溶于300mL甲醇：水混合液，甲醇：水＝1：1，v/v)，拧紧盖子，振荡器振荡试管5～10s，沸水浴5min，取出后继续振荡5～10s，再次拧紧盖子，水浴25min，移出试管，室温冷却。向试管中加入2.0mL的甲基化试剂(325mL 6M的盐酸加入到275mL的甲醇中)，拧紧盖子，振荡器振荡5～10s，进行80℃水浴10min，移出试管并快速用自来水冲凉冷却至室温。加入1.25mL的萃取试剂(正己烷与甲基正丁醚1：1混合)，拧紧盖子，快速振荡10min，打开管盖，用移液管吸除试管的下层似水相。向试管中加入3.0mL的洗涤试剂(10.8gNaOH加入到900mL水)，拧紧盖子，快速振荡5min，用注射器吸取出约2/3体积的上层有机体到GC小瓶中，使用气相色谱系统(Agilent 7890N)进行检测。检测程序参数为：设置汽化室的温度250℃，检测器的温度300℃，载气氢气的流速为2mL·min-1，尾吹气氮气的流速为30mL·min-1，进样分流比100：1，柱前压为68.95kPa；色谱柱采用二阶程序升温，从170℃开始升温，每分钟升温5℃，升到260℃时，再每分钟升温40℃，升到310℃时，保持90s；进样量1μL。
使用基于微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS4.5(Microbial Identification System)和LGS4.5(Library Generation Software)对数据进行分析。
检测结果表明，SG127菌株的主要脂肪酸为anteiso-C15:0,anteiso-C17:1ω9c,C18:0,iso-C14:0,iso-C15:0,iso-C16:0,iso-C16:1H,iso-C18:1H和Summed Feature 9，与Fundidesulfovibrio属的脂肪酸种类一致。
2.对SG127菌株进行醌组分分析：
将培养至对数期的SG127菌体进行离心收集后，用蒸馏水洗涤2～3次，再次离心后进行真空冷冻干燥，备用。称取约100mg冻干的SG127菌体加入40mL的氯仿：甲醇(2:l，v/v)混合溶液，置于暗处进行磁力搅拌10h左右，并于暗处用滤纸过滤，收集菌体。用减压旋转蒸发仪对菌体进行40℃减压蒸馏至干燥。用1～2mL的丙酮重新溶解干燥物，以长条状将样品点于GF 254硅胶板上。以甲苯作为展层剂，展层时间约20min，然后取出并进行风干。打开紫外灯(254nm)观察。Rf＝0.8，在绿色萤光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置。刮下Rf＝0.8的条带，用1mL的丙酮溶解，然后用细菌过滤器过滤除去硅胶，收集滤液，即得到甲基萘醌的丙酮溶液，将其置于黑暗处4℃保存。采用反相高压液相色谱分析法测定甲基萘醌样品，其中，高效液相色谱仪为Agilent 1100，反相高压液相柱为十八烷基硅烷，流动相为甲醇(色谱纯)：异丙醇(色谱纯)＝67:33(v/v)，流速为l mL·min-1，柱温为40℃。同时于250nm，270nm处进行紫外检测。
结果发现，SG127菌株的主要醌组分为MK-7，与Fundidesulfovibrio属的醌组分类型相同。
结合上述实施例中的结果，可以判定该SG127菌株为Fundidesulfovibrio属的一个新种。该SG127菌株(Fundidesulfovibrio SG127)于2022年09月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:62821，分类学命名为Fundidesulfovibrio sp。
实施例4
1.对SG127菌株进行细胞色素测定：
将SG127菌液离心重悬浮于50mM、pH为7的磷酸盐缓冲液中，在进行超声破碎处理后，4000rpm离心除去细胞碎片。通过UV-2600分光光度计(SHIMADZU，日本)在400～800nm波长扫描获得吸收图谱。
同时，取10mL的菌液离心去除上清后重悬浮于1mL的无菌水中，加入1滴20％的NaOH溶液后迅速用365nm的光进行照射，观察荧光情况。
结果如图2所示，可以发现，SG127菌株在波长630nm处检测到细胞色素亚硫酸盐还原酶(desulfoviridin)的吸收峰，且通过荧光测试验证发现有红色荧光产生，说明SG127菌株含有细胞色素亚硫酸盐还原酶。
2.对SG127菌株进行固氮能力测试：
使用固氮基因nifH通用引物对SG127菌株进行PCR扩增，判断SG127菌株是否具有固氮功能。其中，固氮基因nifH通用引物为：Pol-F，序列为5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′(SEQ ID NO:3)和Pol-R，序列为5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′(SEQ ID NO:4)。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火45s；72℃延伸450s，40个循环；最后保持72℃延仲45s。
取5μL PCR扩增产物，点样于1％的琼脂糖凝胶中，以2000bp Marker作为标准分子量，在120V电压条件下电泳15min，用凝胶成像系统观察电泳结果。
结果如图3所示。
通过利用固氮基因nifH对分离菌SG127进行PCR扩增，PCR扩增结果表明，其可以扩增得到长度约为360bp的nifH基因片段，说明SG127菌株具有固氮能力。
进一步使用乙炔还原法(ARA法)测定SG127菌株的固氮酶活性(主要基于固氮酶可以将C2H2还原为C2H4的原理进行检测)，具体步骤为：将SG127菌株用R2A培养基培养至对数期，取20mL菌液转移至无菌厌氧离心管中，6000rpm离心10min，除去上清液。用无氮基础培养基(去除NHCl4 +的基础淡水培养基)漂洗3次后，重悬浮于装有20mL的无氮基础培养基中，用He/C2H2(90：10，v/v)交换的厌氧瓶(先将厌氧瓶与厌氧橡胶塞灭菌，盖上塞子后抽真空，再按比例充入混合气)进行培养。同时，以纯He交换的厌氧瓶作为阴性对照。培养2d后，用气象色谱检测还原乙烯的含量。
同时，对其进行蛋白含量测定：将用于测定固氮酶活性的菌液充分摇匀后，取出5mL菌液于15mL离心管中，利用超声波粉碎机(JY92-ⅡDN，宁波新芝生物科技股份有限公司)进行细胞破碎，利用蛋白含量测定试剂盒(Pierce BCA protein assay kit)测定破碎菌液中的蛋白含量。
结果如图4所示。
结合乙炔还原法的结果表明，SG127菌株具有较高的固氮酶活性，且经过计算其活性可达125.2μmol C2H4 g-1protein h-1。
实施例5
含有SG127菌株的菌剂的制备：
在无菌条件下，按照1％的接种量将SG127菌株的新鲜菌体接种至除氧后无菌的R2A液体培养基中，30℃静止培养3～5d，即可制备获得含有SG127菌株的微生物菌剂。
其中，R2A液体培养基需提前利用混合气N2:CO2(80:20，vol/vol)曝气除氧0.5h以形成厌氧环境，铝盖封口后，121℃高压灭菌20min。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种底部脱硫弧菌(Fundidesulfovibrio sp.)SG127，其特征在于，所述底部脱硫弧菌SG127的分类学命名为Fundidesulfovibrio sp.，于2022年09月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:62821。
2.一种微生物产品，其特征在于，所述微生物产品中含有权利要求1所述的底部脱硫弧菌SG127。
3.根据权利要求2所述的微生物产品，其特征在于，所述微生物产品的剂型选自琼脂菌剂、液体菌剂、冻干菌粉、固体草炭粉剂、油干菌剂、颗粒接种剂或真空渗透接种剂。
4.根据权利要求2所述的微生物产品，其特征在于，所述微生物产品选自微生物菌剂或微生物发酵产品。
5.权利要求1所述的底部脱硫弧菌SG127在固氮发酵中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述固氮发酵包括土壤固氮和有机物发酵。
7.权利要求1所述的底部脱硫弧菌SG127在生物制酶中的应用；所述酶选自酯酶C4和类脂酯酶C8。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211180245.8A CN116064302B (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 底部脱硫弧菌sg127及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211180245.8A CN116064302B (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 底部脱硫弧菌sg127及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN116064302A CN116064302A (zh) | 2023-05-05 |
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- 2022-09-27 CN CN202211180245.8A patent/CN116064302B/zh active Active
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