CN103320347A - 具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌及其发酵方法，所述的枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC NO.7168，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的枯草芽孢杆菌具有更高的溶栓活性，其相对酶活力达1600IU/mL以上。

Description

具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌及其发酵方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种具有溶栓活性的枯草芽孢杆及其发酵方法。 

背景技术

纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)是从日本传统大豆发酵食品纳豆中分离得到的一种产蛋白酶益生菌，属于细菌科、枯草芽孢杆菌属的一个亚种，是好氧型革兰氏阳性菌。纳豆芽孢杆菌又称纳豆菌，它除了具有抗菌、调节肠道微生态平衡、提高免疫力等益生功能外，纳豆菌在增殖过程中产生的大量蛋白酶，能够提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等酶活性，使其发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，且使发酵产品具有多种保健功能，如抗肿瘤、降血压等作用，还可预防骨质疏松、抗氧化等。纳豆菌产生的这种蛋白酶最早由须见洋行博士发现，并命名为纳豆激酶，为纳豆菌发酵的胞外产物，是一种可溶解交联纤维蛋白的碱性丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶除有效溶解血栓外，还可降低血液粘度、抑制血小板凝固、降血脂、降胆固醇、改善血液循环状况、维持血细胞的正常形态和功能等。作为新一代的抗血栓物质，具有较大的开发潜能。又因为纳豆激酶来源于食品，无毒副作用，而且价廉易得，为此开发溶栓保健食品具有实用价值。本研究采用酪蛋白平板法从纳豆、市售纳豆菌以及昆虫与分子生物学研究所保存的37株纳豆菌株中初筛，再通过纤维蛋白平板法复筛得到一株具有高溶栓活性的菌株，并对其产溶栓酶的发酵条件进行优化，以确定该菌株产溶栓酶的最佳发酵条件，为今后开发溶栓保健食品提供理论依据。 

发明内容

本发明一方面涉及一种具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC NO.7168，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述的枯草芽孢杆菌相对尿激酶酶活力达1600IU/mL以上。 

本发明另一方面还涉及上述枯草芽孢杆菌的发酵方法，发酵条件为pH＝7.5-8.5，温度为38-42℃，装液量80-100/500mL，碳源0.4-0.6％的牛肉膏，氮源1.5-2.5％的大豆蛋白胨。；优选为pH＝8.0，温度为40℃，装液量90/500mL，碳源0.5％的牛肉膏，氮源2％的大豆蛋白胨，通过该发酵方法，可以进一步提高酶活力到1800IU/mL以上。 

微生物保藏信息 

本发明的枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.7168，保藏日期为2013年1月18日。 

具体实施方式

1材料与方法 

1.1材料 

本研究用以分离溶栓菌的样品包括：将门纳豆(大连将门食品有限公司)；燕京纳豆(北京燕京中发生物技术有限公司)；尿激酶标准品(Urokinase1280IU/支)，购于中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原(Fibriongen100mg/支)，购于Sigma公司；凝血酶(Thrombin)，购于Sigma公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司；其他均为国产分析纯。 

1.2方法 

1.2.1高效溶栓菌株的分离与初筛 

称取1g或适量样品放入10mL无菌生理盐水的试管中，37℃，200r/min培养24h，用移液器吸取1mL的菌悬液到1.5mL的离心管中，5000r/min离心5分钟，倒掉上清，再用1mL的无菌生理盐水将菌体悬起，85℃水浴5分钟，杀死大部分的营养体及杂菌。将菌液以10倍梯度稀释至10-6，每个梯度吸取100μL涂酪蛋白平板，目测菌落与透明圈比值大的进行划线，分离纯化菌株，直至为单菌落，然后活化此菌株，一部分甘油保藏，一部分作为种子接入发酵培养基，发酵处理，保存粗酶液。 

1.2.2高效溶栓菌株的复筛 

(1)粗酶液的制备 

将初筛得到的菌株接入装有10mL LB培养基的试管中，活化12h后，再从试管中吸取100μL接入液体种子培养基摇菌12h后，再按照2％的接种量接入液体发酵培养基，在37℃下培养48h。8000r/min离心10min，弃沉淀。上清用50％的硫酸铵盐析过夜，10000g/min，离心20min，弃去上清液，沉淀用1mL PBS缓 冲液溶解，即为样品粗酶液。-20℃保存备用。 

依据中华人民共和国药典(二部)和邵荣军的方法，进行综合改进后，制备纤维蛋白平板方法。根据每一种样品中蛋白质的浓度，计算出每种样品合适的点样体积，在37℃恒温培养箱中培养18h，测定溶圈的直径。以尿激酶标准曲线计算样品的相对酶活力大小。 

1.2.3菌株鉴定 

(1)菌株的形态与生化鉴定 

将分离的菌株接种到酪蛋白平板上，观察菌落形态，并进行革兰氏染色。参照马明等菌种鉴定的方法[14]进行菌种的生理生化的鉴定，包括厌氧生长、过氧化氢酶、糖发酵(蔗糖、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉)、运动性、酪蛋白水解试验、硝酸盐还原等。按照伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)对枯草芽孢杆菌的描述，对比鉴定所筛选出的高效菌株，通过酪蛋白初筛和纤维蛋白复筛两种方法相结合筛选得到一株具有高效溶栓活性的菌株，命名为HT8，相对酶活力达1637.6IU/mL。通过形态学鉴定，确定HT8菌株属于杆状菌，革兰氏阳性，菌落形态与枯草芽孢杆菌相似；又通过HT8菌株的生理生化鉴定，进一步确定HT8属于枯草芽孢杆菌属，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC7168，保藏日期为2013年1月18日。 

1.2.4菌株发酵条件的优化 

(1)单因素实验 

分别考察不同温度(28℃、31℃、34℃、37℃、40℃)、不同pH(5、6、7、8、9)、不同的接种量(1％、2％、3％、4％)、不同转速(160、180、200、220、240r/min)、不同培养体积(80mL、90mL、100mL、110mL、120mL)等因素对产酶条件的影响。4次重复试验，记录数据，利用SPSS软件进行单因素方差分析。 

参照大肠杆菌生长曲线制作的方法[18]对菌株的接种时间进行优化。取出在-80℃保藏的液体菌种，自然解冻，在超净工作台中，用移液枪取100μL接入装有10mL LB的培养基的11支无菌试管中，每支试管分别标记0，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h，37℃，200r/min摇床培养，以标记为0，盛有LB培养基但没有接种的试管调零点，测定完毕后，0试管继续放置摇床培养，按照标记的时间在600nm下测定每一支的OD值。 

经单因素发酵试验的方差分析结果表明，发酵温度、pH、摇床、转速和装液 量对HT8菌株发酵产酶有很大的影响，另外，有其他研究者实验结果表明碳源、氮源以及接种量对Bacillus natto液态发酵产纳豆激酶有很大的影响。故设计正交试验来确定HT8菌株适宜的发酵条件。正交试验见表1。 

表1正交试验统计分析 

R²＝0.940(调整R²＝0.913) 

利用SPSS统计分析软件，分析结果如表所示。从正交方差分析表中可知，A(温度)、B(pH)、C(碳源)、F(装液量)、G(氮源)的P＝0.000＜0.01，差异极其显著；D(接种量)、E(转速)的P＝0.633＞0.05，差异不显著；分析结果表明，不同温度、pH、碳源、装液量、氮源对菌株产酶活性有极显著的影响，不同接种量和转速的作用不显著，故应考察不同温度、pH、碳源、装液量、氮源产酶活性高低的多重比较结果，选出最优组合为：pH＝8，发酵温度为40℃，装液量90/500mL，碳源0.5％的牛肉膏以及氮源2％的大豆蛋白胨。 

本发明对HT8进行了发酵条件的初步优化，使其产酶活性进一步得到了提高，测量18h的溶栓圈直径比优化前大了2mm，最佳发酵条件为PH＝8.0，温度为40℃，装液量90/500mL，碳源0.5％的牛肉膏，氮源2％的大豆蛋白胨，按18h计算，其相对活力达1804.08IU/mL。 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

Claims (3)

1.一种具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC NO.7168，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

2.根据权利要求1所述的具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌相对尿激酶酶活力达1600IU/mL以上。 

3.权利要求1或2所述的具有溶栓活性的枯草芽孢杆菌的发酵方法，发酵条件为pH＝7.5-8.5，温度为38-42℃，装液量80-100/500mL，碳源0.4-0.6％的牛肉膏，氮源1.5-2.5％的大豆蛋白胨；优选为pH＝8.0，温度为40℃，装液量90/500mL，碳源0.5％的牛肉膏，氮源2％的大豆蛋白胨。