CN112336847B - 益生菌组合物在制备药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及益生菌组合物在制备药物中的用途，所述组合物还有益生菌和降血糖多肽，所述多肽分离自苦瓜，具有较好的安全性，首次发现，采用本发明的糖尿病治疗产品，将药物定位至肠道进行释放，能够有效的保护多肽和微生物被有效的吸收利用，通过小鼠验证证明了所述组合物具有较好的降低血糖的效果，具有较好的应用价值和应用前景。

Description

益生菌组合物在制备药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及益生菌组合物在制备药物中的用途，可以用于糖尿病的治疗。
背景技术
糖尿病是一种多因素引起的慢性代谢性疾病，是为21世纪威胁人类健康的主要疾病之一。研究证实，全球糖尿病男性患病率从1980年的3.4％提高到2014年的9.0％，女性则从5.0％升至7.9％，世界上成人糖尿病的数量从1980年的1.08亿增加到2014年的4.22亿。在我国，糖尿病的发病率(包括I型糖尿病和Ⅱ型糖尿病)从1980年的0．9％显著提高到2010年的11.6％。根据国家卫生计生委于2016年11月12日发布的最新数据显示：中国糖尿病患者总人数达到1亿，并将持续增长，中国现已成为世界上拥有糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病具有高的致死性，在2015年，大约500万人死于糖尿病。此外，糖尿病的治疗费用很昂贵，2015年，全球糖尿病花费为6730亿美元，预测在2040年将达到8020亿美元，这将给各国的医疗保健系统带来巨大的挑战。
研究表明，肠道微生物在糖尿病的形成与发展中起重要作用。当肠道中有益菌减少，有害菌增多时，代谢内毒素的水平增加，导致长期慢性低度炎症，炎性因子的释放引起氧化应激反应，最终致使胰岛细胞损坏，从而导致糖尿病的发生。
由于益生菌有分泌抗菌物质、与其它病原菌竞争、强化肠道屏障和调节免疫系统的能力，其对人体的益生作用主要是调节肠道pH、平衡肠道菌群、刺激免疫系统、降低血清胆固醇和肿瘤的风险。研究显示益生菌对糖尿病有预防缓解及治疗作用，其潜在的干预机制包括：
体外实验研究表明一些乳酸菌细胞提取物(保加利亚乳杆菌CCFM4、植物乳杆菌CCFM10、嗜酸乳杆菌CCFM6)具有抑制一葡萄糖苷酶作用。Chen等发现，干酪乳杆菌2W和鼠李糖乳杆菌Z7无细胞上清及无细胞提取物对一糖苷酶有较好的抑制作用。Zeng等发现7株乳杆菌无细胞分泌上清具有一糖苷酶的抑制能力，其能力从I8.7％到34.9％不等，然而只有5株乳杆菌的无细胞提取物对一糖苷酶有抑制作用，其中嗜酸乳杆菌05—172的无细胞提取物对一糖苷酶的抑制能力最高。体内实验研究显示：喂食鼠李糖乳杆菌CCFM0528可以降低高脂肪、链脲佐菌素诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠的餐后血糖水平，这可能与鼠李糖乳杆菌CCFM0528对糖苷酶的抑制作用有关。Panwar等对来自婴儿粪便的15株乳杆菌、7株参考菌株、1株阳性对照菌株及2株阴性对照菌株的实验研究表明：15株乳杆菌加热和超声处理后的无细胞提取物在体外对一糖苷酶均有抑制作用，通过喂食加热和超声处理后的鼠李糖乳杆菌提取物(1g／kg)可以降低糖尿病大鼠的血糖波动，因此可以起到缓解糖尿病的作用。劳凤云等通过研究发现菌株可通过产生反竞争性或非竞争性的抑制物来抑制一葡萄糖苷酶的活力。因此，菌株对葡萄糖苷酶活力的抑制作用可能与其无细胞上清和无细胞提取物中含有酶抑制作用的物质有关。一旦葡萄糖苷酶的活力降低，淀粉和多糖降解为可被吸收的单糖的速率变慢，这将影响葡萄糖的吸收，而有利于降低餐后血糖水平。
部分临床研究发现，单个益生菌如长双歧杆菌、青春双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌等均有改善代谢的有益作用。用包含多种益生菌如嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的饮食喂养大鼠，能显著改善高果糖诱导的T2DM大鼠的高血糖、高胰岛素血症、血脂异常以及氧化应激反应，从而降低糖尿病和其并发症的风险。也有研究发现，海洋多糖多肽复合物对2型糖尿病大鼠的糖耐量异常具有显著调节作用 ，对 STZ诱导的糖尿病大鼠具有显著的肾脏及肝脏保护作用。
GLP-2(胰高血糖素样肽-2glucagon-like peptide-2)是由L细胞分泌的33个氨基酸的多肽。GLP-2是新近发现的肠上皮特异性生长因子，对胃肠道有多方面的作用，包括促进正常小肠的生长和发育，保护和修复各种肠道疾病中损伤的肠粘膜，抑制胃酸的分泌和胃肠的运动，增加肠道的血液供应，并能够实现降低血糖的作用。但是目前，新型的降血糖多肽的研究还不是很充分，提供的可选择形式也不充足，而且将益生菌与降血糖多肽一起组合制备成为药物组合物的研究也不充分，还有待进一步的研究。
发明内容
本发明提供一种降血糖多肽及其制备方法，以及将所述降血糖多肽与益生菌一起制备的药物组合物及其用于降低血糖中的用途。
本发明的第一方面提供了一种糖尿病治疗产品，所述糖尿病治疗产品含有于肠定位释放的口服定位释放制剂。
所述多肽可通过从天然苦瓜中提取，人工合成、或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。
具体的，所述的多肽为KG-4或KG-7，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1或2所示。
本发明还提供一种益生菌，所述益生菌能够促进血糖的降低功能。
所述益生菌为本领域常规的益生菌。
更具体的，所述益生菌为干酪乳杆菌CGMCC NO.4775。
进一步的，本发明还提供一种微胶囊，所述微胶囊能够有效的包裹益生菌和多肽，能够有效的将药物递送到肠道进行吸收。
优选地，所述口服微胶囊制剂为包衣的释放制剂。
进一步优选地，所述口服微胶囊制剂也可以为pH敏感型肠溶衣的释放制剂。
可根据要求，选择适宜pH范围溶解的聚合物，例如可选择在pH大于5.0甚至在大于3.0时即可实现快速释放的聚合物。保证药物定位在十二指肠释放。
本发明还提供一种糖尿病治疗用的药物组合物，所述药物组合物含有益生菌和多肽，所述多肽为SEQ ID NO:1所示的多肽，所述益生菌为干酪乳杆菌CGMCC NO.4775。
进一步的，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于:乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如梭甲基纤维素、轻丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等;还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。
优选地，所述糖尿病治疗产品用于I型糖尿病、II型糖尿病、糖尿病前期、肥胖症、食欲控制或代谢综合征治疗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种含有益生菌的组合物，所述组合物还有益生菌和将血糖多肽，所述多肽分离自苦瓜，具有较好的安全性，首次发现，采用本发明的糖尿病治疗产品，将药物定位至肠道进行释放，能够有效的保护多肽和微生物被有效的吸收利用，通过小鼠验证证明了所述组合物具有较好的降低血糖的效果，具有较好的应用价值和应用前景。
附图说明
图1 GSP表达量结果图
具体实施方式
本发明公开了一种防治糖尿病的组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1 降血糖多肽的制备
新鲜苦瓜250g，粉碎。采用本领域常规的方法进行有机酸、醇提取，丙酮沉淀。沉淀物用蒸馏水稀释，使用酸性蛋白酶进行酶解，酶解条件为pH为7.0，温度35℃，底物浓度为50mg/mL，酶添加量与底物的质量比为0.02mg/mg，酶解时间10h。冷却后离心取上清液，得酶解液，酶解液经过水相0.45μm微孔滤膜过滤后，选用分子量<5kDa的Pellicon Biomax滤膜在Millipore Labscale TFF系统(4℃，6000g)上进行分子量截留，收集滤液与残留液，最终得到分子量大小范围为0～5kDa。使用反相高效液相色谱和分子筛分离各洗脱峰。
取67mmol／L的磷酸钾缓冲液(pH6.8)6mL、3mmol／L的谷胱甘肽溶液0.2mL、0.04mg／mL的α-D-葡萄糖苷酶溶液0.3mL，37℃温孵10min后，加入0.0lmol/L的PNPG溶液0.5mL，作用20min后，用0.1mol/L Na2CO3溶液10mL终止反应，在400nm波长下测定各组样品的光密度，计算各洗脱峰的酶抑制率。样品组为加入了洗脱峰，空白对照组不加洗脱峰、阳性药物组(阿卡波糖 1mg/mL)分别用酸钾缓冲液配制。酶抑制率(％)= 100％×【D（λ）对照-D（λ）样品】/【D（λ）对照-D（λ）空白】。
结果如下表1所示。
表1 各洗脱峰对酶抑制率的影响
组别 抑制率
空白对照组 -
阳性对照组 87.35%
洗脱峰1 0.23%
洗脱峰2 0.56%
洗脱峰3 0.12%
洗脱峰4 0.55%
洗脱峰5 4.23%
洗脱峰6 6.32%
洗脱峰7 0.12%
洗脱峰8 5.89%
洗脱峰9 17.63%
洗脱峰10 44.63%
洗脱峰11 52.34%
洗脱峰12 11.03%
洗脱峰13 1.23%
洗脱峰14 0.14%
洗脱峰15 0.11%
洗脱峰16 0.06%
从表1的结果看出，洗脱峰10和11对于酶的抑制效果较好。将洗脱峰10和11采用高效液相色谱进行进一步纯化。ODS-AQ反相柱(20μm,2.5mm×150mm)首先用100％的超纯水平衡至基线呈一条直线，之后上样，以流速1mL/min对样品进行梯度洗脱。色谱条件为：100％的超纯水洗脱3min；100％的色谱乙腈洗脱12min。收集得到2个主要色谱峰，对此组分进行LC-MS-MS分析。利用液相色谱质谱联用仪对二个组分进行氨基酸序列分析，共鉴定到2条活性肽。结果见表2。
表2 酶解液中鉴定到的活性肽序列
活性肽序列 理论分子量 长度（氨基酸）
CTPIPAENRILSCNWM （SEQ ID NO：1，KG-4） 1848.18 g/mol 16
FLRPNAVSWHRQEKTHSDMNGSCS（SEQ ID NO：2，KG-7） 2788.03 g/mol 24
实施例2 KG-4多肽的活性验证
将SEQ ID NO：1多肽采用Fmoc固相合成法，使用CS Bio公司的CS336多肽合成仪，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接而成。
将多肽采用实施例1相似方法进行活性验证方法，分别采用不同的浓度来验证酶活性抑制效果。结果如下表3所示。
表3 多肽对酶抑制率的影响
组别 抑制率
空白对照组 -
阳性对照组 77.37%
（KG-4）SEQ ID NO：1 100ug/mL 56.53%
（KG-4）SEQ ID NO：1 1mg/mL 85.78%
（KG-4）SEQ ID NO：1 10mg/mL 94.53%
实施例3 KG-4多肽细胞活性验证
胰岛β细胞株Beta-TC-6，在含90%的DMEM/F12、10%的胎牛血清培养基中，放置37℃，5%CO2培养箱里培养。每2天换液1次，待细胞融合度达到80%左右用胰酶消化按1:2传代，待细胞融合度达到80%左右，用胰蛋白酶将细胞消化下来，加入含有血清的培养基终止消化，离心4min(1000r/min)，弃去上清，制成单个细胞悬液，在显微镜下进行人工计数后接种于96孔培养板上，细胞接种密度为1×104/孔，培养48h后，待细胞贴壁稳定后加入多肽100mg/L，设6个复孔，继续培养24、48、72h。用多肽干预 24、48、72 h 时，取 1.5 mL EP 管收集细胞上清液200μL，3000×g离心15min，将上清移入新的EP管中并立即放入-80℃冰箱备用。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测胰岛素含量时，每个样设2个复孔，每孔加入待测样品100μL，具体步骤按试剂盒说明书标准操作。每孔细胞数用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，进行人工计数(重复3次后取均值)校正。结果如表4所示。
表 4 KG-4多肽对胰岛细胞胰岛素分泌能力的影响
多肽 24h 48h 72h
0 1.781±0.131 1.950±0.182 2.156±0.387
100 2.457±0.154 2.996±0.205 3.564±0.203
从表4的结果可以看出，在72h时，100mg/L浓度的多肽可以提高胰岛素的产量达到了3.564±0.203，比对照的2.156±0.387显著得到提高。
实施例4 益生菌微胶囊的制备
(1)菌泥的制备
将干酪乳杆菌CGMCC NO.4775取一环干酪乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成1*108cfu/ml干酪乳杆菌CGMCC NO.4775种子液，使用乳酸调节pH值6.0。接种干酪乳杆菌种子液至MRS液体培养基中活化，同时添加质量分数10％的cochlearol E溶液混合培养，厌氧培养24h，将菌液在4℃、4000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。
（2）益生菌微胶囊的制备
称取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4：1的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速15ml·min-1、2000Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入0.3M CaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。
（3）壳聚糖盐酸盐包衣
稀释壳聚糖盐酸盐至7％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤（2）所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到微胶囊。
（4）冷冻干燥
将步骤（3)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到含多肽的益生菌微胶囊制剂。
实施例5 含KG-4多肽的益生菌微胶囊的制备
(1)菌泥的制备
将干酪乳杆菌CGMCC NO.4775取一环干酪乳杆菌接种到MRS固体培养基中划线，37℃厌氧培养24h。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成1*108cfu/ml干酪乳杆菌CGMCC NO.4775种子液，使用乳酸调节pH值6.0。接种干酪乳杆菌种子液至MRS液体培养基中活化，同时添加质量分数10％的cochlearol E溶液混合培养，厌氧培养24h，将菌液在4℃、4000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。
（2）益生菌微胶囊的制备
称取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4：1：0.01的比例与菌泥和KG-4多肽混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速15ml·min-1、2000Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入0.3MCaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。
（3）壳聚糖盐酸盐包衣
稀释壳聚糖盐酸盐至7％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤（2）所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到微胶囊。
（4）冷冻干燥
将步骤（3)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到含多肽的益生菌微胶囊制剂。
实施例6 小鼠模型的动物降血糖实验
实验动物为清洁级雄性C57小鼠体重为20g±3g(30只)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
将C57小鼠，按照体重135mg/kg腹腔注射STZ溶液，3d后禁食5h。取尾血，测空腹血糖，高于11.1mmol/L为高血糖成模小鼠。选择成模小鼠40只，分成4组，每组10只。分别为模型对照组，多肽组，含有多肽的益生菌组，阳性对照组。
其中还设置正常对照组：为正常小鼠。正常对照组和模型对照组每天灌胃20mL/kg/天生理盐水，多肽组灌食20mg/kg/天实施例4的微胶囊；含有多肽的益生菌组灌食20mg/kg/天实施例5的微胶囊；阳性对照组为灌食20mg/kg/天的阿卡波糖。给药期间动物正常进食，饮水，给药5周，在第一周和第五周的同一时间剪尾取血)用血糖仪测空腹血糖，结果如表5所示。
表 5 各组对小鼠空腹血糖含量的影响
组别 0周 5周
正常对照组 5.25±0.42 5.30±0.39
模型对照组 19.03±1.38 22.11±2.24
多肽组 19.35±2.13 8.42±0.59
含有多肽的益生菌组 19.38±2.21 5.81±0.63
阳性对照组 19.31±2.09 16.43±3.96
从表5的结果可以看出，KG-4多肽能够显著的降低模型小鼠的血糖值，特别是与益生菌一起其血糖可以最低达到5.81±0.63，比阳性对照组有显著的降低。此外，通过对小鼠脏器进行检验，发现的多肽组和含有多肽的益生菌组均没有毒性，具有较好的安全性。
给药 5周后，最后一次给药结束2h，摘眼球取血，37℃水浴 30min，3000r/min，离心15min，吸取上层血清，用GSP检测试剂盒检测GSP的含量。结果如图1所示。
由于GSP糖化蛋白能反应机体近期的血糖水平，从图1的结果可以看出，多肽组以及含有多肽的益生菌组均可以降低GSP的含量，其中含有多肽的益生菌的GSP达到1.56，这二个实验组均比阳性对照组的降低效果要显著。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
序列表
<110> 北京欣颂生物科技有限公司
<120> 益生菌组合物在制备药物中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Thr Pro Ile Pro Ala Glu Asn Arg Ile Leu Ser Cys Asn Trp Met
1 5 10 15
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Leu Arg Pro Asn Ala Val Ser Trp His Arg Gln Glu Lys Thr His
1 5 10 15
Ser Asp Met Asn Gly Ser Cys Ser
20

Claims (5)

1.一种药物组合物，其特征在于由益生菌和多肽组成；其中多肽为KG-4其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述益生菌为干酪乳杆菌CGMCC NO.4775。
2.SEQ ID NO：1多肽在制备降糖功能的口服降血糖药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于还有能够降低血糖的第二功效药物一起使用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于第二功效药物为益生菌或者化学降糖药物。
5.如权利要求4所述的应用，所述益生菌为干酪乳杆菌CGMCC NO.4775。
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